Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Anvendelse af MicroSiM (μSiM) barrierevævsplatformen til modellering af blod-hjerne-barrieren

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65258
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 3, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Denne rapport indeholder protokoller til samling, cellekultur og analyser på μSiM-platformen til konstruktion af blod-hjerne-barrieremodeller.

Abstract

MicroSiM (μSiM) er en membranbaseret kulturplatform til modellering af blod-hjerne-barrieren (BBB). I modsætning til konventionelle membranbaserede platforme giver μSiM eksperimentalister nye muligheder, herunder levende cellebilleddannelse, uhindret parakrin signalering mellem 'blod' og 'hjerne' kamre og evnen til direkte at afbilde immunfluorescens uden behov for ekstraktion/genmontering af membraner. Her demonstrerer vi den grundlæggende anvendelse af platformen til at etablere monokultur (endotelceller) og co-kultur (endotelceller og pericytter) modeller af BBB ved hjælp af ultratynde nanoporøse siliciumnitridmembraner. Vi demonstrerer kompatibilitet med både primære cellekulturer og humane inducerede pluripotente stamcellekulturer (hiPSC). Vi leverer metoder til kvalitativ analyse af BBB-modeller via immunofluorescensfarvning og demonstrerer brugen af μSiM til kvantitativ vurdering af barrierefunktion i et lille molekylepermeabilitetsassay. De metoder, der stilles til rådighed, bør gøre det muligt for brugerne at etablere deres barrieremodeller på platformen og fremme anvendelsen af vævschipteknologi til undersøgelse af humant væv.

Introduction

Levende væv er opdelt af specialiserede celler, der skaber og opretholder barrierer og regulerer, hvilke celler og molekyler der transporteres fra et rum til et andet. Forkert regulering af barrierefunktioner kan være kilden til både akutte sygdomme og kronisk sygdom. Blod-hjerne-barrieren (BBB) er den mest restriktive vævsbarriere i menneskekroppen1. Dysfunktion af BBB ligger til grund for en bred vifte af sygdomme i centralnervesystemet (CNS), herunder Alzheimers sygdom2, Parkinsons sygdom 3,4 og multipel sklerose 5,6. Skader på BBB er også forbundet med langvarig kognitiv svækkelse som følge af akutte lidelser, såsom sepsis7, COVID-198 og postoperativt delirium9. Udviklingen af lægemidler med potentiale til behandling af hjernesygdomme har været frustrerende vanskelig på grund af udfordringen med bevidst at bryde BBB for at levere bioaktive molekyler til mål i hjernen10. Af disse grunde er metoder til undersøgelse af BBB-funktion in vitro af afgørende betydning for forståelsen og behandlingen af sygdomme i CNS.

De grundlæggende metoder til måling af barrierefunktion in vitro involverer etablering af et monolag eller en samkultur på en semipermeabel membran og måling af cellernes modstand mod enten små molekyleriffusion eller små elektriske strømme11,12,13,14. Mens fremkomsten af mikrofysiologiske systemer (MPS) har produceret en overflod af valg til modellering af BBB i 3D15,16, gør mangfoldigheden af systemgeometrier det vanskeligt at sammenligne permeabilitetsmålinger mellem MPS eller med etablerede litteraturværdier. Etableringen af pålidelige baselineværdier er særlig vigtig i BBB-forskning, hvor in vitro-permeabilitetsværdier på grund af den omfattende barriereregulering af hjernevaskulære endotelceller undersøges nøje12,17,18. Af disse grunde vil permeabilitetsmålinger på tværs af monolag etableret på 2D-membraner forblive en hæfteklammer i BBB-undersøgelser i de kommende år. Dette gælder for andre vævsbarrierer, herunder epitelbarrierer, hvor absolutte værdier for baselinepermeabilitet anvendes til at validere og sammenligne in vitro-modeller 19,20,21.

Med det mål at etablere et værdifuldt nyt værktøj til BBB-forskningssamfundet har vi introduceret 22 og avanceret23,24,25,26 mikroenhedenmed en silicon membrane (μSiM) platform til brug i barrierevævsmodellering i løbet af de sidste 5 år. Platformens aktiveringsfunktion er en ultratynd (<100 nm tyk) membran med hundreder af millioner nanoporer 27,28 eller en blanding af nanoporer og mikroporer29. De fritstående membranchips produceres på en 300 μm silicium 'chip', der stabiliserer de ultratynde strukturer30 og gør det muligt at håndtere dem med pincet til enhedsmontering. På grund af deres ultratynde natur har membranerne en permeabilitet, der er to størrelsesordener højere end for konventionelle sporætsede membraner, der anvendes i kommercielle membrankulturanordninger31,32. I praksis betyder det, at membranens hindring for diffusion af molekyler, der er mindre end nanoporerne (<60 nm), er ubetydelig33. For cellulære barrierer vil således kun cellerne og matricerne, de deponerer, bestemme hastigheden af små molekyletransporter fra de apikale til basale rum, der adskilles af membranen34. Enhedens design og membranernes ultratynde natur giver også mange fordele ved optisk mikroskopi. Disse omfatter 1) evnen til at følge levende kulturer ved hjælp af fasekontrast eller lysfeltbilleddannelse, 2) evnen til fluorescerende at plette og afbilde in situ uden behov for at ekstrahere og overføre membranen til et dækglas og 3) det faktum, at membranerne er tyndere end konfokale 'skiver', så direkte co-kulturer har en mere naturlig afstand mellem celletyper, end det kan opnås med 6-10 μm tykke sporætsede membraner.

Senest avancerede vi platformen til et modulært format for at lette hurtig montering34 og tilpasning35,36. Vi udnyttede det modulære format til at distribuere enhedskomponenter mellem vores bioengineering og samarbejdende hjernebarrierelaboratorier. Derefter udviklede vi i fællesskab protokoller til enhedssamling, monokultur og cokultur, immunofluorescerende farvning og små molekylepermeabiliteter og viste, at disse metoder var reproducerbare mellem laboratorier. Ved hjælp af disse protokoller viste vi også, at den modulære platform understøtter en valideret BBB udviklet ved hjælp af den udvidede endotelkulturmetode (EECM) til at skabe hjernemikrovaskulære endotellignende endotelceller (BMEC) fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er)37. Formålet med den aktuelle rapport er at gennemgå disse metoder mere detaljeret og ved hjælp af den ledsagende video lette en bredere vedtagelse af platformen i BBB-samfundet.

Protocol

1. μSiM-enhed enhed

BEMÆRK: Denne metode beskriver samlingen af enhederne. Membranchippen har en grøftside og fladside, som kan samles grøft-op eller grøft-ned. Trench-down enheder bruges mest til cellekultur.

  1. I et sterilt miljø (dvs. en biosikkerhedshætte) skal du forberede alle materialer til montering, inklusive monteringsarmaturer, komponenter, membranflis og pincet.
  2. Placer membranchippen på midten af armatur A1 ved hjælp af chippincet. Den flade overflade af chippen vender nedad, og grøftområdet vender opad for grøft-ned-enheder og omvendt for grøft-op-enheder.
    BEMÆRK: Følgende monteringstrin illustreres ved at bruge grøft-ned-enheden som et eksempel, hvilket tillader et fladt vækstområde i det øverste kammer.
  3. Bind komponent 1 til chippen. Skræl først de blå beskyttende lag af på begge sider af komponent 1 ved hjælp af lige pincet og læg det i armatur A1, øverste kammer ned. Tryk forsigtigt komponent 1 ned, indtil det trykfølsomme klæbemiddel (PSA) berører chippen.
  4. Sæt armatur A2 på armatur A1, og anvend et fast tryk i forskellige hjørner for at sikre en tæt pasform af chippen og komponenten.
    BEMÆRK: Sørg for ikke at tage PSA-laget af. Det er et gennemsigtigt og stivere lag sammenlignet med de blå beskyttende lag.
  5. Forbind komponent 2 til komponent 1 med chippen. Forbered først komponent 2 ved at tage fat i det ene hjørne af komponent 2 med lige pincet og skrælle det af arket. Tag derefter fat i ikke-PSA-"trekantområdet" i komponent 2, og fjern sammen det tykke, gennemsigtige beskyttende lag og det blå lag af komponent 2, og blotte PSA-overfladen. Placer komponent 2 i armatur B1 med PSA-siden opad.
  6. Placer komponent 1 med membranchippen i armatur B1 med det øverste kammer opad.
  7. Sæt armatur B2 på komponent 1, og anvend et fast tryk i forskellige hjørner af armatur B2.
  8. Tag den samlede enhed ud af armaturet, og brug lige pincet til at trykke eventuelle luftbobler ud på undersiden af enheden og forsegle kanterne på channelx ', undgå kontakt med membranområdet. Før brug til cellekultur steriliseres ultraviolet (UV)-sterilisering af nymonterede enheder i 20 minutter.

2. Cellekultur

BEMÆRK: Denne metode beskriver protokoller for primære og hiPSC-afledte kulturer på platformen. Metoderne beskriver endotelcellemonokultur i enhedens øverste kammer og pericyt- og endotelcellesamkultur med pericytter i det nederste kammer og endotelceller i det øverste kammer af trench-down monterede enheder. For kammerets dimensioner og volumener, se tabel 1. Dette er de mest almindelige formater; Andre cellekulturlayouts kan dog bruges afhængigt af brugernes behov.

  1. Forberedelse af cellekulturkammer
    1. Saml enhederne i henhold til protokollen beskrevet i afsnit 1.
    2. Anbring enhederne i sterile slangeklemmer. Før cellekultur steriliseres klemmerne ved at lægge dem i blød i ethanol i ≥20 minutter. Gensteriliser efter hvert forsøg til genbrug.
    3. Dyrk enhederne i en stor steril petriskål. For ekstra fugtighed tilsættes en lille petriskål eller 50 ml konisk rørlåg fyldt med sterilt vand.
    4. Vask enhedernes øverste kammer to gange med 100 μL sterilt vand. Til cellekultur i bundkammeret vaskes bundkammeret med 20 μL sterilt vand.
  2. hCMEC/D3-cellelinjemonokultur (BBB)
    1. Cellekulturkammeret klargøres i overensstemmelse med punkt 2.1.
    2. Overtræk de øverste kamre med 25 μg / cm, 2 kollagen I og 5 μg /cm2 humant fibronectin blandet i fosfatbufret saltvand (PBS). Lad det sidde i 1-2 timer ved 37 °C eller natten over ved 4 °C.
    3. Overfladebehandlingsopløsningen fjernes, og der tilsættes 100 μL forvarmet vækstfaktorforarmet endotelmedium (analysemedium) til topkammeret og 20 μL til det nederste kammer. For at forberede analysemediet blandes 100 ml endotelbasalmedium + 400 μL human fibroblastisk vækstfaktor + 40 μL hydrocortison + 100 μL gentamicinsulfat + 2 ml føtalt bovint serum.
    4. passage hCMEC/D3-celler i overensstemmelse med fabrikantens protokol trypsinisere cellerne i en 37 ° C inkubator i 3-5 minutter og derefter stoppe trypsinisering ved tilsætning af forvarmet endotelmedium. Cellesuspensionen overføres til et centrifugeglas og centrifugeres ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspender cellepillen i analysemedier og frø cellerne i de øverste kamre med en densitet på 40.000-60.000 celler / cm2. Inkuber enhederne ved 37 °C med 5% kuldioxid (CO 2) i2-4 timer for at lette celleadhæsion. For eksempel, for at opnå 40.000 celler / cm 2 på 0,37 cm2 chippen, tilsættes 100 μL af en celleopløsning med en koncentration på 150.000 celler / ml til det øverste kammer.
      BEMÆRK: Vi dyrker og passerer hCMEC / D3 i henhold til Hudecz et al.38 ved hjælp af en modificeret formulering af endotelvækstmedier-2 (EGM-2) til cellevedligeholdelse og et vækstfaktorreduceret "analysemedium" efter subkultur til assays. Andre medieformuleringer skal være kompatible med enhederne, selvom vi anbefaler medieformuleringerne fra Hudecz et al.38 , hvis brugerne oplever problemer med hCMEC/D3-overlevelse.
    5. Efter 2-4 timer for celleadhæsion udskiftes med frisk analysemedium i begge kamre for at fjerne døde eller ikke-bundne celler.
    6. Enhederne holdes ved 37 °C med 5 % CO 2, og ombyt analysemediet i begge kamre hver2.-3. dag indtil forsøget. Assays udføres typisk efter 2 ugers kultur.
  3. hiPSC-afledt EECM-BMEC-lignende cellemonokultur
    1. Cellekulturkammeret klargøres i overensstemmelse med punkt 2.1.
    2. Forbered kollagen IV fra human placentaopløsning ved at tilsætte 5 ml 0,5 mg / ml eddikesyre til 5 mg kollagen IV for at skabe en 1 mg / ml opløsning. Opløsningen henstår i ≥4 timer ved 4 °C for at rekonstituere den helt. Opløsningen er stabil ved 4 °C i 2 uger.
    3. Overtræk de øverste kamre med 100 μL af et 4: 1: 5-forhold mellem kollagen IV, bovin fibronectin og sterilt vand. Overtræk ved 37 °C i 2-4 timer.
    4. Fjern belægningsopløsningen, og tilsæt 100 μL stuetemperatur hECSR til det øverste kammer og 20 μL til det nederste kammer.
    5. Passage EECM-BMEC-lignende celler ifølge Nishihara et al.37; Der tilsættes en celleløsrevelsesenzymblanding til cellerne og overføres til en 37 °C inkubator i 5-8 min. Pipetten celleopløsningen for at singularisere og tilføje til 4x volumenet af endotelmedium i et centrifugerør. Der centrifugeres ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur; resuspendere cellerne i hECSR og frø i de øverste kamre med en densitet på 40.000 celler / cm2. Inkuber enhederne ved 37 °C med 5% CO 2 i2-4 timer for at lette celleadhæsion. For eksempel, for at opnå 40.000 celler / cm2, tilsættes 100 μL af en celleopløsning ved 150.000 celler / ml.
    6. Efter 2-4 timer for celleadhæsion udskiftes med frisk hECSR i begge kamre for at fjerne døde eller ikke-bundne celler.
    7. Vedligehold enhederne ved 37 °C med 5% CO 2, og udskift hECSR i begge kamre hver1-2 dag indtil eksperimentering. Assays udføres typisk på dag 6 i kulturen.
  4. hCMEC/D3 og primær human hjernevaskulær pericyt (HBVP) co-kultur
    1. Før enheden samles, skal membranspånerne belægges med 2 μg/cm2 poly-L-lysin (PLL) blandet i PBS. Påfør kun 50-80 μL PLL i en dråbe på den side, der vender nedad i den endelige enhedsenhed. Overmalingsprocessen afsluttes enten 1-2 timer ved 37 °C eller natten over ved 4 °C.
    2. Fjern belægningsopløsningen. Vask membranspånerne med sterilt ultrarent vand og lad dem tørre.
    3. Enhederne samles i henhold til protokollen beskrevet i punkt 1 ovenfor med den PLL-belagte side nedad, og cellekulturkammeret klargøres i henhold til punkt 2.1.
    4. Overtræk de øverste kamre i overensstemmelse med punkt 2.2.2.
    5. Der tilsættes 50 μL forvarmet pericytmedium til de øverste kamre, og der tilsættes 20 μL til de nederste kanaler.
    6. Passage HBVP'er i henhold til producentens protokol; trypsinisere cellerne i en 37 ° C inkubator i 3-5 minutter, derefter stoppe trypsinisering ved tilsætning af forvarmet pericytmedium. Cellesuspensionen overføres til et centrifugeglas og centrifugeres ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspender cellepillen i pericytmedium og frø cellerne i de nederste kamre med en densitet på 14.000-25.000 celler / cm2. Inverter enhederne, men oprethold en luftgrænseflade med de øverste kamre for at lette gasudveksling.
      BEMÆRK: Den luftgrænseflade, der kræves under invertering, kan opnås ved at vende enhederne efter at have placeret dem inde i slangeklemmer og skubbe ned på alle hjørner inden vending eller ved at placere enhederne på hovedet på parallelle strimler af akryl eller silikone med tilstrækkelig afstand til at holde de øverste kamre uhindrede. Såtætheden skal muligvis optimeres for hver bruger. For at opnå 14.000 celler/cm2 tilsættes 20 μL af en cellesuspension ved ~590.000 celler/ml. Bemærk, at 20 μL pipetteres ind i det nederste kammer for at undgå bobler, men densiteten beregnes ved hjælp af det nederste kammervolumen på 10 μL.
    7. Inkuber cellerne ved 37 °C med 5% CO 2 i2-4 timer i omvendt position for at lette celleadhæsion.
    8. Efter 2-4 timer for celleadhæsion skal du vende enhederne lodret og udveksle dem med frisk pericytmedium i begge kamre for at fjerne døde eller ikke-bundne celler.
    9. Efter pericytsåning frø hCMEC/D3'er i det øverste kammer efter trin 2.2.4-2.2.5. Skift begge kamre til analysemediet.
    10. Enhederne holdes ved 37 °C med 5 % CO 2, og udskift analysesubstratet i begge kamre hver 1.-2. dag indtil forsøget. Primær cellecokultur opretholdes normalt i 6-8 dage før analyserne.
      BEMÆRK: Hvis HBVP-monokulturerne sammenlignes med hCMEC/D3-monokulturer eller hCMEC/D3- og HBVP-samkulturer, skal pericytsubstratet udskiftes med analysemedium 2-3 dage efter såning af HBVP'erne.
  5. hiPSC-afledt EECM-BMEC-lignende celle- og hjernepericytlignende celle (BPLC) co-kultur
    1. Cellekulturkammeret klargøres i overensstemmelse med punkt 2.1, og de øverste kamre belægges i overensstemmelse med trin 2.3.2-2.3.3.
    2. Fjern belægningsopløsningen, og tilsæt 50 μL stuetemperatur Essential 6 Medium + 10% føtalt bovin serum (E6 + 10% FBS) til det øverste kammer.
    3. Passage BPLC'erne ifølge Gastfriend et al.39; tilsættes en celleløsrevelsesenzymblanding til cellerne og overføres til en 37 °C inkubator i 5-15 minutter, indtil ~90% af cellerne er afrundede. Pipettér celleopløsningen for at singularisere og tilsæt 4x volumen DMEM / F12 i et 50 ml centrifugerør ved hjælp af en 40 μm cellesil til at filtrere og fuldt singularisere cellerne. Overfør til et 15 ml centrifugerør, centrifuger ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur, resuspender cellepillen i E6 + 10% FBS, og frø cellerne i de nederste kamre med en densitet på 14.000-25.000 celler / cm2. Inverter enhederne, men oprethold en luftgrænseflade med det øverste kammer for at lette gasudveksling.
      BEMÆRK: Den luftgrænseflade, der kræves under invertering, kan opnås ved at vende enhederne efter at have placeret dem inde i slangeklemmerne og skubbe ned på alle hjørner inden vending eller ved at placere enhederne på hovedet på parallelle strimler af akryl eller silikone med tilstrækkelig afstand til at holde de øverste kamre uhindrede. Såtætheden skal muligvis optimeres for hver bruger. For at opnå 14.000 celler/cm2 tilsættes 20 μL af en cellesuspension ved ~590.000 celler/ml. Bemærk, at 20 μL pipetteres ind i det nederste kammer for at undgå bobler, men densiteten beregnes ved hjælp af det nederste kammervolumen på 10 μL.
    4. Inkuber cellerne ved 37 °C med 5% CO 2 i2-4 timer i omvendt position for at lette celleadhæsion.
    5. Efter 2-4 timer for celleadhæsion skal du vende enhederne lodret og udveksle med frisk E6 + 10% FBS i begge kamre for at fjerne døde eller ikke-fastgjorte celler.
    6. En dag efter pericytsåning frøes EECM-BMEC-lignende celler i det øverste kammer ved at følge trin 2.3.5-2.3.6. Skift begge kamre til hECSR.
    7. Enhederne opbevares ved 37 °C med 5 % CO 2, og analysesubstratet udskiftes i begge kamre hver 1.-2. dag indtil forsøget. hiPSC-afledt cokultur opretholdes normalt i 7 dage for BPLC'er og 6 dage for EECM-BMEC-lignende celler før assays.
      BEMÆRK: Hvis BPLC-monokulturerne sammenlignes med EECM-BMEC-monokulturer eller EECM-BMEC- og BPLC-cokulturer, skal du udskifte E6 + 10% FBS med hECSR 1 dag efter såning af BPLC'erne.

3. Immuncytokemi

BEMÆRK: Denne metode beskriver en protokol for immuncytokemisk farvning og billeddannelse af celler dyrket i over- og/eller undersiden af membranen. Formålet med dette eksperiment er at bestemme tilstedeværelsen og placeringen af nøgleproteiner, der skal findes i BBB, såsom adhærenser og stramme forbindelsesproteiner og celleidentitetsproteiner. Alternative og levende farvningsmetoder er også kompatible med platformen.

  1. Fastgørelse og farvning på enhederne
    1. Placer de primære antistoffer på is for at tø op.
    2. Der fremstilles en 4 % paraformaldehydopløsning (PFA) ved stuetemperatur (f.eks. fortyndes 16 % PFA i 3 gange mængden PBS) eller afkøles 100 % methanol ved -20 °C.
    3. Opret en passende blokeringsløsning i henhold til tabel 2. Opbevares på is.
      BEMÆRK: Vortexing opløsningen kan være nødvendig for at opløse Triton X-100 helt.
    4. Fastgør cellerne ved at pipettere 20 μL fikseringsmiddel (f.eks. PFA eller methanol) i bundkammeret og 50 μL i det øverste kammer. Inkuber enhederne i 10 min (PFA) eller 2 min (methanol) ved stuetemperatur.
    5. Der vaskes i 3 x 5 minutter ved at pipettere 20 μL PBS gennem det nederste kammer og 100 μL ind i det øverste kammer.
    6. Der blokeres i 30 minutter ved stuetemperatur ved tilsætning af 20 μL af blokeringsopløsningen til det nederste kammer og 50 μL blokeringsopløsning til det øverste kammer. Kontroller for bobler i det nederste kammer.
    7. Den primære antistofopløsning fremstilles ved at fortynde antistoffet/antistofferne i den blokerende opløsning i overensstemmelse med tabel 2. Opbevares på is.
    8. Plet med de primære antistoffer ved at tilsætte 20 μL af den primære antistofopløsning til det nederste kammer og erstatte volumenet af det øverste kammer med 50 μL af den primære antistofopløsning. Kontroller for bobler i det nederste kammer. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
    9. Der vaskes i 3 x 5 minutter ved at pipettere 20 μL PBS gennem det nederste kammer og 100 μL ind i det øverste kammer.
    10. Den sekundære antistofopløsning fremstilles ved at fortynde antistoffet/antistofferne i den blokerende opløsning i overensstemmelse med tabel 2. Opbevares på is beskyttet mod lys.
    11. Plet med sekundære antistoffer ved at tilsætte 20 μL sekundær antistofopløsning til det nederste kammer og erstatte volumenet af det øverste kammer med 50 μL af den sekundære antistofopløsning. Kontroller for bobler i det nederste kammer. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
    12. Der vaskes i 3 x 5 minutter ved at pipettere 20 μL PBS gennem det nederste kammer og 100 μL ind i det øverste kammer.
    13. Lav en nuklear pletopløsning. Hoechst fortyndes 1:10.000 i PBS. Der tilsættes 20 μL af den nukleare pletopløsning til bundkammeret, og det øverste kammers volumen erstattes med 50 μL af den nukleare pletopløsning. Kontroller for bobler i det nederste kammer. Inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
    14. Pletten fjernes ved at tilsætte 20 μL PBS til det nederste kammer og erstatte topkammerets volumen med 100 μL PBS. Tag straks billeder af enhederne, eller opbevar dem ved 4 °C med petriskålen pakket ind i parafilm og beskyttet mod lys, indtil den er klar til billeddannelse.
  2. Konfokal billeddannelse
    BEMÆRK: Dette afsnit beskriver billeddannelse af enhederne ved hjælp af et omvendt roterende skivekonfokalmikroskop med en lang arbejdsafstand (LWD) 40x mål (vand, WD 590-610, numerisk blænde 1.15) som et eksempel. For arbejdsafstande og linsekompatibilitet henvises til supplerende materiale i McCloskey et al.34. Billeder af hele membranområdet tages også ved hjælp af et 10x-mål for at sikre, at 40x-billederne er repræsentative for hele feltet. Disse tages normalt i widefield.
    1. Tænd mikroskopet, og åbn billedbehandlingssoftwaren.
    2. Indstil kanalerne i henhold til egenskaberne for det sekundære antistof og den nukleare plet ved hjælp af konfokal billeddannelsestilstand. Optimer lasereffekten og eksponeringstiden for at sikre, at signalet er over baggrunden og reducerer billedartefakter.
      1. Til Hoechsts kernefarvning anvendes excitation 405, emission 450/50 Bandpass (BP), 500 ms eksponeringstid, 50 % lasereffekt. For etiketter, der bruger et sekundært antistof konjugeret til Alexa Fluor (AF) 488, skal du bruge excitation 488, emission 525/50BP, 500 ms eksponeringstid og 50% lasereffekt. For etiketter, der bruger et sekundært antistof konjugeret til AF568, skal du bruge excitation 561, emission 600/50BP, 500 ms eksponeringstid og 100% lasereffekt.
    3. Placer enheden i mikroskopets diasholder, øverste kammer opad og sæt i mikroskopet ved hjælp af en mikroskopglideholder. Tænd Live , og vælg kanalen til den nukleare plet. Find membranen ved hjælp af et lavt mål, og sørg for, at det gennemsigtige siliciumnitridmembranområde er centreret, da lys ikke transmitteres gennem det blå, faste silikoneområde. Når enheden er korrekt centreret, og cellelaget er fundet, skal du skifte til 40x-målet, våde målet og fokusere på membranområdet ved hjælp af den nukleare plet som vejledning.
    4. Slå z-stack-billedbehandling til, og indstil scanningstilstand til Start/Slut. Indstil trinstørrelse eller antal. Brug den grove justeringsknap på mikroskopet til at indstille scanningsstarten til toppen af endotelcellelaget ved hjælp af den nukleare plet som vejledning og scanningsenden i bunden af pericytlaget ved hjælp af den nukleare plet som vejledning. Kontroller alle kanaler for at sikre, at alt bliver fanget i billedfeltet.
      BEMÆRK: Vi bruger normalt automatisk trin, som er ~ 0.2 μm skiver.
    5. Indstil billednavnet, og tryk på Hent for at starte billeddannelsen. Gentag på forskellige regioner efter behov.
    6. Behandl de konfokale billeder ved hjælp af ImageJ40 eller Imaris.
      1. For at behandle i Imaris skal du trække billedfilen ind i programmet for at åbne. Vælg Sektion på den øverste menulinje for at se et 2D-billede af x-y-planet med tilsvarende visninger af x-z- og y-z-planerne. Vælg 3D-visning på den øverste menulinje for at se et 3D-billede . Klik på billedet og træk det for at rotere. Vælg Snapshot på den øverste menulinje for at tage et billede.

4. Prøveudtagningsanalyse af små molekylers permeabilitet

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver en metode til kvantitative målinger af cellekulturernes barriereegenskaber. Formålet med dette eksperiment er at detektere koncentrationen af et fluorescerende lille molekyle, der passerer gennem cellelagene og kommer ind i platformens nederste kammer. Disse data bruges derefter til at beregne cellulær permeabilitet.

  1. Prøveudtagning teknik
    1. Saml enhederne i henhold til protokollen beskrevet i afsnit 1, og dyrk de ønskede cellelinjer som beskrevet i afsnit 2. Inkluder en ekstra enhed til at fungere som en cellefri, belagt kontrolenhed til måling af systemets permeabilitet.
      BEMÆRK: Der anbefales mindst tre tekniske replikater pr. tilstand; Der kræves dog kun én replikat af den coatede kontrol.
    2. Inden prøveudtagningsanalysen påbegyndes, udskiftes substratet i det nederste kammer med et friskt substrat. Kontroller sammenløbet af endotelmonolaget i hver enhed under mikroskopet. Bemærk eventuelle huller i cellemonolag, da dette vil påvirke diffusionen af farvestof i bundkammeret.
      BEMÆRK: En sund endotelkultur skal være 100% sammenflydende.
    3. Den fluorescerende opløsning med små molekyler (f.eks. 150 μg/ml Lucifer Yellow, 457 Da) fremstilles i cellekulturmedium. Der fremstilles overskydende volumen af den fluorescerende opløsning af små molekyler, der skal anvendes til fremstilling af de standardopløsninger, der tjener som referencer til beregning af koncentrationen af det fluorescerende lille molekyle, der er udtaget fra bundkanalen.
      BEMÆRK: Vi anbefaler fremstilling af 400 μL overskydende opløsning, der skal anvendes som standardopløsning med den højeste koncentration af det fluorescerende lille molekyle.
    4. Udskift mediet i det øverste hul med 100 μL af den fluorescerende opløsning med små molekyler.
      BEMÆRK: Vi anbefaler at bruge en hydrofob pen til at tegne cirkler rundt om prøvetagningsportene og vente, indtil den hydrofobe blæk tørrer helt, før der tilsættes fluorescerende farvestofopløsning. Dette forhindrer spredning af substratet fra den nederste kanal omkring prøveudtagningsporten i trin 4.1.7. Vi anbefaler at forskyde tilsætningen af den fluorescerende lille molekyleopløsning i den øverste brønd - vent 2 minutter, før du tilføjer den fluorescerende opløsning til den næste enhed, eller arbejd i grupper på 3 (tilføj opløsningen til tre enheder på samme tid, og vent 5 minutter for at tilføje de næste tre enheder).
    5. Inkuber enhederne ved 37 °C, 5% CO2 i 1 time.
    6. Under 1 h-lang inkubation i det foregående trin fremstilles standardopløsninger ved at udføre 2 gange serielle fortyndinger fra den fluorescerende lille molekyleopløsning fremstillet i trin 4.1.3. Der pipetteres 50 μL af hver opløsning i den fladbundede sorte 96-brønds plade i tre eksemplarer. Brug tomt cellekulturmedium som basislinjestandardopløsning.
      BEMÆRK: For at fremstille standardopløsninger anbefaler vi 11 serielle fortyndinger ved et slutvolumen på 200 μL og anvendelse af cellekulturmedium som blindprøve til måling af baseline fluorescerende intensitet.
      1. 200 μL 400 μL af den i trin 4.1.3 fremstillede flygtige fluorescerende opløsning af små molekyler overføres til et glas indeholdende 200 μl medium, blandes godt, og 200 μL af denne opløsning overføres til det næste glas indeholdende 200 μL medium. Gentag 1:2 fortyndingerne, indtil der er i alt 10 rør. 50 μL af den mest koncentrerede standardopløsning afpipetteres i kolonne 1 i tre eksemplarer i 96-brøndpladen (B1, C1, D1), den 2. mest koncentrerede opløsning i kolonne 2 (B2, C2, D2) osv. For 12. kolonne i pladen, pipet 50 μL blindsubstrat i tre eksemplarer (B12, C12, D12).
    7. Udfør følgende trin for at prøve den fluorescerende opløsning af små molekyler fra bundkanalen.
      1. Fjern den fluorescerende opløsning med små molekyler fra brønden for at stoppe diffusionsprocessen.
      2. Anbring en spids indeholdende 50 μL medium i den øverste port for at tjene som reservoir ved at indsætte spidsen med 50 μL i porten, løfte anordningen og forsigtigt skubbe spidsen ud, mens du holder fast i toppen for stabilisering. Indstil enheden. Sørg for, at der ikke er bobler i pipetspidsen eller luft i pipettens spids for at undgå at tilføje bobler i det nederste kammer under prøveudtagningen.
      3. Tilsæt 50 μL medium i det øverste hul for at forhindre forstyrrelse af cellemonolaget under prøveudtagning.
      4. Til prøveudtagning af opløsningen fra den nederste kanal skubbes en pipetter med en tom pipetspids til sin første modstand, spidsen indsættes i prøveudtagningsporten, og der vendepipetteres 50 μL af opløsningen ud af bundkanalen. Overfør direkte til den fladbundede sorte 96-brønds plade, der indeholder standardopløsningerne.
        BEMÆRK: Vi anbefaler, at du kontrollerer cellemonolaget under mikroskopet umiddelbart efter prøveudtagningen. Tegning af medier fra den nederste kanal kan lejlighedsvis resultere i forstyrrelse af cellelaget i den øverste brønd, hvilket kan forårsage inkonsekvente permeabilitetsmålinger. At arbejde hurtigt gennem trin i 4.1.7 vil hjælpe med at forhindre dette.
    8. Mål fluorescensintensiteten i en mikropladelæser ved hjælp af de korrekte excitations- og emissionsbølgelængdeparametre for det anvendte fluorescerende lille molekyle. For Lucifer Yellow skal du bruge 428 nm excitation og 536 nm emission med optimal forstærkning. Fluorescens måles fra toppen af pladen. Tilføj pladen i pladelæseren, fremhæv hullerne med prøven (inklusive standardkurven), og vælg Start for at læse pladen.
  2. Beregning af permeabilitetsværdien (se skabelon i supplerende fil 1 )
    1. Træk den gennemsnitlige fluorescensintensitetsværdi for blindsubstratet fra alle målte fluorescensintensitetsværdier.
    2. Brug ligning (1) til at beregne systemets permeabilitet Ps:
      Equation 1(1)
      Hvor [A]A er koncentrationen af det fluorescerende lille molekyle opsamlet fra den nederste kanal, V er det volumen, der er udtaget prøver af og tilsat pladen (0,050 ml), [A]L er koncentrationen af det fluorescerende lille molekyle, der tilsættes til det øverste hul (f.eks. 0,15 mg/ml), t er inkubationstidspunktet (i s eller min afhængigt af de ønskede enheder), og S er membranens overfladeareal (0,014 cm2).
      1. [A]A beregnes ved hjælp af ligningen opnået ved at plotte en standardkurve ud fra fluorescensintensitetsoutputtene og de kendte koncentrationer af standardopløsningerne. Koncentrationerne (x) af forsøgsprøverne beregnes ved at indsætte deres fluorescensintensitetsværdier (y) i ligningen.
        BEMÆRK: Brug den del af standardkurven, der er lineær. Vi anbefaler at måle membranens overfladeareal ud fra et billede af membranen taget under mikroskopet, da membranarealet kan variere afhængigt af partinummeret og kan påvirke de beregnede permeabilitetsværdier betydeligt, hvis de afviger fra den coatede kontrol.
    3. Brug ligning (2) til at beregne permeabiliteten af cellemonolaget Pe:
      Equation 2(2)
      Hvor PS er systemets permeabilitet som beregnet i trin 4.2.2, og PC er systemgennemtrængelighedsværdien for den cellefrie, coatede kontrolanordning.

Representative Results

Samlingen af en nedgravningsanordning er vist i figur 1. Armaturerne styrer samlingen af komponenterne og membranchippen. Komponent 1 er primært akryl med en PSA-overflade til binding til chippen og en åbning til bundkammeret og porte til pipetadgang til bundkammeret. Komponent 2 er kanallaget og indeholder en ikke-klæbende, PSA-fri "trekant" øverst til højre til greb. Trench-down enheder giver et fladt cellekulturvækstområde i det øverste kammer, mens trench-up-enheder har en flad overflade til cellekultur i bundkammeret.

Vi udførte endotelmonokulturer og co-kulturer af hCMEC/D3 og HBVP'er og af hiPSC IMR90-4-afledte EECM-BMEC-lignende celler og BPLC'er og erhvervede fasebilleder ved hjælp af et Nikon Eclipse Ts2-fasekontrastmikroskop og 10x objektiv (figur 2). Optimale såtætheder for primær cellekultur vises (billeder taget 1 dag efter såning) såvel som underseedede HBVP'er (figur 2A). Endelige samkultur- og monokulturfasebilleder (6 dages endotelcellekultur) kan være vanskelige at skelne (figur 2C), og bekræftelse af vellykket primærcellesamkultur kan kræve immunfluorescensfarvning (se protokolafsnit 3). Lav, høj og optimal hiPSC-afledt BPLC-såtæthed er også illustreret (figur 2B). hiPSC-afledt cokultur er tydeligere at skelne i fasekontrastbilleddannelse sammenlignet med primære cokulturer (figur 2D). Lav BPLC-såning resulterer i dårlig pericytdækning og pericytklumpning, mens oversåning resulterer i, at pericytlaget skræller membranen af. Endvidere kan udskiftning af mediet i bundkammeret for hurtigt resultere i pericyttab, da disse celler er meget følsomme over for forskydning. Optimal dækning af pericytter er ~ 90% for en BBB-model uden huller i endotellaget.

Repræsentative billeder af immunfarvet hiPSC-afledt cokultur er illustreret i figur 3 (6 dages endotelcellekultur). IMR90-4-afledte BPLC'er blev farvet til pericytmarkøren PDGFRβ, og IMR90-4-afledte EECM-BMEC-lignende celler blev farvet til adhærensforbindelsesmarkøren VE-cadherin. Hoechst blev anvendt til at plette kernerne. Billeder blev erhvervet på et spinning disc konfokalmikroskop ved hjælp af et 40x LWD mål med 0,2 μm skiver og behandlet med Imaris. Begge cellelag kan visualiseres, selvom den tynde nanomembran ikke ses.

Vi udførte den prøveudtagningsbaserede analyse af små molekylers permeabilitet under anvendelse af de samme eksperimentelle betingelser i to fysisk fjerne laboratorier ved University of Bern, Schweiz, og University of Rochester, NY, USA for at demonstrere interlaboratorie reproducerbarhed af resultater (figur 4)34. hiPSC IMR90-4-afledte EECM-BMEC-lignende celler blev dyrket i μSiM-enheden i 2, 4 eller 6 dage og på transwellfiltre i 6 dage. Analysen blev udført med 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da) i begge laboratorier. Høj variabilitet i permeabiliteten af endotelcellerne dyrket i 2 dage i enheden indikerer, at 2 dages kultur var utilstrækkelig til barrieremodning. Der var ingen signifikante forskelle i permeabilitet mellem laboratorierne ved barrieremodning - fra 4 dage på. Vi viste også, at permeabiliteten af endotelcellerne dyrket i μSiM og transwellfiltre i 6 dage matchede de tidligere offentliggjorte40.

Figure 1
Figur 1: Trin i μSiM-samling . (A) Klargør chippen ved at placere den på armatur A1. Placer spångraven op for en sidste grøft-nedgravningsenhed. Placer spångraven ned for en sidste grøftningsanordning. (B) Fastgør komponent 1 til chippen ved at fjerne beskyttelsesmaskerne fra komponent 1 og placere den med forsiden nedad i FA1. Bind ved at påføre tryk med armatur A2. C) Fastgør komponent 2 og komponent 1 ved at fjerne komponent 2 fra arket og afskalle de øverste beskyttende lag. Placer kanalen op i armatur B1, og placer komponent 1 oven på komponent 2 med forsiden opad. Bind ved at påføre tryk med armatur B2. Forkortelser: FAn = armatur An; FBn = armatur Bn. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk oversigt over samkultur og repræsentative fasekontrastbilleder af cellekultur i enheder. (A) Placering af pericyt- og endotelcellesåning. (B) Set fra siden skematisk af celleplaceringer på tværs af membranchippens grøft. (C) Repræsentative billeder af lave og optimale såtætheder for primær HBVP og hCMEC/D3 hjerneendotelcellelinje. Billeder blev erhvervet 1 dag efter såning (HBVP) og 2 timer efter såning (hCMEC / D3). (D) Repræsentative billeder af lave, høje og optimale såtætheder for hiPSC-afledte hjernepericytlignende celler. Billeder blev erhvervet 1 dag efter såning. E) Repræsentative billeder af endelig HBVP- og hCMEC/D3-samkultur og hCMEC/D3-monokultur. Billeder blev erhvervet 8 dage efter HBVP-såning og 7 dage efter hCMEC/D3-såning. (F) Repræsentative billeder af mislykket og vellykket BPLC og EECM-BMEC-lignende cellesamkultur og EECM-BMEC-lignende cellemonokultur. Billeder blev erhvervet 7 dage efter BPLC-såning og 6 dage efter EECM-BMEC-såning. Underseedede BPLC-kulturer har ikke tilstrækkelig dækning, mens oversåning af BPLC-kulturer vil vokse oversammenflydende og begynde at klumpe / trække sig tilbage. Skalastænger = 100 μm (C-F). Forkortelser: HBVP'er = humane hjernevaskulære pericytter; hiPSC = humant induceret pluripotent stamcelle BPLC'er = hiPSC-afledte hjernepericytlignende celler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative billeder af immunfarvet hiPSC-afledt cellesamkultur i udstyr. Celler blev farvet for endotelcellemarkør VE-cadherin (grøn), pericytmarkør PDGFRβ (rød) og nuklear plet (blå). To lag af celler kan ses i umiddelbar nærhed, kun adskilt af en tynd siliciumnitridnanomembran (hvid pil markerer membranplacering på venstre billede). Skalabjælke = 50 μm. Forkortelser: hiPSC = humant induceret pluripotent stamcelle; PDGFRβ = trombocytafledt vækstfaktorreceptor beta. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Prøveudtagningsbaseret analyse af små molekylers permeabilitet. (A) Skematisk oversigt over den eksperimentelle arbejdsgang. (B) Demonstration af interlaboratoriereproducerbarhed mellem to fysisk fjerne laboratorier ved universitetet i Bern (UniBe), Schweiz, og University of Rochester (UR), NY, USA: hiPSC-afledte endotelceller blev dyrket i μSiM-enheden i 2, 4 eller 6 dage og i transwellfiltre i 6 dage. Permeabilitetsanalyse blev udført ved hjælp af 150 μg/ml Lucifer gul (457 Da). Den røde bjælke angiver de tidligere offentliggjorte natriumfluorescein (376 Da) permeabilitetsdata for de samme hiPSC-afledte endotelceller dyrket i 6 dage i transwellfiltre40. N = 4-16 pr. Gruppe. Tovejs ANOVA med Tukeys post hoc-test blev brugt, og sammenligninger blev kun vist for relevante p < 0,05. C) Påvisning af cytokinrespons ved anvendelse af hiPSC-afledte EECM-BMEC-lignende celler dyrket i μSiM i 2 dage; 0,1 ng/ml TNFα + 2 IE/ml IFNγ) eller mediekontrol (ikke-stimuleret, NS) blev tilsat til det øverste kammer i 20 timer før permeabilitetsanalyse ved hjælp af 150 μg/ml Lucifer Yellow. N = 3 pr. Gruppe. Elevens t-test, p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

Topkammersåningsoverfladeareal Top brøndvolumen Nederste kammer såoverfladeareal Nederste kanalvolumen
~37 mm2 100 μL (kan rumme ≥115 μL) ~42 mm2 10 μL (pipet 20 μL for at undgå bobler)

Tabel 1: Kritisk μSiM-overfladeareal og -volumen.

Mål Fiksativ Blokering af løsning Fortynding
VE-cadherin 4% PFA eller 100% MeOH 5% GS + 0,4% Tx-100 eller 10% GS + 0,3% Triton X-100 1:50
CD31 4% PFA eller 100% MeOH 5% GS + 0,3-0,4% Triton X-100 1:100
Claudin-5 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:200
ZO-1 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:200
Okklusion 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:50
PDGFRβ 4% PFA 5% GS + 0,4% Triton X-100 1:100
NG2 4% PFA 5% GS + 0,4% Triton X-100 1:100
Geder α-mus IgG Alexa Fluor 488 1:200
Geder α-mus IgG Alexa Fluor 568 1:200

Tabel 2: Antistoffer og farvningsmetoder valideret for co-kultur immuncytokemi i μSiM-udstyr. Forkortelser: PFA = paraformaldehyd; MeOH = methanol; GS = gedeserum.

Supplerende fil 1: Skabelon til beregning af permeabilitetsværdi. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Mens membranchips er designet til stabilitet, kan de revne eller gå i stykker, hvis de håndteres forkert under samlingen. Det er således vigtigt at gribe chippen i chippincethakene og forsigtigt placere den i armaturet. Ved håndtering af enhederne generelt skal der tages ekstra forholdsregler for ikke at støde eller tabe enhederne. Under limningen af membranchippen til armatur A1 skal chippen lægges fladt og centreret på søjlen i armatur A1 for at undgå membranrevner under limningen til komponent 1. Endvidere skal enhver kontakt med de udsatte PSA-lag undgås efter fjernelse af beskyttelsesmasker. Når du håndterer komponent 2 efter fjernelse af beskyttelsesmaskerne, anbefales det at holde den langs komponentens kant og bruge pincet til at få fat i trekanthjørnet, der er PSA-frit.

Mens cellekulturprotokoller blev beskrevet for mulige BBB-modeller, kan BMEC / pericyt-cokulturmodellen for BBB beskrevet her være tilstrækkelig eller utilstrækkelig afhængigt af den fysiologiske kontekst og spørgsmål af interesse. For eksempel forekommer immuncellehandel stort set i hjernens postkapillære venuler41,42. I disse regioner adskiller et perivaskulært rum BMEC / pericytbarrieren fra gliagrænserne etableret af astrocytter. I postkapillære venuler består den neurovaskulære enhed (NVU) således af to fysisk adskilte barrierer i serie, og astrocytiske endefødder kommer ikke direkte i kontakt med BMEC / pericytblodbarrieren, som er godt repræsenteret af den nuværende model. Hvis målet er en NVU-model, der tegner sig for virkningen af astrocytudskillede faktorer på blodbarrieren, kan der tilføjes et astrocytrum til enheden, der tillader opløselig faktorudveksling gennem det perivaskulære rum. Dette eksempel blev illustreret tidligere34 og kunne udvides til at omfatte andre celler såsom mikroglia og neuroner i et 3D 'hjerne' rum. Platformens modulære arkitektur gør det muligt at bruge enkle monteringsstrategier til at opnå disse omkonfigurationer, så platformen er så enkel eller kompleks som nødvendigt for at løse de foreliggende hypoteser. Hver cellekultur opsætning; skal dog optimeres til nye cellelinjer og multikulturer. På grund af siliciumnitridmembranernes egenskaber kan det f.eks. være nødvendigt at justere belægningsopløsningerne sammenlignet med vævskulturplader. Inkluderingen af fibronectin hjælper typisk med cellevedhæftning og overlevelse. Desuden kunne brugerne dyrke endotelceller og pericytter i modsatte retninger. I dette tilfælde kan det være nødvendigt at ændre for eksempel den måde, permeabilitetsmålingerne foretages og fortolkes på. At give skridt til denne type kultur ligger imidlertid uden for rammerne af dette papir.

En anden udfordring, man kan støde på under cellekultur, er den hurtige fordampning af medier, da enhederne kan være mere følsomme over for ændringer i miljøet sammenlignet med standard vævskulturplader og kolber. Hvis der ses overskydende fordampning, eller cellevæksten bremses, skal alle kritiske inkubatorparametre måles for at sikre nøjagtige indstillinger. Mere vand kan tilsættes til vævshætten eller lille petriskål, der er placeret inde i cellekulturkammeret, eller medier skal udskiftes oftere. Yderligere kan bobler komme ind i bundkanalen og sidde fast i grøften til grøft-down enheder. Mens de kan fjernes, er det nemmest at undgå at tilføje bobler i første omgang. For at gøre dette er det vigtigt at kontrollere, at der ikke er bobler i pipettespidsen eller luft i enden af pipettespidsen, før mediet pipetteres ind i det nederste kammer. Endvidere kan mediefordampning i kanalen føre til et mellemrum mellem medieoverfladen og porttoppen. En lille mængde medier kan pipetteres ind i en port, indtil mediet når overfladen af den modsatte port, hvorefter mediet kan udskiftes i den modsatte port. Mens hECSR og E6 + 10% FBS-medier ikke bør opvarmes i vandbadet, kan andre medier forvarmes for at reducere bobledannelse. Hvis en boble kommer ind i bundkammeret, kan den fjernes ved hurtigt at pipettere 100 μL gennem kanalen. Denne metode kan dog føre til forurening mellem kamre eller medier, der spildes over enhedens overflade. Det kan også forstyrre cellelag. Alternativt kan mediet først fjernes fra kanalen og derefter genindføres med et volumen på 50 μL. Fjernelse af mediet først kan dog resultere i mere bobledannelse i kanalen. Hvis en boble ikke er direkte under membranområdet, kan den efterlades i kanalen uden virkninger på cellekulturen.

Pericyttilknytning og vækst, som vist i figur 2, kan være udfordrende. Brug af en optimeret såtæthed er afgørende for dannelsen af et lag med et fysiologisk relevant pericyt-til-endotelcelleforhold. Da pericytterne er følsomme over for forskydning, skal alle medieudvekslinger i kanalen udføres meget langsomt for at beskytte cellerne. Til BPLC-kultur kan forbedret vedhæftning opnås ved at belægge bundkammeret med 800 μg / ml kollagen type IV eller 100 μg / ml fibronectin.

Immuncytokemi i udstyr beskrevet her muliggør kvalitativ analyse af cellesundhed og funktion. Metoder til farvning i vævskulturplader eller andre platforme skal kunne oversættes direkte til platformen. For cellekultur i kun det øverste kammer, efter fiksering, kan PBS tilsættes i det nederste kammer og efterlades i de resterende trin, med blokering og farvning kun udført i det øverste kammer. Dette minimerer risikoen for at bryde membranerne eller få bobler ind i bundkammeret. Til co-kulturfarvning anbefaler vi at bruge begge kamre i alle trin. Det er vigtigt at bemærke, at viskositeten af fikseringsmidlet og PBS er forskellig fra mediets. Det kan således være lettere at tilføje bobler i det nederste kammer, og man bør være ekstra omhyggelig med at kontrollere pipettespidserne for luft for enden af spidsen, inden pipetten pipetteres ind i bundkammeret.

Den beskrevne protokol for analysen af små molekylers permeabilitet muliggør funktionel og kvantitativ vurdering af barrierefunktionen af endotelcellerne dyrket i μSiM-indretningen. Et problem, der kan opstå under denne analyse, er at trække luftbobler ind i pipetten under prøveopsamling fra den nederste kanal ved protokoltrin 4.1.7.4. For at undgå dette problem er det vigtigt at sørge for, at spidsen er forseglet i porten, før prøveindsamlingen påbegyndes, og prøven bør ikke trækkes for hurtigt. Hvis det ikke løser problemet, kan størrelsen på de anvendte spidser være for lille eller for stor til at passe ind i portene; Brug de tips, der er anført i materialetabellen. Hvis der måles uventet høje permeabilitetsværdier på trods af et sundt udseende sammenflydende monolag, skal monolagets integritet kontrolleres for forstyrrelser under prøveindsamlingen. Vi anbefaler altid at kontrollere monolaget under mikroskopet umiddelbart efter prøveindsamling. Hvis monolaget stadig virker intakt og sundt, kan prøven fikseres, og biologiske markører for barrierefunktion kan vurderes, f.eks. via immunfarvning af forbindelsesproteinerne. Omvendt, hvis uventet lave permeabilitetsværdier måles, er det vigtigt at sikre, at 50 μL medier samples fra den nederste kanal uden luftbobler. Hvis substratet kommer ud fra prøveudtagningsporten, så snart reservoirspidsen er anbragt, skal dette medie opsamles, inden pipetten anbringes i prøveudtagningsporten, da det meste af det lille fluorescerende molekyle vil være til stede i det indledende volumen på 10 μL, der udtages prøver fra den nederste kanal. Tegning af cirkler rundt om portene ved hjælp af en hydrofob pen eller placering af et hydrofob bånd med et hul omkring porten forhindrer passivt pumpede medier i at sprede sig. Hvis boblerne trækkes ud under prøveudtagningen, eller den fulde prøve på 50 μL ikke fjernes, må prøven ikke anvendes. Alternativt kan det nøjagtige volumen bestemmes og anvendes i permeabilitetsberegningen; Dette bør dog kun gøres, hvis det fjernede volumen er ≥40 μL, hvilket svarer til ~98-99% farvestofgenvinding34.

Disclosures

J.L.M. er medstifter af SiMPore og har en aktieandel i virksomheden. SiMPore kommercialiserer ultratynde siliciumbaserede teknologier, herunder membranerne, der anvendes i denne undersøgelse.

Acknowledgments

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. og L.W. blev finansieret af NIH-tilskud R33 HL154249. J.L.M. blev finansieret af R44 GM137651. M.M. blev finansieret af Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. M.T. blev finansieret af RF1 AG079138. K.C. blev finansieret af International Foundation for Ethical Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
CD31 Polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific PA5-32321
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 Thermo Fisher Scientific 35-2500
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11011
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 Millipore  MAB2029
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 Thermo Fisher Scientific 33-1500
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 Cell Signaling Technology 3169
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 R&D Systems MAB9381
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal Thermo Fisher Scientific 40-2200
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
100% Methanol VWR 101443-718 Can be substituted with similar products
16% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Can be substituted with similar products
Accutase Thermo Fisher Scientific A1110501
Acetic acid Sigma-Aldrich 695092
B27 supplement Thermo Fischer Scientific 17504044
bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen IV from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL Can be substituted with similar products
DMEM/Ham’s F12 Thermo Fisher Scientific 11320033
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Essential 6 medium Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal bovine serum (FBS) Peak Serum PS-FB1
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Fibronectin human protein, plasma ThermoFisher Scientific 33016015 Can be substituted with similar products
hESFM Thermo Fisher Scientific 11111044
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich 861502
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 500627 Can be substituted with similar products
PBS without calcium, magnesium Cytiva SH30256.01 Can be substituted with similar products
Pericyte Medium ScienCell 1201 Use complete kit (includes supplements)
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL ScienCell 0413
Triton X-100 JT Baker X198-05 Can be substituted with similar products
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen™ 10977015 Can be substituted with similar products
Experimental models: Cell lines
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line Sigma-Aldrich SCC066
Human brain vascular pericytes ScienCell 1200
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells WiCell RRID:CVCL_C437
Glassware and Plasticware
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid Falcon 353025
Clamps VWR MFLX06832-10
Corning tissue culture plates (6-well) Corning 3506
Flat 96-well non-binding microplates Greiner Bio-One 655900
Microscope Slide Device Holder  SiMPore USIM-SB Dimensions compatible with micropscope slide holders
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339653 Tube caps can be filled with water for cell culture
P20-200 pipette tips VWR 76322-516 Alternate brands may not seal as effectively into ports
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) CoStar 3401
Instruments
10X Objective (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD00105 Air; WD: 4 mm; NA 0.45
10X Objective (For Nikon) Nikon Instruments Inc. MRP40102 Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25
40X Objective (LWD) (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD77410 Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15
Andor Spinning Disc Confocal microscope Oxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope Nikon Instruments Inc. Can be substituted with similar products
TECAN Infinite M200 TECAN Can be substituted with similar products
Other
Advanced PAP Pen Millipore Sigma Z672548 2 mm tip is recommended
Assembly kit with fixtures SiMPore USIM-JIGSET Including fixure A1, A2, B1, and B2
Camera Adapter for Microscopes AmScope CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR Φ23.2 - Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera Canon EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 Can be substituted with similar products
Cell strainer, 40 µm Millipore Sigma (Corning) CLS431750
Component 1 SiMPore USIM-C1
Component 2 SiMPore USIM-C2
Membrane chips SiMPore NPSN100-1L Other chips formats are available
SMD handling tweezer double angle Techni-Tool 758TW003 "Chip Tweezers"
Stainless steel precision type GG tweezer Techni-Tool 758TW534 "Straight Tweezers"
Software
Fiji ImageJ For image processing
Fusion Oxford Instruments, Andor Instructions for version 2.3.0.44
i-control TECAN Instructions for version 2.0
Imaris Oxford Instruments For image processing. Instructions for version 9.9.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405 (2019).
  2. Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
  3. Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson's disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813 (2011).
  4. Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451 (2022).
  5. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
  6. Ortiz, G. G., et al. Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis. Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).
  7. Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
  8. Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222 (2022).
  9. Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
  10. Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
  11. Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
  12. Abbott, N. J., et al. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).
  13. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  14. Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671 (2016).
  15. van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
  16. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  17. Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770 (2023).
  18. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685 (2021).
  19. Lea, T., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).
  20. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  21. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  22. Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
  23. Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880 (2021).
  24. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  25. Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
  26. Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
  27. DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
  28. Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750 (2020).
  29. Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111 (2019).
  30. Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
  31. Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
  32. Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
  33. Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
  34. McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804 (2022).
  35. Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802 (2022).
  36. Su, S. -H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030 (2023).
  37. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
  38. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  39. Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21 (2021).
  40. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  41. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  42. Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. What is the blood-brain barrier (not). Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).

Tags

Bioengineering nr. 203
Anvendelse af MicroSiM (μSiM) barrierevævsplatformen til modellering af blod-hjerne-barrieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCloskey, M. C., Kasap, P.,… More

McCloskey, M. C., Kasap, P., Trempel, M., Widom, L. P., Kuebel, J., Chen, K., Gaborski, T. R., Engelhardt, B., McGrath, J. L. Use of the MicroSiM (µSiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (203), e65258, doi:10.3791/65258 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter