Summary
Bu rapor, kan-beyin bariyeri modellerinin oluşturulması için μSiM platformunda montaj, hücre kültürü ve tahliller için protokoller sağlar.
Abstract
MikroSiM (μSiM), kan-beyin bariyerini (BBB) modellemek için membran bazlı bir kültür platformudur. Geleneksel membran tabanlı platformlardan farklı olarak μSiM , deneycilere canlı hücre görüntüleme, 'kan' ve 'beyin' odaları arasında engelsiz parakrin sinyalleme ve membranların çıkarılmasına/yeniden birleştirilmesine gerek kalmadan immünofloresanı doğrudan görüntüleme yeteneği dahil olmak üzere yeni yetenekler sağlar. Burada, ultra ince nano gözenekli silikon-nitrür membranlar kullanarak BBB'nin monokültür (endotel hücreleri) ve ko-kültür (endotel hücreleri ve perisitler) modellerini oluşturmak için platformun temel kullanımını gösteriyoruz. Hem primer hücre kültürleri hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kültürleri ile uyumluluk gösteriyoruz. İmmünofloresan boyama yoluyla BBB modellerinin kalitatif analizi için yöntemler sağlıyoruz ve küçük moleküllü geçirgenlik testinde bariyer fonksiyonunun kantitatif değerlendirmesi için μSiM'nin kullanımını gösteriyoruz. Sağlanan yöntemler, kullanıcıların platform üzerinde bariyer modellerini oluşturmalarını sağlamalı ve insan dokularını incelemek için doku çipi teknolojisinin kullanımını ilerletmelidir.
Introduction
Canlı dokular, bariyerler oluşturan ve koruyan ve hangi hücrelerin ve moleküllerin bir bölmeden diğerine taşınacağını düzenleyen özel hücreler tarafından bölümlere ayrılır. Bariyer fonksiyonlarının yanlış düzenlenmesi hem akut hastalıkların hem de kronik hastalıkların kaynağı olabilir. Kan-beyin bariyeri (BBB), insan vücudundaki en kısıtlayıcı doku bariyeridir1. BBB'nin işlev bozukluğu, Alzheimer hastalığı 2, Parkinson hastalığı3,4 ve multipl skleroz 5,6 dahil olmak üzere çok çeşitli merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıklarının temelini oluşturur. BBB'nin yaralanması, sepsis7, COVID-198 ve postoperatif deliryum9 gibi akut bozuklukların bir sonucu olarak uzun vadeli bilişsel bozuklukla da bağlantılıdır. Beyin bozukluklarını tedavi etme potansiyeline sahip ilaçların geliştirilmesi, beyindeki hedeflere biyoaktif moleküller iletmek için BBB'yi kasıtlı olarak ihlal etme zorluğu nedeniyle sinir bozucu derecede zor olmuştur10. Bu nedenlerden dolayı, BBB fonksiyonunu in vitro olarak inceleme yöntemleri, CNS hastalıklarının anlaşılması ve tedavisi için büyük önem taşımaktadır.
Bariyer fonksiyonunu in vitro ölçmek için temel yöntemler, yarı geçirgen bir membran üzerinde tek tabaka veya ko-kültürün oluşturulmasını ve hücrelerin küçük molekül difüzyonuna veya küçük elektrik akımlarına verdiği direncin ölçülmesini içerir11,12,13,14. Mikrofizyolojik sistemlerin (MPS) ortaya çıkışı, BBB'yi 3D olarak modellemek için çok sayıda seçenek üretmiş olsa da,15,16, sistem geometrilerinin çeşitliliği, MPS veya yerleşik literatür değerleri arasındaki geçirgenlik ölçümlerini karşılaştırmayı zorlaştırmaktadır. Güvenilir temel değerlerin oluşturulması, beyin vasküler endotel hücreleri tarafından kapsamlı bariyer regülasyonu nedeniyle, in vitro geçirgenlik değerlerinin yüksek oranda incelendiği BBB araştırmalarında özellikle önemlidir12,17,18. Bu nedenlerden dolayı, 2D membranlar üzerine kurulan tek tabakalar arasındaki geçirgenlik ölçümleri, önümüzdeki yıllarda BBB çalışmalarında temel bir unsur olmaya devam edecektir. Bu, in vitro modelleri doğrulamak ve karşılaştırmak için temel geçirgenliğin mutlak değerlerinin kullanıldığı epitel bariyerleri de dahil olmak üzere diğer doku bariyerleri için geçerlidir 19,20,21.
BBB araştırma topluluğu için değerli yeni bir araç oluşturmak amacıyla, son 5 yılda bariyer doku modellemesinde kullanılmak üzere silicon membran (μSiM) platformuna sahip mikro cihazı22 vegelişmiş 23,24,25,26'yı tanıttık. Platformun etkinleştirici özelliği, yüz milyonlarca nano gözenek27,28 veya nano gözenek ve mikro gözeneklerin 29 bir karışımı olan ultra ince (<100 nm kalınlığında) bir zardır. Serbest duran membran çipleri, ultra ince yapıları 30 stabilize eden ve cihaz montajı için cımbızla tutulmalarına izin veren300 μm'lik bir silikon 'çip' üzerinde üretilir. Ultra ince yapıları nedeniyle, membranlar, ticari membran kültürü cihazlarında kullanılan geleneksel rayla oyulmuş membranlardan iki kat daha yüksek bir geçirgenliğe sahiptir31,32. Pratikte bu, zarın nanogözeneklerden (<60 nm) daha küçük moleküllerin difüzyonuna engelinin ihmal edilebilir olduğu anlamına gelir33. Bu nedenle, hücresel bariyerler için, sadece hücreler ve biriktirdikleri matrisler, zar34 tarafından ayrılan apikalden bazal bölmelere küçük molekül taşıma hızını belirleyecektir. Cihaz tasarımı ve membranların ultra ince yapısı da optik mikroskopi için birçok avantaj sağlar. Bunlar arasında 1) faz kontrastı veya parlak alan görüntüleme kullanarak canlı kültürleri takip etme yeteneği, 2) membranı çıkarmaya ve bir kapak camına aktarmaya gerek kalmadan floresan olarak boyama ve yerinde görüntüleme yeteneği ve 3) membranların konfokal 'dilimlerden' daha ince olması, böylece doğrudan ko-kültürlerin hücre tipleri arasında 6-10 μm kalınlığında iz kazınmış membranlarla elde edilebilenden daha doğal bir boşluğa sahip olması.
Son zamanlarda, hızlı montajı 34 ve özelleştirmeyi 35,36 kolaylaştırmak için platformu modüler bir formata yükselttik. Cihaz bileşenlerini biyomühendislik ve işbirliği yapan beyin bariyeri laboratuvarlarımız arasında dağıtmak için modüler formattan yararlandık. Daha sonra cihaz montajı, monokültür ve ko-kültür, immünofloresan boyama ve küçük molekül geçirgenliği için ortaklaşa protokoller geliştirdik ve bu yöntemlerin laboratuvarlar arasında tekrarlanabilir olduğunu gösterdik. Bu protokolleri kullanarak, modüler platformun, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) beyin mikrovasküler benzeri endotel hücreleri (BMEC) oluşturmak için genişletilmiş endotel kültürü yöntemi (EECM) kullanılarak geliştirilen doğrulanmış bir BBB'yi desteklediğini de gösterdik37. Mevcut raporun amacı, bu yöntemleri daha ayrıntılı olarak gözden geçirmek ve beraberindeki videonun yardımıyla, platformun BBB topluluğunda daha geniş çapta benimsenmesini kolaylaştırmaktır.
Protocol
1. μSiM cihaz montajı
NOT: Bu yöntem, aygıtların montajını açıklar. Membran çipi, hendek yukarı veya hendek aşağı monte edilebilen bir hendek kenarına ve düz tarafa sahiptir. Hendek açma cihazları en yaygın olarak hücre kültürü için kullanılır.
- Steril bir ortamda (yani bir biyogüvenlik başlığı), montaj armatürleri, bileşenler, membran yongaları ve cımbız dahil olmak üzere tüm malzemeleri montaj için hazırlayın.
- Membran çipini, çip cımbızı kullanarak A1 fikstürünün ortasına yerleştirin. Çipin düz yüzeyi aşağı bakar ve hendek açma alanı hendek açma cihazları için yukarı bakar ve kanal açma cihazları için bunun tersi de geçerlidir.
NOT: Aşağıdaki montaj adımları, örnek olarak, üst bölmede düz bir büyüme alanına izin veren hendek açma cihazı kullanılarak gösterilmiştir. - Bileşen 1'i çipe yapıştırın. İlk olarak, düz cımbız kullanarak bileşen 1'in her iki tarafındaki mavi koruyucu katmanları soyun ve üst bölme aşağı gelecek şekilde A1 fikstürüne yerleştirin. Basınca duyarlı yapıştırıcı (PSA) çipe temas edene kadar bileşen 1'i hafifçe aşağı doğru bastırın.
- A2 fikstürünü A1 fikstürüne yerleştirin ve talaş ve bileşenin sıkıca oturmasını sağlamak için farklı köşelere sıkı bir basınç uygulayın.
NOT: PSA katmanını çıkarmadığınızdan emin olun. Mavi koruyucu katmanlara göre daha şeffaf ve sert bir katmandır. - Bileşen 2'yi çip ile bileşen 1'e bağlayın. İlk olarak, bileşen 2'nin bir köşesini düz cımbızla tutup tabakadan sıyırarak bileşen 2'yi hazırlayın. Ardından, bileşen 2'nin PSA olmayan "üçgen" bölgesini tutun ve birlikte PSA yüzeyini açığa çıkaran kalın, şeffaf koruyucu tabakayı ve bileşen 2'nin mavi tabakasını çıkarın. Bileşen 2'yi PSA tarafı yukarı bakacak şekilde B1 fikstürüne yerleştirin.
- Bileşen 1'i, membran çipi üst bölme yukarı bakacak şekilde B1 fikstürüne yerleştirin.
- B2 fikstürünü bileşen 1'e yerleştirin ve fikstür B2'nin farklı köşelerine sıkı bir basınç uygulayın.
- Monte edilmiş cihazı armatürden çıkarın ve cihazın alt tarafındaki hava kabarcıklarını bastırmak için düz cımbız kullanın ve membran bölgesi ile temastan kaçınarak kanalın kenarlarını kapatın. Hücre kültürü için kullanmadan önce, yeni monte edilen cihazları 20 dakika boyunca ultraviyole (UV) ile sterilize edin.
2. Hücre kültürü
NOT: Bu yöntem, platformdaki birincil ve hiPSC'den türetilen kültürler için protokolleri açıklar. Yöntemler, cihazın üst bölmesinde endotel hücre monokültürünü ve alt odacıkta perisitler ve hendek aşağı monte edilmiş cihazların üst odasında endotel hücreleri ile perisit ve endotel hücre ko-kültürünü tanımlar. Hazne boyutları ve hacimleri için Tablo 1'e bakınız. Bunlar en yaygın biçimlerdir; Bununla birlikte, kullanıcı ihtiyaçlarına bağlı olarak diğer hücre kültürü düzenleri kullanılabilir.
- Hücre kültürü odası hazırlığı
- Cihazları bölüm 1'de ayrıntıları verilen protokole göre monte edin.
- Cihazları steril hortum kelepçelerine yerleştirin. Hücre kültüründen önce, kelepçeleri ≥20 dakika etanolde bekleterek sterilize edin. Her deneyden sonra yeniden kullanım için yeniden sterilize edin.
- Cihazları büyük bir steril Petri kabında kültürleyin. Ekstra nem için, steril suyla doldurulmuş küçük bir Petri kabı veya 50 mL konik tüp kapağı ekleyin.
- Cihazların üst haznesini iki kez 100 μL steril su ile yıkayın. Alt hazne hücre kültürü için, alt hazneyi 20 μL steril su ile yıkayın.
- hCMEC/D3 hücre hattı (BBB) monokültürü
- Hücre kültürü odasını bölüm 2.1'e göre hazırlayın.
- Üst bölmeleri 25 μg / cm2 kollajen I ve 5 μg /cm2 fosfat tamponlu salin (PBS) içinde karıştırılmış insan fibronektini ile kaplayın. 37 °C'de 1-2 saat veya gece boyunca 4 °C'de bekletin.
- Kaplama solüsyonunu çıkarın ve üst hazneye 100 μL önceden ısıtılmış büyüme faktörü tükenmiş endotel ortamı (Test ortamı) ve alt hazneye 20 μL ekleyin. Test ortamını hazırlamak için 100 mL endotelyal bazal ortam + 400 μL insan fibroblastik büyüme faktörü + 40 μL hidrokortizon + 100 μL gentamisin sülfat + 2 mL fetal sığır serumu karıştırın.
- Üreticinin protokolüne göre hCMEC / D3 hücrelerinin geçişi; hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatörde 3-5 dakika boyunca tripsinize edin ve ardından önceden ısıtılmış endotelyal ortam ilavesiyle tripsinizasyonu durdurun. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Hücre peletini tahlil ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri üst bölmelerde 40.000-60.000 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın. Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için cihazları 37 °C'de %5 karbondioksit (CO 2) ile2-4 saat inkübe edin. Örneğin, 0.37 cm2 çip üzerinde 40.000 hücre/cm2 elde etmek için, üst hazneye 150.000 hücre/mL konsantrasyonda 100 μL hücre çözeltisi ekleyin.
NOT: Hudecz ve ark.38'e göre, hücre bakımı için endotelyal büyüme ortamı-2'nin (EGM-2) modifiye edilmiş bir formülasyonunu ve tahliller için alt kültürden sonra büyüme faktörü azaltılmış bir "tahlil ortamı" kullanarak hCMEC/D3'ü kültürledik ve pasajladık. Diğer medya formülasyonları cihazlarla uyumlu olmalıdır, ancak kullanıcılar hCMEC/D3 sağkalımı ile ilgili sorunlar yaşarsa Hudecz ve ark.38'in medya formülasyonlarını öneririz. - Hücre yapışması için 2-4 saat sonra, ölü veya bağlanmamış hücreleri çıkarmak için her iki odacıkta taze tahlil ortamı ile değiştirin.
- Cihazları %5 CO2 ile 37 °C'de tutun, deneye kadar her 2-3 günde bir her iki odadaki tahlil ortamını değiştirin. Tahliller tipik olarak 2 haftalık kültürden sonra gerçekleştirilir.
- hiPSC'den türetilen EECM-BMEC benzeri hücre monokültürü
- Hücre kültürü odasını bölüm 2.1'e göre hazırlayın.
- 1 mg / mL'lik bir çözelti oluşturmak için 5 mg kollajen IV'e 5 mL 0.5 mg / mL asetik asit ekleyerek insan plasenta çözeltisinden kollajen IV hazırlayın. Çözeltinin tamamen sulanması için 4 ° C'de ≥4 saat bekletin. Çözelti 4 °C'de 2 hafta stabildir.
- Üst bölmeleri 100 μL 4:1:5 oranında kollajen IV, sığır fibronektini ve steril su ile kaplayın. 37 °C'de 2-4 saat kaplayın.
- Kaplama solüsyonunu çıkarın ve üst hazneye 100 μL oda sıcaklığında hECSR ve alt hazneye 20 μL ekleyin.
- Nishihara ve ark.37'ye göre geçiş EECM-BMEC benzeri hücreler; hücrelere bir hücre ayırma enzim karışımı ekleyin ve 5-8 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre aktarın. Hücre çözeltisini tekilleştirmek için pipetleyin ve bir santrifüj tüpündeki endotel ortamının hacminin 4 katına ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin; hECSR'deki hücreleri yeniden süspanse edin ve üst odacıklarda 40.000 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın. Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için cihazları 37 °C'de %5CO2 ile 2-4 saat inkübe edin. Örneğin, 40.000 hücre/cm2 elde etmek için, 150.000 hücre/mL'de 100 μL'lik bir hücre çözeltisi ekleyin.
- Hücre yapışması için 2-4 saat sonra, ölü veya bağlanmamış hücreleri çıkarmak için her iki odacıkta taze hECSR ile değiştirin.
- Cihazları %5 CO 2 ile 37 °C'de tutun, deneye kadar her1-2 günde bir her iki bölmede hECSR değiştirin. Tahliller tipik olarak kültürün 6. gününde yapılır.
- hCMEC/D3 ve primer insan beyni vasküler perisit (HBVP) ko-kültürü
- Cihaz montajından önce, membran yongalarını PBS'de karıştırılmış 2 μg/cm2 poli-L-lizin (PLL) ile kaplayın. 50-80 μL PLL'yi bir damlacık halinde yalnızca son cihaz düzeneğinde aşağı bakacak tarafa uygulayın. Kaplama işlemini 37 °C'de 1-2 saat veya gece boyunca 4 °C'de tamamlayın.
- Kaplama çözeltisini çıkarın. Membran talaşlarını steril ultra saf suyla yıkayın ve kurumasını bekleyin.
- Cihazları, PLL kaplı tarafı aşağı bakacak şekilde yukarıdaki bölüm 1'de ayrıntıları verilen protokole göre monte edin ve hücre kültürü odasını bölüm 2.1'e göre hazırlayın.
- Üst bölmeleri bölüm 2.2.2'ye göre kaplayın.
- Üst bölmelere 50 μL önceden ısıtılmış perisit ortamı ekleyin ve alt kanallara 20 μL ekleyin.
- Geçiş HBVP'leri üreticinin protokolüne göre; Hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatörde 3-5 dakika boyunca tripnize edin, ardından önceden ısıtılmış perisit ortamı ekleyerek tripsinizasyonu durdurun. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Hücre peletini perisit ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri alt odacıklarda 14.000-25.000 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın. Cihazları ters çevirin, ancak gaz değişimini kolaylaştırmak için üst odacıklarla bir hava arayüzü sağlayın.
NOT: Ters çevirme sırasında gerekli olan hava arayüzü, cihazları hortum kelepçelerinin içine yerleştirdikten sonra çevirerek ve çevirmeden önce tüm köşeleri aşağı doğru iterek veya cihazları, üst bölmeleri engelsiz tutmak için yeterince aralıklı paralel akrilik veya silikon şeritler üzerine baş aşağı yerleştirerek elde edilebilir. Tohumlama yoğunluğunun her kullanıcı için optimize edilmesi gerekebilir. 14.000 hücre/cm2 elde etmek için, ~590.000 hücre/mL'de 20 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Kabarcıkları önlemek için alt hazneye 20 μL pipetlendiğini, ancak yoğunluğun 10 μL'lik alt hazne hacmi kullanılarak hesaplandığını unutmayın. - Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için hücreleri 37 ° C'de% 5 CO 2 ile ters pozisyonda2-4 saat inkübe edin.
- Hücre yapışması için 2-4 saat sonra, cihazları dik olarak çevirin ve ölü veya bağlanmamış hücreleri çıkarmak için her iki odacıkta taze perisit ortamı ile değiştirin.
- Perisit tohumlamadan sonra, 2.2.4-2.2.5 adımlarını izleyerek üst bölmede hCMEC/D3'leri tohumlayın. Her iki odayı da tahlil ortamına geçirin.
- Cihazları %5CO2 ile 37 °C'de tutun, deneye kadar her 1-2 günde bir her iki odada da test ortamı değiştirin. Birincil hücre ko-kültürü genellikle tahlillerden 6-8 gün önce korunur.
NOT: HBVP monokültürleri hCMEC/D3 monokültürleri veya hCMEC/D3 ve HBVP ko-kültürleri ile karşılaştırılacaksa, HBVP'lerin tohumlanmasından 2-3 gün sonra perisit ortamını test ortamı ile değiştirin.
- hiPSC'den türetilen EECM-BMEC benzeri hücre ve beyin perisit benzeri hücre (BPLC) ko-kültürü
- Hücre kültürü odasını bölüm 2.1'e göre hazırlayın ve üst bölmeleri 2.3.2-2.3.3 adımlarına göre kaplayın.
- Kaplama solüsyonunu çıkarın ve üst hazneye 50 μL oda sıcaklığında Essential 6 Medium + %10 Fetal Sığır Serumu (E6 + %10 FBS) ekleyin.
- BPLC'leri Gastfriend ve ark.39'a göre geçiş; hücrelere bir hücre ayırma enzim karışımı ekleyin ve hücrelerin ~%90'ı yuvarlanana kadar 5-15 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın. Hücreleri filtrelemek ve tamamen tekilleştirmek için 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde DMEM/F12 hacminin 4 katını tekilleştirmek ve eklemek için hücre çözeltisini pipetleyin. 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin, hücre peletini E6 +% 10 FBS'de yeniden süspanse edin ve alt odalardaki hücreleri 14.000-25.000 hücre /cm2 yoğunlukta tohumlayın. Cihazları ters çevirin, ancak gaz değişimini kolaylaştırmak için üst hazne ile bir hava arayüzü sağlayın.
NOT: Ters çevirme sırasında gerekli olan hava arayüzü, cihazları hortum kelepçelerinin içine yerleştirdikten sonra çevirerek ve çevirmeden önce tüm köşeleri aşağı doğru iterek veya cihazları, üst bölmeleri engelsiz tutmak için yeterince aralıklı paralel akrilik veya silikon şeritler üzerine baş aşağı yerleştirerek elde edilebilir. Tohumlama yoğunluğunun her kullanıcı için optimize edilmesi gerekebilir. 14.000 hücre/cm2 elde etmek için, ~590.000 hücre/mL'de 20 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Kabarcıkları önlemek için alt hazneye 20 μL pipetlendiğini, ancak yoğunluğun 10 μL'lik alt hazne hacmi kullanılarak hesaplandığını unutmayın. - Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için hücreleri 37 ° C'de% 5 CO 2 ile ters pozisyonda2-4 saat inkübe edin.
- Hücre yapışması için 2-4 saat sonra, cihazları dik konuma getirin ve ölü veya bağlanmamış hücreleri çıkarmak için her iki bölmede taze E6 +% 10 FBS ile değiştirin.
- Perisit tohumlamasından bir gün sonra, 2.3.5-2.3.6 adımlarını izleyerek üst odadaki EECM-BMEC benzeri hücreleri tohumlayın. Her iki odayı da hECSR'ye geçirin.
- Cihazları %5 CO 2 ile 37 °C'de tutun, deneye kadar her1-2 günde bir her iki odadaki test ortamını değiştirin. hiPSC'den türetilen ko-kültür, tahlillerden önce genellikle BPLC'ler için 7 gün ve EECM-BMEC benzeri hücreler için 6 gün boyunca korunur.
NOT: BPLC monokültürleri, EECM-BMEC monokültürleri veya EECM-BMEC ve BPLC ko-kültürleri ile karşılaştırılacaksa, BPLC'leri tohumladıktan 1 gün sonra E6 +% 10 FBS'yi hECSR ile değiştirin.
3. İmmünositokimya
NOT: Bu yöntem, zarın üst ve/veya alt tarafında kültürlenen hücrelerin immünositokimyasal boyanması ve görüntülenmesi için bir protokolü açıklar. Bu deneyin amacı, adherens ve sıkı bağlantı proteinleri ve hücre kimliği proteinleri gibi BBB'de bulunması gereken anahtar proteinlerin varlığını ve yerini belirlemektir. Alternatif ve canlı boyama yöntemleri de platformla uyumludur.
- Cihazlarda sabitleme ve boyama
- Birincil antikorları çözmek için buzun üzerine yerleştirin.
- Oda sıcaklığında %4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın (örneğin, %16 PFA'yı PBS hacminin 3 katı oranında seyreltin) veya -20 °C'de %100 metanolü soğutun.
- Tablo 2'ye göre uygun bir engelleme çözümü oluşturun. Buz üzerinde saklayın.
NOT: Triton X-100'ü tamamen çözmek için çözeltinin girdaplanması gerekebilir. - Alt hazneye 20 μL fiksatif (örneğin, PFA veya metanol) ve üst hazneye 50 μL pipetleyerek hücreleri sabitleyin. Cihazları oda sıcaklığında 10 dakika (PFA) veya 2 dakika (metanol) inkübe edin.
- Alt hazneye 20 μL PBS ve üst hazneye 100 μL pipetleyerek 3 x 5 dakika yıkayın.
- Alt hazneye 20 μL blokaj solüsyonu ve üst hazneye 50 μL bloke edici solüsyon ekleyerek oda sıcaklığında 30 dakika bloke edin. Alt haznede kabarcık olup olmadığını kontrol edin.
- Bloke edici solüsyondaki antikor(lar)ı Tablo 2'ye göre seyrelterek primer antikor solüsyonunu hazırlayın. Buz üzerinde saklayın.
- Alt bölmeye 20 μL birincil antikor çözeltisi ekleyerek ve üst bölmenin hacmini 50 μL birincil antikor çözeltisi ile değiştirerek birincil antikorlarla boyayın. Alt haznede kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Alt hazneye 20 μL PBS ve üst hazneye 100 μL pipetleyerek 3 x 5 dakika yıkayın.
- İkincil antikor solüsyonunu, bloke edici solüsyondaki antikor(lar)ı Tablo 2'ye göre seyrelterek hazırlayın. Işıktan korunan buz üzerinde saklayın.
- Alt bölmeye 20 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyerek ve üst bölmenin hacmini 50 μL ikincil antikor çözeltisi ile değiştirerek ikincil antikorlarla boyayın. Alt haznede kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Işıktan korunan oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Alt hazneye 20 μL PBS ve üst hazneye 100 μL pipetleyerek 3 x 5 dakika yıkayın.
- Nükleer leke çözeltisi yapın. Hoechst'i PBS'de 1:10.000 oranında seyreltin. Alt hazneye 20 μL nükleer leke çözeltisi ekleyin ve üst haznenin hacmini 50 μL nükleer leke çözeltisi ile değiştirin. Alt haznede kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Işıktan korunarak oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
- Alt hazneye 20 μL PBS ekleyerek ve üst haznenin hacmini 100 μL PBS ile değiştirerek lekeyi çıkarın. Cihazları hemen görüntüleyin veya 4 °C'de petri kabı parafilme sarılmış ve görüntülemeye hazır olana kadar ışıktan korunmuş olarak saklayın.
- Konfokal görüntüleme
NOT: Bu bölümde, uzun çalışma mesafesi (LWD) 40x objektif (su, WD 590-610, sayısal açıklık 1.15) ile ters çevrilmiş dönen diskli konfokal mikroskop kullanılarak cihazların görüntülenmesi açıklanmaktadır.ample. Çalışma mesafeleri ve lens uyumluluğu için McCloskey ve ark.34'teki ek materyale bakın. 40x görüntülerin tüm alanı temsil etmesini sağlamak için tüm membran alanının görüntüleri de 10x objektif kullanılarak alınır. Bunlar genellikle geniş alanda alınır.- Mikroskobu açın ve görüntüleme yazılımını açın.
- Konfokal Görüntüleme Modunu kullanarak kanalları ikincil antikorun ve nükleer lekenin özelliklerine göre ayarlayın. Sinyalin arka planın üzerinde olmasını sağlamak ve görüntüleme artefaktlarını azaltmak için lazer gücünü ve pozlama süresini optimize edin.
- Hoechst nükleer boyama için uyarma 405, emisyon 450/50 Bant Geçiren (BP), 500 ms maruz kalma süresi, %50 lazer gücü kullanın. Alexa Fluor (AF) 488'e konjuge edilmiş ikincil bir antikor kullanan etiketler için uyarma 488, emisyon 525/50BP, 500 ms pozlama süresi ve %50 lazer gücü kullanın. AF568'e konjuge edilmiş ikincil bir antikor kullanan etiketler için uyarma 561, emisyon 600/50BP, 500 ms maruz kalma süresi ve %100 lazer gücü kullanın.
- Cihazı, üst haznesi yukarı bakacak şekilde mikroskop slayt cihazı tutucusuna yerleştirin ve bir mikroskop slayt tutucusu kullanarak mikroskoba yerleştirin. Canlı'yı açın ve nükleer leke için kanalı seçin. Işık mavi, katı silikon bölgeden geçmeyeceğinden, şeffaf silikon-nitrür membran bölgesinin ortalandığından emin olarak düşük bir objektif kullanarak membranı bulun. Cihaz düzgün bir şekilde ortalandığında ve hücre katmanı bulunduğunda, 40x objektife geçin, objektifi ıslatın ve nükleer lekeyi kılavuz olarak kullanarak zar bölgesine odaklanın.
- z-stack görüntülemeyi açın ve Tarama Modu'nu Başlat/Bitir olarak ayarlayın. Adım boyutunu veya sayısını ayarlayın. Mikroskop üzerindeki kaba ayar düğmesini kullanarak, nükleer lekeyi kılavuz olarak kullanarak tarama başlangıcını endotel hücre tabakasının üstüne ayarlayın ve nükleer lekeyi kılavuz olarak kullanarak perisit tabakasının altındaki tarama ucunu ayarlayın. Görüntüleme alanında her şeyin yakalanacağından emin olmak için tüm kanalları kontrol edin.
NOT: Genellikle ~0,2 μm'lik dilimler olan otomatik adım kullanırız. - Görüntü Adını ayarlayın ve görüntülemeyi başlatmak için Al'a basın. Gerektiğinde farklı bölgelerde tekrarlayın.
- Konfokal görüntüleri ImageJ40 veya Imis kullanarak işleyin.
- Imaris'te işlemek için, görüntü dosyasını açmak için programa sürükleyin. x-y düzleminin 2B görüntüsünü x-z ve y-z düzlemlerinin karşılık gelen görünümleriyle birlikte görmek için üst menü çubuğunda Bölüm'ü seçin. Bir 3D görüntü görmek için üst menü çubuğunda 3D Görünüm'ü seçin. Resme tıklayın ve döndürmek için sürükleyin. seçmek Anlık görüntü çekmek için üst menü çubuğunda Enstantane .
4. Küçük molekül geçirgenliğinin örnekleme deneyi
NOT: Bu bölüm, hücre kültürlerinin bariyer özelliklerinin kantitatif ölçümleri için bir metodolojiyi açıklar. Bu deneyin amacı, hücre katmanlarından geçen ve platformun alt odasına giren küçük bir floresan molekülün konsantrasyonunu tespit etmektir. Bu veriler daha sonra hücresel geçirgenliği hesaplamak için kullanılır.
- Örnekleme tekniği
- Cihazları bölüm 1'de ayrıntıları verilen protokole göre birleştirin ve bölüm 2'de açıklandığı gibi istenen hücre hatlarını kültürleyin. Sistem geçirgenliğini ölçmek için hücresiz, kaplamalı bir kontrol cihazı olarak hizmet verecek ek bir cihaz ekleyin.
NOT: Koşul başına en az üç teknik kopya önerilir; ancak, kaplanmış kontrolün yalnızca bir kopyası gereklidir. - Numune alma tahliline başlamadan önce, alt haznedeki besiyerini taze besiyeri ile değiştirin. Mikroskop altında her cihazdaki endotelyal tek tabakanın birleşimini kontrol edin. Hücre tek katmanlarındaki boşluklara dikkat edin, çünkü bu, boyanın alt hazneye difüzyonunu etkileyecektir.
NOT: Sağlıklı bir endotel kültürü %100 birleşik olmalıdır. - Floresan küçük moleküllü çözeltiyi hazırlayın (örneğin, 150 μg / mL Lucifer Yellow, 457 Da) hücre kültürü ortamında. Alt kanaldan örneklenen floresan küçük molekülün konsantrasyonunu hesaplamak için referans görevi gören standart çözeltilerin hazırlanmasında kullanılacak floresan küçük moleküllü çözeltinin fazla hacmini hazırlayın.
NOT: En yüksek floresan küçük molekül konsantrasyonuna sahip standart çözelti olarak kullanılmak üzere 400 μL fazla çözeltinin hazırlanmasını öneririz. - Üst kuyudaki ortamı 100 μL floresan küçük moleküllü çözelti ile değiştirin.
NOT: Örnekleme portlarının etrafına daireler çizmek için hidrofobik bir kalem kullanmanızı ve floresan boya çözeltisi eklenmeden önce hidrofobik mürekkebin tamamen kurumasını beklemenizi öneririz. Bu, ortamın alt kanaldan adım 4.1.7'de örnekleme portu etrafında yayılmasını önler. Floresan küçük moleküllü çözeltinin eklenmesini bir sonraki cihaza eklemeden önce 2 dakika bekleyin veya 3'lü gruplar halinde çalışın (çözeltiyi aynı anda üç cihaza ekleyin ve sonraki üç cihazı eklemek için 5 dakika bekleyin). - Cihazları 37 °C'de, %5CO2'de 1 saat inkübe edin.
- Bir önceki adımda 1 saat uzunluğunda inkübasyon sırasında, adım 4.1.3'te hazırlanan floresan küçük moleküllü çözeltiden 2 kat seri seyreltme gerçekleştirerek standart çözeltiler hazırlayın. Her çözeltiden 50 μL'yi düz tabanlı siyah 96 oyuklu plakaya üç kopya halinde pipetleyin. Temel standart çözüm olarak boş hücre kültürü ortamını kullanın.
NOT: Standart çözeltiler hazırlamak için, 200 μL'lik bir nihai hacimde 11 seri seyreltme ve temel floresan yoğunluğunu ölçmek için boş olarak hücre kültürü ortamının kullanılmasını öneririz.- Adım 4.1.3'te hazırlanan fazla floresan küçük moleküllü çözeltinin 200 μL'lik 400 μL'sini 200 μL ortam içeren bir tüpe aktarın, iyice karıştırın ve bu çözeltinin 200 μL'sini 200 μL ortam içeren bir sonraki tüpe aktarın. Toplam 10 tüp olana kadar 1:2 seyreltmeyi tekrarlayın. En konsantre standart çözeltinin 50 μL'sini 96 oyuklu plakada (B1, C1, D1), 2. en konsantre çözeltiyi sütun 2'ye (B2, C2, D2) vb. üç kopyalar halinde sütun 1'e pipetleyin. Plakadaki 12. sütun için , üç kopya halinde 50 μL boş ortam pipetleyin (B12, C12, D12).
- Floresan küçük moleküllü çözeltiyi alt kanaldan örneklemek için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Difüzyon işlemini durdurmak için floresan küçük moleküllü çözeltiyi kuyudan çıkarın.
- 50 μL'lik ucu porta sokarak, cihazı kaldırarak ve stabilizasyon için üstte tutarken ucu hafifçe çıkararak rezervuar görevi görmesi için 50 μL ortam içeren bir ucu üst porta yerleştirin. Cihazı yere koyun. Örnekleme sırasında alt hazneye kabarcık girmesini önlemek için pipet ucunda kabarcık veya pipetin ucunda hava olmadığından emin olun.
- Örnekleme sırasında hücre tek tabakasının bozulmasını önlemek için üst kuyucuğa 50 μL ortam ekleyin.
- Çözeltiyi alt kanaldan örneklemek için, boş pipet ucu olan bir pipetleyiciyi ilk direncine itin, ucu örnekleme portuna yerleştirin ve alt kanaldan çözeltinin 50 μL'sini ters pipetleyin. Standart çözeltileri içeren düz tabanlı siyah 96 oyuklu plakaya doğrudan aktarın.
NOT: Örneklemeden hemen sonra hücre tek tabakasını mikroskop altında kontrol etmenizi öneririz. Alt kanaldan ortam çekmek, bazen üst kuyudaki hücre katmanının bozulmasına neden olabilir ve bu da tutarsız geçirgenlik ölçümlerine neden olabilir. 4.1.7'deki adımlar boyunca hızlı bir şekilde çalışmak bunu önlemeye yardımcı olacaktır.
- Kullanılan floresan küçük molekül için uygun uyarma ve emisyon dalga boyu parametrelerini kullanarak bir mikroplaka okuyucudaki floresan yoğunluğunu ölçün. Lucifer Yellow için, optimum kazançla 428 nm uyarma ve 536 nm emisyon kullanın. Floresan, plakanın üst kısmından ölçülür. Plakayı plaka okuyucuya ekleyin, numune içeren kuyucukları vurgulayın (standart eğri dahil) ve plakayı okumak için Başlat'ı seçin.
- Cihazları bölüm 1'de ayrıntıları verilen protokole göre birleştirin ve bölüm 2'de açıklandığı gibi istenen hücre hatlarını kültürleyin. Sistem geçirgenliğini ölçmek için hücresiz, kaplamalı bir kontrol cihazı olarak hizmet verecek ek bir cihaz ekleyin.
- Geçirgenlik değerinin hesaplanması (şablon için Ek Dosya 1'e bakın)
- Boş ortamın ortalama floresan yoğunluğu değerini, ölçülen tüm floresan yoğunluğu değerlerinden çıkarın.
- Sistem geçirgenliğini hesaplamak için denklem (1)'i kullanın Ps:
(1)
[A ]A, alt kanaldan toplanan floresan küçük molekülün konsantrasyonudur, V, örneklenen ve plakaya eklenen hacimdir (0.050 mL), [A]L , üst kuyucuğa eklenen floresan küçük molekülün konsantrasyonudur (örn. 0.15 mg/mL), t inkübasyon süresidir (istenen birimlere bağlı olarak s veya dak cinsinden), ve S , membran yüzey alanıdır (0.014cm2).- Floresan yoğunluğu çıkışlarından ve standart çözeltilerin bilinen konsantrasyonlarından standart bir eğri çizerek elde edilen denklemi kullanarak [A]A'yı hesaplayın. Floresan yoğunluk değerlerini (y) denkleme ekleyerek deneysel numunelerin konsantrasyonlarını (x) hesaplayın.
NOT: Standart eğrinin doğrusal olan kısmını kullanın. Membran alanı lot numarasına bağlı olarak değişebileceğinden ve kaplanmış kontrolden farklıysa hesaplanan geçirgenlik değerlerini önemli ölçüde etkileyebileceğinden, membran yüzey alanının mikroskop altında alınan bir membran görüntüsünden ölçülmesini öneririz.
- Floresan yoğunluğu çıkışlarından ve standart çözeltilerin bilinen konsantrasyonlarından standart bir eğri çizerek elde edilen denklemi kullanarak [A]A'yı hesaplayın. Floresan yoğunluk değerlerini (y) denkleme ekleyerek deneysel numunelerin konsantrasyonlarını (x) hesaplayın.
- Hücre tek tabakası Pe'nin geçirgenliğini hesaplamak için denklemi (2) kullanın:
(2)
BuradaPS, adım 4.2.2'de hesaplanan sistem geçirgenliğidir ve PC , hücresiz, kaplanmış kontrol cihazının sistem geçirgenlik değeridir.
(1)
(2)Representative Results
Bir hendek açma cihazının montajı Şekil 1'de gösterilmektedir. Fikstürler, bileşenlerin ve membran çipinin montajına rehberlik eder. Bileşen 1, çipe yapıştırmak için bir PSA yüzeyi ve alt bölmeye bir açıklık ve alt bölmeye pipet erişimi için bağlantı noktaları ile esas olarak akriliktir. Bileşen 2, kanal katmanıdır ve kavrama için sağ üstte yapışkan olmayan, PSA içermeyen bir "üçgen" içerir. Hendek açma cihazları, üst bölmede düz bir hücre kültürü büyüme alanı sağlarken, açma cihazları, alt bölmede hücre kültürü için düz bir yüzeye sahiptir.
Nikon Eclipse Ts2 faz kontrast mikroskobu ve 10x objektif kullanarak hCMEC/D3 ve HBVP'lerin ve hiPSC IMR90-4'ten türetilen EECM-BMEC benzeri hücrelerin ve BPLC'lerin endotelyal monokültürleri ve ko-kültürleri gerçekleştirdik ve faz görüntüleri elde ettik (Şekil 2). Birincil hücre kültürü için en uygun tohumlama yoğunlukları (tohumlamadan 1 gün sonra alınan görüntüler) ve ayrıca tohumlanmış HBVP'ler gösterilmiştir (Şekil 2A). Nihai kokültür ve monokültür faz görüntülerinin (6 günlük endotel hücre kültürü) ayırt edilmesi zor olabilir (Şekil 2C) ve başarılı primer hücre ko-kültürünün doğrulanması immünofloresan boyama gerektirebilir (bkz. protokol bölüm 3). Düşük, yüksek ve optimal hiPSC'den türetilen BPLC tohumlama yoğunlukları da gösterilmektedir (Şekil 2B). hiPSC'den türetilen ko-kültür, primer ko-kültürlere kıyasla faz kontrast görüntülemede ayırt etmek için daha açıktır (Şekil 2D). Düşük BPLC tohumlama, zayıf perisit örtüsü ve perisit kümelenmesine neden olurken, aşırı tohumlama, perisit tabakasının zardan soyulmasına neden olur. Ayrıca, alt odadaki ortamın çok hızlı bir şekilde değiştirilmesi, bu hücreler kaymaya karşı çok hassas olduklarından perisit kaybına neden olabilir. Perisitler tarafından optimal kapsama alanı, endotel tabakasında boşluk olmayan bir BBB modeli için ~%90'dır.
İmmün boyanmış hiPSC'den türetilmiş ko-kültürün temsili görüntüleri Şekil 3'te gösterilmektedir (6 günlük endotel hücre kültürü). IMR90-4'ten türetilen BPLC'ler, perisit belirteci PDGFRβ için boyandı ve IMR90-4'ten türetilen EECM-BMEC benzeri hücreler, adherens bağlantı belirteci VE-kaderin için boyandı. Hoechst, çekirdekleri boyamak için kullanıldı. Görüntüler, 0.2 μm'lik dilimlerle 40x LWD objektif kullanılarak bir Spinning Disc konfokal mikroskopta elde edildi ve Imaris ile işlendi. İnce nanomembran görülmese bile her iki hücre katmanı da görselleştirilebilir.
Sonuçların laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliğini göstermek için İsviçre'deki Bern Üniversitesi ve ABD'deki Rochester Üniversitesi'ndeki fiziksel olarak uzak iki laboratuvarda aynı deneysel koşulları kullanarak örneklemeye dayalı küçük molekül geçirgenlik testini gerçekleştirdik (Şekil 4)34. hiPSC IMR90-4'ten türetilen EECM-BMEC benzeri hücreler μSiM cihazında 2, 4 veya 6 gün ve transwell filtrelerinde 6 gün kültürlendi. Test, her iki laboratuvarda da 150 μg/mL Lucifer Yellow (457 Da) kullanılarak gerçekleştirildi. Cihazda 2 gün boyunca kültüre edilen endotel hücrelerinin geçirgenliğindeki yüksek değişkenlik, 2 günlük kültürün bariyer maturasyonu için yetersiz olduğunu göstermektedir. Bariyer olgunlaşması üzerine laboratuvarlar arasında 4 günden itibaren geçirgenlik açısından önemli bir fark yoktu. Ayrıca, μSiM ve transwell filtrelerinde 6 gün boyunca kültürlenen endotel hücrelerinin geçirgenliğinin daha önce yayınlanan40 ile eşleştiğini gösterdik.
Şekil 1: μSiM montaj adımları . (A) Çipi A1 fikstürüne yerleştirerek hazırlayın. Son bir hendek açma cihazı için talaş hendeğini yukarı yerleştirin. Son bir hendek açma cihazı için talaş hendeğini aşağı yerleştirin. (B) Koruyucu maskeleri bileşen 1'den çıkararak ve yüzü aşağı bakacak şekilde FA1'e yerleştirerek bileşen 1'i çipe yapıştırın. A2 fikstürü ile basınç uygulayarak yapıştırın. (C) Bileşen 2'yi ve bileşen 1'i, bileşen 2'yi tabakasından çıkararak ve üst koruyucu katmanları soyarak yapıştırın. Kanalı B1 fikstürüne yerleştirin ve bileşen 1'i yüzü yukarı bakacak şekilde bileşen 2'nin üzerine yerleştirin. B2 fikstürü ile basınç uygulayarak yapıştırın. Kısaltmalar: FAn = fikstür An; FBn = fikstür Bn. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cihazlarda hücre kültürünün kokültür şeması ve temsili faz kontrast görüntüleri. (A) Perisit ve endotel hücre tohumlamasının yeri. (B) Membran çipinin hendeği boyunca hücre konumlarının yandan görünüm şeması. (C) Primer HBVP ve hCMEC/D3 beyin endotel hücre hattı için düşük ve optimal tohumlama yoğunluklarının temsili görüntüleri. Görüntüler tohumlamadan 1 gün sonra (HBVP) ve tohumlamadan 2 saat sonra (hCMEC/D3) elde edildi. (D) HiPSC'den türetilen beyin perisit benzeri hücreler için düşük, yüksek ve optimal tohumlama yoğunluklarının temsili görüntüleri. Görüntüler tohumlamadan 1 gün sonra elde edildi. (E) Nihai HBVP ve hCMEC/D3 ko-kültürü ve hCMEC/D3 monokültürünün temsili görüntüleri. Görüntüler, HBVP tohumlamasından 8 gün sonra ve hCMEC/D3 tohumlamasından 7 gün sonra elde edildi. (F) Başarısız ve başarılı BPLC ve EECM-BMEC benzeri hücre ko-kültürü ve EECM-BMEC benzeri hücre monokültürünün temsili görüntüleri. Görüntüler, BPLC tohumlamasından 7 gün sonra ve EECM-BMEC tohumlamasından 6 gün sonra elde edildi. Yetersiz tohumlanmış BPLC kültürleri yeterli kapsama alanına sahip olamazken, aşırı tohumlanmış BPLC kültürleri aşırı birleşecek ve topaklanmaya/gerilemeye başlayacaktır. Ölçek çubukları = 100 μm (C-F). Kısaltmalar: HBVP'ler = insan beyni vasküler perisitleri; hiPSC = insan kaynaklı pluripotent kök hücre; BPLC'ler = hiPSC'den türetilen beyin perisit benzeri hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Cihazlarda immüno-boyanmış hiPSC'den türetilmiş hücre ko-kültürünün temsili görüntüleri. Hücreler endotel hücre markörü VE-kaderin (yeşil), perisit markörü PDGFRβ (kırmızı) ve nükleer boya (mavi) için boyandı. Sadece ince bir silikon-nitrür nanomembran ile ayrılmış iki hücre tabakası yakın mesafede görülebilir (beyaz ok, soldaki resimde membran konumunu gösterir). Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: hiPSC = insan kaynaklı pluripotent kök hücre; PDGFRβ = trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü beta. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Örnekleme tabanlı küçük molekül geçirgenlik deneyi . (A) Deneysel iş akışının şeması. (B) İsviçre'deki Bern Üniversitesi (UniBe) ve Rochester Üniversitesi'ndeki (UR), NY, ABD'deki fiziksel olarak uzak iki laboratuvar arasındaki laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliğin gösterilmesi: hiPSC'den türetilen endotel hücreleri, μSiM cihazında 2, 4 veya 6 gün boyunca ve transwell filtrelerinde 6 gün boyunca kültürlendi. Geçirgenlik testi 150 μg/mL Lucifer Yellow (457 Da) kullanılarak yapıldı. Kırmızı çubuk, transwell filtrelerinde40 gün boyunca kültürlenen aynı hiPSC'den türetilmiş endotel hücrelerinin daha önce yayınlanmış sodyum floresein (376 Da) geçirgenlik verilerini gösterir. N = grup başına 4-16. Tukey'in post hoc testi ile iki yönlü ANOVA kullanıldı ve karşılaştırmalar sadece ilgili p < 0.05 için görüntülendi. (C) 2 gün boyunca μSiM'de kültürlenen hiPSC'den türetilmiş EECM-BMEC benzeri hücreler kullanılarak sitokin yanıtının gösterilmesi; 0.1 ng / mL TNFa + 2 IU / mL IFNγ) veya ortam kontrolü (uyarılmamış, NS), 150 μg / mL Lucifer Yellow kullanılarak geçirgenlik testinden önce 20 saat boyunca üst odaya eklendi. Grup başına N = 3. Öğrenci t-testi, p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Üst Hazne Tohumlama Yüzey Alanı | En İyi Kuyu Hacmi | Alt Hazne Tohumlama Yüzey Alanı | Alt Kanal Hacmi |
| ~37 mm2 | 100 μL (≥115 μL tutabilir) | ~42 mm2 | 10 μL (kabarcıkları önlemek için pipet 20 μL) |
Tablo 1: Kritik μSiM yüzey alanı ve hacimleri.
| Hedef | Sabitleyici | Engelleme Çözümü | Seyreltme |
| VE-cadherin | %4 PFA veya %100 MeOH | %5 GS + %0.4 Tx-100 veya %10 GS + %0.3 Triton X-100 | 1:50 |
| CD31 Serisi | %4 PFA veya %100 MeOH | % 5 GS +% 0.3-0.4 Triton X-100 | 1:100 |
| Claudin-5 | %100 MeOH | % 5-10 GS +% 0.3 Triton X-100 | 1:200 |
| ZO-1 (İngilizce) | %100 MeOH | % 5-10 GS +% 0.3 Triton X-100 | 1:200 |
| Oklüdin | %100 MeOH | % 5-10 GS +% 0.3 Triton X-100 | 1:50 |
| PDGFRβ | %4 PFA | %5 GS + %0.4 Triton X-100 | 1:100 |
| NG2 | %4 PFA | %5 GS + %0.4 Triton X-100 | 1:100 |
| Keçi α-Fare IgG Alexa Fluor 488 | 1:200 | ||
| Keçi α-Fare IgG Alexa Fluor 568 | 1:200 |
Tablo 2: μSiM cihazlarında ko-kültür immünositokimyası için doğrulanmış antikorlar ve boyama yöntemleri. Kısaltmalar: PFA = paraformaldehit; MeOH = metanol; GS = keçi serumu.
Ek Dosya 1: Geçirgenlik değerinin hesaplanması için şablon. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Membran yongaları stabilite için tasarlanmış olsa da, montaj sırasında yanlış kullanılırsa çatlayabilir veya kırılabilir. Bu nedenle, çipi çip cımbız çentiklerinde kavramak ve yavaşça fikstüre yerleştirmek çok önemlidir. Cihazları genel olarak tutarken, cihazlara çarpmamak veya düşürmemek için ekstra önlem alınmalıdır. Membran çipinin A1 fikstürüne bağlanması sırasında, bileşen 1'e bağlanma sırasında membran çatlamasını önlemek için çip düz bir şekilde yerleştirilmeli ve fikstür A1'in direğine ortalanmalıdır. Ayrıca, koruyucu maskeler çıkarıldıktan sonra açıkta kalan PSA katmanlarıyla herhangi bir temastan kaçınılmalıdır. Koruyucu maskelerin çıkarılmasının ardından bileşen 2'yi tutarken, bileşenin kenarı boyunca tutmanız ve PSA içermeyen üçgen köşeyi tutmak için cımbız kullanmanız önerilir.
Olası BBB modelleri için hücre kültürü protokolleri tanımlanmış olsa da, burada açıklanan BBB'nin BMEC/perisit ko-kültür modeli, fizyolojik bağlama ve ilgilenilen sorulara bağlı olarak yeterli veya yetersiz olabilir. Örneğin, bağışıklık hücresi kaçakçılığı büyük ölçüde beynin postkapiller venüllerinde meydana gelir41,42. Bu bölgelerde, bir perivasküler boşluk, BMEC / perisit bariyerini astrositler tarafından oluşturulan glial limitanslardan ayırır. Bu nedenle, postkapiller venüllerde, nörovasküler ünite (NVU) seri olarak fiziksel olarak ayrılmış iki bariyer içerir ve astrositik uç ayaklar, mevcut model tarafından iyi temsil edilen BMEC / perisit kan bariyerine doğrudan temas etmez. Amaç, astrosit tarafından salgılanan faktörlerin kan bariyeri üzerindeki etkisini açıklayan bir NVU modeli ise, cihaza perivasküler boşluktan çözünür faktör değişimine izin veren bir astrosit bölmesi eklenebilir. Bu örnek daha önce 34 gösterilmişti ve bir3D 'beyin' bölmesindeki mikroglia ve nöronlar gibi diğer hücreleri içerecek şekilde genişletilebilir. Platformun modüler mimarisi, bu yeniden yapılandırmaları gerçekleştirmek için basit montaj stratejilerinin kullanılmasını sağlar, böylece platform eldeki hipotezleri ele almak için gerektiği kadar basit veya karmaşık olur. Her hücre kültürü kurulumu; ancak, yeni hücre hatları ve çoklu kültürler için optimize edilmelidir. Örneğin, silikon-nitrür membranların özellikleri nedeniyle, doku kültürü plakalarına kıyasla kaplama çözeltilerinin ayarlanması gerekebilir. Fibronektinin dahil edilmesi tipik olarak hücre bağlanmasına ve hayatta kalmasına yardımcı olur. Ayrıca, kullanıcılar endotel hücrelerini ve perisitleri zıt yönlerde kültürleyebilirler. Bu durumda, örneğin geçirgenlik ölçümlerinin yapılma ve yorumlanma şeklini değiştirmek gerekebilir. Bununla birlikte, bu tür bir kültür için adımlar sağlamak bu makalenin kapsamı dışındadır.
Hücre kültürü sırasında karşılaşılabilecek bir diğer zorluk, ortamın hızlı buharlaşmasıdır, çünkü cihazlar standart doku kültürü plakalarına ve şişelerine kıyasla ortamdaki değişikliklere karşı daha hassas olabilir. Aşırı buharlaşma görülürse veya hücre büyümesi yavaşlarsa, doğru ayarları sağlamak için tüm kritik inkübatör parametreleri ölçülmelidir. Hücre kültürü odasının içine yerleştirilen doku kapağına veya küçük Petri kabına daha fazla su eklenebilir veya ortam daha sık değiştirilmelidir. Ayrıca, kabarcıklar alt kanala girebilir ve hendek açma cihazları için hendekte sıkışabilir. Çıkarılabilseler de, ilk etapta baloncuk eklemekten kaçınmak en kolay yoldur. Bunu yapmak için, medyayı alt hazneye pipetlemeden önce pipet ucunda kabarcık veya pipet ucunun ucunda hava olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Ayrıca, kanaldaki ortam buharlaşması, ortam yüzeyi ile bağlantı noktası üst kısmı arasında bir boşluğa yol açabilir. Ortam karşı bağlantı noktasının yüzeyine ulaşana kadar küçük bir hacimde ortam bir bağlantı noktasına pipetlenebilir, ardından ortam bu karşı bağlantı noktasında değiştirilebilir. hECSR ve E6 + %10 FBS ortamı su banyosunda ısıtılmamalıdır, ancak kabarcık oluşumunu azaltmak için diğer ortamlar önceden ısıtılabilir. Alt hazneye bir kabarcık girerse, kanaldan 100 μL'yi hızlı bir şekilde pipetleyerek çıkarılabilir. Ancak bu yöntem, cihazın yüzeyine dökülen odalar veya ortamlar arasında kontaminasyona yol açabilir. Ayrıca hücre katmanlarını da bozabilir. Alternatif olarak, ortam önce kanaldan çıkarılabilir ve ardından 50 μL'lik bir hacimle yeniden verilebilir. Bununla birlikte, önce medyayı çıkarmak, kanalda daha fazla kabarcık oluşumuna neden olabilir. Bir kabarcık doğrudan zar alanının altında değilse, hücre kültürü üzerinde hiçbir etkisi olmadan kanalda bırakılabilir.
Şekil 2'de gösterildiği gibi perisit bağlanması ve büyümesi zor olabilir. Optimize edilmiş bir tohumlama yoğunluğunun kullanılması, fizyolojik olarak ilgili perisit-endotel hücre oranına sahip bir tabakanın oluşumu için gereklidir. Ayrıca, perisitler kaymaya duyarlı olduğundan, hücreleri korumak için kanaldaki tüm medya alışverişleri çok yavaş yapılmalıdır. BPLC kültürü için, alt hazne 800 μg/mL kollajen tip IV veya 100 μg/mL fibronektin ile kaplanarak daha iyi bağlantı sağlanabilir.
Burada açıklanan cihazlardaki immünositokimya, hücre sağlığı ve fonksiyonunun kalitatif analizini sağlar. Doku kültürü plakalarında veya diğer platformlarda boyama yöntemleri doğrudan platforma çevrilebilir olmalıdır. Sadece üst odadaki hücre kültürü için, fiksasyonu takiben, PBS alt bölmeye eklenebilir ve kalan adımlar için bırakılabilir, blokaj ve boyama sadece üst bölmede yapılır. Bu, membranların kırılması veya alt hazneye kabarcık girmesi risklerini en aza indirir. Ko-kültür boyama için, her iki odayı da tüm adımlarda kullanmanızı öneririz. Fiksatif ve PBS'nin viskozitesinin ortamınkinden farklı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, alt hazneye kabarcık eklemek daha kolay olabilir ve alt hazneye pipetlemeden önce pipet uçlarında ucun ucunda hava olup olmadığını kontrol etmek için ekstra özen gösterilmelidir.
Küçük molekül geçirgenlik deneyi için açıklanan protokol, μSiM cihazında kültürlenen endotel hücrelerinin bariyer fonksiyonunun fonksiyonel ve kantitatif değerlendirmesine izin verir. Bu test sırasında karşılaşılabilecek bir sorun, protokol adımı 4.1.7.4'teki alt kanaldan numune toplama sırasında pipete hava kabarcıkları çekilmesidir. Bu sorunu önlemek için, numune toplamaya başlamadan önce ucun porta kapatıldığından emin olmak önemlidir ve numune çok hızlı çekilmemelidir. Bu sorunu çözmezse, kullanılan uçların boyutu bağlantı noktalarına sığamayacak kadar küçük veya çok büyük olabilir; Malzeme Tablosunda listelenen ipuçlarını kullanın. Sağlıklı görünen birleşik bir tek tabakaya rağmen beklenmedik şekilde yüksek geçirgenlik değerleri ölçülürse, numune toplama sırasında tek tabakanın bütünlüğünde bozulma olup olmadığı kontrol edilmelidir. Numune alındıktan hemen sonra tek tabakayı her zaman mikroskop altında kontrol etmenizi öneririz. Tek tabaka hala sağlam ve sağlıklı görünüyorsa, numune sabitlenebilir ve bariyer fonksiyonunun biyolojik belirteçleri, örneğin bağlantı proteinlerinin immün boyanması yoluyla değerlendirilebilir. Tersine, beklenmedik şekilde düşük geçirgenlik değerleri ölçülürse, alt kanaldan herhangi bir hava kabarcığı olmadan 50 μL ortam numunesi alındığından emin olmak önemlidir. Rezervuar ucu yerleştirilir yerleştirilmez ortam numune alma portundan çıkarsa, floresan küçük molekülün çoğu alt kanaldan örneklenen ilk 10 μL hacimde bulunacağından, pipeti numune alma portuna takmadan önce bu ortam toplanmalıdır. Hidrofobik bir kalem kullanarak bağlantı noktalarının etrafına daireler çizmek veya bağlantı noktasının etrafına delikli bir hidrofobik bant yerleştirmek, pasif olarak pompalanan ortamların yayılmasını önler. Numune alma sırasında kabarcıklar geri çekilirse veya 50 μL'lik numunenin tamamı çıkarılmazsa, numune kullanılmamalıdır. Alternatif olarak, tam hacim belirlenebilir ve geçirgenlik hesaplamasında kullanılabilir; ancak bu, yalnızca çıkarılan hacim ~%98-99 boya geri kazanımına karşılık gelen ≥40 μL ise yapılmalıdır34.
Disclosures
J.L.M., SiMPore'un kurucu ortağıdır ve şirkette hisse senedi sahibidir. SiMPore, bu çalışmada kullanılan membranlar da dahil olmak üzere ultra ince silikon bazlı teknolojileri ticarileştiriyor.
Acknowledgments
J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. ve L.W., NIH hibesi R33 HL154249 tarafından finanse edildi. J.L.M. R44 GM137651 tarafından finanse edildi. M.M., Rochester Üniversitesi, Schmidt Program Ödülü Del Monte Sinirbilim Enstitüsü tarafından finanse edildi. M.T., RF1 AG079138 tarafından finanse edildi. K.C., Uluslararası Etik Araştırmalar Vakfı tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
| Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
| Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
| VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
| ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| 100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
| DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
| hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
| PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
| Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
| Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
| Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
| Experimental models: Cell lines | |||
| Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
| Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
| iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
| Glassware and Plasticware | |||
| 150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
| Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
| Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
| Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
| Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
| P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
| Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
| Instruments | |||
| 10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
| 10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
| 40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
| Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
| Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
| TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
| Other | |||
| Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
| Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
| Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 - Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
| Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
| Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
| Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
| Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
| Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
| SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
| Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
| Software | |||
| Fiji | ImageJ | For image processing | |
| Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
| i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
| Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |
References
- Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405 (2019).
- Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
- Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson's disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813 (2011).
- Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451 (2022).
- Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
- Ortiz, G. G., et al.
- Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
- Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222 (2022).
- Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
- Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
- Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
- Abbott, N. J., et al.
- Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
- Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671 (2016).
- van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770 (2023).
- Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685 (2021).
- Lea, T., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).
- Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
- Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880 (2021).
- Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
- Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
- Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
- DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
- Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750 (2020).
- Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111 (2019).
- Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
- Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
- Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
- Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
- McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802 (2022).
- Su, S. -H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030 (2023).
- Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
- Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
- Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21 (2021).
- Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H.
