Summary
Her er en protokol til dyrkning af placentaplanter under konstante strømningsforhold. Denne tilgang forbedrer traditionelle statiske villøse kultursystemer ved at muliggøre replikation af dynamiske fysiologiske miljøer.
Abstract
De eksisterende ex vivo placenta-eksplantatkulturmodeller er primært baseret på statiske kultursystemer ved hjælp af brøndplader. Disse modeller afspejler imidlertid ikke tilstrækkeligt dynamikken i livmoderen , hvor moderkagen møder konstant let forskydningsstress på grund af plasma eller blodgennemstrømning. For at imødegå denne begrænsning er der udviklet et flowkultursystem for at bringe ex vivo placenta-eksplantatdyrkning tættere på de in utero-strømningsforhold , der opleves i moderkroppen. Inden for denne tilgang dyrkes placentaeksplanter i en sekvens af fem sammenkoblede strømningskamre. Denne indstilling opretholder fysiologiske iltkoncentrationer og en ensartet strømningshastighed. De indsamlede data afslører, at bevarelsen af vævsmorfologi under strømningsbetingelser udviser bemærkelsesværdig forbedring sammenlignet med konventionelle statiske metoder. Denne innovative teknik introducerer et enkelt middel til ex vivo placenta explant-kultur, der giver en mere tro repræsentation af det dynamiske in vivo-miljø . Desuden introducerer denne undersøgelse nye muligheder for at undersøge den funktionelle dynamik i føto-moderens grænseflade. Ved at omfavne gennemførlige dynamiske metoder lettes en dybere forståelse af placenta biologi, hvilket understreger dens relevans for moder-føtal sundhed.
Introduction
Siden 1960'erne er placenta explant dyrkning på bunden af en brøndplade blevet brugt til at studere føto-moderens grænseflade 1,2,3. Denne metode er veletableret og ligetil og muliggør udnyttelse af humant væv til forskellige undersøgelser ud over kulturer af enkeltceller 2,3. Over tid er eksperimentelle designs til placenta-eksplantatkulturer blevet ændret med hensyn til iltkoncentration4 og for at forhindre vævet i at sætte sig i brøndpladens bund 2,5,6. Denne metode er imidlertid ikke blevet tilpasset in vivo-forholdene i livmoderen, specifikt tilstedeværelsen af en konstant strøm3.
Succesen med en graviditet afhænger af en tilstrækkelig og konsekvent perfusion af det intervilløse rum med moderens blod, der etablerer et dynamisk kredsløb med kontinuerlig tilstrømning og udstrømning af blod og blodbårne stoffer 7,8,9,10,11,12. Placenta har to forskellige blodforsyningssystemer, et til moderblod og et til føtalt blod, hvilket resulterer i dobbelt perfusion af både føtal og modersystem13. Moderens blod begynder at perfusere moderkagens intervilløse rum i slutningen af første trimester og strømmer langsomt gennem udvidede livmoderspiralarterier10,11,14. Derfor bades placenta villøse træer i moderblod og leverer næringsstoffer og ilt til fosteret. Dette moderblod strømmer gennem det intervilløse rum, før det vender tilbage til moderens cirkulation via uteroplacentale vener. Under sin passage gennem det intervilløse rum fører diffusion og aktiv optagelse af ilt og næringsstoffer i fosterblod til lavere ilt- og næringsstofniveauer i moderblod12,15. Imidlertid erstattes det intervilløse rums blod fuldstændigt af frisk, iltrigt blod cirka to til tre gange i minuttet, hvilket sikrer en kontinuerlig forsyning af næringsstoffer og gasser13. Især syncytiotrophoblast, den yderste del af placentabarrieren, er den eneste komponent i placenta villøse træ, der direkte udsættes for moderblod15,16,17. Derfor oplever syncytiotrophoblast en konstant mild forskydningsspænding fra det flydende moderblod 3,14.
Den nuværende videnskabelige viden om placenta flow miljøet og moderne tekniske fremskridt tillader nu en tilpasset og fysiologisk tilnærmet dyrkning af placenta explants under strømningsbetingelser. Desuden tyder beviser på, at forskydningskræfter påvirker de biologiske funktioner af syncytiotrophoblast 18,19,20,21. En velkendt tilgang, der tegner sig for blodgennemstrømningen, er placenta dual lobe perfusionssystem22. Disse eksperimenter kræver imidlertid betydelig ekspertise, er tidsbegrænsede (udføres kun i nogle få timer) og er kun mulige med placentaprøveri tredje trimester 3,23. I modsætning hertil har vi udviklet en ligetil og ikke-påtrængende teknik til ex vivo placenta villøs eksplantatkultur under konstante strømningsindstillinger, der imødekommer både første og tredje trimester placentavæv3. I denne opsætning dyrkes placentaeksplanter i fem serieforbundne flowkamre. Villøse eksplanter fastgøres til kammerets bund ved hjælp af nåleformede forhøjninger på tynde metalplader. Det konstruerede flowkredsløb overføres efterfølgende til en bioreaktor, hvor både iltkoncentration og strømningshastighed reguleres3. Flowkulturresultater viser, at vævsintegriteten bevares bedre sammenlignet med den typisk anvendte statiske metode3. Desuden muliggør denne dynamiske tilgang nye og tilpassede eksperimentelle designs til vævseksplantedyrkning, hvilket muliggør in vitro-forsøg, der i højere grad efterligner det naturlige miljø3.
Protocol
Den etiske komité ved det medicinske universitet i Graz godkendte denne undersøgelse (31-019 ex 18/19 version 1.2 og 29-319 ex 16/17). Der blev indhentet informeret samtykke fra alle forsøgspersoner, der var involveret i undersøgelsen.
1. Forberedelse til floweksperimentet
BEMÆRK: Forsøgene udføres i en bioreaktor med integrerede peristaltiske pumper (se materialetabel). Fugtigheden, temperaturen og gasniveauet inde i bioreaktoren kan justeres.
- Tænd for bioreaktoren, og foretag alle forudindstillinger (f.eks. kalibrering af pumperne, foropvarmning, gasforhold og fugtighed) til eksperimentet i henhold til bioreaktorens manual. Før eksperimentet påbegyndes, skal de nødvendige indstillinger (temperatur, gasindhold, fugtighed) stabiliseres i et par timer eller natten over. For at gøre dette skal du starte bioreaktoren og softwaren og derefter klikke på Skift sætpunkter under menupunktet "Inkubator".
- Forvarm PBS og det nødvendige medium (endotelcellevækstmedium suppleret med kosttilskud hEGF-5, HC-500 samt 5% exosom-depleteret føtalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin) (se materialetabel) til 37 °C.
2. Dissektion af placentaprøve
- Umiddelbart efter fødslen skæres tre gange 2 cm 3 placentaprøver fra midten af placenta som beskrevet i Kupper etal.3 Opbevar kort sagt prøverne i PBS. Kassér chorionpladen, moderens decidua og områder med synlige infarkter fra prøven.
- Disseker den resterende vævsprøve i villøse eksplanter med en tværsnitsdiameter på ca. 0,5 cm (vådvægt på ca. 7,5 mg). Overfør dem til en petriskål med frisk PBS.
- Vask eksplanterne i PBS ved forsigtigt at ryste dem i væsken med pincet for at fjerne blodrester.
BEMÆRK: Disseker prøverne i en petriskål med PBS for at forvaske og forhindre dem i at tørre ud og brug steriliserede / autoklaverede værktøjer til behandling af vævet.
3. Flow eksperiment
- Under en steril hætte forbindes fem kamre i serie til reservoirflasken ved hjælp af luerlåsene i henhold til brugervejledningen til strømningskamrene (se materialetabel).
BEMÆRK: Steriliser og/eller autoklave alle materialer før brug i henhold til den respektive manual. Brug et luftfilter på reservoirflasken til steril gasudveksling. For at åbne og lukke kamrene skal du forsigtigt klemme kamrenes lugs ind. Trin 3.1. kan også udarbejdes tidligere. - Vend kamrene på hovedet, og åbn dem ved at fjerne bunden. Brug tang til at overføre metalpladerne centralt i den øverste del af kamrene med stifterne pegende opad.
- Kamrene fyldes med 1 ml forvarmet substrat (37 °C). Fyld derefter reservoiret med yderligere 20 ml. Kredsløbet kræver i alt 25 ml, inklusive volumenet i hvert flowkammer, i rørene og reservoirflasken. Under strømmen er det endelige volumen af mediet i et fyldt kammer 2 ml.
- Brug tang og overfør den ene villøse eksplant efter den anden mellem nålene på metalpladen i kammeret. Lad nålene glide mellem placenta villi for at undgå punktering af vævet. Overfør fire explants til et kammer. Luk kamrene ved forsigtigt at montere bunden. Et komplet kredsløb indeholder i alt 20 explants. Kamrene skal forblive i en omvendt position.
BEMÆRK: Tag forsigtigt fat i eksplanterne med pincetten; Prøv ikke at presse dem. Sørg for, at kamrene og kredsløbet er helt forseglet for at forhindre lækage. Kamrene bruges altid på hovedet. Antallet af eksplantater pr. kammer og antallet af kamre selv er variable. Proceduren for væv i første trimester svarer til den for væv i tredje trimester med en lille tilføjelse: For at fastgøre villi bøjes nålene lidt over eksplanterne, efter at vævet er overført til metalpladen (personlig kommunikation Brugger et al.). Dette fastgør det skrøbelige væv på metalpladen og forhindrer prøverne i at glide af. - Overfør strømningsenheden til bioreaktoren.
- Tilslut flowkredsløbet til den peristaltiske pumpe i bioreaktoren ved at forbinde pumpeslangen til pumpen. Fix det på 4. trin (man vil høre det klikke fire gange).
- Hvis der kræves en statisk kontrol, skal du også placere brøndpladen i bioreaktoren.
BEMÆRK: For statisk kultur fyldes fem brønde i en seksbrøndplade med 4 ml medium pr. Brønd og 4 villøse eksplanter pr. Brønd. Den fyldte brøndplade placeres også i bioreaktoren og dyrkes i samme atmosfære som strømningskulturen udstråler. Yderligere detaljer er beskrevet i Kupper et al.3 - Indstil pumpetilstanden til Manuel under menupunktet "Pumper". Indstil derefter pumpehastigheden til 1 ml / min, og start pumpningen af mediet ind i slangen ved at klikke på Kør. Mens kredsløbet fyldes med medium, skal du holde kamrene i en vinkel, så de er helt fyldt med medium.
BEMÆRK: Se supplerende tabel 1 for forsøgsindstillingerne for placenta villøs strømning og statisk kultur. Specifikationerne for flowsystemet og det statiske system findes i supplerende tabel 2.
FORSIGTIG: Vip forsigtigt kammeret under påfyldning for at forhindre, at prøverne glider af nålene. - Når påfyldningen er afsluttet, forbliver kamrene i deres omvendte position. Sørg for, at kamrene står sikkert og oprejst, og luk begge låg på bioreaktoren.
BEMÆRK: Det endelige volumen af mediet i et fyldt flowkammer er 2 ml. De eksperimentelle indstillinger og specifikationerne for strømningskamrene og brøndpladerne, der blev brugt i eksperimenterne, er beskrevet i Kupper et al.3 - Inkuber vævet i den ønskede tid.
BEMÆRK: Temperatur, gasniveau og strømningshastighed kan overvåges på computeren uden at åbne låget på bioreaktoren igen. - Stop pumpen efter inkubation af vævet i den ønskede tid ved at klikke på Afbryd under menupunktet "Pumper". Åbn bioreaktorens to låg og derefter et flowkammer ad gangen. Fjern forsigtigt eksplanterne fra metalpladen ved hjælp af tang.
- Vævet og supernatanten behandles i overensstemmelse med den valgte downstream-analyse. I dette tilfælde blev immunohistokemisk farvning og elektronmikroskopi udført3. Se supplerende tabel 3 for nærmere oplysninger om de antistoffer, der anvendes til immunhistokemi og immunofluorescens.
BEMÆRK: Efter fjernelse af vævet tømmes mediet fra kredsløbet ved pumpens rotation mod uret. - Demonter og rengør flowkredsløbet i henhold til producentens anvisninger for flowkamre og slanger.
Representative Results
Dele af denne publikation og resultaterne heraf er allerede offentliggjort (se referencerne 3 og 23).
Eksperimentel opsætning
En eksperimentel opsætning er illustreret i figur 1. En sammensat strømningscyklus består af fem flowkamre, der er serieforbundne (figur 1A). Inden for hvert strømningskammer dyrkes fire eksplanter, hver med en tværsnitsdiameter på ca. 0,5 cm (figur 1 A,C). Til det statiske kontroleksperiment dyrkes eksplanterne i individuelle brønde i en seksbrøndsplade (figur 1B). For at forhindre, at eksplanterne skylles ud, fastgøres de på metalplader med smalle nåleformede fremspring (figur 1 D, E). For at udsætte eksplanterne for en direkte strøm af mediet er kamrene omvendt med indtag og udløb placeret ved hovedsektionen (figur 1 F,G). Inden for bioreaktoren er strømningscyklussen forbundet med en peristaltisk pumpe. Med henblik på at sammenligne vævsintegritet mellem flowdyrket væv og konventionelt statisk dyrket væv placeres eksplantater i en plade med seks brønde ved siden af strømningscyklussen. Dette sikrer verifikation af konsistente dyrkningsbetingelser med hensyn til ilt, temperatur og fugtighed (figur 1A)3.
Morfologisk analyse
β-actin
Forskellige immunhistokemiske farvningsprocedurer blev udført for at undersøge histologiske forskelle i vævsintegritet forbundet med forskellige dyrkningsbetingelser (figur 2). Explants, der straks blev indlejret efter dissektion, tjente som baseline-reference. Til analyse af actincytoskelettet inden for villøse eksplanter blev β-actinfarvning udført (figur 2A-E). Beskrivende analyse afslørede en velstruktureret og organiseret visuel præsentation af cytoskelettet i frisk opnået væv (figur 2A). Over tid, efterhånden som dyrkningen skred frem, var der en observerbar aggregering af mikrofilamenter, hvilket betyder en nedbrydning af cytoskeletstrukturen. Dette fænomen blev konsekvent observeret i villøse eksplanter, der gennemgik statisk dyrkning3 (figur 2C, E, angivet med stjerner).
H&E farvning
H&E-farvning gav yderligere forstærkning til observationen af, at vævsintegriteten mindskes i løbet af statisk kultur, en tendens, der forbedres i forbindelse med flowkultur (figur 2F-J). Frisk væv udviste en struktureret og karakteristisk histologisk præsentation af de villøse eksplanter, kendetegnet ved en tæt og tæt pakket stroma (figur 2F). Derudover blev syncytiotrophoblast klæbet fast til den underliggende stroma (figur 2F). Et sammenligneligt udseende blev observeret i villøse eksplanter dyrket i et strømningsmiljø i 24 timer (figur 2G). Efter 48 timers dyrkning under strømmen blev det imidlertid observeret, at dele af syncytiotrofoblasten var delvist løsrevet (figur 2I, angivet med pil), ledsaget af sporadiske små lakuner i stroma. Histologisk undersøgelse af vævet viste, at vævets integritet efter 24 timer i en statisk dyrkningstilstand var utilstrækkeligt bevaret (figur 2H). Desuden forringedes denne integritet yderligere markant efter 48 timer i statisk kultur (figur 2J). Stromaen udviste et porøst og udstenet udseende, og signifikant løsrivelse af syncytiotrophoblast fra stroma var tydelig i større områder (figur 2J, pile)3.
CD34II
CD34II-farvning blev anvendt til at visualisere endotelceller og følgelig føtoplacenta blodkar i de villøse eksplantater (figur 2K-O). Væv, der var direkte indlejret lige efter dissektion, viste et tydeligt organiseret arrangement af endotelcellerne (figur 2K). Den morfologiske integritet af føto-placenta blodkarrene forblev godt vedligeholdt efter 24 timers strømningskultur og ofte selv efter 48 timer, selvom lejlighedsvise tilfælde af kollapsede blodkar blev noteret under strømningsbetingelser (figur 2 L, N). Efter 24 timers statisk kultur udviste blodkarrene imidlertid delvis sammenbrud, hvilket fremgår af deres forstyrrede visuelle udseende (figur 2M, angivet med pilespidser). Denne forringelse af blodkarrene i den statiske kulturindstilling syntes at forværres med forlænget dyrkningstid. Sammenfattende indikerede den beskrivende morfologiske vurdering af de villøse eksplantater efter både strømning og statisk kultur, at vævsintegritet synes at være mere effektivt bevaret inden for strømningssystemet i modsætning til den statiske kulturtilstand3.
Ultrastrukturel analyse af det dyrkede væv
Transmission elektron mikroskopi
For at foretage en mere detaljeret undersøgelse af morfologien af de villøse eksplanter blev yderligere ultrastrukturelle analyser udført ved anvendelse af transmissionselektronmikroskopi (TEM) (figur 3A-E). Disse resultater bekræftede resultaterne af de histologiske undersøgelser. I væv, der var direkte indlejret umiddelbart efter tilberedning, var morfologien usædvanligt velbevaret (figur 3A). Microvilli var tydeligt synlige på overfladen af syncytiotrophoblast. Syncytiotrophoblast præsenterede sit karakteristiske kontinuerlige lag uden laterale cellegrænser og etablerede direkte kontakt med kældermembranen. Stromaet i det friske væv udviste tæt pakning uden signifikante perforeringer eller brud. Desuden viste det ultrastrukturelle udseende af blodkarrene og individualiserede intravaskulære erytrocytter også fremragende bevarelse (figur 3A).
Selv efter 24 timers flowkultur forblev vævsprøvernes samlede morfologi relativt godt vedligeholdt (figur 3D). Mens der var lidt færre mikrovilli på overfladen af syncytiotrophoblast sammenlignet med frisk væv, forblev syncytiotrophoblast primært bundet til basalmembranen. Kerner og lejlighedsvise små vakuoler kunne observeres i den indre del af syncytiotrophoblast. Stromaet i placenta villi syntes velbevaret og lignede tæt frisk væv (figur 3D). Selv efter 48 timers strømningskultur udviste stromale celler relativt god bevaring, omend med nogle perforeringer til stede (figur 3E). Spændende nok blev lipiddråber påvist i vævet. Mens syncytiotrophoblast viste vakuoler og en reduktion i antallet af mikrovilli, forblev den fastgjort til basalmembranen i adskillige regioner, og syncytiale og cellekerner var tydeligt synlige (figur 3E).
I skarp kontrast til vævet fra strømningskulturen udviste morfologien af villøst væv, der blev udsat for statisk kultur, forringelse så tidligt som 24 timer (figur 3B). Syncytiotrophoblast blev dissocieret fra basalmembranen flere steder og viste relativt betydelige perforeringer. Derudover var lipiddråber ofte tydelige i både syncytiotrophoblast og stroma (figur 3B). Efter 48 timers statisk kultur var et progressivt fald i ultrastrukturen tydelig (figur 3C). Syncytiotrophoblast præsenterede adskillige perforeringer og løsrivelse fra basalmembranen i betydelig grad. Identifikation af celler i stroma, såvel som endotelceller, der omfatter blodkarrene, blev udfordrende. Desuden var der en bemærkelsesværdig ophobning af lipiddråber i de villøse eksplanter efter 48 timers statisk kultur (figur 3C). Sammenfattende udviste ultrastrukturen af væv i statisk kultur successiv forringelse i løbet af dyrkningsperioden, en tendens, der blev afbødet ved dyrkning under strømningsbetingelser3.
Scanning elektronmikroskopi
Ved hjælp af scanningelektronmikroskopi (SEM) blev en detaljeret undersøgelse af overfladen af de villøse eksplantater lettet (figur 4A-J). Væv, der var blevet frisk indlejret, udviste et tæt befolket udvalg af mikrovilli over overfladen (figur 4 A, B). Nogle regioner udstillede vesikellignende strukturer. I modsætning hertil manifesterede væv fra den statiske kultur en betydelig reduktion i mikrovilli efter 24 timer (figur 4C, D), en reduktion, der fortsatte efter 48 timer (figur 4E, F). Mens visse områder viste aggregering af vesikellignende strukturer, der ikke var blevet frigivet, syntes andre regioner nøgne og eroderede (figur 4D, F). I væv, der blev udsat for strømningskultur, var mikrovilli stadig til stede på overfladen efter 24 timer (figur 4G, H) såvel som efter 48 timer (figur 4I, J), skønt i mindre grad end i frisk væv. I sammenligning med den statiske kultur blev forekomsten af vesikellignende strukturer på overfladen reduceret. Interessant nok var disse vesikellignende strukturer især koncentreret i specifikke fordybninger, hvor strømmen kunne reduceres eller mangle (figur 4H, J), hvilket tyder på, at de kunne have været løsnet fra den floweksponerede vævsoverflade på grund af strømmen af mediet3.
Figur 1: Opsætning af flowsystemet . (A) Det samlede flowsystem, der består af reservoiret og fem flowkamre, er forbundet med en af de peristaltiske pumper. På højre side er en seks-brøndplade, hvor eksplanterne dyrkes statisk. (B,C) For begge dyrkningsmetoder dissekeres placentaprøverne i villøse eksplanter på ca. 0,5 cm2, hvoraf fire eksplanter derefter anvendes pr. Brønd eller kammer. I en eksperimentel tilgang anvendes fem kamre eller brønde. (D,E) Til strømningskultur bruges en metalplade med smalle nåleformede forhøjninger til at sikre eksplanterne. (F,G) Rørenes åbninger er placeret i kamrenes hoved og bruges således på hovedet for at sikre, at vævet udsættes for direkte strømning. Denne figur er gengivet fra Kupper et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfologisk analyse af placenta villøse eksplanter ved strømning og statisk kultur. (A-E) Immunofluorescensfarvning for β-actin til visualisering af cytoskelettet af eksplanter ved dyrkning. Til analysen blev der brugt seks tilfældigt udvalgte pletter pr. Dias. Repræsentative billeder vises. (A) Visualisering af cytoskelettet af væv indlejret direkte efter forberedelsen. Skalabjælke: 20 μm. (B-E) Repræsentativ skildring af både tidsafhængig og dyrkningstilstandsafhængig degeneration af actincytoskelettet i dyrkede eksplantater af strømning og statisk kultur. (C-E) Stjerner betyder øget actinmikrofilamentakkumulering, hvilket er en indikation af nedbrydning af actincytoskelet. (F-J) Hematoxylin-eosin farvning af villøse explants. Skalastang: 100 μm. (F,G) Frisk indlejret væv (F) og flowkultureksplanter i 24 timer (G) viser en velbevaret morfologi af en villøs eksplantat. (I) Flowdyrkede eksplanter i 48 timer viser periodisk løsrevne områder af syncytiotrophoblast (pil). (H,J) Tidsafhængig forringelse af strukturel integritet efter statisk eksplantatkultur, indikeret ved opløsning af syncytiotrophoblast (pil) og perforeret stroma. (K-O) CD34 II blev brugt til at plette villøse endotelceller. Skalastang: 100 μm. (K,L) Frisk væv (K) og eksplantater dyrket i 24 timer under strømningsbetingelser (L) udviser et karakteristisk strukturelt justeret endotelcellemønster. (N) Efter 48 timer i strømningskultur falder den vaskulære integritet til en vis grad. (M,O) I statisk kultur er kollapsede blodkar allerede synlige efter 24 timer (M), hvilket blev observeret at stige med længere statisk dyrkningstid (O). Denne figur er gengivet fra Kupper et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ultrastrukturel præ- og efterdyrkningsundersøgelse af villøse eksplanter ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi. Væv fra tre uafhængige eksperimenter blev brugt til at analysere billederne. (A) Et repræsentativt billede af frisk indlejret væv viser en stor mængde mikrovilli (MV) på overfladen af syncytiotrophoblast (ST). Strukturelt intakte kapillærer (Ca) er synlige i den velbevarede stroma (S). (B) I vævet, der er blevet statisk dyrket i 24 timer, er der en forringelse af syncytiotrofoblastens strukturelle integritet, som synes at være afbrudt fra basalmembranen i nogle områder. Der er også en mærkbar ophobning af lipiddråber (LD). (C) Efter 48 timer i statisk kultur observeres alvorlig ultrastrukturel forringelse. Stromaen såvel som syncytiotrophoblast er perforeret, og en massiv ophobning af lipiddråber er tydelig. Blodkarrene kunne næsten ikke spores. (D,E) Ultrastrukturen af vævet fra strømningskulturen var relativt godt bevaret efter 24 timer (D) såvel som efter 48 timer (E). Skalastang: 2 μm. MV: Microvilli, ST: Syncytiotrophoblast, S: Stroma, Ca: Kapillær, LD: Lipiddråber. Denne figur er gengivet fra Kupper et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Ultrastrukturel præ- og efterdyrkningsundersøgelse af villøse eksplanter ved hjælp af scanningelektronmikroskopi. (A, C, E, G, I) Oversigtsbilleder af overfladen af placenta villøse træer med respektive detaljerede billeder (B, D, F, H, J). (A,B) Frisk indlejret væv udviser en tæt søm af mikrovilli. (B) Vesikulære lignende strukturer kan bemærkes nogle steder. (C-F) Efter 24 timer og 48 timer i statisk kultur er et fald i mikrovilli på overfladen af syncytiotrophoblast synlig. Slående er den omfattende ophobning af vesikulære partikler på overfladen af eksplantatet. (F) Partiklerne synes at visne efter 48 timer i statisk kultur. (G-J) Overfladen af vævet fra strømningskulturen synes at være bedre bevaret efter 24 timer (G,H) såvel som efter 48 timer (I,J) sammenlignet med den statiske kultur. Microvilli er synlige på overfladen (H,J), men ikke i samme høje densitet som i det friske væv. (B) Vesikulære partikler kan ses spredt i nicherne med reduceret strømning. Denne figur er gengivet fra Kupper et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Eksperimentelle indstillinger for placenta villøs strømning og statisk kultur. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: Specifikationer for flow og statisk system. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 3: Antistoffer mod immunhistokemi og immunofluorescens anvendt til dette studie. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Denne undersøgelse introducerer et unikt perspektiv på en flowkulturteknik til placentaeksplanter designet til at replikere dynamikken i utero-miljøet 3,23. Resultaterne afslører, at morfologien af væv dyrket under strømningsbetingelser er bedre bevaret sammenlignet med den traditionelle statiske dyrkningsmetode3. Især selvom hverken statiske eller strømningskulturbetingelser letter perfusion af placentakar, blev ødelæggelsen af føto-placenta blodkar inde i villøs stroma overvejende observeret i statisk kultur, mens blodkarrenes integritet syntes at være bedre opretholdt over en længere varighed i flowkultur3.
En mulig forklaring på denne observation kunne være knyttet til den afgørende beskyttende og endokrine rolle af syncytiotrophoblast, en funktion veldokumenteret i litteraturen 12,24,25,26. I betragtning af dette er det tænkeligt, at den overordnede integritet af det ydre lag af villi væsentligt bidrager til vedligeholdelsen af den underliggende stroma, herunder blodkarrene. Derfor kan blodkarrenes vedvarende cellulære integritet under strømningsbetingelser tilskrives den kontinuerlige strøm af mediet. Denne bevægelse hjælper med den passive bevægelse af eksplanterne, hvilket letter udvekslingen af gasser, næringsstoffer og nanopartikler (som ekstracellulære vesikler) over placentabarrieren. Dette kan igen have en positiv indvirkning på bevarelsen af blodkarmorfologi. Desuden spiller fænomenet mekanosensation en rolle i vævsmorfogenese på tværs af forskellige væv27,28. Undersøgelser har vist, at mekanositfølsomhed påvirker cellulære processer på flere niveauer, hvilket udløser en række biokemiske reaktioner, der i sidste ende påvirker vævs- og organfunktionalitet29. Især udtrykkes mekanofølsomme proteiner af syncytiotrophoblast gennem hele drægtigheden28. Desuden antyder undersøgelsen, at mikrovilli på vævsoverfladen kan være impliceret i denne sammenhæng28.
Et yderligere perspektiv, der er værd at overveje, er mitokondriernes potentielle rolle i det cellulære respons på strømning. For eksempel tjener mitokondrier i endotelceller som signaltransducere til cellulære reaktioner på miljømæssige stimuli30. Øget akkumulering af lipiddråber, observeret i statisk dyrket væv gennem TEM3, har været forbundet med apoptoseinduktion på grund af mitokondriel dysfunktion31. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afdække de underliggende mekanismer og nøglefaktorer, der forbinder dem med nedstrøms signalveje. Denne udforskning kan forbedre vores forståelse af, hvordan vævet opfatter og reagerer på forskydningsstress, hvilket oversættes til forbedret levedygtighed og integritet af villøse eksplanter i kultur23.
Flere kritiske protokoltrin skal gentages og udføres med omhu. Efter placenta levering skal væv dyrkes så hurtigt som muligt. Under forberedelse af eksplantater er det afgørende at undgå områder med synlige infarkter. Det er vigtigt at håndtere eksplanter forsigtigt med tang for at forhindre klemning. Det anbefales at holde vævet dækket med væske under hele proceduren og udføre det hurtigt.
Det er vigtigt at erkende, at denne undersøgelse ikke er i stand til at specificere den nøjagtige forskydningsspænding inden for det præsenterede flowsystem, hvilket bør betragtes som en begrænsning i fremtidige undersøgelser 3,23. Ikke desto mindre er det vigtigt at erkende, at præcis strømningshastighed og forskydningsspænding for en bestemt placenta villus in vivo påvirkes af adskillige parametre, såsom de geometriske egenskaber ved det intervilløse rum, villusens placering inden for dette rum og dets nærhed og vinkel til moderens spiralarterier og livmodervener 3,19,23,32 . Kompleksiteten af moderkagens geometriske struktur, som varierer mellem individer, skal også tages i betragtning23,32. Der findes allerede matematiske modeller, der estimerer blodgennemstrømningen i det intervilløse rum32 og beregninger af vægforskydningsspænding på syncytiotrophoblast19,28. Interessant nok forudsagde en undersøgelse, at forskydningsspænding på syncytiotrophoblast er lavere i tredje trimester sammenlignet med første trimester28, mens en anden demonstrerede rumligt heterogen vægforskydningsspænding på syncytiotrophoblast19. Bestemmelse af den præcise strømningshastighed og forskydningsspænding for en bestemt placenta villus forbliver en udfordring 3,19,23,32. Sådanne beregninger giver en tilnærmelse af forskydningsspændingsområdet til fremtidige undersøgelser, men de kan kræve løbende anatomiske justeringer og optimering23. Desuden kan fremtidige undersøgelser udvikle nye og raffinerede gennemstrømningskulturteknikker, der tager højde for den indviklede geometri i det intervilløse rum og strategier til at øge antallet af prøver pr. Eksperiment3. Der forventes løbende fremskridt og udvikling af flowsystemet, potentielt anvendelse af alternative flowkamre (Brugger et al., upublicerede data, 2023).
Afslutningsvis lægger denne undersøgelse et robust fundament ved at demonstrere en let implementerbar ex vivo flowkulturteknik, der opretholder den strukturelle integritet af dyrkede villøse eksplanter. Det understreger betydningen af dynamiske teknikker i placenta funktionelle biologistudier, hvilket baner vejen for yderligere fremskridt inden for flowkultursystemer og generering af nye ideer og hypoteser 3,23.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne sætter stor pris på den fremragende tekniske støtte fra Bettina Amtmann og Petra Winkler til vævsprøvetagning. Denne forskning blev finansieret af den østrigske videnskabsfond FWF (DOC 31-B26) og det medicinske universitet i Graz, Østrig, gennem ph.d.-programmet Inflammatoriske lidelser under graviditet (DP-iDP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
| Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
| antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
| anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
| Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
| CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
| CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
| Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
| Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
| Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
| Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
| Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
| Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
| Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
| Metal plate with needles | In-house construction | ||
| Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
| Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
| Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
| Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
| QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
| SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
| Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
| Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
| TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
| UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
| UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
| Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |
References
- Villee, C. A. The metabolism of human placenta in vitro. Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: Approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Placental villous explant culture 2.0: flow culture allows studies closer to the in vivo situation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7464 (2021).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell and Tissue Research. 328 (3), 607-616 (2007).
- Simán, C. M., Sibley, C. P., Jones, C. J. P., Turner, M. A., Greenwood, S. L. The functional regeneration of syncytiotrophoblast in cultured explants of term placenta. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 280 (4), R1116-R1122 (2001).
- Toro, A. R., et al. Leptin is an anti-apoptotic effector in placental cells involving p53 downregulation. PLoS ONE. 9 (6), e99187 (2014).
- Morley, L. C., Debant, M., Walker, J. J., Beech, D. J., Simpson, N. A. B. Placental blood flow sensing and regulation in fetal growth restriction. Placenta. 113, 23-28 (2021).
- Wang, Y. Z. S., Wang, Y., Zhao, S.
- Huppertz, B.
- Weiss, G., Sundl, M., Glasner, A., Huppertz, B., Moser, G. The trophoblast plug during early pregnancy: a deeper insight. Histochemistry and Cell Biology. 146 (6), 749-756 (2016).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Gude, N. M., Roberts, C. T., Kalionis, B., King, R. G. Growth and function of the normal human placenta. Thrombosis Research. 114 (5-6), 397-407 (2004).
- Wang, Y.
- Moser, G., Windsperger, K., Pollheimer, J., de Sousa Lopes, S. C., Huppertz, B. Human trophoblast invasion: new and unexpected routes and functions. Histochemistry and Cell Biology. 150 (4), 361-370 (2018).
- Kupper, N., Huppertz, B. The endogenous exposome of the pregnant mother: Placental extracellular vesicles and their effect on the maternal system. Molecular Aspects of Medicine. 87 (October 2020), 100955 (2022).
- Huppertz, B. IFPA award in placentology lecture: biology of the placental syncytiotrophoblast - myths and facts. Placenta. 31 (SUPPL), S75-S81 (2010).
- Gauster, M., Moser, G., Wernitznig, S., Kupper, N., Huppertz, B. Early human trophoblast development: from morphology to function. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (6), 345 (2022).
- Lecarpentier, E., et al. Fluid shear stress promotes placental growth factor upregulation in human syncytiotrophoblast through the cAMP-pKA signaling pathway. Hypertension. 68 (6), 1438-1446 (2016).
- Lecarpentier, E., et al. Computational fluid dynamic simulations of maternal circulation: wall shear stress in the human placenta and its biological implications. PLOS ONE. 11 (1), e0147262 (2016).
- Miura, S., Sato, K., Kato-Negishi, M., Teshima, T., Takeuchi, S. Fluid shear triggers microvilli formation via mechanosensitive activation of TRPV6. Nature Communications. 6 (1), 8871 (2015).
- Jauniaux, E., et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. The American Journal of Pathology. 157 (6), 2111-2122 (2000).
- Sodha, R. J., Proegler, M., Schneider, H. Transfer and metabolism of norepinephrine studied from maternal-to-fetal and fetal-to-maternal sides in the in vitro perfused human placental lobe. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 148 (4), 474-481 (1984).
- Kupper, N. Extracellular vesicles from advanced placental explant flow culture and their role in preeclampsia [Dissertation]. , Medical University of Graz, Austria. (2022).
- Burton, G. J., Fowden, A. L. The placenta: a multifaceted, transient organ. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1663), 20140066 (2015).
- Arora, N., Sadovsky, Y., Dermody, T. S., Coyne, C. B. Microbial vertical transmission during human pregnancy. Cell Host & Microbe. 21 (5), 561-567 (2017).
- Cheong, M. L., et al. A Positive feedback loop between glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCGβ expression and cell differentiation. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 197-209 (2016).
- Heisenberg, C. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Lee, T. C., Moulvi, A., James, J. L., Clark, A. R. Multi-scale modelling of shear stress on the syncytiotrophoblast: could maternal blood flow impact placental function across gestation. Annals of Biomedical Engineering. 51 (6), 1256-1269 (2023).
- Kamkin, A., Kiseleva, I. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. 49 (0), Academia. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21290773 (2005).
- Kluge, M. A., Fetterman, J. L., Vita, J. A.
- Boren, J., Brindle, K. M. Apoptosis-induced mitochondrial dysfunction causes cytoplasmic lipid droplet formation. Cell Death & Differentiation. 19 (9), 1561-1570 (2012).
- Chernyavsky, I. L., Jensen, O. E., Leach, L. A Mathematical model of intervillous blood flow in the human placentone. Placenta. 31 (1), 44-52 (2010).
