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Developmental Biology

पूर्व वीवो प्लेसेंटल एक्सप्लांट फ्लो कल्चर - गर्भाशय में गतिशील स्थितियों की नकल करना

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65919
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Division of Cell Biology, Histology and Embryology, Gottfried Schatz Research Center, Medical University of Graz

Summary

यहाँ निरंतर प्रवाह की स्थिति के तहत अपरा explants संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल है. यह दृष्टिकोण गतिशील शारीरिक वातावरण की प्रतिकृति को सक्षम करके पारंपरिक स्थैतिक विलस कल्चर सिस्टम को बढ़ाता है।

Abstract

मौजूदा पूर्व विवो प्लेसेंटल एक्सप्लांट कल्चर मॉडल मुख्य रूप से अच्छी प्लेटों का उपयोग करके स्थिर संस्कृति प्रणालियों में आधारित हैं। हालांकि, ये मॉडल अपर्याप्त रूप से गर्भाशय सेटिंग में गतिशील को दर्शाते हैं, जहां प्लेसेंटा प्लाज्मा या रक्त प्रवाह के कारण लगातार मामूली कतरनी तनाव का सामना करता है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, मातृ शरीर के भीतर अनुभव किए गए गर्भाशय प्रवाह की स्थिति के करीब पूर्व विवो प्लेसेंटल एक्सप्लांट खेती लाने के लिए एक प्रवाह संस्कृति प्रणाली तैयार की गई है। इस दृष्टिकोण के भीतर, अपरा explants पांच परस्पर प्रवाह कक्षों के एक अनुक्रम में खेती कर रहे हैं. यह सेटिंग शारीरिक ऑक्सीजन सांद्रता और एक सुसंगत प्रवाह दर बनाए रखती है। एकत्रित आंकड़ों से पता चलता है कि प्रवाह की स्थिति के तहत, ऊतक आकृति विज्ञान का संरक्षण पारंपरिक स्थैतिक तरीकों की तुलना में उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित करता है। यह अभिनव तकनीक पूर्व विवो प्लेसेंटल एक्सप्लांट संस्कृति का एक सीधा साधन पेश करती है, जो विवो वातावरण में गतिशील का अधिक वफादार प्रतिनिधित्व प्रदान करती है। इसके अलावा, यह अध्ययन भ्रूण-मातृ इंटरफ़ेस की कार्यात्मक गतिशीलता की जांच के लिए नई संभावनाओं का परिचय देता है। व्यवहार्य गतिशील पद्धतियों को अपनाने से, प्लेसेंटल जीव विज्ञान की गहरी समझ की सुविधा है, जो मातृ-भ्रूण स्वास्थ्य के लिए इसकी प्रासंगिकता को रेखांकित करता है।

Introduction

1960 के दशक के बाद से, एक अच्छी तरह से प्लेट के तल पर अपरा explant खेती भ्रूण-मातृ इंटरफ़ेस 1,2,3 का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है. यह विधि अच्छी तरह से स्थापित और सीधी है, जो एकल कोशिकाओं 2,3 की संस्कृतियों के अलावा, विभिन्न अध्ययनों के लिए मानव ऊतक के उपयोग को सक्षम करती है। समय के साथ, अपरा explant संस्कृतियों के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन ऑक्सीजन एकाग्रता4 के संबंध में संशोधित किया गया है और अच्छी तरह से थाली के नीचे 2,5,6 पर बसने से ऊतक को रोकने के लिए. हालांकि, इस विधि को गर्भाशय के भीतर विवो स्थितियों में अनुकूलित नहीं किया गया है, विशेष रूप से एक निरंतर प्रवाह3 की उपस्थिति।

गर्भावस्था की सफलता मातृ रक्त के साथ इंटरविलस स्पेस के पर्याप्त और सुसंगत छिड़काव पर टिका है, जो रक्त और रक्त जनित पदार्थों के निरंतर प्रवाह और बहिर्वाह के साथ एक गतिशील सर्किट स्थापित करता है 7,8,9,10,11,12. नाल दो अलग रक्त की आपूर्ति प्रणाली, मातृ रक्त के लिए एक और भ्रूण के रक्त के लिए एक, दोनों भ्रूण और मातृ प्रणालियों13 द्वारा दोहरी छिड़काव में जिसके परिणामस्वरूप. मातृ रक्त पहली तिमाही के अंत में नाल के अंतःक्रियात्मक स्थान को छिड़कना शुरू कर देता है, धीरे-धीरे चौड़ी गर्भाशय सर्पिल धमनियों10,11,14के माध्यम से बहता है। नतीजतन, अपरा विलस पेड़ों को मातृ रक्त में स्नान किया जाता है, भ्रूण को पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्रदान करता है। यह मातृ रक्त गर्भाशय नसों के माध्यम से मातृ परिसंचरण में लौटने से पहले इंटरविलस स्पेस से बहता है। इंटरविलस स्पेस के माध्यम से इसके पारित होने के दौरान, भ्रूण के रक्त में ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के प्रसार और सक्रिय तेज से मातृ रक्त12,15में ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का स्तर कम हो जाता है। हालांकि, इंटरविलस स्पेस के रक्त को पूरी तरह से ताजा, ऑक्सीजन युक्त रक्त द्वारा प्रति मिनट लगभग दो से तीन बार बदल दिया जाता है, जिससे पोषक तत्वों और गैसोंकी निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित होती है। विशेष रूप से, सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट, प्लेसेंटल बाधा का सबसे बाहरी हिस्सा, प्लेसेंटल विलस पेड़ का एकमात्र घटक है जो सीधे मातृ रक्त15,16,17के संपर्क में आता है। नतीजतन, syncytiotrophoblast बह मातृ रक्त 3,14 से एक निरंतर हल्के कतरनी तनाव का अनुभव.

अपरा प्रवाह पर्यावरण और आधुनिक तकनीकी प्रगति के बारे में वर्तमान वैज्ञानिक ज्ञान अब प्रवाह की स्थिति के तहत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स की एक अनुकूलित और शारीरिक रूप से अनुमानित खेती की अनुमति देता है। इसके अलावा, सबूत बताते हैं कि कतरनी बल सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट 18,19,20,21के जैविक कार्यों को प्रभावित करते हैं। एक प्रसिद्ध दृष्टिकोण है कि रक्त प्रवाह के लिए खातों अपरा दोहरी पालि छिड़काव प्रणाली22 है. हालांकि, इन प्रयोगों महत्वपूर्ण विशेषज्ञता की आवश्यकता है, समय प्रतिबंधित (केवल कुछ घंटों के लिए आयोजित) कर रहे हैं, और केवल तीसरे तिमाही अपरा नमूने 3,23 के साथ संभव हैं. इसके विपरीत, हमने निरंतर प्रवाह सेटिंग्स के तहत पूर्व विवो प्लेसेंटल विलस एक्सप्लांट कल्चर के लिए एक सीधी और गैर-घुसपैठ तकनीक विकसित की है, जिसमें पहली और तीसरी तिमाही के अपरा ऊतक3 दोनों को समायोजित किया गया है। इस सेटअप में, प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स की खेती पांच श्रृंखला-जुड़े प्रवाह कक्षों में की जाती है। पतली धातु प्लेटों पर सुई के आकार की ऊंचाई का उपयोग करके कक्ष के तल पर विलस एक्सप्लांट्स को सुरक्षित किया जाता है। निर्मित प्रवाह सर्किट को बाद में एक बायोरिएक्टर में स्थानांतरित किया जाता है, जहां ऑक्सीजन एकाग्रता और प्रवाह दर दोनों को विनियमित किया जाताहै 3. प्रवाह संस्कृति के परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि ऊतक अखंडता बेहतर आम तौर पर इस्तेमाल किया स्थिर विधि3 की तुलना में संरक्षित है. इसके अलावा, इस गतिशील दृष्टिकोण ऊतक explant संवर्धन के लिए उपन्यास और अनुकूलित प्रयोगात्मक डिजाइन सक्षम बनाता है, इन विट्रो प्रयोगों है कि और अधिक बारीकी से प्राकृतिक वातावरण3 की नकल में अनुमति देता है.

Protocol

ग्राज़ के मेडिकल यूनिवर्सिटी की आचार समिति ने इस अध्ययन को मंजूरी दे दी (31-019 पूर्व 18/19 संस्करण 1.2 और 29-319 पूर्व 16/17)। अध्ययन में शामिल सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. प्रवाह प्रयोग के लिए तैयारी

नोट: प्रयोगों एकीकृत क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंपों ( सामग्री की तालिका) के साथ एक बायोरिएक्टर में आयोजित कर रहे हैं. बायोरिएक्टर के अंदर आर्द्रता, तापमान और गैस के स्तर को समायोजित किया जा सकता है।

  1. बायोरिएक्टर चालू करें और बायोरिएक्टर के मैनुअल के अनुसार प्रयोग के लिए सभी पूर्व-व्यवस्था (जैसे, पंपों का अंशांकन, पूर्व-वार्मिंग, गैस की स्थिति और आर्द्रता) करें। प्रयोग शुरू करने से पहले, आवश्यक सेटिंग्स (तापमान, गैस सामग्री, आर्द्रता) को कुछ घंटों या रात भर के लिए स्थिर किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, बायोरिएक्टर और सॉफ्टवेयर शुरू करें और फिर मेनू आइटम "इनक्यूबेटर" के तहत चेंज सेटपॉइंट्स पर क्लिक करें।
  2. प्री-वार्म पीबीएस और आवश्यक माध्यम (एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम प्रदान किए गए पूरक एचईजीएफ -5, एचसी -500 के साथ-साथ 5% एक्सोसोम-समाप्त भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) ( सामग्री की तालिकादेखें) से 37 डिग्री सेल्सियस।
    ​

2. प्लेसेंटल नमूना विच्छेदन

  1. प्रसव के तुरंत बाद, मध्य अपरा क्षेत्र से तीन बार 2 सेमी 3 अपरा के नमूनों को काट लें जैसा कि कुपर एटअल.3 में वर्णित है संक्षेप में, नमूनों को पीबीएस में रखें। कोरियोनिक प्लेट, मातृ decidua और नमूना से दिखाई रोधगलन के क्षेत्रों त्यागें.
  2. शेष ऊतक नमूने को लगभग 0.5 सेमी (लगभग 7.5 मिलीग्राम का गीला वजन) के क्रॉस-सेक्शनल व्यास के साथ विलस एक्सप्लांट्स में विच्छेदित करें। उन्हें ताजा पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश में स्थानांतरण.
  3. पीबीएस में एक्सप्लांट्स को धीरे-धीरे रक्त अवशेषों को हटाने के लिए चिमटी के साथ तरल में हिलाकर धो लें।
    नोट: पीबीएस के साथ पेट्री डिश में नमूनों को पूर्व-धोने के लिए विच्छेदन करें और उन्हें सूखने से रोकें और ऊतक प्रसंस्करण के लिए निष्फल/आटोक्लेव उपकरण का उपयोग करें।

3. प्रवाह प्रयोग

  1. एक बाँझ हुड के तहत, प्रवाह कक्षों के उपयोगकर्ता मैनुअल के अनुसार luer ताले का उपयोग करके जलाशय की बोतल में श्रृंखला में पांच कक्षों को कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: संबंधित मैनुअल के अनुसार, उपयोग करने से पहले सभी सामग्रियों को स्टरलाइज़ और/या आटोक्लेव करें। बाँझ गैस विनिमय के लिए जलाशय की बोतल पर एक एयर फिल्टर का उपयोग करें। कक्षों को खोलने और बंद करने के लिए, धीरे से कक्षों के लग्स में निचोड़ें। चरण 3.1. पहले भी तैयार किया जा सकता है।
  2. कक्षों को उल्टा कर दें और नीचे को हटाकर उन्हें खोलें। ऊपर की ओर इशारा करते हुए पिन के साथ कक्षों के शीर्ष भाग में केंद्रीय धातु प्लेटों हस्तांतरण संदंश का प्रयोग करें.
  3. पूर्व-गर्म माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) के 1 एमएल के साथ कक्षों को भरें। फिर जलाशय को अतिरिक्त 20 एमएल से भरें। सर्किट को कुल 25 एमएल की आवश्यकता होती है, जिसमें प्रत्येक प्रवाह कक्ष में मात्रा, ट्यूबों और जलाशय की बोतल शामिल है। प्रवाह के तहत, एक भरे हुए कक्ष में माध्यम की अंतिम मात्रा 2 एमएल है।
  4. संदंश का प्रयोग करें और कक्ष में धातु की थाली की सुइयों के बीच एक के बाद एक villous explant हस्तांतरण. ऊतक के पंचर से बचने के लिए सुइयों को अपरा विली के बीच स्लाइड करने दें। चार एक्सप्लांट को एक कक्ष में स्थानांतरित करें। नीचे सावधानी से refitting द्वारा कक्षों बंद करें. एक पूर्ण सर्किट में कुल 20 एक्सप्लांट होते हैं। कक्षों को उल्टा स्थिति में रहने की जरूरत है।
    नोट: संदंश के साथ धीरे explants समझ; उन्हें निचोड़ने की कोशिश न करें। सुनिश्चित करें कि रिसाव को रोकने के लिए कक्षों और सर्किट को पूरी तरह से सील कर दिया गया है। कक्षों का उपयोग हमेशा उल्टा किया जाता है। प्रति कक्ष एक्सप्लांट की संख्या और कक्षों की संख्या स्वयं परिवर्तनशील हैं। पहली-तिमाही ऊतक के लिए प्रक्रिया एक छोटे से जोड़ के साथ तीसरे-तिमाही ऊतक के समान है: विली को ठीक करने के लिए, ऊतक को धातु की प्लेट में स्थानांतरित करने के बाद एक्सप्लांट पर सुइयों को थोड़ा मोड़ें (व्यक्तिगत संचार ब्रुगर एट अल। यह धातु की प्लेट पर नाजुक ऊतक को ठीक करता है और नमूनों को फिसलने से रोकता है।
  5. प्रवाह विधानसभा को बायोरिएक्टर में स्थानांतरित करें।
  6. पंप टयूबिंग को पंप से जोड़कर बायोरिएक्टर के भीतर प्रवाह सर्किट को क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से कनेक्ट करें। इसे 4वें चरण पर ठीक करें (एक इसे चार बार क्लिक करते हुए सुनेगा)।
  7. यदि एक स्थिर नियंत्रण की आवश्यकता है, तो अच्छी तरह से प्लेट को बायोरिएक्टर में भी रखें।
    नोट: स्थैतिक संस्कृति के लिए, छह-अच्छी प्लेट के पांच कुओं को प्रति अच्छी तरह से मध्यम के 4 एमएल और प्रति अच्छी तरह से 4 विलस एक्सप्लांट्स से भरा जाता है। भरी हुई अच्छी प्लेट को बायोरिएक्टर में भी रखा जाता है और उसी वातावरण में सुसंस्कृत किया जाता है जैसे प्रवाह संस्कृति का उत्सर्जन होता है। अधिक विवरण कुपर एट अल में वर्णित हैं।
  8. मेनू आइटम "पंप्स" के तहत पंप मोड को मैनुअल पर सेट करें। फिर पंप की गति को 1 एमएल/मिनट पर सेट करें और रन पर क्लिक करके माध्यम को टयूबिंग में पंप करना शुरू करें। जबकि सर्किट को माध्यम से भरा जा रहा है, कक्षों को एक कोण पर पकड़ें ताकि वे पूरी तरह से माध्यम से भर जाएं।
    नोट: अपरा विलस प्रवाह और स्थिर संस्कृति के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए पूरक तालिका 1 देखें। प्रवाह और स्थैतिक प्रणाली के विनिर्देश पूरक तालिका 2 में प्रदान किए गए हैं।
    चेतावनी: सुइयों से फिसलने से नमूनों को रोकने के लिए भरने के दौरान कक्ष को सावधानी से झुकाएं।
  9. भरने के पूरा होने के बाद, कक्ष अपनी उल्टी स्थिति में रहते हैं। सुनिश्चित करें कि कक्ष सुरक्षित और सीधे खड़े हैं, और बायोरिएक्टर के दोनों ढक्कन बंद कर दें।
    नोट: एक भरे हुए प्रवाह कक्ष में माध्यम की अंतिम मात्रा 2 एमएल है। प्रयोगात्मक सेटिंग्स और प्रवाह कक्षों और अच्छी तरह से प्रयोगों में इस्तेमाल प्लेटों के विनिर्देशों Kupper एट अल 3 में वर्णित हैं
  10. वांछित समय के लिए ऊतक सेते हैं.
    नोट: बायोरिएक्टर के ढक्कन को फिर से खोले बिना कंप्यूटर पर तापमान, गैस स्तर और प्रवाह दर की निगरानी की जा सकती है।
  11. मेनू आइटम "पंप्स" के तहत गर्भपात पर क्लिक करके वांछित समय के लिए ऊतक के इनक्यूबेशन के बाद पंप बंद करो। बायोरिएक्टर के दो ढक्कन खोलें और फिर एक समय में एक प्रवाह कक्ष। ध्यान से संदंश का उपयोग धातु की थाली से explants हटा दें.
  12. चयनित बहाव विश्लेषण के अनुसार ऊतक और सतह पर तैरनेवाला प्रक्रिया. इस मामले में, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी3 प्रदर्शन किया गया. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के विवरण के लिए पूरक तालिका 3 देखें।
    नोट: ऊतक को हटाने के बाद, पंप के वामावर्त घुमाव द्वारा सर्किट से माध्यम को सूखा दें।
  13. प्रवाह कक्षों और टयूबिंग के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह सर्किट को अलग और साफ करें।

Representative Results

इस प्रकाशन के कुछ हिस्सों और इसके परिणामों को पहले ही प्रकाशित किया जा चुका है (संदर्भ 3 और 23 देखें)।

प्रायोगिक सेटअप
एक प्रयोगात्मक सेटअप चित्रा 1 में सचित्र है. एक समग्र प्रवाह चक्र में पांच प्रवाह कक्ष शामिल हैं जो श्रृंखला(चित्रा 1ए)में परस्पर जुड़े हुए हैं। प्रत्येक प्रवाह कक्ष के भीतर, चार प्रत्यारोपण, लगभग 0.5 सेमी के एक पार अनुभागीय व्यास के साथ प्रत्येक, (चित्रा 1 ए, सी) खेती कर रहे हैं. स्थैतिक नियंत्रण प्रयोग के लिए, एक्सप्लांट्स की खेती छह-अच्छी प्लेट (चित्रा 1बी)के अलग-अलग कुओं में की जाती है। एक्सप्लांट्स को फ्लश होने से रोकने के लिए, उन्हें धातु की प्लेटों पर चिपका दिया जाता है जिसमें संकीर्ण सुई के आकार के प्रोट्रूशियंस (चित्र 1 डी, ई) होते हैं। एक्सप्लांट्स को माध्यम के प्रत्यक्ष प्रवाह के अधीन करने के लिए, कक्षों को उलटा किया जाता है, इनलेट्स और आउटलेट हेड सेक्शन (चित्रा 1 एफ, जी) पर तैनात होते हैं। बायोरिएक्टर के भीतर, प्रवाह चक्र एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ा हुआ है। प्रवाह सुसंस्कृत ऊतक और पारंपरिक रूप से स्थिर-सुसंस्कृत ऊतक के बीच ऊतक अखंडता की तुलना करने के उद्देश्य से, प्रवाह चक्र से सटे छह-अच्छी प्लेट में एक्सप्लांट्स को रखा जाता है। यह ऑक्सीजन, तापमान, और आर्द्रता (चित्रा 1 ए)3के संदर्भ में लगातार संस्कृति की स्थिति के सत्यापन को सुनिश्चित करता है।

रूपात्मक विश्लेषण

β-एक्टिन
विभिन्न इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला प्रक्रियाओं को विविध खेती की स्थिति(चित्रा 2)से जुड़े ऊतक अखंडता में हिस्टोलॉजिकल भेदों की जांच करने के लिए आयोजित किया गया था। एक्सप्लांट्स जो तुरंत पोस्ट-विच्छेदन एम्बेडेड थे, आधारभूत संदर्भ के रूप में कार्य करते थे। विलस एक्सप्लांट्स के भीतर एक्टिन साइटोस्केलेटन के विश्लेषण के लिए, β-एक्टिन धुंधला हो जाना निष्पादित किया गया था(चित्र 2ए-ई)। वर्णनात्मक विश्लेषण ताजा प्राप्त ऊतक (चित्रा 2 ए) में साइटोस्केलेटन की एक अच्छी तरह से संरचित और संगठित दृश्य प्रस्तुति का अनावरण किया। समय के साथ, जैसे-जैसे खेती आगे बढ़ी, माइक्रोफिल्मेंट्स का एक अवलोकन योग्य एकत्रीकरण हुआ, जो साइटोस्केलेटल संरचना के क्षरण को दर्शाता है। इस घटना को लगातार विलस एक्सप्लांट्स में देखा गया था जो स्थिर खेती3 (चित्रा 2सी, ई, तारांकन द्वारा संकेत) से गुजरे थे।

एच एंड ई धुंधला हो जाना
एच&ई धुंधला अवलोकन के लिए अतिरिक्त सुदृढीकरण प्रदान किया कि ऊतक अखंडता स्थिर संस्कृति के पाठ्यक्रम में कम हो जाती है, एक प्रवृत्ति जो प्रवाह संस्कृति (चित्रा 2एफ-जे) के संदर्भ में सुव्यवस्थित होती है। ताजा ऊतक ने विलस एक्सप्लांट्स की एक संरचित और विशेषता ऊतकीय प्रस्तुति का प्रदर्शन किया, जो घने और कसकर पैक किए गए स्ट्रोमा (चित्रा 2एफ) की विशेषता है। इसके अतिरिक्त, सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट को अंतर्निहित स्ट्रोमा(चित्रा 2एफ)का दृढ़ता से पालन किया गया था। एक तुलनीय उपस्थिति 24 घंटे (चित्रा 2 जी) के लिए एक प्रवाह वातावरण में सुसंस्कृत खलनायक explants में उल्लेख किया गया था. हालांकि, प्रवाह के तहत खेती के 48 घंटे के बाद, सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट के कुछ हिस्सों को आंशिक रूप से अलग किया गया (चित्र 2I, तीर द्वारा इंगित), स्ट्रोमा के भीतर छिटपुट छोटे लैकुने के साथ। ऊतक की हिस्टोलॉजिकल जांच ने संकेत दिया कि एक स्थिर संस्कृति की स्थिति में 24 घंटे के बाद ऊतक की अखंडता अपर्याप्त रूप से संरक्षित थी(चित्रा 2एच)। इसके अलावा, यह अखंडता स्थिर संस्कृति (चित्रा 2J) में 48 घंटे के बाद स्पष्ट रूप से अपमानित हुई। स्ट्रोमा ने एक झरझरा और खड़ा उपस्थिति का प्रदर्शन किया, और स्ट्रोमा से सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट की महत्वपूर्ण टुकड़ी बड़े क्षेत्रों (चित्रा 2जे, तीर)3में स्पष्ट थी।

सीडी34II
CD34II धुंधला एंडोथेलियल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए नियोजित किया गया था और, परिणामस्वरूप, विलस एक्सप्लांट्स(चित्रा 2K-O)के भीतर भ्रूण-प्लेसेंटल रक्त वाहिकाएं। ऊतक जो सीधे विच्छेदन के ठीक बाद एम्बेडेड था, एंडोथेलियल कोशिकाओं(चित्रा 2के)की एक विशिष्ट संगठित व्यवस्था प्रदर्शित करता है। भ्रूण-अपरा रक्त वाहिकाओं की रूपात्मक अखंडता प्रवाह संस्कृति के 24 घंटे के बाद और अक्सर 48 घंटे के बाद भी अच्छी तरह से बनाए रखा गया था, हालांकि ढह रक्त वाहिकाओं के कभी-कभी उदाहरणों को प्रवाह की स्थिति(चित्रा 2 एल,एन) के तहत नोट किया गया था। हालांकि, स्थैतिक संस्कृति के 24 घंटे के बाद, रक्त वाहिकाओं ने आंशिक पतन का प्रदर्शन किया, जैसा कि उनके बाधित दृश्य उपस्थिति (चित्रा 2 एम, तीर के निशान द्वारा संकेत) द्वारा प्रमाणित है। स्थैतिक संस्कृति सेटिंग के भीतर रक्त वाहिकाओं की यह गिरावट लंबे समय तक खेती के समय के साथ तेज होती दिखाई दी। सारांश में, दोनों प्रवाह और स्थैतिक संस्कृति के बाद villous explants के वर्णनात्मक रूपात्मक मूल्यांकन ऊतक अखंडता और अधिक प्रभावी ढंग से प्रवाह प्रणाली के भीतर संरक्षित किया जा करने के लिए जब स्थिर संस्कृति मोड3 के साथ विपरीत प्रतीत होता है संकेत दिया.

खेती ऊतक का अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
विलस एक्सप्लांट्स की आकृति विज्ञान की अधिक विस्तृत परीक्षा आयोजित करने के लिए, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)(चित्रा 3ए-ई)का उपयोग करके अतिरिक्त अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण किए गए थे। इन निष्कर्षों ने हिस्टोलॉजिकल जांच के परिणामों की पुष्टि की। ऊतक में जो सीधे तैयारी के तुरंत बाद एम्बेडेड था, आकृति विज्ञान असाधारण रूप से अच्छी तरह से संरक्षित था(चित्रा 3ए)। माइक्रोविली सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट की सतह पर स्पष्ट रूप से स्पष्ट थे। सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट ने पार्श्व कोशिका सीमाओं के बिना अपनी विशिष्ट निरंतर परत प्रस्तुत की, जो तहखाने की झिल्ली के साथ सीधा संपर्क स्थापित करती है। ताजा ऊतक के स्ट्रोमा ने महत्वपूर्ण छिद्रों या टूटने के बिना घने पैकिंग का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, रक्त वाहिकाओं और व्यक्तिगत इंट्रावास्कुलर एरिथ्रोसाइट्स की अल्ट्रास्ट्रक्चरल उपस्थिति ने भी उत्कृष्ट संरक्षण(चित्रा 3ए)का प्रदर्शन किया।

प्रवाह संस्कृति के 24 घंटे के बाद भी, ऊतक के नमूनों की समग्र आकृति विज्ञान अपेक्षाकृत अच्छी तरह से बनाए रखा(चित्रा 3डी)बने रहे. जबकि ताजा ऊतक की तुलना में सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट की सतह पर थोड़ा कम माइक्रोविली थे, सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट मुख्य रूप से बेसल झिल्ली से जुड़ा रहा। नाभिक और कभी-कभी छोटे रिक्तिकाएं सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट के आंतरिक भाग के भीतर देखी जा सकती थीं। अपरा विली के भीतर स्ट्रोमा अच्छी तरह से संरक्षित दिखाई दिया और बारीकी से ताजा ऊतक (चित्रा 3 डी) जैसा दिखता था। प्रवाह संस्कृति के 48 घंटे के बाद भी, स्ट्रोमल कोशिकाओं ने अपेक्षाकृत अच्छे संरक्षण का प्रदर्शन किया, यद्यपि कुछ छिद्रों के साथ मौजूद(चित्रा 3ई)। दिलचस्प बात यह है कि ऊतक के भीतर लिपिड बूंदों का पता चला था। जबकि सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट ने रिक्तिकाएं और माइक्रोविली की संख्या में कमी प्रदर्शित की, यह कई क्षेत्रों में बेसल झिल्ली से जुड़ा रहा, और सिंकिटियल और सेल नाभिक स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे(चित्र 3ई)।

प्रवाह संस्कृति से ऊतक के विपरीत, स्थिर संस्कृति के अधीन विलस ऊतक की आकृति विज्ञान ने 24 घंटे(चित्रा 3बी)के रूप में जल्दी गिरावट का प्रदर्शन किया। सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट कई साइटों पर बेसल झिल्ली से अलग हो गया और अपेक्षाकृत पर्याप्त छिद्र प्रदर्शित किया। इसके अतिरिक्त, लिपिड बूंदें अक्सर सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट और स्ट्रोमा(चित्रा 3बी)दोनों में स्पष्ट थीं। स्थैतिक संस्कृति के 48 घंटे के बाद, अल्ट्रास्ट्रक्चर में एक प्रगतिशील गिरावट स्पष्ट थी(चित्रा 3सी)। सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट ने बेसल झिल्ली से काफी हद तक कई छिद्र और टुकड़ी प्रस्तुत की। स्ट्रोमा के भीतर कोशिकाओं की पहचान करना, साथ ही रक्त वाहिकाओं से युक्त एंडोथेलियल कोशिकाएं चुनौतीपूर्ण हो गईं। इसके अलावा, स्थिर संस्कृति(चित्रा 3सी)के 48 घंटे के बाद विलस एक्सप्लांट्स के भीतर लिपिड बूंदों का एक उल्लेखनीय संचय था। सारांश में, स्थैतिक संस्कृति में ऊतक के अल्ट्रास्ट्रक्चर ने खेती की अवधि की अवधि में लगातार गिरावट का प्रदर्शन किया, एक प्रवृत्ति जिसे प्रवाह की स्थिति3 के तहत खेती द्वारा कम किया गया था।

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करते हुए, विलस एक्सप्लांट्स की सतह की एक विस्तृत परीक्षा की सुविधा प्रदान की गई थी(चित्रा 4ए-जे)। ऊतक जो हौसले से एम्बेडेड किया गया था, इसकी सतह (चित्रा 4 ए, बी) में माइक्रोविली की घनी आबादी वाली सरणी का प्रदर्शन किया। कुछ क्षेत्रों ने पुटिका जैसी संरचनाओं का प्रदर्शन किया। इसके विपरीत, स्थैतिक संस्कृति से ऊतक ने 24 घंटे (चित्रा 4 सी, डी) के बाद माइक्रोविली में काफी कमी प्रकट की, एक कमी जो 48 घंटे(चित्रा 4ई,एफ)के बाद बनी रही। जबकि कुछ क्षेत्रों में पुटिका जैसी संरचनाओं का एकत्रीकरण दिखाया गया था जो जारी नहीं किए गए थे, अन्य क्षेत्र नंगे और नष्ट हो गए (चित्रा 4 डी, एफ) दिखाई दिए। प्रवाह संस्कृति के अधीन ऊतक में, माइक्रोविली अभी भी 24 घंटे (चित्रा 4 जी, एच) के बाद सतह पर मौजूद थे, साथ ही 48 एच (चित्रा 4 आई, जे) के बाद, हालांकि ताजा ऊतक की तुलना में कुछ हद तक। स्थैतिक संस्कृति की तुलना में, सतह पर पुटिका जैसी संरचनाओं की व्यापकता कम हो गई थी। दिलचस्प बात यह है कि इन पुटिका जैसी संरचनाओं को विशेष रूप से विशिष्ट अवकाश में केंद्रित किया गया था जहां प्रवाह कम या अनुपस्थित हो सकता है (चित्र 4एच, जे), यह सुझाव देते हुए कि वे माध्यम3 के प्रवाह के कारण प्रवाह-उजागर ऊतक सतह से उखाड़ फेंके गए होंगे।

Figure 1
चित्रा 1: प्रवाह प्रणाली की स्थापना। (ए) इकट्ठे प्रवाह प्रणाली, जलाशय और पांच प्रवाह कक्षों से मिलकर, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंपों में से एक से जुड़ा हुआ है। दाईं ओर एक छह-अच्छी प्लेट है जिसमें एक्सप्लांट स्थिर रूप से सुसंस्कृत हैं। (बी, सी) दोनों खेती के तरीकों के लिए, अपरा के नमूनों को लगभग 0.5 सेमी2 के विलस एक्सप्लांट्स में विच्छेदित किया जाता है, जिनमें से चार एक्सप्लांट तब प्रति कुएं या कक्ष में उपयोग किए जाते हैं। एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में, पांच कक्षों या कुओं का उपयोग किया जाता है। (डी, ई) प्रवाह संस्कृति के लिए, संकीर्ण सुई के आकार की ऊंचाई वाली एक धातु की प्लेट का उपयोग एक्सप्लांट्स को सुरक्षित करने के लिए किया जाता है। (एफ, जी) ट्यूबों के उद्घाटन कक्षों के सिर पर स्थित होते हैं, और इस प्रकार यह गारंटी देने के लिए उल्टा उपयोग किया जाता है कि ऊतक प्रत्यक्ष प्रवाह के संपर्क में है। यह आंकड़ा कुपर एट अल 3 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रवाह और स्थिर संस्कृति पर प्लेसेंटल विलस एक्सप्लांट्स का रूपात्मक विश्लेषण। (ए-ई) संस्कृति पर एक्सप्लांट्स के साइटोस्केलेटन की कल्पना करने के लिए β-एक्टिन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। विश्लेषण के लिए, छह बेतरतीब ढंग से चयनित स्पॉट प्रति स्लाइड का उपयोग किया गया। प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं। (ए) तैयारी के बाद सीधे एम्बेडेड ऊतक के साइटोस्केलेटन का दृश्य। स्केल बार: 20 माइक्रोन। (बीई) प्रवाह और स्थैतिक संस्कृति के सुसंस्कृत एक्सप्लांट्स में एक्टिन साइटोस्केलेटन के समय-निर्भर और खेती मोड-निर्भर अध: पतन दोनों का प्रतिनिधि चित्रण। (सीई) तारांकन बढ़े हुए एक्टिन माइक्रोफिलामेंट संचय को दर्शाता है, जो एक्टिन साइटोस्केलेटन गिरावट का संकेत है। (एफ-जे) "खलनायक एक्सप्लांट्स के हेमेटोक्सिलिन-ईोसिन धुंधला हो जाना"। स्केल बार: 100 माइक्रोन (एफ, जी) हौसले से एम्बेडेड ऊतक (एफ) और 24 घंटे (जी) के लिए प्रवाह संस्कृति एक्सप्लांट्स एक विलस एक्सप्लांट की एक अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान दिखाते हैं। (I) 48 घंटे के लिए फ्लो-सुसंस्कृत एक्सप्लांट्स सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट (तीर) के आंतरायिक रूप से अलग क्षेत्रों को दिखाते हैं। (एच, जे) स्थैतिक एक्सप्लांट संस्कृति के बाद संरचनात्मक अखंडता की समय-निर्भर गिरावट, सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट (तीर) और छिद्रित स्ट्रोमा के विघटन द्वारा इंगित की जाती है। (के-ओ) CD34 II का उपयोग विलस एंडोथेलियल कोशिकाओं को दागने के लिए किया गया था। स्केल बार: 100 माइक्रोन (के, एल) ताजा ऊतक (के) और प्रवाह की स्थिति (एल) के तहत 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत explants एक विशेषता संरचनात्मक गठबंधन endothelial सेल पैटर्न प्रदर्शित. (एन) प्रवाह संस्कृति में 48 घंटे के बाद, संवहनी अखंडता कुछ हद तक कम हो जाती है। (एम, ओ) स्थैतिक संस्कृति में, ढह गई रक्त वाहिकाएं पहले से ही 24 घंटे (एम) के बाद दिखाई देती हैं, जो लंबे समय तक स्थिर खेती के समय (ओ) के साथ बढ़ने के लिए देखी गई थीं। यह आंकड़ा कुपर एट अल 3 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विलस एक्सप्लांट्स की अल्ट्रास्ट्रक्चरल प्री- और पोस्ट-खेती परीक्षा। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से ऊतक छवियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. (ए) हौसले से एम्बेडेड ऊतक की एक प्रतिनिधि छवि सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट (एसटी) की सतह पर बड़ी मात्रा में माइक्रोविली (एमवी) दिखाती है। संरचनात्मक रूप से बरकरार केशिकाएं (सीए) अच्छी तरह से संरक्षित स्ट्रोमा (एस) में दिखाई देती हैं। (बी) ऊतक में जिसे 24 घंटे के लिए स्थैतिक रूप से सुसंस्कृत किया गया है, सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट की संरचनात्मक अखंडता में गिरावट है, जो कुछ क्षेत्रों में बेसल झिल्ली से डिस्कनेक्ट हो गया प्रतीत होता है। लिपिड बूंदों (एलडी) का एक ध्यान देने योग्य संचय भी है। (सी) स्थैतिक संस्कृति में 48 घंटे के बाद, गंभीर अल्ट्रास्ट्रक्चरल गिरावट देखी जाती है। स्ट्रोमा के साथ-साथ सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट छिद्रित होते हैं और लिपिड बूंदों का एक विशाल संचय स्पष्ट होता है। रक्त वाहिकाओं का शायद ही पता लगाया जा सके। (डी, ई) प्रवाह संस्कृति से ऊतक की अल्ट्रास्ट्रक्चर अपेक्षाकृत अच्छी तरह से 24 घंटे (डी) के बाद और साथ ही 48 घंटे (ई) के बाद संरक्षित थी। स्केल बार: 2 माइक्रोन। एमवी: माइक्रोविली, एसटी: सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट, एस: स्ट्रोमा, सीए: केशिका, एलडी: लिपिड बूंदें। यह आंकड़ा कुपर एट अल 3 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विलस एक्सप्लांट्स की अल्ट्रास्ट्रक्चरल प्री- और पोस्ट-खेती परीक्षा। (ए, सी, ई, जी, आई) संबंधित विस्तृत छवियों (बी, डी, एफ, एच, जे) के साथ अपरा विलस पेड़ों की सतह की छवियों का अवलोकन करें। (ए, बी) ताजा एम्बेडेड ऊतक माइक्रोविली के घने सीम को प्रदर्शित करता है। (B) कुछ स्थानों पर वेसिकुलर जैसी संरचनाएँ देखी जा सकती हैं। (सीएफ) स्थैतिक संस्कृति में 24 घंटे और 48 घंटे के बाद, सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट की सतह पर माइक्रोविली में कमी दिखाई देती है। हड़ताली एक्सप्लांट की सतह पर वेसिकुलर जैसे कणों का व्यापक संचय है। (एफ) कण स्थैतिक संस्कृति में 48 घंटे के बाद मुरझाते दिखाई देते हैं। (जी-जे) प्रवाह संस्कृति से ऊतक की सतह स्थिर संस्कृति की तुलना में 24 घंटे (जी, एच) के साथ-साथ 48 घंटे (आई, जे) के बाद बेहतर संरक्षित प्रतीत होती है। माइक्रोविली सतह (एच, जे) पर दिखाई देते हैं, हालांकि ताजा ऊतक के समान उच्च घनत्व में नहीं। (बी) वेसिकुलर कणों को कम प्रवाह के साथ निचे में बिखरे हुए देखा जा सकता है। यह आंकड़ा कुपर एट अल 3 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: अपरा विलस प्रवाह और स्थिर संस्कृति के लिए प्रायोगिक सेटिंग्स। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: प्रवाह और स्थैतिक प्रणाली के विनिर्देशों। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 3: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एंटीबॉडी इस अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह अध्ययन गर्भाशय पर्यावरण 3,23 में गतिशील को दोहराने के लिए डिज़ाइन किए गए प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स के लिए एक प्रवाह संस्कृति तकनीक पर एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य का परिचय देता है। निष्कर्षों से पता चलता है कि प्रवाह की स्थिति के तहत सुसंस्कृत ऊतक की आकृति विज्ञान पारंपरिक स्थैतिक खेती विधि3 की तुलना में बेहतर संरक्षित है। विशेष रूप से, भले ही न तो स्थिर और न ही प्रवाह संस्कृति की स्थिति अपरा वाहिकाओं के छिड़काव की सुविधा, खलनायक स्ट्रोमा के अंदर भ्रूण-अपरा रक्त वाहिकाओं के विनाश मुख्य रूप से स्थिर संस्कृति में मनाया गया था, जबकि रक्त वाहिकाओं की अखंडता बेहतरप्रवाह संस्कृति 3 में एक लंबी अवधि से अधिक बनाए रखा जा करने के लिए दिखाई दिया.

इस अवलोकन के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण syncytiothoblast की महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक और अंतःस्रावी भूमिका से जोड़ा जा सकता है, एक समारोह साहित्य 12,24,25,26 में अच्छी तरह से प्रलेखित. इसे देखते हुए, यह बोधगम्य है कि विली की बाहरी परत की समग्र अखंडता रक्त वाहिकाओं सहित अंतर्निहित स्ट्रोमा के रखरखाव में महत्वपूर्ण योगदान देती है। नतीजतन, प्रवाह की स्थिति के तहत रक्त वाहिकाओं की निरंतर सेलुलर अखंडता को माध्यम के निरंतर प्रवाह के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। यह आंदोलन एक्सप्लांट्स की निष्क्रिय गति में सहायता करता है, जिससे प्लेसेंटल बाधा के पार गैसों, पोषक तत्वों और नैनोकणों (जैसे बाह्य पुटिकाओं) के आदान-प्रदान की सुविधा मिलती है। यह, बदले में, रक्त वाहिका आकृति विज्ञान के संरक्षण को सकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, mechanosensation की घटना विभिन्न ऊतकों27,28 भर में ऊतक morphogenesis में एक भूमिका निभाता है. अध्ययनों से पता चला है कि mechanosensitivity कई स्तरों पर सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करता है, जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं है कि अंततः ऊतक और अंग कार्यक्षमता29 को प्रभावित की एक श्रृंखला ट्रिगर. विशेष रूप से, mechanosensitive प्रोटीन गर्भ28 भर syncytiotrophoblast द्वारा व्यक्त कर रहे हैं. इसके अलावा, अध्ययन से पता चलता है कि ऊतक की सतह पर माइक्रोविली इस संदर्भ28 में फंसाया जा सकता है.

विचार करने लायक एक अतिरिक्त परिप्रेक्ष्य प्रवाह के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में माइटोकॉन्ड्रिया की संभावित भूमिका है। उदाहरण के लिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं में, माइटोकॉन्ड्रिया पर्यावरणीय उत्तेजनाओं30 के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के लिए सिग्नल ट्रांसड्यूसर के रूप में कार्य करते हैं। टीईएम3 के माध्यम से स्थिर सुसंस्कृत ऊतक में मनाया लिपिड बूंदों की वृद्धि संचय, माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता31 के कारण एपोप्टोसिस प्रेरण के साथ जुड़ा हुआ है। अंतर्निहित तंत्र और प्रमुख कारकों का अनावरण करने के लिए आगे की जांच आवश्यक है, उन्हें डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गों से जोड़ना। यह अन्वेषण हमारी समझ को बढ़ा सकता है कि ऊतक कैसे मानता है और कतरनी तनाव पर प्रतिक्रिया करता है, संस्कृति23 में विलस एक्सप्लांट्स की बेहतर व्यवहार्यता और अखंडता में अनुवाद करता है।

कई महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल कदम दोहराया और देखभाल के साथ निष्पादित किया जाना चाहिए. प्लेसेंटल डिलीवरी के बाद, ऊतक को यथासंभव तेजी से सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। एक्सप्लांट की तैयारी के दौरान, दृश्यमान रोधगलन वाले क्षेत्रों से बचना महत्वपूर्ण है। धीरे निचोड़ को रोकने के लिए संदंश के साथ explants संभाल महत्वपूर्ण है. पूरी प्रक्रिया में ऊतक को तरल से ढंककर रखने और इसे तेजी से संचालित करने की सिफारिश की जाती है।

यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि इस अध्ययन प्रस्तुत प्रवाह प्रणाली, जो भविष्य की जांच 3,23 में एक सीमा के रूप में माना जाना चाहिए के भीतर सटीक कतरनी तनाव निर्दिष्ट करने में असमर्थ है. फिर भी, यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि विवो में एक विशिष्ट प्लेसेंटल विलस के लिए सटीक प्रवाह वेग और कतरनी तनाव कई मापदंडों से प्रभावित होते हैं, जैसे कि इंटरविलस स्पेस की ज्यामितीय विशेषताएं, इस स्थान के भीतर विलस का स्थान, और इसकी निकटता और मातृ सर्पिल धमनियों और गर्भाशय नसों के लिए कोण 3,19,23,32 . नाल की ज्यामितीय संरचना, जो व्यक्तियों के बीच भिन्न होता है की जटिलता,23,32 के रूप में अच्छी तरह से खाते में लिया जाना चाहिए. गणितीय मॉडल intervillous अंतरिक्ष32 के भीतर रक्त के प्रवाह का अनुमान और syncytiotrophoblast19,28 पर दीवार कतरनी तनाव पर गणना पहले से ही मौजूद हैं. दिलचस्प बात यह है कि एक अध्ययन ने भविष्यवाणी की है कि सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट पर कतरनी तनाव पहली तिमाही28 की तुलना में तीसरी तिमाही में कम है, जबकि दूसरे ने सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट19 पर स्थानिक रूप से विषम दीवार कतरनी तनाव का प्रदर्शन किया। एक विशिष्ट अपरा विलस के लिए सटीक प्रवाह वेग और कतरनी तनाव का निर्धारण एक चुनौती 3,19,23,32 बनी हुई है। इस तरह की गणना भविष्य की जांच के लिए कतरनी तनाव सीमा का एक सन्निकटन प्रदान करते हैं, लेकिन वे चल रहे शारीरिक समायोजन और अनुकूलन23 की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, भविष्य के अध्ययन नई और परिष्कृत प्रवाह के माध्यम से संस्कृति तकनीक है कि intervillous अंतरिक्ष और रणनीतियों के जटिल ज्यामिति के लिए खाते प्रयोग3 प्रति नमूनों की संख्या में वृद्धि विकसित कर सकते हैं. प्रवाह प्रणाली की चल रही प्रगति और विकास का अनुमान है, संभावित रूप से वैकल्पिक प्रवाह कक्षों को नियोजित करना (ब्रुगर एट अल., अप्रकाशित डेटा, 2023)।

अंत में, यह अध्ययन आसानी से लागू करने योग्य पूर्व विवो प्रवाह संस्कृति तकनीक का प्रदर्शन करके एक मजबूत नींव रखता है जो सुसंस्कृत विलस एक्सप्लांट्स की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है। यह अपरा कार्यात्मक जीव विज्ञान अध्ययन में गतिशील तकनीकों के महत्व को रेखांकित करता है, प्रवाह संस्कृति प्रणालियों में आगे की प्रगति और नए विचारों औरपरिकल्पनाओं की पीढ़ी 3,23 के लिए मार्ग प्रशस्त करता है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक कृतज्ञतापूर्वक ऊतक नमूनाकरण के लिए बेट्टीना एमटमैन और पेट्रा विंकलर के उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन की सराहना करते हैं। इस शोध को ऑस्ट्रियाई साइंस फंड एफडब्ल्यूएफ (डीओसी 31-बी 26) और मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ ग्राज़, ऑस्ट्रिया द्वारा पीएचडी प्रोग्राम इंफ्लेमेटरी डिसऑर्डर इन प्रेग्नेंसी (डीपी-आईडीपी) के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plates NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 140675
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA A21422 Diluted in PBS, 1:200
antibody diluent Dako, Santa Clara, CA, USA S3022
anti-β-actin (AC-15) Abcam, Cambridge, UK ab6276 Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000
Bioreactor TEB500 TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117
CD34 Class II (QBEnd-10) Dako, Santa Clara, CA, USA M7165 Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500
CPD 030 critically point dryer Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) Critically point dryer
DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA D21490 Diluted in PBS, 1:1000
Ebers TEB505 Series Software TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain  Series Software 1.4
Endothelial Cell Growth Medium MV PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;  C-22120 Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used
Excelsior AS Tissue Processor  ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Exosome-depleted fetal bovine serum Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA A2720803
Histolab Clear Histolab, Askim, Sweden 14250-TY
Hydrogen Peroxide Block ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TA125H202Q
Kaiser’s Glycerin Gelatine Merck, Darmstadt, Germany 1092420100
Leica DM 6000 B microscope Leica, Wetzlar, Germany Equipped with an Olympus DP 72 Camera
Leica UC7 ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna, Austria)
Metal plate with needles In-house construction
Microtome  Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Microwave oven Miele, Guetersloh, Germany
Olympus microscope  (BX63) Olympus, Hamburg, Germany Serial Number: 1A52421
PBS ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Penicillin/Streptomycin  Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 2585627
Primary antibody enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TL-125-PB
ProLong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA P36934
Pumping tube Tygon, Bartelt, Graz, Austria 6.078 175  1.02 mm diameter 
QV500 Flow chambers Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK QV500  Other chambers would work as well
SCD 500, sputter coater Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein Sputter coater
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit Abcam, Cambridge, UK ab64252
Superfrost Plus slides  Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
Syringe Filter Corning Incorporated, NY, USA 431219 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle 
TAAB epoxy resin Agar Scientific, Stansted, Essex, UK T001
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer  ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TL-125-HL
UltraVision Protein Block ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TA125BPQ
Zeiss EM 900 transmission electron microscope Zeiss, Oberkochen, Germany
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope Zeiss, Cambridge, UK Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage

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Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M.,… More

Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero. J. Vis. Exp. (199), e65919, doi:10.3791/65919 (2023).

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