Summary
Hier ist ein Protokoll für die Kultivierung von Plazenta-Explantaten unter konstanten Flussbedingungen. Dieser Ansatz verbessert traditionelle statische Zottenkultursysteme, indem er die Replikation dynamischer physiologischer Umgebungen ermöglicht.
Abstract
Die existierenden ex vivo Plazenta-Explantat-Kulturmodelle basieren hauptsächlich auf statischen Kultursystemen unter Verwendung von Well-Platten. Diese Modelle spiegeln jedoch nur unzureichend die Dynamik in utero wider, in der die Plazenta aufgrund des Plasma- oder Blutflusses einer konstanten leichten Scherbelastung ausgesetzt ist. Um dieser Einschränkung zu begegnen, wurde ein Flow-Culture-System entwickelt, um die Ex-vivo-Plazenta-Explantat-Kultivierung näher an die In-utero-Flow-Bedingungen im mütterlichen Körper heranzuführen. Bei diesem Ansatz werden plazentare Explantaten in einer Sequenz von fünf miteinander verbundenen Strömungskammern kultiviert. Diese Einstellung sorgt für physiologische Sauerstoffkonzentrationen und eine gleichbleibende Durchflussrate. Die gesammelten Daten zeigen, dass die Erhaltung der Gewebemorphologie unter Strömungsbedingungen im Vergleich zu herkömmlichen statischen Methoden eine deutliche Verbesserung aufweist. Diese innovative Technik führt eine unkomplizierte Methode der Ex-vivo-Plazenta-Explantatkultur ein und bietet eine getreuere Darstellung der dynamischen In-vivo-Umgebung. Darüber hinaus eröffnet diese Studie neue Möglichkeiten zur Untersuchung der funktionellen Dynamik der feto-maternalen Grenzfläche. Durch die Anwendung praktikabler dynamischer Methoden wird ein tieferes Verständnis der Plazentabiologie ermöglicht, was ihre Bedeutung für die Gesundheit von Mutter und Fötus unterstreicht.
Introduction
Seit den 1960er Jahren wird die Plazenta-Explantat-Kultivierung auf dem Boden einer Well-Platte zur Untersuchung der feto-maternalen Schnittstelle verwendet 1,2,3. Diese Methode ist gut etabliert und unkompliziert und ermöglicht die Verwendung von menschlichem Gewebe für verschiedene Studien zusätzlich zu Kulturen einzelner Zellen 2,3. Im Laufe der Zeit wurden experimentelle Designs für plazentare Explantatskulturen im Hinblick auf die Sauerstoffkonzentration4 und um zu verhindern, dass sich das Gewebe am Boden der Well-Platte absetzt 2,5,6, modifiziert. Diese Methode wurde jedoch nicht an die In-vivo-Bedingungen in der Gebärmutter angepasst, insbesondere an das Vorhandensein eines konstanten Flusses3.
Der Erfolg einer Schwangerschaft hängt von einer ausreichenden und gleichmäßigen Durchblutung des intervillösen Raumes mit mütterlichem Blut ab, wodurch ein dynamischer Kreislauf mit kontinuierlichem Zu- und Abfluss von Blut und blutstäblichen Substanzen entsteht 7,8,9,10,11,12. Die Plazenta verfügt über zwei unterschiedliche Blutversorgungssysteme, eines für mütterliches Blut und eines für fetales Blut, was zu einer doppelten Perfusion sowohl durch das fötale als auch durch das mütterliche System führt13. Das mütterliche Blut beginnt am Ende des ersten Trimesters den intervillösen Raum der Plazenta zu durchbluten und fließt langsam durch die erweiterten Spiralarterien der Gebärmutter10,11,14. Folglich werden die Plazentazottenbäume in mütterlichem Blut gebadet, wodurch der Fötus mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt wird. Dieses mütterliche Blut fließt durch den intervillösen Raum, bevor es über die Gebärmuttervenen in den mütterlichen Kreislauf zurückkehrt. Während der Passage durch den intervillösen Raum führen die Diffusion und die aktive Aufnahme von Sauerstoff und Nährstoffen in das Blut des Fötus zu niedrigeren Sauerstoff- und Nährstoffwerten im mütterlichen Blut12,15. Das Blut des intervillösen Raumes wird jedoch etwa zwei- bis dreimal pro Minute vollständig durch frisches, sauerstoffreiches Blut ersetzt, wodurch eine kontinuierliche Versorgung mit Nährstoffen und Gasen gewährleistetwird 13. Bemerkenswert ist, dass der Synzytiotrophoblast, der äußerste Teil der Plazentaschranke, der einzige Bestandteil des Plazentazottenbaums ist, der direkt dem mütterlichen Blut ausgesetzt ist15,16,17. Folglich erfährt der Synzytiotrophoblast eine konstante leichte Scherbelastung durch das fließende mütterliche Blut 3,14.
Aktuelle wissenschaftliche Erkenntnisse über die Plazentaflussumgebung und moderne technische Fortschritte erlauben heute eine angepasste und physiologisch angenäherte Kultivierung von Plazentaexplantaten unter Strömungsbedingungen. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass Scherkräfte die biologischen Funktionen des Synzytiotrophoblastbeeinflussen 18,19,20,21. Ein bekannter Ansatz, der den Blutfluss berücksichtigt, ist das plazentare zweilappige Perfusionssystem22. Diese Experimente erfordern jedoch erhebliches Fachwissen, sind zeitlich begrenzt (nur wenige Stunden durchgeführt) und sind nur mit Plazentaproben aus dem dritten Trimester durchführbar 3,23. Im Gegensatz dazu haben wir eine unkomplizierte und nicht-intrusive Technik für die ex vivo Plazentazottenzotten-Explantatskultur unter konstanten Flussbedingungen entwickelt, die sowohl Plazentagewebeim ersten als auch im dritten Trimester berücksichtigt 3. In diesem Aufbau werden Plazenta-Explantaten in fünf in Reihe geschalteten Strömungskammern kultiviert. Die villösen Explantaten werden mit nadelförmigen Erhebungen auf dünnen Metallplatten am Boden der Kammer befestigt. Der aufgebaute Strömungskreislauf wird anschließend in einen Bioreaktor überführt, in dem sowohl die Sauerstoffkonzentration als auch die Durchflussrate geregelt werden3. Die Ergebnisse der Durchflusskultur zeigen, dass die Gewebeintegrität im Vergleich zur typischerweise verwendeten statischen Methode besser erhalten bleibt3. Darüber hinaus ermöglicht dieser dynamische Ansatz neuartige und angepasste Versuchsdesigns für die Kultivierung von Gewebeexplantaten, die In-vitro-Experimente ermöglichen, die die natürliche Umgebung besser nachahmen3.
Protocol
Die Ethikkommission der Medizinischen Universität Graz hat diese Studie genehmigt (31-019 ex 18/19 Version 1.2 und 29-319 ex 16/17). Alle an der Studie beteiligten Probanden erhielten eine Einverständniserklärung.
1. Vorbereitung auf das Strömungsexperiment
HINWEIS: Die Experimente werden in einem Bioreaktor mit integrierten Peristaltikpumpen durchgeführt (siehe Materialtabelle). Die Luftfeuchtigkeit, die Temperatur und der Gasgehalt im Inneren des Bioreaktors können eingestellt werden.
- Schalten Sie den Bioreaktor ein und treffen Sie alle Vorkehrungen (z. B. Kalibrierung der Pumpen, Vorwärmung, Gasbedingungen und Feuchtigkeit) für das Experiment gemäß dem Handbuch des Bioreaktors. Vor Beginn des Experiments sollten die erforderlichen Einstellungen (Temperatur, Gasgehalt, Luftfeuchtigkeit) für einige Stunden oder über Nacht stabilisiert werden. Starten Sie dazu den Bioreaktor und die Software und klicken Sie anschließend unter dem Menüpunkt "Inkubator" auf Sollwerte ändern .
- PBS und das erforderliche Medium (Endothelzellwachstumsmedium, ergänzt mit den mitgelieferten Nahrungsergänzungsmitteln hEGF-5, HC-500 sowie 5 % exosomenarmiertem fötalem Kälberserum, 1 % Penicillin/Streptomycin) (siehe Materialtabelle) auf 37 °C vorwärmen.
2. Präparation der Plazentaprobe
- Unmittelbar nach der Entbindung werden drei mal 2 cm 3 Plazentaproben aus dem mittleren Plazentabereich geschnitten, wie in Kupper et al. beschrieben.3 Kurz gesagt, bewahren Sie die Proben in PBS auf. Verwerfen Sie die Chorionplatte, die mütterliche Dezidua und Bereiche mit sichtbaren Infarkten aus der Probe.
- Die verbleibende Gewebeprobe wird in zottenartige Explantaten mit einem Querschnittsdurchmesser von ca. 0,5 cm (Nassgewicht ca. 7,5 mg) zerlegt. Gib sie in eine Petrischale mit frischem PBS.
- Waschen Sie die Explantate in PBS, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette in der Flüssigkeit schütteln, um Blutreste zu entfernen.
HINWEIS: Sezieren Sie die Proben in einer Petrischale mit PBS, um sie vorzuwaschen und vor dem Austrocknen zu schützen, und verwenden Sie sterilisierte/autoklavierte Werkzeuge zur Verarbeitung des Gewebes.
3. Strömungs-Experiment
- Verbinden Sie unter einer sterilen Haube fünf Kammern in Reihe mit der Vorratsflasche mit den Luer-Locks gemäß der Bedienungsanleitung der Durchflusskammern (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Sterilisieren und/oder autoklavieren Sie alle Materialien vor dem Gebrauch gemäß dem jeweiligen Handbuch. Verwenden Sie einen Luftfilter an der Vorratsflasche für den sterilen Gasaustausch. Um die Kammern zu öffnen und zu schließen, drücken Sie die Laschen der Kammern vorsichtig hinein. Schritt 3.1. kann auch früher zubereitet werden. - Drehen Sie die Kammern auf den Kopf und öffnen Sie sie, indem Sie den Boden entfernen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Metallplatten mittig im oberen Teil der Kammern mit den Stiften nach oben zu übertragen.
- Füllen Sie die Kammern mit 1 ml vorgewärmtem Medium (37 °C). Füllen Sie dann das Reservoir mit weiteren 20 ml. Der Kreislauf benötigt insgesamt 25 ml, einschließlich des Volumens in jeder Durchflusskammer, in den Röhrchen und der Vorratsflasche. Unter dem Durchfluss beträgt das Endvolumen des Mediums in einer gefüllten Kammer 2 ml.
- Verwenden Sie eine Pinzette und führen Sie ein villöses Explantat nach dem anderen zwischen die Nadeln der Metallplatte in der Kammer. Lassen Sie die Nadeln zwischen die Plazentazotten gleiten, um eine Punktion des Gewebes zu vermeiden. Überführen Sie vier Explantate in eine Kammer. Schließen Sie die Kammern, indem Sie den Boden vorsichtig wieder anbringen. Ein kompletter Kreislauf enthält insgesamt 20 Explantate. Die Kammern müssen auf dem Kopf stehend bleiben.
HINWEIS: Fassen Sie die Explantate vorsichtig mit der Pinzette; Versuchen Sie, sie nicht zu quetschen. Stellen Sie sicher, dass die Kammern und der Kreislauf vollständig abgedichtet sind, um Leckagen zu vermeiden. Die Kammern werden immer verkehrt herum verwendet. Die Anzahl der Explantate pro Kammer und die Anzahl der Kammern selbst sind variabel. Das Verfahren für Gewebe im ersten Trimester ist ähnlich wie für Gewebe im dritten Trimester mit einer kleinen Ergänzung: Um die Zotten zu fixieren, biegen Sie die Nadeln leicht über die Explantate, nachdem das Gewebe auf die Metallplatte übertragen wurde (persönliche Mitteilung Brugger et al.). Dadurch wird das zerbrechliche Gewebe auf der Metallplatte fixiert und ein Abrutschen der Proben verhindert. - Überführen Sie die Durchflusseinheit in den Bioreaktor.
- Verbinden Sie den Durchflusskreislauf mit der Peristaltikpumpe im Bioreaktor, indem Sie den Pumpenschlauch mit der Pumpe verbinden. Befestigen Sie es auf der 4. Stufe (man hört es viermal klicken).
- Wenn eine statische Kontrolle erforderlich ist, dann legen Sie auch die Well-Platte in den Bioreaktor.
HINWEIS: Für die statische Kultur werden fünf Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 4 ml Medium pro Well und 4 villösen Explantaten pro Well gefüllt. Die gefüllte Well-Platte wird ebenfalls in den Bioreaktor gelegt und in der gleichen Atmosphäre wie die Flow-Kultur-Explantate kultiviert. Weitere Details sind in Kupper et al.3 beschrieben - Stellen Sie den Pumpenmodus unter dem Menüpunkt "Pumpen" auf Manuell. Stellen Sie dann die Pumpendrehzahl auf 1 mL/min ein und beginnen Sie mit dem Pumpen des Mediums in den Schlauch, indem Sie auf Run klicken. Während der Kreislauf mit Medium gefüllt wird, halten Sie die Kammern schräg, so dass sie vollständig mit Medium gefüllt sind.
ANMERKUNG: Siehe Ergänzende Tabelle 1 für die Versuchseinstellungen für den Plazentazottenfluss und die statische Kultur. Spezifikationen des Durchflusses und des statischen Systems sind in der Ergänzenden Tabelle 2 enthalten.
VORSICHT: Kippen Sie die Kammer während des Befüllens vorsichtig, um zu verhindern, dass die Proben von den Nadeln rutschen. - Nach Beendigung der Befüllung verbleiben die Kammern in ihrer auf dem Kopf stehenden Position. Stellen Sie sicher, dass die Kammern sicher und aufrecht stehen, und schließen Sie beide Deckel des Bioreaktors.
HINWEIS: Das Endvolumen des Mediums in einer gefüllten Durchflusskammer beträgt 2 ml. Die experimentellen Einstellungen und die Spezifikationen der in den Experimenten verwendeten Durchflusskammern und Well-Platten sind in Kupper et al.3 beschrieben - Inkubieren Sie das Gewebe für die gewünschte Zeit.
HINWEIS: Die Temperatur, der Gasstand und die Durchflussmenge können am Computer überwacht werden, ohne den Deckel des Bioreaktors erneut zu öffnen. - Stoppen Sie die Pumpe nach der Inkubation des Gewebes für die gewünschte Zeit, indem Sie unter dem Menüpunkt "Pumpen" auf Abbruch klicken. Öffnen Sie die beiden Deckel des Bioreaktors und dann eine Durchflusskammer nach der anderen. Entferne die Explantate vorsichtig mit einer Pinzette von der Metallplatte.
- Verarbeiten Sie das Gewebe und den Überstand entsprechend der ausgewählten Downstream-Analyse. In diesem Fall wurden immunhistochemische Färbungen und Elektronenmikroskopie durchgeführt3. Ergänzende Tabelle 3 enthält Einzelheiten zu den Antikörpern, die für die Immunhistochemie und die Immunfluoreszenz verwendet werden.
HINWEIS: Nach dem Entfernen des Gewebes das Medium durch Drehen der Pumpe gegen den Uhrzeigersinn aus dem Kreislauf ablassen. - Zerlegen und reinigen Sie den Durchflusskreislauf gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Durchflusskammern und Schläuche.
Representative Results
Teile dieser Veröffentlichung und ihre Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht (siehe Referenzen 3 und 23).
Versuchsaufbau
Ein Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein zusammengesetzter Strömungskreislauf besteht aus fünf Strömungskammern, die in Reihe geschaltet sind (Abbildung 1A). In jeder Strömungskammer werden vier Explantate mit einem Querschnittsdurchmesser von jeweils ca. 0,5 cm kultiviert (Abbildung 1 A,C). Für das statische Kontrollexperiment werden die Explantaten in einzelnen Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte kultiviert (Abbildung 1B). Um ein Ausspülen der Explantaten zu verhindern, werden sie auf Metallplatten mit schmalen, nadelförmigen Ausstülpungen befestigt (Abbildung 1 D,E). Um die Explantate einer direkten Strömung des Mediums auszusetzen, sind die Kammern invertiert, wobei die Ein- und Auslässe am Kopfteil positioniert sind (Abbildung 1 F,G). Innerhalb des Bioreaktors ist der Durchflusskreislauf mit einer Peristaltikpumpe verbunden. Um die Gewebeintegrität zwischen flusskultiviertem Gewebe und konventionell statisch kultiviertem Gewebe zu vergleichen, werden Explantaten in eine Sechs-Well-Platte neben dem Flusszyklus gelegt. Dies gewährleistet die Überprüfung gleichbleibender Kulturbedingungen in Bezug auf Sauerstoff, Temperatur und Luftfeuchtigkeit (Abbildung 1A)3.
Morphologische Analyse
β-Aktin
Es wurden verschiedene immunhistochemische Färbeverfahren durchgeführt, um histologische Unterschiede in der Gewebeintegrität im Zusammenhang mit verschiedenen Kultivierungsbedingungen zu untersuchen (Abbildung 2). Explantate, die sofort nach der Präparation eingebettet wurden, dienten als Referenzbasis. Für die Analyse des Aktin-Zytoskeletts in villösen Explantaten wurde eine β-Aktin-Färbung durchgeführt (Abbildung 2A-E). Die deskriptive Analyse enthüllte eine gut strukturierte und organisierte visuelle Darstellung des Zytoskeletts in frisch gewonnenem Gewebe (Abbildung 2A). Im Laufe der Zeit kam es im Laufe der Kultivierung zu einer beobachtbaren Aggregation von Mikrofilamenten, was auf einen Abbau der Zytoskelettstruktur hindeutet. Dieses Phänomen wurde konsequent bei zottenartigen Explantaten beobachtet, die einer statischen Kultivierung unterzogenwurden 3 (Abbildung 2C,E, gekennzeichnet durch Sternchen).
H&E-Färbung
Die H&E-Färbung untermauerte zusätzlich die Beobachtung, dass die Gewebeintegrität im Verlauf der statischen Kultur abnimmt, ein Trend, der im Zusammenhang mit der Durchflusskultur abgeschwächt wird (Abbildung 2F-J). Frisches Gewebe zeigte ein strukturiertes und charakteristisches histologisches Erscheinungsbild der villösen Explantate, das durch ein dichtes und dicht gepacktes Stroma gekennzeichnet war (Abbildung 2F). Zusätzlich war der Synzytiotrophoblast fest mit dem darunterliegenden Stroma verbunden (Abbildung 2F). Ein vergleichbares Erscheinungsbild wurde bei villösen Explantaten festgestellt, die 24 Stunden lang in einer Strömungsumgebung kultiviert wurden (Abbildung 2G). Nach 48 Stunden Kultivierung unter der Strömung wurde jedoch beobachtet, dass sich Teile des Synzytiotrophoblasten teilweise abgelöst hatten (Abbildung 2I, mit dem Pfeil angedeutet), begleitet von sporadischen kleinen Lücken innerhalb des Stromas. Die histologische Untersuchung des Gewebes zeigte, dass die Integrität des Gewebes nach 24 h in einem statischen Kulturzustand unzureichend erhalten war (Abbildung 2H). Darüber hinaus verschlechterte sich diese Integrität nach 48 h in statischer Kultur weiter deutlich (Abbildung 2J). Das Stroma wies ein poröses und löchriges Erscheinungsbild auf, und in größeren Regionen war eine signifikante Ablösung des Synzytiotrophoblast vom Stroma erkennbar (Abbildung 2J, Pfeile)3.
CD34II
Die CD34II-Färbung wurde verwendet, um Endothelzellen und damit die feto-plazentaren Blutgefäße innerhalb der villösen Explantaten sichtbar zu machen (Abbildung 2K-O). Gewebe, das direkt nach der Dissektion eingebettet wurde, zeigte eine deutlich organisierte Anordnung der Endothelzellen (Abbildung 2K). Die morphologische Integrität der feto-plazentaren Blutgefäße blieb nach 24 h Flusskultur und häufig auch nach 48 h gut erhalten, obwohl gelegentlich kollabierte Blutgefäße unter Flussbedingungen beobachtet wurden (Abbildung 2 L,N). Nach 24 Stunden statischer Kultur zeigten die Blutgefäße jedoch einen teilweisen Kollaps, was sich in ihrem gestörten visuellen Erscheinungsbild zeigte (Abbildung 2M, angedeutet durch Pfeilspitzen). Diese Verschlechterung der Blutgefäße innerhalb der statischen Kulturumgebung schien sich mit längerer Kultivierungszeit zu verschlimmern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die deskriptive morphologische Bewertung der villösen Explantaten sowohl nach der Strömung als auch nach der statischen Kultur zeigte, dass die Gewebeintegrität innerhalb des Flusssystems im Vergleich zum statischen Kulturmodus effektiver erhalten zu seinscheint 3.
Ultrastrukturelle Analyse des kultivierten Gewebes
Transmissionselektronenmikroskopie
Um die Morphologie der villösen Explantate genauer untersuchen zu können, wurden zusätzlich ultrastrukturelle Analysen mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) durchgeführt (Abbildung 3A-E). Diese Ergebnisse bestätigten die Ergebnisse der histologischen Untersuchungen. In Geweben, die unmittelbar nach der Präparation direkt eingebettet wurden, war die Morphologie außergewöhnlich gut erhalten (Abbildung 3A). Mikrovilli waren auf der Oberfläche des Synzytiotrophoblasten deutlich erkennbar. Der Synzytiotrophoblast zeigte seine charakteristische durchgehende Schicht ohne laterale Zellgrenzen und stellte einen direkten Kontakt mit der Basalmembran her. Das Stroma des frischen Gewebes wies eine dichte Packung ohne signifikante Perforationen oder Risse auf. Darüber hinaus zeigten auch das ultrastrukturelle Erscheinungsbild der Blutgefäße und die individualisierten intravaskulären Erythrozyten eine hervorragende Erhaltung (Abbildung 3A).
Auch nach 24 h Durchflusskultur blieb die Gesamtmorphologie der Gewebeproben relativ gut erhalten (Abbildung 3D). Während sich auf der Oberfläche des Synzytiotrophoblast im Vergleich zu frischem Gewebe etwas weniger Mikrovilli befanden, blieb der Synzytiotrophoblast primär an der Basalmembran haften. Zellkerne und gelegentlich kleine Vakuolen waren im inneren Teil des Synzytiotrophoblasten zu beobachten. Das Stroma in den Plazentazotten schien gut erhalten zu sein und ähnelte stark frischem Gewebe (Abbildung 3D). Selbst nach 48 Stunden Durchflusskultur zeigten die Stromazellen eine relativ gute Konservierung, wenn auch mit einigen Perforationen (Abbildung 3E). Interessanterweise wurden Lipidtröpfchen im Gewebe nachgewiesen. Während der Synzytiotrophoblast Vakuolen und eine Reduktion der Anzahl der Mikrovillen aufwies, blieb er in zahlreichen Regionen an der Basalmembran haften, Synzytial- und Zellkerne waren deutlich sichtbar (Abbildung 3E).
Im Gegensatz zu dem Gewebe aus der Durchflusskultur zeigte sich die Morphologie des Zottengewebes, das einer statischen Kultur unterzogen wurde, bereits nach 24 h (Abbildung 3B). Der Synzytiotrophoblast dissoziierte an mehreren Stellen von der Basalmembran und wies relativ starke Perforationen auf. Darüber hinaus zeigten sich häufig Lipidtröpfchen sowohl im Synzytiotrophoblast als auch im Stroma (Abbildung 3B). Nach 48 h statischer Kultur zeigte sich ein fortschreitender Rückgang der Ultrastruktur (Abbildung 3C). Der Synzytiotrophoblast wies zahlreiche Perforationen und Ablösungen von der Basalmembran in erheblichem Umfang auf. Die Identifizierung von Zellen innerhalb des Stromas sowie von Endothelzellen, aus denen die Blutgefäße bestehen, wurde zu einer Herausforderung. Darüber hinaus gab es eine bemerkenswerte Akkumulation von Lipidtröpfchen in den villösen Explantaten nach 48 h statischer Kultur (Abbildung 3C). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ultrastruktur des Gewebes in statischer Kultur über die Dauer der Kultivierungsperiode eine sukzessive Verschlechterung aufwies, ein Trend, der durch die Kultivierung unter Fließbedingungen abgeschwächt wurde3.
Rasterelektronenmikroskopie
Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurde eine detaillierte Untersuchung der Oberfläche der villösen Explantate ermöglicht (Abbildung 4A-J). Frisch eingebettetes Gewebe wies eine dicht besiedelte Anordnung von Mikrovilli auf seiner Oberfläche auf (Abbildung 4 A,B). Einige Regionen wiesen vesikelartige Strukturen auf. Im Gegensatz dazu zeigte Gewebe aus der statischen Kultur nach 24 Stunden eine erhebliche Reduktion der Mikrovilli (Abbildung 4C,D), eine Reduktion, die nach 48 Stunden anhielt (Abbildung 4E,F). Während bestimmte Bereiche eine Aggregation von vesikelartigen Strukturen aufwiesen, die nicht freigesetzt worden waren, schienen andere Regionen kahl und erodiert zu sein (Abbildung 4D,F). In Gewebe, das einer Durchflusskultur unterzogen wurde, waren die Mikrovilli nach 24 h (Abbildung 4G,H) sowie nach 48 h (Abbildung 4I,J) noch auf der Oberfläche vorhanden, wenn auch in geringerem Ausmaß als in frischem Gewebe. Im Vergleich zur statischen Kultur war die Prävalenz von vesikelartigen Strukturen auf der Oberfläche verringert. Interessanterweise waren diese vesikelartigen Strukturen bemerkenswerterweise in spezifischen Vertiefungen konzentriert, in denen der Fluss reduziert oder nicht vorhanden sein konnte (Abbildung 4H, J), was darauf hindeutet, dass sie aufgrund des Flussesdes Mediums 3 von der strömungsexponierten Gewebeoberfläche gelöst worden sein könnten.
Abbildung 1: Aufbau des Durchflusssystems . (A) Das montierte Durchflusssystem, bestehend aus dem Reservoir und fünf Durchflusskammern, ist mit einer der Schlauchpumpen verbunden. Auf der rechten Seite befindet sich eine Sechs-Well-Platte, in der die Explantate statisch kultiviert werden. (B,C) Bei beiden Kultivierungsmethoden werden die Plazentaproben in zottenartige Explantaten von ca. 0,5cm2 zerlegt, von denen dann vier Explantate pro Vertiefung oder Kammer verwendet werden. Bei einem experimentellen Ansatz werden fünf Kammern oder Brunnen verwendet. (D,E) Für die Flow-Kultur wird eine Metallplatte mit schmalen nadelförmigen Erhebungen verwendet, um die Explantate zu sichern. (F,G) Die Öffnungen der Röhrchen befinden sich am Kopf der Kammern und werden daher verkehrt herum verwendet, um zu gewährleisten, dass das Gewebe einem direkten Fluss ausgesetzt ist. Diese Abbildung ist reproduziert von Kupper et al.3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Morphologische Analyse von Plazentazotten-Explantaten nach Strömung und statischer Kultur. (A-E) Immunfluoreszenzfärbung für β-Aktin zur Visualisierung des Zytoskeletts von Explantaten in Kultur. Für die Analyse wurden pro Objektträger sechs zufällig ausgewählte Spots verwendet. Es werden repräsentative Bilder gezeigt. (A) Visualisierung des Zytoskeletts von eingebettetem Gewebe direkt nach der Präparation. Maßstab: 20 μm. (B-E) Repräsentative Darstellung sowohl der zeitabhängigen als auch der kultivierungsmodusabhängigen Degeneration des Aktin-Zytoskeletts in kultivierten Explantaten aus Durchfluss- und statischer Kultur. (C-E) Sternchen bedeuten eine erhöhte Akkumulation von Aktin-Mikrofilamenten, was ein Hinweis auf den Abbau des Aktin-Zytoskeletts ist. (F-J) Hämatoxylin-Eosin-Färbung von villösen Explantaten. Maßstab: 100 μm. (F,G) Frisch eingebettetes Gewebe (F) und Flow-Kultur-Explantaten für 24 h (G) zeigen eine gut erhaltene Morphologie eines villösen Explantats. (I) Strömungskultivierte Explantaten für 48 h zeigen intermittierend abgelöste Bereiche des Synzytiotrophoblasten (Pfeil). (H,J) Zeitabhängige Verschlechterung der strukturellen Integrität nach statischer Explantatkultur, angezeigt durch Dislogment des Synzytiotrophoblasten (Pfeil) und perforiertes Stroma. (K-O) CD34 II wurde zur Färbung von zottenartigen Endothelzellen verwendet. Maßstab: 100 μm. (K,L) Frisches Gewebe (K) und Explantate, die für 24 h unter Strömungsbedingungen (L) kultiviert wurden, zeigen ein charakteristisches strukturell ausgerichtetes Endothelzellmuster. (N) Nach 48 h in Flow-Kultur nimmt die vaskuläre Integrität bis zu einem gewissen Grad ab. (M,O) In der statischen Kultur sind kollabierte Blutgefäße bereits nach 24 h sichtbar (M), wobei beobachtet wurde, dass sie mit längerer statischer Kultivierungszeit zunehmen (O). Diese Abbildung ist reproduziert von Kupper et al.3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ultrastrukturelle Prä- und Postkultivierungsuntersuchung von villösen Explantaten mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Für die Analyse der Bilder wurde Gewebe aus drei unabhängigen Experimenten verwendet. (A) Ein repräsentatives Bild von frisch eingebettetem Gewebe zeigt eine große Menge an Mikrovilli (MV) auf der Oberfläche des Synzytiotrophoblasten (ST). Strukturell intakte Kapillaren (Ca) sind im gut erhaltenen Stroma (S) sichtbar. (B) In dem Gewebe, das 24 Stunden lang statisch kultiviert wurde, kommt es zu einer Verschlechterung der strukturellen Integrität des Synzytiotrophoblasten, der in einigen Bereichen von der Basalmembran getrennt zu sein scheint. Es kommt auch zu einer spürbaren Ansammlung von Lipidtröpfchen (LD). (C) Nach 48 h in statischer Kultur wird eine schwere ultrastrukturelle Verschlechterung beobachtet. Sowohl das Stroma als auch der Synzytiotrophoblast sind perforiert und es zeigt sich eine massive Ansammlung von Lipidtröpfchen. Blutgefäße waren kaum zu erkennen. (D,E) Die Ultrastruktur des Gewebes aus der Flusskultur war sowohl nach 24 h (D) als auch nach 48 h (E) relativ gut erhalten. Maßstab: 2 μm. MV: Mikrovilli, ST: Synzytiotrophoblast, S: Stroma, Ca: Kapillare, LD: Lipidtröpfchen. Diese Abbildung ist reproduziert von Kupper et al.3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ultrastrukturelle Prä- und Postkultivierungsuntersuchung von zottenartigen Explantaten mittels Rasterelektronenmikroskopie. (A,C,E,G,I) Übersichtsbilder der Oberfläche der Plazentazottenbäume mit entsprechenden Detailbildern (B,D,F,H,J). (A,B) Frisch eingebettetes Gewebe weist eine dichte Naht aus Mikrovilli auf. (B) An einigen Stellen können vesikuläre Strukturen festgestellt werden. (C-F) Nach 24 h und 48 h in statischer Kultur ist eine Abnahme der Mikrovilli auf der Oberfläche des Synzytiotrophoblasten sichtbar. Auffallend ist die großflächige Ansammlung von vesikulärartigen Partikeln auf der Oberfläche des Explantats. (F) Die Partikel scheinen nach 48 Stunden in statischer Kultur zu verwelken. (G-J) Die Oberfläche des Gewebes aus der Durchflusskultur scheint sowohl nach 24 h (G,H) als auch nach 48 h (I,J) besser erhalten zu sein als in der statischen Kultur. Mikrovilli sind auf der Oberfläche sichtbar (H,J), wenn auch nicht in der gleichen hohen Dichte wie im frischen Gewebe. (B) Vesikuläre Partikel sind in den Nischen mit reduzierter Strömung verstreut. Diese Abbildung ist reproduziert von Kupper et al.3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Tabelle 1: Versuchseinstellungen für plazentaren Zottenfluss und statische Kultur. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Spezifikationen des Durchfluss- und statischen Systems. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 3: Antikörper für Immunhistochemie und Immunfluoreszenz, die für diese Studie verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Diese Studie stellt eine einzigartige Perspektive auf eine Flow-Kulturtechnik für Plazenta-Explantaten vor, die entwickelt wurde, um die Dynamik in utero zu replizieren 3,23. Die Ergebnisse zeigen, dass die Morphologie von Gewebe, das unter Fließbedingungen kultiviert wird, im Vergleich zur traditionellen statischen Kultivierungsmethode besser erhalten bleibt3. Bemerkenswert ist, dass, obwohl weder statische noch Flusskulturbedingungen die Perfusion von Plazentagefäßen erleichtern, die Zerstörung von feto-plazentaren Blutgefäßen innerhalb des villösen Stromas überwiegend in statischer Kultur beobachtet wurde, während die Integrität von Blutgefäßen über einen längeren Zeitraum in Flusskultur besser erhalten zu seinschien 3.
Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung könnte mit der entscheidenden schützenden und endokrinen Rolle des Synzytiotrophoblasten zusammenhängen, eine Funktion, die in der Literatur gut dokumentiert ist 12,24,25,26. Vor diesem Hintergrund ist es denkbar, dass die Gesamtintegrität der äußeren Schicht der Zotten wesentlich zur Aufrechterhaltung des darunter liegenden Stromas, einschließlich der Blutgefäße, beiträgt. Folglich könnte die anhaltende zelluläre Integrität der Blutgefäße unter Strömungsbedingungen auf den kontinuierlichen Fluss des Mediums zurückgeführt werden. Diese Bewegung unterstützt die passive Bewegung der Explantate und erleichtert den Austausch von Gasen, Nährstoffen und Nanopartikeln (wie extrazellulären Vesikel) über die Plazentaschranke. Dies wiederum könnte sich positiv auf den Erhalt der Morphologie der Blutgefäße auswirken. Darüber hinaus spielt das Phänomen der Mechanosensibilität eine Rolle bei der Gewebemorphogenese in verschiedenen Geweben27,28. Studien haben gezeigt, dass die Mechanosensitivität zelluläre Prozesse auf mehreren Ebenen beeinflusst und eine Reihe biochemischer Reaktionen auslöst, die letztendlich die Gewebe- und Organfunktionalität beeinflussen29. Bemerkenswert ist, dass mechanosensitive Proteine während der gesamten Schwangerschaft vom Synzytiotrophoblast exprimiertwerden 28. Darüber hinaus deutet die Studie darauf hin, dass Mikrovilli auf der Gewebeoberfläche in diesem Zusammenhang eine Rolle spielen könnten28.
Eine weitere Perspektive, die es wert ist, in Betracht gezogen zu werden, ist die mögliche Rolle der Mitochondrien bei der zellulären Reaktion auf den Fluss. In Endothelzellen dienen Mitochondrien beispielsweise als Signalwandler für zelluläre Reaktionen auf Umweltreize30. Eine erhöhte Akkumulation von Lipidtröpfchen, die in statisch kultiviertem Gewebe durch TEM3 beobachtet wurde, wurde mit der Apoptose-Induktion aufgrund einer mitochondrialen Dysfunktion in Verbindung gebracht31. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die zugrundeliegenden Mechanismen und Schlüsselfaktoren aufzudecken und sie mit nachgeschalteten Signalwegen in Verbindung zu bringen. Diese Untersuchung könnte unser Verständnis darüber verbessern, wie das Gewebe Scherspannungen wahrnimmt und darauf reagiert, was sich in einer verbesserten Lebensfähigkeit und Integrität von zottenartigen Explantaten in Kultur niederschlägt23.
Mehrere kritische Protokollschritte müssen wiederholt und sorgfältig ausgeführt werden. Nach der Plazentaentbindung sollte das Gewebe so schnell wie möglich kultiviert werden. Bei der Explantationsvorbereitung ist es wichtig, Bereiche mit sichtbaren Infarkten zu vermeiden. Es ist wichtig, Explantate vorsichtig mit einer Pinzette zu behandeln, um ein Quetschen zu verhindern. Es wird empfohlen, das Gewebe während des gesamten Eingriffs mit Flüssigkeit bedeckt zu halten und ihn schnell durchzuführen.
Es ist wichtig anzuerkennen, dass diese Studie nicht in der Lage ist, die genaue Schubspannung innerhalb des vorgestellten Strömungssystems zu spezifizieren, was als Einschränkung in zukünftigen Untersuchungen berücksichtigt werden sollte 3,23. Nichtsdestotrotz ist es wichtig zu erkennen, dass die präzise Strömungsgeschwindigkeit und die Scherspannung für eine bestimmte Plazentazotte in vivo von zahlreichen Parametern beeinflusst werden, wie z. B. den geometrischen Eigenschaften des intervillösen Raums, der Lage der Zotte in diesem Raum und ihrer Nähe und ihrem Winkel zu mütterlichen Spiralarterien und Uterusvenen 3,19,23,32 . Die Komplexität der geometrischen Struktur der Plazenta, die von Individuum zu Individuum variiert, muss ebenfalls berücksichtigt werden23,32. Mathematische Modelle zur Abschätzung des Blutflusses innerhalb des intervillösen Raumes32 und Berechnungen zur Wandschubspannung auf den Synzytiotrophoblast19,28 existieren bereits. Interessanterweise prognostizierte eine Studie, dass die Schubspannung auf den Synzytiotrophoblast im dritten Trimester im Vergleich zum ersten Trimester geringer ist28, während eine andere Studie eine räumlich heterogene Wandschubspannung auf den Synzytiotrophoblast19 zeigte. Die Bestimmung der genauen Strömungsgeschwindigkeit und Scherspannung für eine bestimmte Plazentazotte stellt nach wie vor eine Herausforderungdar 3,19,23,32. Solche Berechnungen bieten eine Annäherung an den Schubspannungsbereich für zukünftige Untersuchungen, erfordern jedoch möglicherweise laufende anatomische Anpassungen und Optimierungen23. Darüber hinaus könnten zukünftige Studien neue und verfeinerte Durchflusskulturtechniken entwickeln, die der komplizierten Geometrie des intervillösen Raums Rechnung tragen, sowie Strategien zur Erhöhung der Anzahl der Proben pro Experiment3. Es wird erwartet, dass das Strömungssystem weiter voranschreitet und weiterentwickelt wird, möglicherweise unter Einsatz alternativer Durchflusskammern (Brugger et al., unveröffentlichte Daten, 2023).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine solide Grundlage schafft, indem sie eine leicht implementierbare ex vivo Durchflusskulturtechnik demonstriert, die die strukturelle Integrität von kultivierten zottenartigen Explantaten aufrechterhält. Es unterstreicht die Bedeutung dynamischer Techniken in der funktionellen Biologie der Plazenta und ebnet den Weg für weitere Fortschritte in Flusskultursystemen und die Generierung neuer Ideen und Hypothesen 3,23.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich für die hervorragende technische Unterstützung von Bettina Amtmann und Petra Winkler bei der Gewebeprobenahme. Diese Forschung wurde vom Wissenschaftsfonds FWF (DOC 31-B26) und der Medizinischen Universität Graz, Österreich, im Rahmen des PhD-Programms Inflammatory Disorders in Pregnancy (DP-iDP) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
| Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
| antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
| anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
| Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
| CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
| CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
| Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
| Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
| Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
| Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
| Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
| Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
| Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
| Metal plate with needles | In-house construction | ||
| Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
| Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
| Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
| Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
| QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
| SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
| Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
| Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
| TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
| UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
| UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
| Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |
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