Summary
Hier is een protocol voor het kweken van placenta-explantaten onder constante stroomomstandigheden. Deze aanpak verbetert traditionele statische villeuze kweeksystemen door de replicatie van dynamische fysiologische omgevingen mogelijk te maken.
Abstract
De bestaande ex vivo placenta-explantatiecultuurmodellen zijn voornamelijk gebaseerd op statische kweeksystemen met behulp van putplaten. Deze modellen weerspiegelen echter onvoldoende de dynamiek in utero , waarbij de placenta constant lichte schuifspanning ondervindt als gevolg van plasma- of bloedstroom. Om deze beperking aan te pakken, is een flow-kweeksysteem bedacht om ex vivo placenta-explantatie-explantatie-kweek dichter bij de in utero flow-omstandigheden te brengen die in het moederlichaam worden ervaren. Binnen deze benadering worden placenta-explantaten gekweekt in een reeks van vijf onderling verbonden stroomkamers. Deze instelling handhaaft fysiologische zuurstofconcentraties en een constant debiet. Uit de verzamelde gegevens blijkt dat onder stromingsomstandigheden het behoud van weefselmorfologie een opmerkelijke verbetering vertoont in vergelijking met conventionele statische methoden. Deze innovatieve techniek introduceert een eenvoudige manier van ex vivo placenta-explantatiecultuur, die een meer getrouwe weergave biedt van de dynamische in vivo-omgeving . Bovendien introduceert deze studie nieuwe mogelijkheden voor het onderzoeken van de functionele dynamiek van de foeto-maternale interface. Door haalbare dynamische methodologieën te omarmen, wordt een dieper begrip van de placentabiologie vergemakkelijkt, wat de relevantie ervan voor de gezondheid van moeder en foetus onderstreept.
Introduction
Sinds de jaren 1960 wordt placenta-explantatiekweek op de bodem van een putplaat gebruikt voor het bestuderen van de foeto-maternale interface 1,2,3. Deze methode is goed ingeburgerd en eenvoudig, waardoor menselijk weefsel kan worden gebruikt voor verschillende onderzoeken, naast culturen van afzonderlijke cellen 2,3. In de loop van de tijd zijn experimentele ontwerpen voor placenta-explantatieculturen gewijzigd met betrekking tot zuurstofconcentratie4 en om te voorkomen dat het weefsel zich op de bodem van de putplaat nestelt 2,5,6. Deze methode is echter niet aangepast aan de in vivo omstandigheden in de baarmoeder, met name de aanwezigheid van een constante stroom3.
Het succes van een zwangerschap hangt af van een adequate en consistente perfusie van de intervilleuze ruimte met bloed van de moeder, waardoor een dynamisch circuit tot stand wordt gebracht met continue in- en uitstroom van bloed en door bloed overgedragen stoffen 7,8,9,10,11,12. De placenta heeft twee verschillende bloedtoevoersystemen, één voor bloed van de moeder en één voor bloed van de foetus, wat resulteert in dubbele perfusie door zowel het foetale als het maternale systeem. Aan het einde van het eerste trimester begint het bloed van de moeder de intervilleuze ruimte van de placenta te doordrenken en stroomt het langzaam door verwijde spiraalvormige baarmoederslagaders10,11,14. Bijgevolg baden de placenta-villeuze bomen in moederbloed en leveren ze voedingsstoffen en zuurstof aan de foetus. Dit maternale bloed stroomt door de intervilleuze ruimte voordat het via uteroplacentale aderen terugkeert naar de maternale circulatie. Tijdens de passage door de intervilleuze ruimte leiden diffusie en actieve opname van zuurstof en voedingsstoffen in het foetale bloed tot lagere zuurstof- en nutriëntenniveaus in het bloed van de moeder12,15. Het bloed van de tussenruimte wordt echter ongeveer twee tot drie keer per minuut volledig vervangen door vers, zuurstofrijk bloed, waardoor een continue toevoer van voedingsstoffen en gassen wordtgegarandeerd13. Met name de syncytiotrofoblast, het buitenste deel van de placentabarrière, is het enige onderdeel van de placenta-villeuze boom die direct wordt blootgesteld aan bloed van de moeder15,16,17. Bijgevolg ondervindt de syncytiotrofoblast een constante milde schuifspanning van het stromende bloed van de moeder 3,14.
De huidige wetenschappelijke kennis met betrekking tot de omgeving van de placentastroom en de moderne technische vooruitgang maken nu een aangepaste en fysiologisch benaderde kweek van placenta-explantaten onder stromingsomstandigheden mogelijk. Bovendien zijn er aanwijzingen dat schuifkrachten de biologische functies van de syncytiotrofoblast beïnvloeden 18,19,20,21. Een bekende benadering die rekening houdt met de bloedstroom is het placenta-perfusiesysteem met dubbele lobben22. Deze experimenten vereisen echter aanzienlijke expertise, zijn beperkt in de tijd (slechts enkele uren uitgevoerd) en zijn alleen haalbaar met placentamonsters in het derde trimester 3,23. Daarentegen hebben we een eenvoudige en niet-intrusieve techniek ontwikkeld voor ex vivo placenta-villeuze explantatiecultuur onder constante stroominstellingen, geschikt voor placentaweefsels in zowel het eerste als het derde trimester3. In deze opstelling worden placenta-explantaten gekweekt in vijf in serie geschakelde stroomkamers. Villeuze explantaten worden aan de bodem van de kamer bevestigd met behulp van naaldvormige verhogingen op dunne metalen platen. Het geconstrueerde stroomcircuit wordt vervolgens overgebracht naar een bioreactor, waar zowel de zuurstofconcentratie als het debiet worden geregeld3. De resultaten van flowkweek tonen aan dat de weefselintegriteit beter behouden blijft in vergelijking met de doorgaans gebruikte statische methode3. Bovendien maakt deze dynamische aanpak nieuwe en aangepaste experimentele ontwerpen mogelijk voor het kweken van weefselexplantatie, waardoor in-vitro-experimenten mogelijk worden die denatuurlijke omgeving beter nabootsen.
Protocol
De ethische commissie van de Medische Universiteit van Graz keurde deze studie goed (31-019 ex 18/19 versie 1.2 en 29-319 ex 16/17). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen die bij het onderzoek betrokken waren.
1. Voorbereiding op het stromingsexperiment
OPMERKING: De experimenten worden uitgevoerd in een bioreactor met geïntegreerde peristaltische pompen (zie Materiaaltabel). De luchtvochtigheid, temperatuur en gasniveau in de bioreactor kunnen worden aangepast.
- Zet de bioreactor aan en maak alle voorbereidingen (bijv. kalibratie van de pompen, voorverwarming, gascondities en vochtigheid) voor het experiment volgens de handleiding van de bioreactor. Voordat met het experiment wordt begonnen, moeten de vereiste instellingen (temperatuur, gasgehalte, vochtigheid) gedurende enkele uren of een nacht worden gestabiliseerd. Start hiervoor de bioreactor en de software en klik vervolgens onder het menu-item "Incubator" op Setpoints wijzigen .
- PBS en het benodigde medium (Endothelial Cell Growth Medium aangevuld met meegeleverde supplementen hEGF-5, HC-500 en 5% exosoom-verarmd foetaal runderserum, 1% penicilline/streptomycine) voorverwarmen (zie materiaaltabel) tot 37 °C.
2. Dissectie van het placentamonster
- Snijd onmiddellijk na de bevalling drie keer 2 cm 3 placentamonsters uit het midden van de placenta zoals beschreven in Kupper etal.3 Bewaar de monsters kort in PBS. Gooi de chorionplaat, de decidua van de moeder en gebieden met zichtbare infarcten van het monster weg.
- Ontleed het resterende weefselmonster in villeuze explantaten met een dwarsdoorsnedediameter van ongeveer 0,5 cm (nat gewicht van ongeveer 7,5 mg). Breng ze over in een petrischaal met verse PBS.
- Was de explantaten in PBS door ze voorzichtig in de vloeistof te schudden met een pincet om bloedresten te verwijderen.
NOTITIE: Ontleed de monsters in een petrischaal met PBS om ze voor te wassen en te voorkomen dat ze uitdrogen en gebruik gesteriliseerde/geautoclaveerde gereedschappen voor het verwerken van het weefsel.
3. Flow-experiment
- Sluit onder een steriele kap vijf kamers in serie aan op de reservoirfles met behulp van de luer-vergrendelingen volgens de gebruikershandleiding van de stroomkamers (zie Materiaaltabel).
NOTITIE: Steriliseer en/of autoclaaf alle materialen voor gebruik, volgens de respectievelijke handleiding. Gebruik een luchtfilter op de reservoirfles voor steriele gasuitwisseling. Om de kamers te openen en te sluiten, knijpt u voorzichtig in de nokken van de kamers. Stap 3.1. kan ook eerder worden bereid. - Draai de kamers ondersteboven en open ze door de onderkant te verwijderen. Gebruik een pincet om de metalen platen centraal in het bovenste deel van de kamers over te brengen met de pinnen naar boven gericht.
- Vul de kamers met 1 ml voorverwarmd medium (37 °C). Vul vervolgens het reservoir met nog eens 20 ml. Het circuit vereist in totaal 25 ml, inclusief het volume in elke stroomkamer, in de buizen en de reservoirfles. Onder de stroom is het uiteindelijke volume van het medium in een gevulde kamer 2 ml.
- Gebruik een pincet en breng de ene villeuze explantatie na de andere over tussen de naalden van de metalen plaat in de kamer. Laat de naalden tussen de placentavilli glijden om prikken in het weefsel te voorkomen. Breng vier explantaten over in één kamer. Sluit de kamers door de bodem voorzichtig terug te plaatsen. Een compleet circuit bevat in totaal 20 explantaten. De kamers moeten ondersteboven blijven staan.
NOTITIE: Pak de explantaten voorzichtig vast met de pincet; Probeer ze niet uit te knijpen. Zorg ervoor dat de kamers en het circuit volledig zijn afgedicht om lekkage te voorkomen. De kamers worden altijd ondersteboven gebruikt. Het aantal explantaten per kamer en het aantal kamers zelf zijn variabel. De procedure voor weefsel in het eerste trimester is vergelijkbaar met die voor weefsel in het derde trimester met een kleine toevoeging: om de villi te fixeren, buigt u de naalden lichtjes over de explantaten nadat het weefsel is overgebracht naar de metalen plaat (persoonlijke communicatie Brugger et al.). Dit fixeert het kwetsbare weefsel op de metalen plaat en voorkomt dat de monsters eraf glijden. - Breng de stroomeenheid over naar de bioreactor.
- Sluit het stroomcircuit aan op de peristaltische pomp in de bioreactor door de pompslang op de pomp aan te sluiten. Bevestig het op de 4etrap ( men hoort het vier keer klikken).
- Als een statische controle nodig is, plaats dan ook de putplaat in de bioreactor.
OPMERKING: Voor statische cultuur worden vijf putjes van een plaat met zes putjes gevuld met 4 ml medium per putje en 4 villeuze explantaten per putje. De gevulde putplaat wordt ook in de bioreactor geplaatst en gekweekt in dezelfde atmosfeer als de explantatie van de stroomcultuur. Verdere details worden beschreven in Kupper et al.3 - Stel de pompmodus onder het menupunt "Pompen" in op Handmatig . Stel vervolgens de pompsnelheid in op 1 ml/min en begin met het pompen van het medium in de slang door op Uitvoeren te klikken. Terwijl het circuit wordt gevuld met medium, houdt u de kamers schuin zodat ze volledig gevuld zijn met medium.
OPMERKING: Zie aanvullende tabel 1 voor de experimentele instellingen voor placenta-villeuze flow en statische kweek. Specificaties van het stroom- en statische systeem zijn opgenomen in aanvullende tabel 2.
LET OP: Kantel de kamer voorzichtig tijdens het vullen om te voorkomen dat de monsters van de naalden glijden. - Nadat het vullen is voltooid, blijven de kamers ondersteboven. Zorg ervoor dat de kamers stevig en rechtop staan en sluit beide deksels van de bioreactor.
NOTITIE: Het uiteindelijke volume van het medium in een gevulde stroomkamer is 2 ml. De experimentele instellingen en de specificaties van de stromingskamers en putplaten die in de experimenten zijn gebruikt, worden beschreven in Kupper et al.3 - Incubeer het weefsel gedurende de gewenste tijd.
OPMERKING: De temperatuur, het gasniveau en het debiet kunnen op de computer worden gecontroleerd zonder het deksel van de bioreactor opnieuw te openen. - Stop de pomp na incubatie van het weefsel voor de gewenste tijd door onder het menu-item "Pompen" op Afbreken te klikken. Open de twee deksels van de bioreactor en vervolgens één stroomkamer tegelijk. Verwijder de explantaten voorzichtig van de metalen plaat met een pincet.
- Verwerk het weefsel en het supernatans volgens de geselecteerde stroomafwaartse analyse. In dit geval werden immunohistochemische kleuring en elektronenmicroscopie uitgevoerd3. Zie aanvullende tabel 3 voor de bijzonderheden van de antilichamen die worden gebruikt voor immunohistochemie en immunofluorescentie.
NOTITIE: Laat na het verwijderen van het weefsel het medium uit het circuit lopen door de pomp tegen de klok in te draaien. - Demonteer en reinig het stroomcircuit volgens de instructies van de fabrikant voor de stroomkamers en slangen.
Representative Results
Gedeelten van deze publikatie en de resultaten ervan zijn reeds gepubliceerd (zie referenties 3 en 23).
Experimentele opstelling
Een experimentele opstelling wordt geïllustreerd in figuur 1. Een samengestelde stromingscyclus bestaat uit vijf stromingskamers die in serie met elkaar zijn verbonden (figuur 1A). In elke stroomkamer worden vier explantaten gekweekt, elk met een doorsnedediameter van ongeveer 0,5 cm (figuur 1 A,C). Voor het statische controle-experiment worden de explantaten gekweekt in individuele putjes van een plaat met zes putjes (figuur 1B). Om te voorkomen dat de explantaten worden weggespoeld, worden ze bevestigd op metalen platen met smalle naaldvormige uitsteeksels (figuur 1 D,E). Om de explantaten aan een directe stroming van het medium te onderwerpen, zijn de kamers omgekeerd, waarbij de inlaten en uitlaten zich bij het hoofdgedeelte bevinden (figuur 1 F,G). Binnen de bioreactor is de stroomcyclus gekoppeld aan een peristaltische pomp. Om de weefselintegriteit te vergelijken tussen flow-gekweekt weefsel en conventioneel statisch-gekweekt weefsel, worden explantaten geplaatst in een plaat met zes putjes naast de flowcyclus. Dit zorgt voor de verificatie van consistente kweekomstandigheden in termen van zuurstof, temperatuur en vochtigheid (Figuur 1A)3.
Morfologische analyse
β-actine
Er werden verschillende immunohistochemische kleuringsprocedures uitgevoerd om histologische verschillen in weefselintegriteit geassocieerd met verschillende kweekomstandigheden te onderzoeken (Figuur 2). Explantaten die na de dissectie onmiddellijk werden ingebed, dienden als basisreferentie. Voor de analyse van het actine-cytoskelet in villeuze explantaten werd β-actinekleuring uitgevoerd (Figuur 2A-E). Beschrijvende analyse onthulde een goed gestructureerde en georganiseerde visuele presentatie van het cytoskelet in vers verkregen weefsel (Figuur 2A). Na verloop van tijd, naarmate de teelt vorderde, was er een waarneembare aggregatie van microfilamenten, wat een afbraak van de cytoskeletstructuur betekende. Dit verschijnsel werd consequent waargenomen bij villeuze explantaten die statische cultivatie ondergingen3 (Figuur 2C,E, aangegeven met sterretjes).
H&E-kleuring
H&E-kleuring versterkte de waarneming dat de weefselintegriteit afneemt in de loop van statische kweek, een trend die wordt verbeterd in de context van flowkweek (Figuur 2F-J). Vers weefsel vertoonde een gestructureerde en karakteristieke histologische presentatie van de villeuze explantaten, gekenmerkt door een dicht en dicht opeengepakt stroma (Figuur 2F). Bovendien was de syncytiotrofoblast stevig gehecht aan het onderliggende stroma (Figuur 2F). Een vergelijkbaar uiterlijk werd waargenomen bij villeuze explantaten die gedurende 24 uur in een stromingsomgeving werden gekweekt (figuur 2G). Na 48 uur kweken onder de stroom werd echter waargenomen dat delen van de syncytiotrofoblast gedeeltelijk waren losgelaten (figuur 2I, aangegeven met pijl), vergezeld van sporadische kleine lacunes in het stroma. Histologisch onderzoek van het weefsel wees uit dat de integriteit van het weefsel na 24 uur in een statische kweektoestand onvoldoende behouden was gebleven (figuur 2H). Bovendien verslechterde deze integriteit verder aanzienlijk na 48 uur in statische cultuur (figuur 2J). Het stroma vertoonde een poreus en ontpit uiterlijk, en een aanzienlijke loslating van de syncytiotrofoblast van het stroma was duidelijk zichtbaar in grotere gebieden (Figuur 2J, pijlen)3.
CD34II
CD34II-kleuring werd gebruikt om endotheelcellen te visualiseren en, bijgevolg, de foeto-placentale bloedvaten in de villeuze explantaten (Figuur 2K-O). Weefsel dat direct na dissectie direct was ingebed, vertoonde een duidelijk georganiseerde rangschikking van de endotheelcellen (Figuur 2K). De morfologische integriteit van de foeto-placentale bloedvaten bleef goed behouden na 24 uur flowkweek en vaak zelfs na 48 uur, hoewel af en toe gevallen van ingeklapte bloedvaten werden waargenomen onder flowcondities (Figuur 2 L,N). Na 24 uur statische kweek vertoonden de bloedvaten echter een gedeeltelijke collaps, zoals blijkt uit hun verstoorde visuele uiterlijk (figuur 2M, aangegeven met pijlpunten). Deze verslechtering van de bloedvaten in de statische kweeksetting bleek te verergeren bij een langere kweektijd. Samenvattend gaf de beschrijvende morfologische beoordeling van de villeuze explantaten na zowel stroming als statische kweek aan dat de weefselintegriteit effectiever lijkt te worden bewaard binnen het stroomsysteem in tegenstelling tot de statische kweekmodus3.
Ultrastructurele analyse van het gekweekte weefsel
De microscopie van het transmissieelektron
Om een gedetailleerder onderzoek van de morfologie van de villeuze explantaten uit te voeren, werden aanvullende ultrastructurele analyses uitgevoerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (Figuur 3A-E). Deze bevindingen bevestigden de uitkomsten van het histologisch onderzoek. In weefsel dat direct na de bereiding direct werd ingebed, was de morfologie uitzonderlijk goed bewaard gebleven (Figuur 3A). Microvilli waren duidelijk waarneembaar op het oppervlak van de syncytiotrofoblast. De syncytiotrofoblast presenteerde zijn kenmerkende continue laag zonder laterale celgrenzen, waardoor direct contact werd gemaakt met het basaalmembraan. Het stroma van het verse weefsel vertoonde een dichte pakking zonder noemenswaardige perforaties of breuken. Bovendien vertoonden het ultrastructurele uiterlijk van de bloedvaten en geïndividualiseerde intravasculaire erytrocyten ook een uitstekende conservering (Figuur 3A).
Zelfs na 24 uur flowkweek bleef de algehele morfologie van de weefselmonsters relatief goed gehandhaafd (figuur 3D). Hoewel er iets minder microvilli op het oppervlak van de syncytiotrofoblast waren in vergelijking met vers weefsel, bleef de syncytiotrofoblast voornamelijk vastzitten aan het basale membraan. Kernen en af en toe kleine vacuolen waren waarneembaar in het binnenste gedeelte van de syncytiotrofoblast. Het stroma in de placentavilli leek goed bewaard gebleven en leek sterk op vers weefsel (Figuur 3D). Zelfs na 48 uur flowkweek vertoonden de stromale cellen een relatief goede bewaring, zij het met enkele perforaties (Figuur 3E). Intrigerend genoeg werden lipidedruppeltjes gedetecteerd in het weefsel. Hoewel de syncytiotrofoblast vacuolen en een vermindering van het aantal microvilli vertoonde, bleef deze in tal van regio's aan het basale membraan gehecht en waren syncytiele en celkernen duidelijk zichtbaar (Figuur 3E).
In schril contrast met het weefsel van de flowkweek vertoonde de morfologie van villeuze weefsels die aan statische kweek werden onderworpen, al na 24 uur verslechtering (figuur 3B). De syncytiotrofoblast werd op meerdere plaatsen losgekoppeld van het basale membraan en vertoonde relatief substantiële perforaties. Bovendien waren lipidedruppeltjes vaak zichtbaar in zowel de syncytiotrofoblast als het stroma (Figuur 3B). Na 48 uur statische cultuur was een progressieve achteruitgang van de ultrastructuur zichtbaar (figuur 3C). De syncytiotrofoblast vertoonde talrijke perforaties en in aanzienlijke mate loslating van het basale membraan. Het identificeren van cellen in het stroma, evenals endotheelcellen die de bloedvaten vormen, werd een uitdaging. Bovendien was er een opmerkelijke accumulatie van lipidedruppeltjes in de villeuze explantaten na 48 uur statische cultuur (figuur 3C). Samenvattend kan worden gesteld dat de ultrastructuur van weefsel in statische kweek achtereenvolgens verslechtert gedurende de duur van de kweekperiode, een trend die werd afgezwakt door kweek onder stromingsomstandigheden3.
Scanning elektronenmicroscopie
Met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) werd een gedetailleerd onderzoek van het oppervlak van de villeuze explantaten vergemakkelijkt (Figuur 4A-J). Weefsel dat vers was ingebed, vertoonde een dichtbevolkte reeks microvilli over het hele oppervlak (Figuur 4 A,B). Sommige regio's vertoonden blaasjesachtige structuren. Daarentegen vertoonden weefsels uit de statische kweek na 24 uur een substantiële vermindering van microvilli (Figuur 4C,D), een vermindering die na 48 uur aanhield (Figuur 4E,F). Terwijl bepaalde gebieden een aggregatie van blaasjesachtige structuren vertoonden die niet waren vrijgegeven, leken andere regio's kaal en geërodeerd (Figuur 4D,F). In weefsel dat aan flowkweek werd onderworpen, waren microvilli na 24 uur (figuur 4G,H) en na 48 uur (figuur 4I,J) nog steeds aanwezig op het oppervlak, zij het in mindere mate dan in vers weefsel. In vergelijking met de statische cultuur was de prevalentie van blaasjesachtige structuren op het oppervlak verminderd. Intrigerend genoeg waren deze blaasjesachtige structuren met name geconcentreerd in specifieke uitsparingen waar de stroming verminderd of afwezig kon zijn (Figuur 4H,J), wat suggereert dat ze mogelijk zijn losgeraakt van het aan de stroming blootgestelde weefseloppervlak als gevolg van de stroming van het medium3.
Figuur 1: Opstelling van het stroomsysteem. (A) Het geassembleerde stroomsysteem, bestaande uit het reservoir en vijf stroomkamers, is aangesloten op een van de peristaltische pompen. Aan de rechterkant bevindt zich een plaat met zes putjes waarin de explantaten statisch zijn gekweekt. (B,C) Bij beide kweekmethoden worden de placentamonsters ontleed tot villeuze explantaten van ongeveer 0,5cm2, waarvan vervolgens vier explantaten per put of kamer worden gebruikt. Bij een experimentele aanpak worden vijf kamers of putten gebruikt. (D,E) Voor stromingscultuur wordt een metalen plaat met smalle naaldvormige verhogingen gebruikt om de explantaten vast te zetten. (F,G) De openingen van de buizen bevinden zich aan de kop van de kamers en worden dus ondersteboven gebruikt om te garanderen dat het weefsel wordt blootgesteld aan directe stroom. Deze figuur is overgenomen uit Kupper et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologische analyse van placenta-villeuze explantaten bij stroming en statische cultuur. (A-E) Immunofluorescentiekleuring voor β-actine om het cytoskelet van explantaten op kweek te visualiseren. Voor de analyse werden zes willekeurig geselecteerde spots per dia gebruikt. Er worden representatieve afbeeldingen getoond. (A) Visualisatie van het cytoskelet van weefsel dat direct na de bereiding is ingebed. Schaalbalk: 20 μm. (B-E) Representatieve weergave van zowel tijdsafhankelijke als cultivatiemodusafhankelijke degeneratie van het actine-cytoskelet in gekweekte explantaten van flow- en statische cultuur. (C-E) Sterretjes duiden op een verhoogde accumulatie van actine-microfilamenten, wat een indicatie is van de afbraak van het actinecytoskelet. (F-J) Hematoxyline-eosine-kleuring van villeuze explantaten. Schaalbalk: 100 μm. (F,G) Vers ingebed weefsel (F) en flowcultuurexplantaten gedurende 24 uur (G) vertonen een goed bewaarde morfologie van een villeuze explantatie. (I) Flow-gekweekte explantaten gedurende 48 uur tonen met tussenpozen losgemaakte gebieden van de syncytiotrofoblast (pijl). (H,J) Tijdsafhankelijke verslechtering van de structurele integriteit na statische explantatiecultuur, aangegeven door het loskomen van de syncytiotrofoblast (pijl) en geperforeerd stroma. (K-O) CD34 II werd gebruikt om villeuze endotheelcellen te kleuren. Schaalbalk: 100 μm. (K,L) Vers weefsel (K) en explantaten die gedurende 24 uur onder stromingsomstandigheden (L) zijn gekweekt, vertonen een karakteristiek structureel uitgelijnd endotheelcelpatroon. (N) Na 48 uur in flowcultuur neemt de vasculaire integriteit tot op zekere hoogte af. (M,O) Bij statische kweek zijn ingeklapte bloedvaten al na 24 uur zichtbaar (M), wat werd waargenomen bij een langere statische kweektijd (O). Deze figuur is overgenomen uit Kupper et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ultrastructureel onderzoek voor en na de teelt van villeuze explantaten met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Weefsel van drie onafhankelijke experimenten werd gebruikt om de beelden te analyseren. (A) Een representatief beeld van vers ingebed weefsel toont een grote hoeveelheid microvilli (MV) op het oppervlak van de syncytiotrofoblast (ST). Structureel intacte capillairen (Ca) zijn zichtbaar in het goed bewaarde stroma (S). (B) In het weefsel dat gedurende 24 uur statisch is gekweekt, is er een verslechtering van de structurele integriteit van de syncytiotrofoblast, die op sommige plaatsen lijkt te zijn losgekoppeld van het basale membraan. Er is ook een merkbare ophoping van lipidedruppeltjes (LD). (C) Na 48 uur in statische cultuur wordt ernstige ultrastructurele achteruitgang waargenomen. Zowel het stroma als de syncytiotrofoblast zijn geperforeerd en er is een enorme opeenhoping van lipidedruppeltjes zichtbaar. Bloedvaten waren nauwelijks te traceren. (D,E) De ultrastructuur van het weefsel uit de flowkweek was zowel na 24 uur (D) als na 48 uur (E) relatief goed bewaard gebleven. Schaalbalk: 2 μm. MV: Microvilli, ST: Syncytiotrofoblast, S: Stroma, Ca: Capillair, LD: Lipidedruppeltjes. Deze figuur is overgenomen uit Kupper et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Ultrastructureel onderzoek voor en na de teelt van villeuze explantaten met behulp van scanning-elektronenmicroscopie. (A,C,E,G,I) Overzichtsbeelden van het oppervlak van de placenta-villeuze bomen met respectievelijke detailbeelden (B,D,F,H,J). (A,B) Vers ingebed weefsel vertoont een dichte naad van microvilli. (B) Op sommige locaties kunnen blaasjesachtige structuren worden opgemerkt. (C-F) Na 24 uur en 48 uur in statische cultuur is een afname van microvilli op het oppervlak van de syncytiotrofoblast zichtbaar. Opvallend is de uitgebreide opeenhoping van blaasjesachtige deeltjes op het oppervlak van de explantatie. (F) De deeltjes lijken na 48 uur in statische cultuur te verdorren. (G-J) Het oppervlak van het weefsel uit de flowcultuur lijkt zowel na 24 uur (G,H) als na 48 uur (I,J) beter bewaard te blijven in vergelijking met de statische cultuur. Microvilli zijn zichtbaar aan het oppervlak (H,J), hoewel niet in dezelfde hoge dichtheid als in het verse weefsel. (B) Vesiculaire deeltjes kunnen worden gezien verspreid in de nissen met verminderde stroom. Deze figuur is overgenomen uit Kupper et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Experimentele instellingen voor placenta-villeuze flow en statische cultuur. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Specificaties van het stroom- en statisch systeem. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Antilichamen voor immunohistochemie en immunofluorescentie gebruikt voor dit onderzoek. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Deze studie introduceert een uniek perspectief op een flow-kweektechniek voor placenta-explantaten die is ontworpen om de dynamiek in utero-omgeving na te bootsen 3,23. De bevindingen laten zien dat de morfologie van weefsel dat onder stromingsomstandigheden wordt gekweekt, beter behouden blijft in vergelijking met de traditionele statische kweekmethode3. Met name, hoewel noch statische noch flowcultuuromstandigheden de perfusie van placentavaten vergemakkelijken, werd de vernietiging van foeto-placenta-bloedvaten in het villeuze stroma voornamelijk waargenomen in statische kweek, terwijl de integriteit van bloedvaten beter leek te worden gehandhaafd over een langere duur in flowcultuur3.
Een mogelijke verklaring voor deze waarneming zou in verband kunnen worden gebracht met de cruciale beschermende en endocriene rol van de syncytiotrofoblast, een functie die goed gedocumenteerd is in de literatuur 12,24,25,26. Daarom is het denkbaar dat de algehele integriteit van de buitenste laag van de villi aanzienlijk bijdraagt aan het behoud van het onderliggende stroma, inclusief de bloedvaten. Bijgevolg kan de aanhoudende cellulaire integriteit van de bloedvaten onder stromingsomstandigheden worden toegeschreven aan de continue stroom van het medium. Deze beweging helpt bij de passieve beweging van de explantaten en vergemakkelijkt de uitwisseling van gassen, voedingsstoffen en nanodeeltjes (zoals extracellulaire blaasjes) over de placentabarrière. Dit zou op zijn beurt een positieve invloed kunnen hebben op het behoud van de morfologie van bloedvaten. Bovendien speelt het fenomeen mechanosensatie een rol bij weefselmorfogenese in verschillende weefsels27,28. Studies hebben aangetoond dat mechanosensitiviteit cellulaire processen op meerdere niveaus beïnvloedt, waardoor een reeks biochemische reacties wordt geactiveerd die uiteindelijk de weefsel- en orgaanfunctionaliteit beïnvloeden29. Met name mechanosensitieve eiwitten worden tot expressie gebracht door de syncytiotrofoblast gedurende de hele zwangerschap28. Bovendien suggereert de studie dat microvilli op het weefseloppervlak in deze context betrokken kunnen zijn28.
Een bijkomend perspectief dat het overwegen waard is, is de mogelijke rol van mitochondriën in de cellulaire reactie op stroom. In endotheelcellen dienen mitochondriën bijvoorbeeld als signaaltransducers voor cellulaire reacties op omgevingsstimuli30. Verhoogde accumulatie van lipidedruppeltjes, waargenomen in statisch gekweekt weefsel via TEM3, is in verband gebracht met apoptose-inductie als gevolg van mitochondriale disfunctie31. Verder onderzoek is nodig om de onderliggende mechanismen en sleutelfactoren te onthullen en deze te koppelen aan stroomafwaartse signaalroutes. Deze verkenning zou ons begrip kunnen vergroten van hoe het weefsel schuifspanning waarneemt en erop reageert, wat zich vertaalt in verbeterde levensvatbaarheid en integriteit van villeuze explantaten in cultuur23.
Verschillende kritieke protocolstappen moeten worden herhaald en zorgvuldig worden uitgevoerd. Na de bevalling van de placenta moet het weefsel zo snel mogelijk worden gekweekt. Tijdens de voorbereiding van de explantatie is het vermijden van gebieden met zichtbare infarcten cruciaal. Het is belangrijk om explantaten voorzichtig met een tang te behandelen om knijpen te voorkomen. Het wordt aanbevolen om het weefsel tijdens de procedure bedekt te houden met vloeistof en deze snel uit te voeren.
Het is belangrijk om te erkennen dat deze studie niet in staat is om de exacte schuifspanning binnen het gepresenteerde stroomsysteem te specificeren, wat in toekomstige onderzoeken als een beperking moet worden beschouwd 3,23. Desalniettemin is het belangrijk om te erkennen dat de precieze stroomsnelheid en schuifspanning voor een specifieke placentale villus in vivo worden beïnvloed door tal van parameters, zoals de geometrische kenmerken van de intervilleuze ruimte, de locatie van de villus binnen deze ruimte en de nabijheid en hoek van de maternale spiraalslagaders en baarmoederaders 3,19,23,32 . Er moet ook rekening worden gehouden met de complexiteit van de geometrische structuur van de placenta, die van persoon tot persoonverschilt23,32. Er bestaan al wiskundige modellen voor het schatten van de bloedstroom binnen de intervilleuze ruimte32 en berekeningen van de schuifspanning van de wand op de syncytiotrofoblast19,28. Interessant is dat één studie voorspelde dat de schuifspanning op de syncytiotrofoblast lager is in het derde trimester in vergelijking met het eerste trimester28, terwijl een andere ruimtelijk heterogene wandschuifspanning op de syncytiotrofoblast19 aantoonde. Het bepalen van de precieze stroomsnelheid en schuifspanning voor een specifieke placentale vlokkentest blijft een uitdaging 3,19,23,32. Dergelijke berekeningen bieden een benadering van het schuifspanningsbereik voor toekomstig onderzoek, maar ze kunnen voortdurende anatomische aanpassingen en optimalisatie vereisen23. Bovendien kunnen toekomstige studies nieuwe en verfijnde doorstroomcultuurtechnieken ontwikkelen die rekening houden met de ingewikkelde geometrie van de intervilleuze ruimte en strategieën om het aantal monsters per experiment te verhogen3. Er wordt geanticipeerd op voortdurende vooruitgang en ontwikkeling van het stromingssysteem, waarbij mogelijk gebruik wordt gemaakt van alternatieve stromingskamers (Brugger et al., niet-gepubliceerde gegevens, 2023).
Concluderend legt deze studie een robuuste basis door een gemakkelijk implementeerbare ex vivo flow-kweektechniek aan te tonen die de structurele integriteit van gekweekte villeuze explantaten handhaaft. Het onderstreept het belang van dynamische technieken in studies van de functionele biologie van de placenta en maakt de weg vrij voor verdere vooruitgang in flowcultuursystemen en het genereren van nieuwe ideeën en hypothesen 3,23.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs waarderen de uitstekende technische ondersteuning van Bettina Amtmann en Petra Winkler voor weefselbemonstering. Dit onderzoek werd gefinancierd door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds FWF (DOC 31-B26) en de Medische Universiteit van Graz, Oostenrijk, via het PhD-programma Inflammatory Disorders in Pregnancy (DP-iDP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
| Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
| antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
| anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
| Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
| CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
| CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
| Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
| Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
| Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
| Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
| Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
| Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
| Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
| Metal plate with needles | In-house construction | ||
| Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
| Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
| Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
| Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
| QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
| SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
| Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
| Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
| TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
| UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
| UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
| Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |
References
- Villee, C. A. The metabolism of human placenta in vitro. Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: Approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Placental villous explant culture 2.0: flow culture allows studies closer to the in vivo situation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7464 (2021).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell and Tissue Research. 328 (3), 607-616 (2007).
- Simán, C. M., Sibley, C. P., Jones, C. J. P., Turner, M. A., Greenwood, S. L. The functional regeneration of syncytiotrophoblast in cultured explants of term placenta. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 280 (4), R1116-R1122 (2001).
- Toro, A. R., et al. Leptin is an anti-apoptotic effector in placental cells involving p53 downregulation. PLoS ONE. 9 (6), e99187 (2014).
- Morley, L. C., Debant, M., Walker, J. J., Beech, D. J., Simpson, N. A. B. Placental blood flow sensing and regulation in fetal growth restriction. Placenta. 113, 23-28 (2021).
- Wang, Y. Z. S., Wang, Y., Zhao, S.
- Huppertz, B.
- Weiss, G., Sundl, M., Glasner, A., Huppertz, B., Moser, G. The trophoblast plug during early pregnancy: a deeper insight. Histochemistry and Cell Biology. 146 (6), 749-756 (2016).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Gude, N. M., Roberts, C. T., Kalionis, B., King, R. G. Growth and function of the normal human placenta. Thrombosis Research. 114 (5-6), 397-407 (2004).
- Wang, Y.
- Moser, G., Windsperger, K., Pollheimer, J., de Sousa Lopes, S. C., Huppertz, B. Human trophoblast invasion: new and unexpected routes and functions. Histochemistry and Cell Biology. 150 (4), 361-370 (2018).
- Kupper, N., Huppertz, B. The endogenous exposome of the pregnant mother: Placental extracellular vesicles and their effect on the maternal system. Molecular Aspects of Medicine. 87 (October 2020), 100955 (2022).
- Huppertz, B. IFPA award in placentology lecture: biology of the placental syncytiotrophoblast - myths and facts. Placenta. 31 (SUPPL), S75-S81 (2010).
- Gauster, M., Moser, G., Wernitznig, S., Kupper, N., Huppertz, B. Early human trophoblast development: from morphology to function. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (6), 345 (2022).
- Lecarpentier, E., et al. Fluid shear stress promotes placental growth factor upregulation in human syncytiotrophoblast through the cAMP-pKA signaling pathway. Hypertension. 68 (6), 1438-1446 (2016).
- Lecarpentier, E., et al. Computational fluid dynamic simulations of maternal circulation: wall shear stress in the human placenta and its biological implications. PLOS ONE. 11 (1), e0147262 (2016).
- Miura, S., Sato, K., Kato-Negishi, M., Teshima, T., Takeuchi, S. Fluid shear triggers microvilli formation via mechanosensitive activation of TRPV6. Nature Communications. 6 (1), 8871 (2015).
- Jauniaux, E., et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. The American Journal of Pathology. 157 (6), 2111-2122 (2000).
- Sodha, R. J., Proegler, M., Schneider, H. Transfer and metabolism of norepinephrine studied from maternal-to-fetal and fetal-to-maternal sides in the in vitro perfused human placental lobe. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 148 (4), 474-481 (1984).
- Kupper, N. Extracellular vesicles from advanced placental explant flow culture and their role in preeclampsia [Dissertation]. , Medical University of Graz, Austria. (2022).
- Burton, G. J., Fowden, A. L. The placenta: a multifaceted, transient organ. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1663), 20140066 (2015).
- Arora, N., Sadovsky, Y., Dermody, T. S., Coyne, C. B. Microbial vertical transmission during human pregnancy. Cell Host & Microbe. 21 (5), 561-567 (2017).
- Cheong, M. L., et al. A Positive feedback loop between glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCGβ expression and cell differentiation. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 197-209 (2016).
- Heisenberg, C. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Lee, T. C., Moulvi, A., James, J. L., Clark, A. R. Multi-scale modelling of shear stress on the syncytiotrophoblast: could maternal blood flow impact placental function across gestation. Annals of Biomedical Engineering. 51 (6), 1256-1269 (2023).
- Kamkin, A., Kiseleva, I. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. 49 (0), Academia. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21290773 (2005).
- Kluge, M. A., Fetterman, J. L., Vita, J. A.
- Boren, J., Brindle, K. M. Apoptosis-induced mitochondrial dysfunction causes cytoplasmic lipid droplet formation. Cell Death & Differentiation. 19 (9), 1561-1570 (2012).
- Chernyavsky, I. L., Jensen, O. E., Leach, L. A Mathematical model of intervillous blood flow in the human placentone. Placenta. 31 (1), 44-52 (2010).
