Summary
다음은 일정한 흐름 조건에서 태반 외식을 배양하기 위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동적 생리학적 환경의 복제를 가능하게 하여 기존의 정적 융모 배양 시스템을 향상시킵니다.
Abstract
기존의 체외 태반 이식 배양 모델은 주로 웰 플레이트를 사용하는 정적 배양 시스템에 기반을 두고 있습니다. 그러나 이러한 모델은 태반이 혈장 또는 혈류로 인해 일정한 약간의 전단 응력을 겪는 자궁 환경의 역동성을 부적절하게 반영합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 체외 태반 식물 배양을 모체 내에서 경험하는 자궁 내 유동 조건에 더 가깝게 만들기 위해 유동 배양 시스템이 고안되었습니다. 이 접근법 내에서 태반 외식은 5개의 상호 연결된 유동 챔버의 시퀀스에서 배양됩니다. 이 설정은 생리적 산소 농도와 일정한 유속을 유지합니다. 수집된 데이터는 유동 조건 하에서 조직 형태의 보존이 기존의 정적 방법에 비해 현저한 향상을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 혁신적인 기술은 체외 태반 이식 배양의 간단한 방법을 도입하여 역동적인 생체 내 환경을 보다 충실하게 표현합니다. 또한, 본 연구는 태아-모성 인터페이스의 기능적 역동성을 조사할 수 있는 새로운 가능성을 제시한다. 실현 가능한 동적 방법론을 수용함으로써 태반 생물학에 대한 더 깊은 이해가 촉진되어 산모-태아 건강과의 관련성을 강조합니다.
Introduction
1960년대부터 우물판 바닥에서 태반 외래 식물 재배가 태아-모계 계면 1,2,3을 연구하는 데 활용되었습니다. 이 방법은 잘 정립되어 있고 간단하여 단일 세포 2,3의 배양 외에도 다양한 연구에 인체 조직을 활용할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라, 태반 외식성 배양을 위한 실험 설계는 산소 농도4와 관련하여수정되었으며, 조직이 웰 플레이트의 바닥(2,5,6)에 침전되는 것을 방지하였다. 그러나, 이 방법은 자궁 내 생체 내 조건, 특히 일정한 흐름의 존재에 적응하지 못했다3.
임신의 성공은 융모의 혈액과 융모 사이의 공간을 적절하고 일관되게 관류하여 혈액 및 혈액 매개 물질의 지속적인 유입 및 유출을 통한 동적 회로를 확립하는 데 달려 있다 7,8,9,10,11,12. 태반은 모체와 태아의 혈액을 위한 두 개의 뚜렷한 혈액 공급 시스템을 갖추고 있으며, 그 결과 태아와 모계 모두에 의한 이중 관류가 발생한다13. 산모의 혈액은 임신 초기에 태반의 융모 사이 공간을 관류하기 시작하여 넓어진 자궁 나선형 동맥을 통해 천천히 흐른다10,11,14. 그 결과, 태반의 융모나무는 모체의 혈액으로 목욕을 하여 태아에게 영양분과 산소를 공급한다. 이 산모의 혈액은 자궁태반 정맥을 통해 모체 순환계로 돌아가기 전에 융모 사이의 공간을 통해 흐릅니다. 융모 사이 공간을 통과하는 동안 산소와 영양분이 태아의 혈액으로 확산되고 능동적으로 흡수되어 모체 혈액의 산소와 영양소 수치가 낮아집니다12,15. 그러나 융모 사이의 혈액은 분당 약 2-3회 산소가 풍부한 신선한 혈액으로 완전히 대체되어 영양분과 가스의 지속적인 공급을 보장한다13. 특히, 태반 장벽의 가장 바깥쪽 부분인 세포융합영양아세포(syncytiotrophoblast)는 모체의 혈액에 직접 노출되는 태반 융모 나무의 유일한 구성 요소이다15,16,17. 결과적으로, 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)는 흐르는 모체의 혈액(3,14)으로부터 지속적으로 약한 전단 응력을 경험한다.
태반 유동 환경에 관한 현재의 과학적 지식과 현대 기술 발전은 이제 유동 조건 하에서 태반 외설물의 적응되고 생리학적으로 근사한 배양을 허용합니다. 또한, 증거는 전단력이 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast) 18,19,20,21의 생물학적 기능에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 혈류를 설명하는 잘 알려진 접근법은 태반 이중엽 관류 시스템(placental dual lobe perfusion system) 22이다. 그러나 이러한 실험은 상당한 전문 지식이 필요하고, 시간 제한이 있으며(몇 시간 동안만 수행됨), 임신 3기 태반 샘플에서만 가능합니다 3,23. 대조적으로, 우리는 일정한 흐름 설정 하에서 생체 외 태반 융모 이식 배양을 위한 간단하고 비침습적인 기술을 개발하여 임신 1기 및 3기 태반 조직을 모두 수용했습니다3. 이 설정에서 태반 외식은 5개의 직렬로 연결된 유동 챔버에서 배양됩니다. 융모 외피는 얇은 금속판에 바늘 모양의 돌출부를 사용하여 챔버 바닥에 고정됩니다. 구성된 유동 회로는 이후 바이오리액터로 전달되어 산소 농도와 유량이 모두 조절된다3. 유동 배양 결과는 일반적으로 사용되는 정적 분석법에 비해 조직 무결성이 더 잘 보존된다는 것을 보여줍니다3. 또한, 이러한 동적 접근 방식은 조직 외식물 배양을 위한 새롭고 적응된 실험 설계를 가능하게 하여 자연 환경을 보다 밀접하게 모방하는 체외 실험을 가능하게 합니다3.
Protocol
그라츠 의과대학의 윤리위원회는 이 연구를 승인했다(31-019 ex 18/19 version 1.2 and 29-319 ex 16/17). 연구에 참여한 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.
1. 유동 실험 준비
참고: 실험은 연동 펌프가 통합된 생물반응기에서 수행됩니다( 재료 표 참조). 생물 반응기 내부의 습도, 온도 및 가스 수준을 조정할 수 있습니다.
- 생물 반응기를 켜고 생물 반응기의 설명서에 따라 실험을 위한 모든 사전 준비(예: 펌프 교정, 사전 온난화, 가스 조건 및 습도)를 합니다. 실험을 시작하기 전에 필요한 설정(온도, 가스 함량, 습도)을 몇 시간 또는 밤새 안정화해야 합니다. 이렇게 하려면 바이오리액터와 소프트웨어를 시작한 다음 메뉴 항목 "Incubator"에서 설정값 변경 을 클릭합니다.
- PBS 및 필요한 배지(제공된 보충제 hEGF-5, HC-500 및 5% 엑소좀 결핍 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 내피 세포 성장 배지)( 재료 표 참조)를 37°C로 예열합니다.
2. 태반 시료 해부
- 분만 직후, Kupper et al.3에 설명된 대로 중간 태반 부위에서 2cm 3 태반 샘플을 3회 절단합니다.3 간단히 샘플은 PBS에 보관합니다. 융모막판, 모체 낙엽 및 눈에 보이는 경색 부위를 표본에서 폐기하십시오.
- 나머지 조직 표본을 단면적 직경이 약 0.5cm(습윤 중량 약 7.5mg)인 융모 외형물로 해부합니다. 신선한 PBS와 함께 페트리 접시에 옮깁니다.
- PBS에서 피 잔여물을 제거하기 위해 핀셋으로 액체에 부드럽게 흔들어 외래를 씻습니다.
알림: PBS가 있는 페트리 접시에서 샘플을 해부하여 사전 세척하고 건조를 방지하고 조직 처리를 위해 멸균/고압멸균 도구를 사용합니다.
3. 흐름 실험
- 멸균 후드 아래에서 흐름 챔버의 사용 설명서에 따라 루어 잠금 장치를 사용하여 5개의 챔버를 저장소 병에 직렬로 연결합니다( 재료 표 참조).
알림: 해당 설명서에 따라 사용하기 전에 모든 재료를 멸균 및/또는 고압멸균하십시오. 멸균 가스 교환을 위해 저장소 병에 공기 필터를 사용하십시오. 챔버를 열고 닫으려면 챔버의 러그를 부드럽게 짜십시오. 3.1 단계. 더 일찍 준비할 수도 있습니다. - 챔버를 거꾸로 뒤집고 바닥을 제거하여 엽니다. 집게를 사용하여 핀이 위쪽을 향하도록 챔버 상단 중앙의 금속판을 옮깁니다.
- 챔버를 1mL의 예열된 배지(37°C)로 채웁니다. 그런 다음 저장소에 20mL를 추가로 채웁니다. 회로에는 각 유량 챔버, 튜브 및 저장 용기의 부피를 포함하여 총 25mL가 필요합니다. 유동 하에서 채워진 챔버에서 배지의 최종 부피는 2mL입니다.
- 겸자를 사용하여 챔버의 금속판 바늘 사이에 융모 이식을 차례로 옮깁니다. 조직의 구멍을 피하기 위해 바늘이 태반 융모 사이로 미끄러지도록 합니다. 4개의 외식을 하나의 챔버로 옮깁니다. 바닥을 조심스럽게 다시 장착하여 챔버를 닫습니다. 전체 회로에는 총 20개의 외식이 포함되어 있습니다. 챔버는 거꾸로 된 위치에 있어야 합니다.
알림: 집게로 외피를 부드럽게 잡으십시오. 그들을 짜지 마십시오. 누출을 방지하기 위해 챔버와 회로가 완전히 밀봉되었는지 확인하십시오. 챔버는 항상 거꾸로 사용됩니다. 챔버 당 explants 수와 챔버 자체의 수는 가변적입니다. 임신 1기 조직에 대한 절차는 약간의 추가를 제외하고는 임신 3기 조직에 대한 절차와 유사합니다: 융모를 고정하기 위해 조직이 금속판으로 옮겨진 후 바늘을 외피 부위 위로 약간 구부립니다(개인 통신 Brugger et al.). 이렇게 하면 금속판에 깨지기 쉬운 조직이 고정되고 샘플이 미끄러지는 것을 방지할 수 있습니다. - 유동 어셈블리를 생물반응기로 옮깁니다.
- 펌프 튜브를 펌프에 연결하여 생물 반응기 내의 연동 펌프에 유량 회로를 연결합니다. 4번째 단계에서 수정하십시오 (네 번 딸깍 소리가 들립니다).
- 정적 제어가 필요한 경우 웰 플레이트를 생물 반응기에 놓습니다.
참고: 정적 배양의 경우, 6웰 플레이트의 5개 웰은 웰당 4mL의 배지와 웰당 4개의 융모 외식재로 채워집니다. 충전된 웰 플레이트는 또한 생물반응기에 배치되고 유동 배양 식재와 동일한 분위기에서 배양됩니다. 보다 자세한 내용은 문헌[Kupper et al.3]에 기재되어 있다 - 메뉴 항목 "Pumps"에서 펌프 모드를 Manual 로 설정합니다. 그런 다음 펌프 속도를 1mL/min으로 설정하고 Run(실행)을 클릭하여 배지를 튜브로 펌핑하기 시작합니다. 회로가 매체로 채워지는 동안 챔버가 매체로 완전히 채워지도록 비스듬히 잡으십시오.
참고: 태반 융모 흐름 및 정적 배양에 대한 실험 설정에 대해서는 보충 표 1 을 참조하십시오. 유량 및 정적 시스템의 사양은 보충 표 2에 나와 있습니다.
주의 : 시편이 바늘에서 미끄러지는 것을 방지하기 위해 채우는 동안 챔버를 조심스럽게 기울이십시오. - 충전이 완료된 후 챔버는 거꾸로 된 위치에 유지됩니다. 챔버가 안전하고 똑바로 서 있는지 확인하고 생물반응기의 양쪽 뚜껑을 닫습니다.
참고: 채워진 유동 챔버에서 배지의 최종 부피는 2mL입니다. 실험에 사용된 유동 챔버 및 웰 플레이트의 실험 설정 및 사양은 Kupper et al.3에 설명되어 있습니다 - 원하는 시간 동안 조직을 배양합니다.
알림: 온도, 가스 레벨 및 유량은 생물 반응기의 뚜껑을 다시 열지 않고도 컴퓨터에서 모니터링 할 수 있습니다. - 조직 배양 후 "Pumps" 메뉴 항목 아래의 Abort 를 클릭하여 원하는 시간 동안 펌프를 중지합니다. 생물반응기의 두 뚜껑을 연 다음 한 번에 하나의 유동 챔버를 엽니다. 집게를 사용하여 금속판에서 외엽을 조심스럽게 제거합니다.
- 선택한 다운스트림 분석에 따라 조직과 상층액을 처리합니다. 이 경우 면역조직화학적 염색 및 전자현미경 검사를 실시하였다3. 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 면역형광(immunofluorescence)에 사용되는 항체의 자세한 내용은 보충표 3 을 참조하십시오.
알림: 티슈를 제거한 후 펌프를 시계 반대 방향으로 돌려 회로에서 매체를 배출합니다. - 유량 챔버 및 튜브에 대한 제조업체의 지침에 따라 유량 회로를 분해하고 청소하십시오.
Representative Results
이 출판물의 일부와 그 결과는 이미 출판되었습니다(참고 문헌 3 및 23 참조).
실험 설정
실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다. 복합 유동 사이클은 직렬로 상호 연결된 5개의 유동 챔버로 구성됩니다(그림 1A). 각 유동 챔버 내에는 각각 단면적이 약 0.5cm인 4개의 외식이 배양됩니다(그림 1 A,C). 정적 제어 실험의 경우, 외식은 6웰 플레이트의 개별 웰에서 배양됩니다(그림 1B). 외식이 씻겨 나가는 것을 방지하기 위해 좁은 바늘 모양의 돌출부가 있는 금속판에 부착됩니다(그림 1 D,E). 외식물을 매체의 직접적인 흐름에 적용하기 위해 챔버는 입구와 출구가 헤드 섹션에 위치하도록 반전됩니다(그림 1 F,G). 생물반응기 내에서 유량 사이클은 연동 펌프에 연결됩니다. 유동 배양 조직과 종래의 정적 배양 조직 사이의 조직 무결성을 비교하기 위해, 외식은 유동 주기에 인접한 6웰 플레이트에 배치됩니다. 이를 통해 산소, 온도 및 습도 측면에서 일관된 배양 조건을 검증할 수 있습니다(그림 1A)3.
형태학적 분석
β-액틴
다양한 배양 조건과 관련된 조직 무결성의 조직학적 차이를 조사하기 위해 다양한 면역조직화학적 염색 절차가 수행되었습니다(그림 2). 해부 후 즉시 삽입된 외식이 기준 참조 역할을 했습니다. 융모 외식물 내의 액틴 세포골격 분석을 위해 β-액틴 염색을 수행했습니다(그림 2A-E). 기술 분석은 갓 얻은 조직에서 세포골격의 잘 구조화되고 조직화된 시각적 표현을 보여주었습니다(그림 2A). 시간이 지남에 따라 재배가 진행됨에 따라 미세 필라멘트의 관찰 가능한 응집이 있었으며, 이는 세포골격 구조의 저하를 의미합니다. 이 현상은 정적 배양(staticcultivation)3을 거친 융모 외식(villous explant)에서 일관되게 관찰되었다(그림 2C,E, 별표로 표시).
H&E 염색
H&E 염색은 정적 배양 과정에서 조직 무결성이 감소한다는 관찰을 추가로 강화했으며, 이러한 경향은 유동 배양의 맥락에서 개선됩니다(그림 2F-J). 신선한 조직은 조밀하고 조밀하게 포장된 기질이 특징인 융모 외피의 구조화되고 특징적인 조직학적 표현을 나타냈습니다(그림 2F). 또한, 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)는 기저 기질(substerma)에 단단히 부착되어 있었습니다(그림 2F). 24시간 동안 유동 환경에서 배양한 융모 외식에서 유사한 모양이 관찰되었습니다(그림 2G). 그러나, 유동 하에서 48시간 동안 배양한 후, 세포융합영양세포의 일부가 부분적으로 분리되는 것이 관찰되었으며(그림 2I, 화살표로 표시), 기질 내에 산발적인 작은 틈새가 동반되었습니다. 조직의 조직학적 정밀 조사는 정적 배양 조건에서 24시간 후 조직의 무결성이 부적절하게 보존되었음을 나타냈습니다(그림 2H). 더욱이, 이 무결성은 정적 배양에서 48시간 후에 현저하게 더욱 저하되었습니다(그림 2J). 기질은 다공성(porous)이고 움푹 패인 모양을 나타냈으며, 기질에서 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)의 상당한 분리는 더 큰 영역에서 분명했습니다(그림 2J, 화살표)3.
CD34II (CD34II)
CD34II 염색을 사용하여 내피 세포를 시각화하고 결과적으로 융모 외피 내의 태아-태반 혈관을 시각화했습니다(그림 2K-O). 절개 직후 직접 삽입된 조직은 내피 세포의 독특하게 조직화된 배열을 보여주었습니다(그림 2K). 태아-태반 혈관의 형태학적 완전성은 유동 배양 24시간 후 그리고 종종 48시간 후에도 잘 유지되었지만, 유동 조건에서 간혹 혈관이 붕괴되는 사례가 관찰되었습니다(그림 2 L,N). 그러나 24시간의 정적 배양 후 혈관은 시각적으로 흐트러진 모습으로 입증된 바와 같이 부분적인 붕괴를 보였습니다(그림 2M, 화살촉으로 표시). 정적 배양 환경에서 이러한 혈관 악화는 배양 시간이 길어짐에 따라 악화되는 것으로 나타났습니다. 요약하면, 유동 및 정적 배양 모두에 따른 융모 외식에 대한 서술적 형태학적 평가는 정적 배양 모드3와 대조될 때 조직 무결성이 유동 시스템 내에서 더 효과적으로 보존되는 것으로 나타났다.
배양 조직의 초구조 분석
투과 전자 현미경
융모 외식의 형태에 대한 보다 자세한 검사를 수행하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 추가 초미세 구조 분석을 수행했습니다(그림 3A-E). 이러한 발견은 조직학적 조사의 결과를 확증했다. 준비 직후 직접 삽입된 조직에서는 형태가 매우 잘 보존되었습니다(그림 3A). 미세융모(microvilli)는 세포융합영양인모세포(syncytiotrophoblast)의 표면에서 명확하게 식별될 수 있었다. 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)는 측면 세포 경계가 없는 독특한 연속층을 나타내어 기저막과 직접 접촉합니다. 신선한 조직의 기질은 심각한 천공이나 파열 없이 조밀한 패킹을 나타냈습니다. 또한, 혈관의 초구조적 외관과 개별화된 혈관 내 적혈구도 우수한 보존을 보여주었습니다(그림 3A).
24시간의 유동 배양 후에도 조직 샘플의 전체 형태는 비교적 잘 유지되었습니다(그림 3D). 세포융합영양세포의 표면에는 신선한 조직에 비해 미세융모가 약간 적었지만, 세포융합영양세포는 주로 기저막에 부착되어 있었습니다. 핵(nuclei)과 간혹 작은 액포(small vacuoles)가 세포융합영양인세포(syncytiotrophoblast)의 안쪽 부분에서 관찰되었다. 태반 융모 내의 기질은 잘 보존된 것처럼 보였고 신선한 조직과 매우 흡사했습니다(그림 3D). 48시간의 유동 배양 후에도 기질 세포는 약간의 천공이 있기는 하지만 비교적 양호한 보존을 보였습니다(그림 3E). 흥미롭게도, 조직 내에서 지질 방울이 검출되었습니다. 세포융합영양세포는 액포와 미세융모의 수 감소를 보였지만 여러 부위의 기저막에 부착된 상태로 남아 있었고 세포핵과 세포핵이 명확하게 보였습니다(그림 3E).
유동 배양의 조직과는 대조적으로, 정적 배양을 받은 융모 조직의 형태는 빠르면 24시간 내에 악화를 나타냈습니다(그림 3B). 세포융합영양세포는 여러 부위에서 기저막에서 해리되어 비교적 상당한 천공을 보였다. 또한, 지질 방울은 세포융합 영양 세포와 기질 모두에서 자주 나타났습니다(그림 3B). 48시간의 정적 배양 후 초미세 구조의 점진적인 감소가 분명했습니다(그림 3C). 세포융합영양세포는 상당한 정도로 기저막에서 수많은 천공과 박리를 나타냈다. 혈관을 구성하는 내피 세포뿐만 아니라 기질 내의 세포를 식별하는 것이 어려워졌습니다. 또한, 정적 배양 48시간 후 융모 외엽 내에 지질 방울이 눈에 띄게 축적되었습니다(그림 3C). 요약하면, 정적 배양에서 조직의 초구조는 배양 기간 동안 연속적인 열화를 나타냈으며, 이러한 경향은 유동 조건 하에서 배양함으로써 완화되었습니다3.
주사 전자 현미경
주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 융모 외피의 표면을 자세히 검사할 수 있었습니다(그림 4A-J). 갓 삽입된 조직은 표면 전체에 조밀하게 밀집된 미세융모 배열을 나타냈습니다(그림 4 A,B). 일부 지역은 소포와 같은 구조를 나타냈다. 대조적으로, 정적 배양에서 얻은 조직은 24시간 후(그림 4C,D), 48시간 후에도 지속된 감소(그림 4E,F)에서 상당한 미세융모 감소를 나타냈습니다. 어떤 지역은 방출되지 않은 소포와 같은 구조의 응집을 보였지만, 다른 지역은 벌거벗고 침식된 것처럼 보였다(그림 4D,F). 유동 배양된 조직에서, 미세융모는 24시간 후(그림 4G,H)와 48시간 후(그림 4I,J) 후에도 여전히 표면에 존재했지만, 신선한 조직에서보다 그 정도는 덜했습니다. 정적 배양과 비교했을 때, 표면에 소포와 같은 구조의 보급이 감소했습니다. 흥미롭게도, 이러한 소포 유사 구조는 흐름이 감소하거나 없을 수 있는 특정 홈에 현저하게 집중되어 있었으며(그림 4H,J), 이는 매체3의 흐름으로 인해 흐름에 노출된 조직 표면에서 제거되었을 수 있음을 시사합니다.
그림 1: 유량 시스템 설정 . (A) 저장소와 5개의 유량 챔버로 구성된 조립식 유량 시스템은 연동 펌프 중 하나에 연결됩니다. 오른쪽에는 외식이 정적으로 배양되는 6웰 플레이트가 있습니다. (나,씨) 두 가지 배양 방법 모두에서, 태반 샘플은 약 0.5cm2의 융모 외식(villous explant)으로 절개되며, 그 중 4개의 외식(explant)은 웰 또는 챔버(well or chamber)당 사용된다. 실험적 접근 방식에서는 5개의 챔버 또는 웰이 사용됩니다. (디,이) 유동 배양의 경우 좁은 바늘 모양의 돌출부를 가진 금속판을 사용하여 외식을 고정합니다. (에프,지) 튜브의 개구부는 챔버 헤드에 위치하므로 조직이 직접 흐름에 노출되도록 거꾸로 사용됩니다. 이 그림은 Kupper et al.3에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유동 및 정적 배양에 따른 태반 융모 외식의 형태학적 분석. (A-E) 배양 시 외식의 세포골격을 시각화하기 위한 β-actin에 대한 면역형광 염색. 분석을 위해 슬라이드당 무작위로 선택된 6개의 지점이 사용되었습니다. 대표 이미지가 표시됩니다. (A) 준비 직후 내장된 조직의 세포골격 시각화. 척도 막대: 20 μm. (B-E) 유동 및 정적 배양의 배양된 외식에서 액틴 세포골격의 시간 의존적 및 배양 모드 의존적 변성의 대표적인 묘사. (씨-E) 별표는 액틴 마이크로필라멘트 축적 증가를 의미하며, 이는 액틴 세포골격 분해를 나타냅니다. (에프제이 ) 융모 외식의 Hematoxylin-eosin 염색. 척도 막대: 100 μm. (F,G) 갓 삽입된 조직(F)과 24시간(G) 동안 유동 배양 외식은 융모 외식의 잘 보존된 형태를 보여줍니다. (I) 48시간 동안의 유동 배양 외식은 세포융합영양세포(화살표)의 간헐적으로 분리된 영역을 보여줍니다. (H,J) 정적 외식 배양 후 구조적 무결성의 시간 의존적 악화, 세포융합 영양 세포(화살표) 및 천공된 기질의 이탈로 나타남. (K-O) CD34 II는 융모 내피 세포를 염색하는 데 사용되었습니다. 척도 막대: 100 μm. (K,L) 유동 조건(L)에서 24시간 동안 배양된 신선한 조직(K) 및 외식은 구조적으로 정렬된 특징적인 내피 세포 패턴을 나타냅니다. (N) 유동 배양에서 48시간 후, 혈관 무결성은 어느 정도 감소합니다. (남,오) 정적 배양에서 붕괴된 혈관은 24시간(M) 후에 이미 볼 수 있으며, 이는 정적 배양 시간(O)이 길어질수록 증가하는 것으로 관찰되었습니다. 이 그림은 Kupper et al.3에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 투과 전자 현미경을 사용한 융모 외피의 초구조적 배양 전후 검사. 세 가지 독립적인 실험의 조직을 사용하여 이미지를 분석했습니다. (A) 갓 삽입된 조직의 대표 이미지는 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast, ST)의 표면에 다량의 미세융모(microvilli, MV)를 보여줍니다. 구조적으로 온전한 모세혈관(Ca)은 잘 보존된 기질(S)에서 볼 수 있습니다. (B) 24시간 동안 정적으로 배양된 조직에서는 세포융합영양아세포의 구조적 무결성이 저하되어 일부 영역에서 기저막에서 분리된 것으로 보입니다. 또한 지질 방울(LD)이 눈에 띄게 축적됩니다. (C) 정적 배양에서 48시간 후, 심각한 초미세 구조 열화가 관찰됩니다. 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)뿐만 아니라 기질(stroma)에 구멍이 뚫려 있고 지질 방울이 대량으로 축적되어 있는 것이 분명합니다. 혈관을 거의 추적할 수 없었다. (디,이) 유동 배양으로부터 조직의 초세구조는 24시간(D) 후 및 48시간(E) 후에도 비교적 잘 보존되었습니다. 척도 막대: 2 μm. MV: Microvilli, ST: Syncytiotrophoblast, S: Stroma, Ca: 모세관, LD: 지질 방울. 이 그림은 Kupper et al.3에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 주사 전자 현미경을 사용한 융모 외피의 초구조적 배양 전후 검사. (A,C,E,G,I) 각각의 상세 이미지(B,D,F,H,J)가 있는 태반 융모 나무 표면의 개요 이미지. (ᅡ,ᄂ) 갓 박힌 조직은 촘촘한 미세 융모의 이음새를 나타냅니다. (B) 일부 위치에서 Vesicular와 유사한 구조를 볼 수 있습니다. (C-F) 정적 배양에서 24시간 및 48시간 후, 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast) 표면의 미세융모(microvilli)가 감소하는 것을 볼 수 있습니다. 눈에 띄는 것은 외피의 표면에 소포와 같은 입자가 광범위하게 축적되어 있다는 것입니다. (F) 입자는 정적 배양에서 48시간 후에 시들게 됩니다. (G-J) 유동 배양에서 조직의 표면은 정적 배양에 비해 24시간(G,H) 후와 48시간(I,J) 후에 더 잘 보존되는 것으로 보입니다. 미세융모는 표면(H,J)에서 볼 수 있지만 신선한 조직에서와 같은 고밀도는 아닙니다. (B) 소포 입자는 감소된 흐름으로 틈새에 흩어져 있는 것을 볼 수 있습니다. 이 그림은 Kupper et al.3에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 태반 융모 흐름 및 정적 배양을 위한 실험 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 흐름 및 정적 시스템의 사양. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충표 3: 본 연구에 사용된 면역조직화학 및 면역형광용 항체. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 연구는 자궁 환경에서의 역동성을 복제하도록 설계된 태반 외식에 대한 유동 배양 기술에 대한 독특한 관점을 소개합니다 3,23. 연구 결과, 유동 조건에서 배양된 조직의 형태가 기존의 정적 배양 방법에 비해 더 잘 보존된다는 것을 알 수 있다3. 주목할 만한 점은, 정적 배양 조건이나 유동 배양 조건 모두 태반 혈관의 관류를 촉진하지 않음에도 불구하고, 융모 기질 내 태아-태반 혈관의 파괴는 정적 배양에서 주로 관찰된 반면, 유동 배양에서는 혈관의 무결성이 더 오랜 기간 동안 더 잘 유지되는 것으로 나타났다3.
이 관찰에 대한 한 가지 가능한 설명은 문헌 12,24,25,26에 잘 문서화된 기능인 세포융합영양인모세포(syncytiotrophoblast)의 중요한 보호 및 내분비 역할과 연결될 수 있습니다. 이를 감안할 때, 융모 바깥층의 전반적인 무결성은 혈관을 포함한 기저 기질의 유지에 크게 기여한다고 생각할 수 있습니다. 결과적으로, 유동 조건 하에서 혈관의 지속적인 세포 무결성은 배지의 지속적인 흐름에 기인할 수 있습니다. 이 움직임은 외식의 수동적 움직임을 도와 태반 장벽을 가로질러 가스, 영양소 및 나노 입자(예: 세포 외 소포)의 교환을 촉진합니다. 이는 차례로 혈관 형태 보존에 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, 기계감각 현상은 다양한 조직에 걸친 조직 형태 형성에 중요한 역할을 한다27,28. 연구에 따르면 기계적 민감성은 여러 수준에서 세포 과정에 영향을 미쳐 궁극적으로 조직 및 장기 기능에 영향을 미치는 다양한 생화학적 반응을 유발합니다29. 특히, 기계민감성 단백질은 임신 기간 동안 세포융합영양세포(syncytiotropholast)에 의해 발현된다(28). 더욱이, 이 연구는 조직 표면의 미세융모가 이러한 맥락과 관련이 있을 수 있음을 시사한다28.
고려할 가치가 있는 또 다른 관점은 흐름에 대한 세포 반응에서 미토콘드리아의 잠재적인 역할입니다. 예를 들어, 내피 세포에서, 미토콘드리아는 환경 자극에 대한 세포 반응에 대한 신호 변환기(signal transducer)로서 기능한다(30). TEM3을 통해 정적 배양 조직에서 관찰되는 지질 방울의 축적 증가는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 세포 사멸 유도와 관련이 있다31. 근본적인 메커니즘과 핵심 요인을 밝히고 이를 다운스트림 신호 경로와 연결하기 위해서는 추가 조사가 필요합니다. 이 탐구는 조직이 전단 응력을 어떻게 인식하고 반응하는지에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있으며, 배양에서 융모 외식의 생존력과 무결성을 향상시킬 수 있습니다23.
몇 가지 중요한 프로토콜 단계를 반복하고 주의해서 실행해야 합니다. 태반 분만 후 조직은 가능한 한 빨리 배양해야 합니다. 이식 준비 중에는 눈에 띄는 경색이 있는 부위를 피하는 것이 중요합니다. 압착을 방지하기 위해 집게로 외설물을 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 시술 내내 조직을 액체로 덮은 상태로 유지하고 신속하게 수행하는 것이 좋습니다.
이 연구는 제시된 유동 시스템 내에서 정확한 전단 응력을 지정할 수 없다는 것을 인정하는 것이 중요하며, 이는 향후 조사에서 한계로 고려되어야 합니다 3,23. 그럼에도 불구하고, 생체 내 특정 태반 융모에 대한 정확한 유속 및 전단 응력은 융모 사이의 공간의 기하학적 특성, 이 공간 내 융모의 위치, 모체 나선형 동맥 및 자궁 정맥에 대한 근접성 및 각도와 같은 수많은 매개변수의 영향을 받는다는 것을 인식하는 것이 중요합니다 3,19,23,32 . 개인마다 다른 태반의 기하학적 구조의 복잡성도 고려해야 합니다23,32. 융모 사이 공간(32) 내의 혈류를 추정하는 수학적 모델과 세포융합영양세포(syncytiotrophoblast)(19,28)에 대한 벽 전단 응력에 대한 계산이 이미 존재한다. 흥미롭게도, 한 연구에서는 세포융합영양세포에 대한 전단 응력이 임신 초기에 비해 임신 3기에 더 낮다고 예측한 반면, 다른 연구에서는 세포융합영양세포에 대한 공간적으로 이질적인 벽 전단 응력을 보여주었다19. 특정 태반 융모에 대한 정확한 유속과 전단 응력을 결정하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있다 3,19,23,32. 이러한 계산은 향후 조사를 위해 전단 응력 범위의 근사치를 제공하지만, 지속적인 해부학적 조정 및 최적화가 필요할 수 있다23. 또한, 향후 연구에서는 융모 간 공간의 복잡한 기하학적 구조를 설명하는 새롭고 정교한 유동 배양 기술과 실험당 표본 수를 늘리기 위한 전략을 개발할 수 있다3. 유량 시스템의 지속적인 발전과 개발이 예상되며, 잠재적으로 대체 유량 챔버를 사용할 수 있습니다(Brugger et al., unpublished data, 2023).
결론적으로, 이 연구는 배양된 융모 외식의 구조적 무결성을 유지하는 쉽게 구현할 수 있는 생체 외 유동 배양 기술을 시연함으로써 강력한 기반을 마련합니다. 이는 태반 기능 생물학 연구에서 동적 기술의 중요성을 강조하며, 유동 배양 시스템의 추가 발전과 새로운 아이디어 및 가설 생성을 위한 길을 열어줍니다 3,23.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자들은 조직 샘플링에 대한 Bettina Amtmann과 Petra Winkler의 탁월한 기술 지원에 감사하고 있습니다. 이 연구는 오스트리아 과학 기금 FWF(DOC 31-B26)와 오스트리아 그라츠 의과대학의 박사 과정 임신 중 염증성 장애(DP-iDP)를 통해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
| Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
| antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
| anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
| Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
| CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
| CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
| Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
| Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
| Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
| Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
| Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
| Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
| Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
| Metal plate with needles | In-house construction | ||
| Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
| Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
| Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
| Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
| QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
| SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
| Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
| Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
| TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
| UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
| UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
| Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |
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