Summary
Her er en protokoll for dyrking av placenta explants under konstante strømningsforhold. Denne tilnærmingen forbedrer tradisjonelle statiske villøse kultursystemer ved å muliggjøre replikering av dynamiske fysiologiske miljøer.
Abstract
De eksisterende ex vivo placentaplantekulturmodellene er primært forankret i statiske kultursystemer ved bruk av brønnplater. Imidlertid reflekterer disse modellene utilstrekkelig dynamikken i utero-innstillingen, hvor morkaken møter konstant liten skjærspenning på grunn av plasma eller blodstrøm. For å møte denne begrensningen er det utviklet et strømningskultursystem for å bringe ex vivo placentaplantedyrking nærmere de in utero strømningsforholdene som oppleves i mors kropp. Innenfor denne tilnærmingen dyrkes placentaplanter i en sekvens av fem sammenkoblede strømningskamre. Denne innstillingen opprettholder fysiologiske oksygenkonsentrasjoner og en konsistent strømningshastighet. De innsamlede dataene viser at under strømningsforhold viser bevaring av vevsmorfologi merkbar forbedring sammenlignet med konvensjonelle statiske metoder. Denne innovative teknikken introduserer et enkelt middel til ex vivo placentaplantekultur, og tilbyr en mer trofast representasjon av det dynamiske in vivo-miljøet. Videre introduserer denne studien nye muligheter for å undersøke den funksjonelle dynamikken i feto-mors grensesnitt. Ved å omfavne gjennomførbare dynamiske metoder, blir det lettere å forstå placentabiologien, noe som understreker dens relevans for mors fosterhelse.
Introduction
Siden 1960-tallet har dyrking av placentaplanter på bunnen av en brønnplate blitt brukt til å studere feto-mors grensesnitt 1,2,3. Denne metoden er veletablert og grei, og muliggjør bruk av humant vev for ulike studier, i tillegg til kulturer av enkeltceller 2,3. Over tid har eksperimentelle design for placentaplantekulturer blitt modifisert med hensyn til oksygenkonsentrasjon4 og for å forhindre at vevet legger seg på brønnplatens bunn 2,5,6. Denne metoden har imidlertid ikke blitt tilpasset in vivo-forholdene i livmoren, spesielt tilstedeværelsen av en konstant strømning3.
Suksessen til en graviditet avhenger av en tilstrekkelig og konsistent perfusjon av det intervillous rommet med mors blod, og etablerer en dynamisk krets med kontinuerlig innstrømning og utstrømning av blod og blodbårne stoffer 7,8,9,10,11,12. Morkaken har to forskjellige blodforsyningssystemer, en for mors blod og en for fosterblod, noe som resulterer i dobbel perfusjon av både foster- og morssystemer13. Mors blod begynner å perfusere morkakens intervillous rom i slutten av første trimester, sakte strømmer gjennom utvidede livmor spiralarterier10,11,14. Følgelig blir placenta villøse trær badet i mors blod, og leverer næringsstoffer og oksygen til fosteret. Dette mors blod strømmer gjennom det intervillous rommet før det går tilbake til mors sirkulasjon via uteroplacental vener. Under passasjen gjennom det intervillous rommet fører diffusjon og aktivt opptak av oksygen og næringsstoffer i fosterblod til lavere oksygen- og næringsnivåer i mors blod12,15. Imidlertid er det intervillous rommets blod helt erstattet av friskt, oksygenrikt blod omtrent to til tre ganger per minutt, noe som sikrer kontinuerlig tilførsel av næringsstoffer og gasser13. Spesielt er syncytiotrofoblasten, den ytterste delen av placentabarrieren, den eneste komponenten i placentavilletreet som er direkte utsatt for mors blod15,16,17. Følgelig opplever syncytiotrofoblasten en konstant mild skjærspenning fra det flytende morsblodet 3,14.
Nåværende vitenskapelig kunnskap om placentastrømningsmiljøet og moderne tekniske fremskritt tillater nå en tilpasset og fysiologisk tilnærmet dyrking av placentaplanter under strømningsforhold. Videre tyder bevis på at skjærkrefter påvirker de biologiske funksjonene til syncytiotrofoblasten 18,19,20,21. En velkjent tilnærming som står for blodstrømmen er placenta dual lobe perfusjonssystem22. Imidlertid krever disse forsøkene betydelig kompetanse, er tidsbegrenset (utført i bare noen få timer), og er bare gjennomførbare med tredje trimester placentaprøver 3,23. I kontrast har vi utviklet en enkel og ikke-påtrengende teknikk for ex vivo placenta villøs eksplantkultur under konstante strømningsinnstillinger, imøtekommende både første og tredje trimester placentavev3. I dette oppsettet dyrkes placentaplanter i fem seriekoblede strømningskamre. Villøse eksplanter festes til kammerets bunn ved hjelp av nålformede forhøyninger på tynne metallplater. Den konstruerte strømningskretsen overføres deretter til en bioreaktor, hvor både oksygenkonsentrasjon og strømningshastighet reguleres3. Strømningskulturresultater viser at vevets integritet er bedre bevart sammenlignet med den typisk brukte statiske metoden3. Videre muliggjør denne dynamiske tilnærmingen nye og tilpassede eksperimentelle design for vevseksplantdyrking, noe som muliggjør in vitro-eksperimenter som nærmere etterligner det naturlige miljøet3.
Protocol
Den etiske komiteen ved Medical University of Graz godkjente denne studien (31-019 ex 18/19 versjon 1.2 og 29-319 ex 16/17). Informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersonene som var involvert i studien.
1. Forberedelse til strømningseksperimentet
MERK: Forsøkene utføres i en bioreaktor med integrerte peristaltiske pumper (se materialfortegnelse). Fuktigheten, temperaturen og gassnivået inne i bioreaktoren kan justeres.
- Slå på bioreaktoren og gjør alle forhåndsordninger (f.eks. kalibrering av pumpene, forvarming, gassforhold og fuktighet) for eksperimentet i henhold til manualen til bioreaktoren. Før du starter eksperimentet, bør de nødvendige innstillingene (temperatur, gassinnhold, fuktighet) stabiliseres i noen timer eller over natten. For å gjøre dette, start bioreaktoren og programvaren og klikk deretter på Endre settpunkter under menypunktet "Inkubator".
- Forvarm PBS og nødvendig medium (Endothelial Cell Growth Medium supplert med medfølgende tilskudd hEGF-5, HC-500 samt 5% eksosomutarmet føtal bovint serum, 1% penicillin / streptomycin) (se materialtabell) til 37 ° C.
2. Disseksjon av placentaprøve
- Umiddelbart etter fødselen, kutt tre ganger 2 cm 3 placentaprøver fra midtre placentaregionen som beskrevet i Kupper etal.3 Hold prøvene kort i PBS. Kast bort chorionplaten, mors decidua og områder med synlige infarkt fra prøven.
- Dissekere den gjenværende vevsprøven i villøse eksplanter med en tverrsnittsdiameter på ca. 0,5 cm (våtvekt på ca. 7,5 mg). Overfør dem til en petriskål med fersk PBS.
- Vask eksplantene i PBS ved å riste dem forsiktig i væsken med pinsett for å fjerne blodrester.
MERK: Dissekere prøvene i en petriskål med PBS for å forvaske og forhindre at de tørker ut og bruk steriliserte / autoklaverte verktøy for behandling av vevet.
3. Flow eksperiment
- Under en steril hette kobler du fem kamre i serie til flasken ved hjelp av luerlåsene i henhold til brukerhåndboken til strømningskamrene (se materialfortegnelse).
MERK: Steriliser og / eller autoklav alt materiale før bruk, i henhold til den respektive håndboken. Bruk et luftfilter på reservoarflasken for steril gassutveksling. For å åpne og lukke kamrene, klem forsiktig inn kamrene. Trinn 3.1. kan også være forberedt tidligere. - Vri kamrene opp ned og åpne dem ved å fjerne bunnen. Bruk tang til å overføre metallplatene sentralt i den øverste delen av kamrene med pinnene pekende oppover.
- Fyll kamrene med 1 ml forvarmet medium (37 °C). Fyll deretter reservoaret med ytterligere 20 ml. Kretsen krever totalt 25 ml, inkludert volumet i hvert strømningskammer, i rørene og reservoarflasken. Under strømmen er det endelige volumet av mediet i et fylt kammer 2 ml.
- Bruk tang og overfør den ene villøse eksplanten etter den andre mellom nålene på metallplaten i kammeret. La nålene gli mellom placenta villi for å unngå punktering av vevet. Overfør fire eksplanter til ett kammer. Lukk kamrene ved å montere bunnen forsiktig. En komplett krets inneholder totalt 20 eksplanter. Kamrene må forbli i en opp-ned-posisjon.
MERK: Ta forsiktig tak i eksplantene med tangen; Prøv å ikke klemme dem. Forsikre deg om at kamrene og kretsen er helt forseglet for å forhindre lekkasje. Kamrene brukes alltid opp ned. Antall eksplanter per kammer og antall kamre selv er varierende. Prosedyren for vev i første trimester ligner den for vev i tredje trimester med et lite tillegg: For å fikse villi, bøy nålene litt over eksplantene etter at vevet er overført til metallplaten (personlig kommunikasjon Brugger et al.). Dette fikserer det skjøre vevet på metallplaten og forhindrer at prøvene glir av. - Overfør strømningsenheten til bioreaktoren.
- Koble strømningskretsen til den peristaltiske pumpen i bioreaktoren ved å koble pumpeslangen til pumpen. Fiks det på 4. trinn (man vil høre det klikke fire ganger).
- Hvis det kreves en statisk kontroll, plasserer du også brønnplaten i bioreaktoren.
MERK: For statisk kultur er fem brønner på en seks-brønns plate fylt med 4 ml medium per brønn og 4 villøse eksplanter per brønn. Den fylte brønnplaten er også plassert i bioreaktoren og dyrket i samme atmosfære som strømningskulturen eksplanterer. Ytterligere detaljer er beskrevet i Kupper et al.3 - Sett pumpemodus til Manuell under menypunktet "Pumper". Sett deretter pumpehastigheten til 1 ml / min og begynn å pumpe mediet inn i slangen ved å klikke på Kjør. Mens kretsen fylles med medium, hold kamrene i en vinkel slik at de er fullstendig fylt med medium.
MERK: Se tilleggstabell 1 for eksperimentelle innstillinger for placenta, villøs strømning og statisk kultur. Spesifikasjoner for strømning og statisk system er gitt i tilleggstabell 2.
FORSIKTIG: Vipp kammeret forsiktig under fylling for å forhindre at prøvene glir av nålene. - Etter at fyllingen er fullført, forblir kamrene i opp-ned-posisjon. Sørg for at kamrene står sikkert og oppreist, og lukk begge lokkene på bioreaktoren.
MERK: Det endelige volumet av mediet i et fylt strømningskammer er 2 ml. De eksperimentelle innstillingene og spesifikasjonene til strømningskamrene og brønnplatene som ble brukt i forsøkene er beskrevet i Kupper et al.3 - Inkuber vevet i ønsket tid.
MERK: Temperaturen, gassnivået og strømningshastigheten kan overvåkes på datamaskinen uten å åpne lokket på bioreaktoren igjen. - Stopp pumpen etter inkubering av vevet i ønsket tid ved å klikke på Abort under menypunktet "Pumper". Åpne de to lokkene på bioreaktoren og deretter ett strømningskammer om gangen. Fjern forsiktig eksplantene fra metallplaten ved hjelp av tang.
- Behandle vevet og supernatanten i henhold til den valgte nedstrømsanalysen. I dette tilfellet ble immunhistokjemisk farging og elektronmikroskopi utført3. Se tilleggstabell 3 for detaljer om antistoffer brukt for immunhistokjemi og immunfluorescens.
NOTAT: Etter å ha fjernet vevet, tøm mediet fra kretsløpet ved å rotere pumpen mot klokken. - Demonter og rengjør strømningskretsen i henhold til produsentens instruksjoner for strømningskamrene og slangene.
Representative Results
Deler av denne publikasjonen og dens resultater er allerede publisert (Se referanser 3 og 23).
Eksperimentelt oppsett
Et eksperimentelt oppsett er illustrert i figur 1. En sammensatt strømningssyklus består av fem strømningskamre som er sammenkoblet i serie (figur 1A). Innenfor hvert strømningskammer dyrkes fire eksplanter, hver med en tverrsnittsdiameter på ca. 0,5 cm (figur 1 A,C). For det statiske kontrolleksperimentet dyrkes eksplantene i individuelle brønner på en seksbrønnsplate (figur 1B). For å hindre at eksplantene skylles ut, festes de på metallplater med smale nålformede fremspring (figur 1 D,E). For å utsette eksplantene for en direkte strøm av mediet, er kamrene invertert, med innløp og utløp plassert ved hodeseksjonen (figur 1 F,G). Innenfor bioreaktoren er strømningssyklusen knyttet til en peristaltisk pumpe. For å sammenligne vevsintegritet mellom strømningskulturert vev og konvensjonelt statisk-dyrket vev, plasseres eksplanter i en seksbrønnsplate ved siden av strømningssyklusen. Dette sikrer verifisering av konsistente dyrkningsforhold når det gjelder oksygen, temperatur og fuktighet (figur 1A)3.
Morfologisk analyse
β-aktin
Ulike immunhistokjemiske fargeprosedyrer ble utført for å undersøke histologiske forskjeller i vevsintegritet assosiert med ulike dyrkingsbetingelser (figur 2). Eksplanter som raskt ble innebygd etter disseksjon fungerte som basislinjereferanse. For analyse av aktincytoskjelettet i villøse eksplanter ble β-aktinfarging utført (figur 2A-E). Deskriptiv analyse avdekket en velstrukturert og organisert visuell presentasjon av cytoskjelettet i nyoppnådd vev (figur 2A). Over tid, etter hvert som dyrkingen utviklet seg, var det en observerbar aggregering av mikrofilamenter, noe som betyr en nedbrytning av cytoskeletalstrukturen. Dette fenomenet ble konsekvent observert i villøse eksplanter som gjennomgikk statisk dyrking3 (figur 2C,E, indikert med stjerner).
H&E-farging
H&E-farging ga ytterligere forsterkning til observasjonen om at vevsintegriteten reduseres i løpet av statisk kultur, en trend som forbedres i sammenheng med strømningskultur (figur 2F-J). Ferskt vev viste en strukturert og karakteristisk histologisk fremstilling av villøse eksplanter, karakterisert ved en tett og tettpakket stroma (figur 2F). I tillegg festet syncytiotrofoblasten seg godt til underliggende stroma (figur 2F). Et sammenlignbart utseende ble observert i villøse eksplanter dyrket i et strømningsmiljø i 24 timer (figur 2G). Etter 48 timers dyrkning under strømmen ble det imidlertid observert at deler av syncytiotrofoblasten var delvis løsrevet (figur 2I, angitt med pil), ledsaget av sporadiske små lakuner i stroma. Histologisk gransking av vevet indikerte at vevets integritet etter 24 timer i statisk dyrkningstilstand ikke var tilstrekkelig bevart (figur 2H). Videre ble denne integriteten ytterligere forringet etter 48 timer i statisk kultur (figur 2J). Stroma viste et porøst og pitted utseende, og signifikant løsrivelse av syncytiotrofoblast fra stroma var tydelig i større regioner (figur 2J, piler)3.
CD34II
CD34II-farging ble brukt for å visualisere endotelceller og følgelig feto-placentale blodkar i villøse eksplanter (figur 2K-O). Vev som var direkte innebygd rett etter disseksjon viste et tydelig organisert arrangement av endotelcellene (figur 2K). Den morfologiske integriteten til feto-placenta blodkar forble godt opprettholdt etter 24 timers strømningskultur og ofte selv etter 48 timer, selv om sporadiske tilfeller av kollapsede blodkar ble observert under strømningsforhold (figur 2 L,N). Imidlertid, etter 24 timer med statisk kultur, viste blodkarene delvis kollaps, noe som gjenspeiles av deres forstyrrede visuelle utseende (figur 2M, indikert med pilspisser). Denne forverringen av blodkar i den statiske kultursettingen så ut til å forverres med forlenget dyrkingstid. Oppsummert indikerte den deskriptive morfologiske vurderingen av villøse eksplanter etter både strømning og statisk kultur at vevsintegritet ser ut til å bli mer effektivt bevart i strømningssystemet i kontrast til statisk kulturmodus3.
Ultrastrukturell analyse av dyrket vev
Transmisjonselektronmikroskopi
For å gjøre en nærmere undersøkelse av morfologien til de villøse eksplantene ble det utført ytterligere ultrastrukturelle analyser ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) (figur 3A-E). Disse funnene bekreftet resultatene av de histologiske undersøkelsene. I vev som var direkte innebygd umiddelbart etter preparering, var morfologien usedvanlig godt bevart (figur 3A). Microvilli var tydelig merkbar på overflaten av syncytiotrofoblasten. Syncytiotrofoblasten presenterte sitt karakteristiske kontinuerlige lag uten laterale cellegrenser, og etablerte direkte kontakt med kjellermembranen. Stroma av det ferske vevet viste tett pakking uten signifikante perforeringer eller brudd. Videre viste det ultrastrukturelle utseendet til blodkarene og individualiserte intravaskulære erytrocytter også utmerket bevaring (figur 3A).
Selv etter 24 timers strømningskultur var vevsprøvenes samlede morfologi relativt godt vedlikeholdt (figur 3D). Mens det var litt færre mikrovilli på overflaten av syncytiotrofoblasten sammenlignet med ferskt vev, forble syncytiotrofoblasten primært festet til basalmembranen. Kjerner og sporadiske små vakuoler kunne observeres i den indre delen av syncytiotrofoblasten. Stroma i placentavilli virket godt bevart og lignet ferskt vev (figur 3D). Selv etter 48 timers strømningskultur viste stromale celler relativt god konservering, om enn med noen perforeringer tilstede (figur 3E). Oppsiktsvekkende nok ble lipiddråper påvist i vevet. Mens syncytiotrofoblasten viste vakuoler og en reduksjon i antall mikrovilli, forble den festet til basalmembranen i mange regioner, og syncytial- og cellekjerner var tydelig synlige (figur 3E).
I sterk kontrast til vevet fra strømningskulturen viste morfologien til villøst vev utsatt for statisk kultur forverring så tidlig som 24 timer (figur 3B). Syncytiotrofoblasten ble dissosiert fra basalmembranen flere steder og viste relativt betydelige perforeringer. I tillegg ble lipiddråper ofte påvist både i syncytiotrofoblast og stroma (figur 3B). Etter 48 timer med statisk kultur var en progressiv nedgang i ultrastruktur tydelig (figur 3C). Syncytiotrofoblasten presenterte i betydelig grad tallrike perforeringer og løsrivelse fra basalmembranen. Identifisering av celler i stroma, samt endotelceller som blodkarene, ble utfordrende. Videre var det en merkbar akkumulering av lipiddråper i villøse eksplanter etter 48 timer statisk kultur (figur 3C). Oppsummert viste ultrastrukturen av vev i statisk kultur suksessiv forverring i løpet av dyrkingsperioden, en trend som ble dempet ved dyrking under strømningsforhold3.
Skanning elektronmikroskopi
Ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM) ble det lagt til rette for en detaljert undersøkelse av overflaten av villøse eksplanter (figur 4A-J). Vev som hadde vært nyinnstøpt, viste et tett befolket utvalg av mikrovilli over overflaten (figur 4 A,B). Noen regioner viste vesikkellignende strukturer. I motsetning til dette manifesterte vev fra statisk kultur en betydelig reduksjon i mikrovilli etter 24 timer (figur 4C,D), en reduksjon som vedvarte etter 48 timer (figur 4E,F). Mens enkelte områder viste aggregering av vesikkellignende strukturer som ikke var frigjort, virket andre regioner nakne og eroderte (figur 4D, F). I vev utsatt for strømningskultur var mikrovilli fortsatt til stede på overflaten etter 24 timer (figur 4G,H), samt etter 48 timer (figur 4I,J), men i mindre grad enn i ferskt vev. I forhold til den statiske kulturen ble forekomsten av vesikkellignende strukturer på overflaten redusert. Interessant nok var disse vesikkellignende strukturene spesielt konsentrert i spesifikke fordypninger hvor strømmen kunne reduseres eller fraværende (figur 4H, J), noe som tyder på at de kan ha blitt løsnet fra den strømningseksponerte vevsoverflaten på grunn av strømmen av mediet3.
Figur 1: Oppsett av strømningssystemet. (A) Det sammensatte strømningssystemet, bestående av reservoaret og fem strømningskamre, er koblet til en av de peristaltiske pumpene. På høyre side er en seks-brønnplate hvor eksplantene er statisk dyrket. (B,C) For begge dyrkingsmetoder dissekeres placentaprøvene til villøse eksplanter på ca. 0,5 cm2, hvorav fire eksplanter deretter brukes per brønn eller kammer. I en eksperimentell tilnærming brukes fem kamre eller brønner. (D,E) For strømningskultur brukes en metallplate med smale nålformede forhøyninger for å sikre eksplantene. (F,G) Åpningene til rørene er plassert innerst i kamrene, og brukes dermed opp ned for å garantere at vevet utsettes for direkte strømning. Denne figuren er gjengitt fra Kupper et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologisk analyse av placentavilløse eksplanter ved strømning og statisk kultur. (A-E) Immunfluorescensfarging for β-aktin for å visualisere cytoskjelettet av eksplanter ved kultur. For analysen ble seks tilfeldig valgte flekker brukt per lysbilde. Representative bilder vises. (A) Visualisering av cytoskjelettet av vev innebygd direkte etter preparering. Skala bar: 20 μm. (B-E) Representativ skildring av både tidsavhengig og dyrkingsmodusavhengig degenerasjon av aktincytoskjelettet i dyrkede eksplanter av strømning og statisk kultur. (VG Nett) Stjerner betyr økt akkumulering av aktinmikrofilament, som er en indikasjon på nedbrytning av aktincytoskjelettet. (VG Nett) Hematoksylin-eosinfarging av villøse eksplanter. Skalastang: 100 μm. (F,G) Nyinnstøpt vev (F) og strømningskulturplanter i 24 timer (G) viser en godt bevart morfologi av en villøs eksplant. (I) Strømningsdyrkede eksplanter i 48 timer viser periodisk frittliggende områder av syncytiotrofoblasten (pil). (H,J) Tidsavhengig forringelse av strukturell integritet etter statisk eksplantkultur, indikert ved dislodgment av syncytiotrofoblast (pil) og perforert stroma. (KO) CD34 II ble brukt til å farge villøse endotelceller. Skala bar: 100 μm. (K,L) Ferskt vev (K) og eksplanter dyrket i 24 timer under strømningsforhold (L) viser et karakteristisk strukturelt justert endotelcellemønster. (N) Etter 48 timer i strømningskultur reduseres den vaskulære integriteten til en viss grad. (M,O) I statisk kultur er kollapsede blodkar allerede synlige etter 24 timer (M), noe som ble observert å øke med lengre statisk dyrkingstid (O). Denne figuren er gjengitt fra Kupper et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ultrastrukturell før- og etterdyrkingsundersøkelse av villøse eksplanter ved transmisjonselektronmikroskopi. Vev fra tre uavhengige eksperimenter ble brukt til å analysere bildene. (A) Et representativt bilde av ferskt innebygd vev viser en stor mengde mikrovilli (MV) på overflaten av syncytiotrofoblasten (ST). Strukturelt intakte kapillærer (Ca) er synlige i den godt bevarte stroma (S). (B) I vevet som har vært statisk dyrket i 24 timer, er det en forverring av den strukturelle integriteten til syncytiotrofoblasten, som synes å være frakoblet basalmembranen i enkelte områder. Det er også en merkbar akkumulering av lipiddråper (LD). (C) Etter 48 timer i statisk kultur observeres alvorlig ultrastrukturell forverring. Stroma samt syncytiotrofoblast er perforert og en massiv akkumulering av lipiddråper er tydelig. Blodårer kunne knapt spores. (D,E) Vevets ultrastruktur fra strømningskulturen ble relativt godt bevart etter 24 timer (D) og etter 48 timer (E). Skala bar: 2 μm. MV: Microvilli, ST: Syncytiotrophoblast, S: Stroma, Ca: Kapillær, LD: Lipiddråper. Denne figuren er gjengitt fra Kupper et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ultrastrukturell før- og etterdyrkingsundersøkelse av villøse eksplanter ved hjelp av scanning elektronmikroskopi. (A,C,E,G,I) Oversiktsbilder av overflaten av morkakevilttrærne med respektive detaljerte bilder (B,D,F,H,J). (A,B) Ferskt innebygd vev utviser en tett søm av mikrovilli. (B) Vesikulære strukturer kan bli lagt merke til noen steder. (VG Nett) Etter 24 timer og 48 timer i statisk kultur er en reduksjon i mikrovilli på overflaten av syncytiotrofoblasten synlig. Slående er den omfattende akkumuleringen av vesikulære lignende partikler på overflaten av planten. (F) Partiklene ser ut til å visne etter 48 timer i statisk kultur. (VG Nett) Overflaten av vevet fra strømningskulturen ser ut til å bli bedre bevart etter 24 timer (G,H) samt etter 48 timer (I,J) sammenlignet med statisk kultur. Mikrovilli er synlige på overflaten (H,J), men ikke i samme høye tetthet som i det ferske vevet. (B) Vesikulære partikler kan sees spredt i nisjene med redusert strømning. Denne figuren er gjengitt fra Kupper et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Eksperimentelle innstillinger for placentavilløs strømning og statisk dyrkning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 2: Spesifikasjoner for strømningssystemet og det statiske systemet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 3: Antistoffer for immunhistokjemi og immunfluorescens brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Denne studien introduserer et unikt perspektiv på en strømningskulturteknikk for placentaplanter designet for å gjenskape dynamikken i utero miljø 3,23. Funnene viser at morfologien til vev dyrket under strømningsbetingelser er bedre bevart sammenlignet med den tradisjonelle statiske dyrkingsmetoden3. Spesielt, selv om verken statiske eller strømningskulturelle forhold muliggjør perfusjon av placentakar, ble ødeleggelsen av feto-placenta blodkar inne i villøs stroma hovedsakelig observert i statisk kultur, mens integriteten til blodkar syntes å være bedre opprettholdt over lengre varighet i strømningskultur3.
En mulig forklaring på denne observasjonen kan knyttes til syncytiotrofoblastens avgjørende beskyttende og endokrine rolle, en funksjon som er godt dokumentert i litteraturen 12,24,25,26. Gitt dette er det tenkelig at den generelle integriteten til det ytre laget av villi bidrar betydelig til vedlikehold av den underliggende stroma, inkludert blodkarene. Følgelig kan den vedvarende cellulære integriteten til blodkarene under strømningsforhold tilskrives den kontinuerlige strømmen av mediet. Denne bevegelsen hjelper til med passiv bevegelse av eksplantene, noe som letter utvekslingen av gasser, næringsstoffer og nanopartikler (som ekstracellulære vesikler) over placentabarrieren. Dette kan i sin tur positivt påvirke bevaringen av blodkarmorfologi. Videre spiller fenomenet mekanosensasjon en rolle i vevsmorfogenese over forskjellige vev27,28. Studier har vist at mekanosensitivitet påvirker cellulære prosesser på flere nivåer, og utløser en rekke biokjemiske responser som til slutt påvirker vev og organfunksjonalitet29. Spesielt uttrykkes mekanosensitive proteiner av syncytiotrofoblasten gjennom hele svangerskapet28. Videre antyder studien at mikrovilli på vevsoverflaten kan være involvert i denne sammenhengen28.
Et ekstra perspektiv verdt å vurdere er mitokondriens potensielle rolle i den cellulære responsen på strømning. For eksempel, i endotelceller, tjener mitokondrier som signaltransdusere for cellulære responser på miljøstimuli30. Økt akkumulering av lipiddråper, observert i statisk dyrket vev gjennom TEM3, har vært assosiert med apoptoseinduksjon på grunn av mitokondriell dysfunksjon31. Ytterligere undersøkelser er nødvendige for å avdekke de underliggende mekanismene og nøkkelfaktorene, og knytte dem til nedstrøms signalveier. Denne utforskningen kan forbedre vår forståelse av hvordan vevet oppfatter og reagerer på skjærspenning, og oversettes til forbedret levedyktighet og integritet av villøse eksplanter i kultur23.
Flere kritiske protokolltrinn må gjentas og utføres med forsiktighet. Etter placentafødsel bør vevet dyrkes så raskt som mulig. Under forberedelse av eksplanter er det avgjørende å unngå områder med synlige infarkter. Forsiktig håndtering av eksplanter med tang for å forhindre klemming er viktig. Det anbefales å holde vevet dekket med væske gjennom hele prosedyren og gjennomføre det raskt.
Det er viktig å erkjenne at denne studien ikke er i stand til å spesifisere den eksakte skjærspenningen i det presenterte strømningssystemet, noe som bør betraktes som en begrensning i fremtidige undersøkelser 3,23. Likevel er det viktig å erkjenne at presis strømningshastighet og skjærspenning for en bestemt placenta villus in vivo påvirkes av mange parametere, for eksempel de geometriske egenskapene til det intervillous rommet, villusens plassering i dette rommet, og dens nærhet og vinkel til mors spiralarterier og livmorvener 3,19,23,32 . Kompleksiteten i morkakens geometriske struktur, som varierer mellom individer, må også tas i betraktning23,32. Matematiske modeller som estimerer blodstrømmen i det intervilløse rommet32 og beregninger på veggskjærspenning på syncytiotrofoblasten19,28 eksisterer allerede. Interessant nok spådde en studie at skjærspenningen på syncytiotrofoblasten er lavere i tredje trimester sammenlignet med første trimester28, mens en annen viste romlig heterogen veggskjærspenning på syncytiotrofoblast19. Bestemmelse av nøyaktig strømningshastighet og skjærspenning for en bestemt placenta villus er fortsatt en utfordring 3,19,23,32. Slike beregninger gir en tilnærming av skjærspenningsområdet for fremtidige undersøkelser, men de kan kreve løpende anatomiske justeringer og optimalisering23. Videre kan fremtidige studier utvikle nye og raffinerte strømningskulturteknikker som står for den intrikate geometrien i det intervillous rommet og strategier for å øke antall prøver per eksperiment3. Det forventes kontinuerlig fremgang og utvikling av strømningssystemet, potensielt ved bruk av alternative strømningskamre (Brugger et al., upubliserte data, 2023).
Avslutningsvis legger denne studien et robust grunnlag ved å demonstrere en lett implementerbar ex vivo strømningskulturteknikk som opprettholder den strukturelle integriteten til dyrkede villøse eksplanter. Det understreker betydningen av dynamiske teknikker i placenta funksjonelle biologistudier, baner vei for videre fremskritt i strømningskultursystemer og generering av nye ideer og hypoteser 3,23.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne setter pris på den utmerkede tekniske støtten fra Bettina Amtmann og Petra Winkler for vevsprøvetaking. Denne forskningen ble finansiert av det østerrikske vitenskapsfondet FWF (DOC 31-B26) og Medical University of Graz, Østerrike, gjennom PhD-programmet Inflammatoriske lidelser i svangerskapet (DP-iDP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
| Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
| antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
| anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
| Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
| CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
| CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
| Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
| Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
| Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
| Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
| Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
| Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
| Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
| Metal plate with needles | In-house construction | ||
| Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
| Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
| Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
| Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
| QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
| SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
| Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
| Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
| TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
| UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
| UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
| Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |
References
- Villee, C. A. The metabolism of human placenta in vitro. Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: Approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Placental villous explant culture 2.0: flow culture allows studies closer to the in vivo situation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7464 (2021).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell and Tissue Research. 328 (3), 607-616 (2007).
- Simán, C. M., Sibley, C. P., Jones, C. J. P., Turner, M. A., Greenwood, S. L. The functional regeneration of syncytiotrophoblast in cultured explants of term placenta. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 280 (4), R1116-R1122 (2001).
- Toro, A. R., et al. Leptin is an anti-apoptotic effector in placental cells involving p53 downregulation. PLoS ONE. 9 (6), e99187 (2014).
- Morley, L. C., Debant, M., Walker, J. J., Beech, D. J., Simpson, N. A. B. Placental blood flow sensing and regulation in fetal growth restriction. Placenta. 113, 23-28 (2021).
- Wang, Y. Z. S., Wang, Y., Zhao, S.
- Huppertz, B.
- Weiss, G., Sundl, M., Glasner, A., Huppertz, B., Moser, G. The trophoblast plug during early pregnancy: a deeper insight. Histochemistry and Cell Biology. 146 (6), 749-756 (2016).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Gude, N. M., Roberts, C. T., Kalionis, B., King, R. G. Growth and function of the normal human placenta. Thrombosis Research. 114 (5-6), 397-407 (2004).
- Wang, Y.
- Moser, G., Windsperger, K., Pollheimer, J., de Sousa Lopes, S. C., Huppertz, B. Human trophoblast invasion: new and unexpected routes and functions. Histochemistry and Cell Biology. 150 (4), 361-370 (2018).
- Kupper, N., Huppertz, B. The endogenous exposome of the pregnant mother: Placental extracellular vesicles and their effect on the maternal system. Molecular Aspects of Medicine. 87 (October 2020), 100955 (2022).
- Huppertz, B. IFPA award in placentology lecture: biology of the placental syncytiotrophoblast - myths and facts. Placenta. 31 (SUPPL), S75-S81 (2010).
- Gauster, M., Moser, G., Wernitznig, S., Kupper, N., Huppertz, B. Early human trophoblast development: from morphology to function. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (6), 345 (2022).
- Lecarpentier, E., et al. Fluid shear stress promotes placental growth factor upregulation in human syncytiotrophoblast through the cAMP-pKA signaling pathway. Hypertension. 68 (6), 1438-1446 (2016).
- Lecarpentier, E., et al. Computational fluid dynamic simulations of maternal circulation: wall shear stress in the human placenta and its biological implications. PLOS ONE. 11 (1), e0147262 (2016).
- Miura, S., Sato, K., Kato-Negishi, M., Teshima, T., Takeuchi, S. Fluid shear triggers microvilli formation via mechanosensitive activation of TRPV6. Nature Communications. 6 (1), 8871 (2015).
- Jauniaux, E., et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. The American Journal of Pathology. 157 (6), 2111-2122 (2000).
- Sodha, R. J., Proegler, M., Schneider, H. Transfer and metabolism of norepinephrine studied from maternal-to-fetal and fetal-to-maternal sides in the in vitro perfused human placental lobe. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 148 (4), 474-481 (1984).
- Kupper, N. Extracellular vesicles from advanced placental explant flow culture and their role in preeclampsia [Dissertation]. , Medical University of Graz, Austria. (2022).
- Burton, G. J., Fowden, A. L. The placenta: a multifaceted, transient organ. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1663), 20140066 (2015).
- Arora, N., Sadovsky, Y., Dermody, T. S., Coyne, C. B. Microbial vertical transmission during human pregnancy. Cell Host & Microbe. 21 (5), 561-567 (2017).
- Cheong, M. L., et al. A Positive feedback loop between glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCGβ expression and cell differentiation. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 197-209 (2016).
- Heisenberg, C. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Lee, T. C., Moulvi, A., James, J. L., Clark, A. R. Multi-scale modelling of shear stress on the syncytiotrophoblast: could maternal blood flow impact placental function across gestation. Annals of Biomedical Engineering. 51 (6), 1256-1269 (2023).
- Kamkin, A., Kiseleva, I. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. 49 (0), Academia. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21290773 (2005).
- Kluge, M. A., Fetterman, J. L., Vita, J. A.
- Boren, J., Brindle, K. M. Apoptosis-induced mitochondrial dysfunction causes cytoplasmic lipid droplet formation. Cell Death & Differentiation. 19 (9), 1561-1570 (2012).
- Chernyavsky, I. L., Jensen, O. E., Leach, L. A Mathematical model of intervillous blood flow in the human placentone. Placenta. 31 (1), 44-52 (2010).
