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Developmental Biology

Ex Vivo Cultura do Fluxo de Explantes Placentários - Mimetizando as Condições Dinâmicas no Útero

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65919
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Division of Cell Biology, Histology and Embryology, Gottfried Schatz Research Center, Medical University of Graz

Summary

Aqui está um protocolo para cultivo de explantes placentários em condições de fluxo constante. Essa abordagem aprimora os sistemas tradicionais de cultura de vilosidades estáticas, permitindo a replicação de ambientes fisiológicos dinâmicos.

Abstract

Os modelos de cultura de explantes placentários ex vivo existentes são primariamente fundamentados em sistemas de cultura estática usando placas de poço. No entanto, esses modelos refletem inadequadamente a dinâmica no cenário utero, onde a placenta encontra um leve estresse de cisalhamento constante devido ao fluxo plasmático ou sanguíneo. Para resolver essa limitação, um sistema de cultura de fluxo foi desenvolvido para aproximar o cultivo ex vivo de explantes placentários das condições de fluxo intrauterino experimentadas no corpo materno. Dentro dessa abordagem, explantes placentários são cultivados em uma sequência de cinco câmaras de fluxo interconectadas. Essa configuração mantém as concentrações fisiológicas de oxigênio e uma taxa de fluxo consistente. Os dados coletados revelam que, sob condições de fluxo, a preservação da morfologia tecidual apresenta notável realce em comparação com os métodos estáticos convencionais. Esta técnica inovadora introduz um meio simples de cultura ex vivo de explantes placentários, oferecendo uma representação mais fiel do ambiente dinâmico in vivo. Além disso, este estudo introduz novas possibilidades para investigar a dinâmica funcional da interface feto-materna. Ao adotar metodologias dinâmicas factíveis, facilita-se uma compreensão mais profunda da biologia placentária, ressaltando sua relevância para a saúde materno-fetal.

Introduction

Desde a década de 1960, o cultivo de explantes placentários no fundo de uma placa de poço tem sido utilizado para o estudo da interface feto-materna 1,2,3. Esse método é bem estabelecido e simples, possibilitando a utilização de tecido humano para diversos estudos, além de culturas de célulasisoladas 2,3. Ao longo do tempo, os desenhos experimentais para culturas de explantes placentários foram modificados em relação à concentração de oxigênio4 e para evitar que o tecido se instalasse no fundo da placa dopoço 2,5,6. Entretanto, esse método não foi adaptado às condições in vivo dentro do útero, especificamente à presença de fluxo constante3.

O sucesso de uma gestação depende de uma perfusão adequada e consistente do espaço interviloso com o sangue materno, estabelecendo um circuito dinâmico com entrada e saída contínua de sangue e substâncias veiculadas pelo sangue 7,8,9,10,11,12. A placenta apresenta dois sistemas distintos de suprimento sanguíneo, um para o sangue materno e outro para o sangue fetal, resultando em dupla perfusão pelos sistemas fetal e materno13. O sangue materno começa a perfundir o espaço interviloso da placenta no final do primeiro trimestre, fluindo lentamente através das artérias espirais uterinas alargadas10,11,14. Consequentemente, as árvores vilosas placentárias são banhadas em sangue materno, fornecendo nutrientes e oxigênio ao feto. Esse sangue materno flui através do espaço interviloso antes de retornar à circulação materna através das veias útero-placentárias. Durante sua passagem pelo espaço interviloso, a difusão e a captação ativa de oxigênio e nutrientes no sangue fetal levam a menores níveis de oxigênio e nutrientes no sangue materno12,15. No entanto, o sangue do espaço interviloso é inteiramente substituído por sangue fresco, rico em oxigênio, cerca de duas a três vezes por minuto, garantindo um suprimento contínuo de nutrientes e gases13. Notadamente, o sinciciotrofoblasto, parte mais externa da barreira placentária, é o único componente da árvore vilosa placentária diretamente exposta ao sangue materno15,16,17. Consequentemente, o sinciciotrofoblasto experimenta um estresse de cisalhamento leve constante do sangue materno que flui 3,14.

O conhecimento científico atual sobre o ambiente de fluxo placentário e os avanços técnicos modernos permitem um cultivo adaptado e fisiologicamente aproximado de explantes placentários sob condições de fluxo. Além disso, evidências sugerem que as forças de cisalhamento influenciam as funções biológicas do sinciciotrofoblasto 18,19,20,21. Uma abordagem bem conhecida que responde pelo fluxo sanguíneo é o sistema de perfusão do lobo duplo placentário22. No entanto, esses experimentos requerem conhecimentos significativos, são limitados no tempo (conduzidos por apenas algumas horas) e são viáveis apenas com amostras placentárias do terceiro trimestre 3,23. Em contraste, desenvolvemos uma técnica simples e não intrusiva para cultura ex vivo de explantes vilosos placentários sob ajustes de fluxo constante, acomodando tecidos placentários do primeiro e terceirotrimestres 3. Nesta configuração, explantes placentários são cultivados em cinco câmaras de fluxo conectadas em série. Os explantes vilosos são fixados ao fundo da câmara usando elevações em forma de agulha em placas finas de metal. O circuito de fluxo construído é posteriormente transferido para um biorreator, onde tanto a concentração de oxigênio quanto a vazão são reguladas3. Os resultados da cultura em fluxo demonstram que a integridade tecidual é mais preservada quando comparada ao método estático tipicamente utilizado3. Além disso, essa abordagem dinâmica permite novos e adaptados desenhos experimentais para o cultivo de explantes teciduais, permitindo experimentos in vitro que mimetizam mais de perto o ambiente natural3.

Protocol

O comitê de ética da Universidade de Medicina de Graz aprovou este estudo (31-019 ex 18/19 versão 1.2 e 29-319 ex 16/17). Consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos envolvidos no estudo.

1. Preparação para o experimento de fluxo

NOTA: Os experimentos são conduzidos em um biorreator com bombas peristálticas integradas (ver Tabela de Materiais). A umidade, temperatura e nível de gás dentro do biorreator podem ser ajustados.

  1. Ligue o biorreator e faça todos os pré-arranjos (por exemplo, calibração das bombas, pré-aquecimento, condições de gás e umidade) para o experimento de acordo com o manual do biorreator. Antes de iniciar o experimento, as configurações necessárias (temperatura, teor de gás, umidade) devem ser estabilizadas por algumas horas ou durante a noite. Para isso, inicie o biorreator e o software e, em seguida, clique em Alterar SetPoints no item de menu "Incubadora".
  2. PBS pré-aquecido e o meio necessário (Meio de Crescimento de Células Endoteliais suplementado com suplementos fornecidos hEGF-5, HC-500, bem como 5% de soro fetal bovino esgotado em exossomo, 1% de penicilina/estreptomicina) (ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
    ​

2. Dissecção da amostra placentária

  1. Imediatamente após o parto, cortar três vezes 2cm3 amostras placentárias da região placentária média como descrito em Kupper et al.3 Resumidamente, manter as amostras em PBS. Descarte a placa coriônica, a decídua materna e áreas de infartos visíveis do espécime.
  2. Dissecar o espécime de tecido restante em explantes vilosos com um diâmetro transversal de cerca de 0,5 cm (peso úmido de cerca de 7,5 mg). Transfira-os para uma placa de Petri com PBS fresco.
  3. Lave os explantes em PBS, agitando-os suavemente no líquido com uma pinça para remover os resíduos sanguíneos.
    OBS: Dissecar as amostras em uma placa de Petri com PBS para pré-lavagem e evitar que sequem e utilizar ferramentas esterilizadas/autoclavadas para processamento do tecido.

3. Experimento de fluxo

  1. Sob uma coifa estéril, conecte cinco câmaras em série ao frasco reservatório usando as travas luer de acordo com o manual do usuário das câmaras de fluxo (consulte a Tabela de Materiais).
    OBS: Esterilizar e/ou autoclavar todos os materiais antes do uso, conforme respectivo manual. Use um filtro de ar no frasco reservatório para trocas gasosas estéreis. Para abrir e fechar as câmaras, aperte suavemente as alças das câmaras. Passo 3.1. também pode ser preparado mais cedo.
  2. Vire as câmaras de cabeça para baixo e abra-as removendo o fundo. Use pinças para transferir as placas de metal centralmente na parte superior das câmaras com os pinos apontados para cima.
  3. Encher as câmaras com 1 ml de meio pré-aquecido (37 °C). Em seguida, encha o reservatório com mais 20 mL. O circuito requer um total de 25 mL, incluindo o volume em cada câmara de fluxo, nos tubos e no frasco reservatório. Sob o fluxo, o volume final do meio em uma câmara cheia é de 2 mL.
  4. Use pinças e transfira um explante viloso após o outro entre as agulhas da placa de metal na câmara. Deixe as agulhas deslizarem entre as vilosidades placentárias para evitar a punção do tecido. Transfira quatro explantes para uma câmara. Feche as câmaras reajustando o fundo cuidadosamente. Um circuito completo contém um total de 20 explantes. As câmaras precisam permanecer de cabeça para baixo.
    OBS: Segure os explantes suavemente com a pinça; tente não apertá-los. Certifique-se de que as câmaras e o circuito estejam completamente vedados para evitar vazamentos. As câmaras são sempre usadas de cabeça para baixo. O número de explantes por câmara e o número de câmaras propriamente ditas são variáveis. O procedimento para o tecido do primeiro trimestre é semelhante ao do tecido do terceiro trimestre com uma pequena adição: para fixar as vilosidades, dobrar ligeiramente as agulhas sobre os explantes após o tecido ter sido transferido para a placa metálica (comunicação pessoal Brugger et al.). Isso fixa o tecido frágil na placa de metal e evita que as amostras escorreguem.
  5. Transfira o conjunto de fluxo para o biorreator.
  6. Conecte o circuito de fluxo à bomba peristáltica dentro do biorreator conectando a tubulação da bomba à bomba. Corrija-o no4º estágio (ouvi-se clicar quatro vezes).
  7. Se um controle estático for necessário, coloque também a placa do poço no biorreator.
    NOTA: Para a cultura estática, cinco poços de uma placa de seis poços são preenchidos com 4 mL de meio por poço e 4 explantes vilosos por poço. A placa de poço preenchido também é colocada no biorreator e cultivada na mesma atmosfera que os explantes de cultura em fluxo. Maiores detalhes estão descritos em Kupper et al.3
  8. Defina o modo de bomba como Manual no item de menu "Bombas". Em seguida, ajuste a velocidade da bomba para 1 mL/min e comece a bombear o meio para a tubulação clicando em Executar. Enquanto o circuito está sendo preenchido com médio, segure as câmaras em um ângulo para que elas sejam completamente preenchidas com meio.
    NOTA: Consulte a Tabela Suplementar 1 para os ajustes experimentais para fluxo viloso placentário e cultura estática. As especificações do fluxo e do sistema estático são fornecidas na Tabela Suplementar 2.
    CUIDADO: Incline cuidadosamente a câmara durante o enchimento para evitar que os espécimes escorregem das agulhas.
  9. Após o enchimento, as câmaras permanecem em sua posição invertida. Certifique-se de que as câmaras estejam firmes e verticais e feche ambas as tampas do biorreator.
    NOTA: O volume final do meio em uma câmara de fluxo preenchida é de 2 mL. Os ajustes experimentais e as especificações das câmaras de fluxo e placas de poço utilizadas nos experimentos estão descritos em Kupper et al.3
  10. Incubar o tecido pelo tempo desejado.
    NOTA: A temperatura, o nível de gás e a vazão podem ser monitorados no computador sem abrir a tampa do biorreator novamente.
  11. Pare a bomba após a incubação do tecido pelo tempo desejado clicando em Abortar no item de menu "Bombas". Abra as duas tampas do biorreator e, em seguida, uma câmara de fluxo de cada vez. Retire cuidadosamente os explantes da placa metálica usando pinças.
  12. Processar o tecido e o sobrenadante de acordo com a análise a jusante selecionada. Neste caso, foram realizadas coloração imunoistoquímica e microscopia eletrônica3. Consulte a Tabela Suplementar 3 para os detalhes dos anticorpos usados para imunohistoquímica e imunofluorescência.
    NOTA: Após a remoção do tecido, drene o meio do circuito por rotação anti-horária da bomba.
  13. Desmonte e limpe o circuito de fluxo de acordo com as instruções do fabricante para as câmaras de fluxo e tubulação.

Representative Results

Partes desta publicação e seus resultados já foram publicados (ver referências 3 e 23).

Arranjo experimental
Um arranjo experimental é ilustrado na Figura 1. Um ciclo de escoamento composto é composto por cinco câmaras de fluxo que são interligadas em série (Figura 1A). Dentro de cada câmara de fluxo são cultivados quatro explantes, cada um com diâmetro transversal de aproximadamente 0,5 cm (Figura 1 A,C). Para o experimento controle estático, os explantes são cultivados em poços individuais de placa de seis poços (Figura 1B). Para evitar que os explantes sejam liberados, eles são afixados em placas metálicas com saliências estreitas em forma de agulha (Figura 1 D,E). Para submeter os explantes a um fluxo direto do meio, as câmaras são invertidas, com as entradas e saídas posicionadas na seção principal (Figura 1 F,G). Dentro do biorreator, o ciclo de fluxo está ligado a uma bomba peristáltica. Com o objetivo de comparar a integridade tecidual entre o tecido cultivado em fluxo e o tecido convencionalmente estático, os explantes são colocados em uma placa de seis poços adjacente ao ciclo de fluxo. Isso garante a verificação de condições de cultura consistentes em termos de oxigênio, temperatura e umidade (Figura 1A)3.

Análise morfológica

β-actina
Vários procedimentos de coloração imuno-histoquímica foram realizados para examinar distinções histológicas na integridade tecidual associadas a diversas condições de cultivo (Figura 2). Explantes prontamente incluídos pós-dissecção serviram como referência basal. Para a análise do citoesqueleto da actina no interior dos explantes vilosos foi realizada a coloração β-actina (Figura 2A-E). A análise descritiva revelou uma apresentação visual bem estruturada e organizada do citoesqueleto no tecido recém-obtido (Figura 2A). Ao longo do tempo, à medida que o cultivo progredia, observava-se uma agregação de microfilamentos, significando uma degradação da estrutura do citoesqueleto. Esse fenômeno foi consistentemente observado em explantes vilosos submetidos a cultivo estático3 (Figura 2C,E, indicada por asteriscos).

Coloração H&E
A coloração H&E forneceu reforço adicional à observação de que a integridade tecidual diminui ao longo da cultura estática, uma tendência que é melhorada no contexto da cultura em fluxo (Figura 2F-J). O tecido fresco exibiu uma apresentação histológica estruturada e característica dos explantes vilosos, caracterizada por um estroma denso e firmemente compactado (Figura 2F). Além disso, o sinciciotrofoblasto estava firmemente aderido ao estroma subjacente (Figura 2F). Uma aparência comparável foi observada em explantes vilosos cultivados em ambiente de fluxo por 24 h (Figura 2G). Entretanto, após 48 h de cultivo sob o fluxo, observou-se que porções do sinciciotrofoblasto estavam parcialmente descoladas (Figura 2I, indicada por seta), acompanhadas de pequenas lacunas esporádicas no interior do estroma. O exame histológico do tecido indicou que a integridade do tecido após 24 h em uma condição de cultura estática estava inadequadamente preservada (Figura 2H). Além disso, essa integridade degradou-se acentuadamente após 48 h em cultura estática (Figura 2J). O estroma exibia aspecto poroso e esburacado, e importante descolamento do sinciciotrofoblasto do estroma era evidente em regiões maiores (Figura 2J, setas)3.

CD34II
A coloração CD34II foi empregada para visualizar as células endoteliais e, consequentemente, os vasos fetoplacentários dentro dos explantes vilosos (Figura 2K-O). O tecido que foi diretamente incluído logo após a dissecção apresentou um arranjo distintivamente organizado das células endoteliais (Figura 2K). A integridade morfológica dos vasos fetoplacentários permaneceu bem mantida após 24 h de cultura de fluxo e frequentemente mesmo após 48 h, embora casos ocasionais de colapso de vasos sanguíneos tenham sido observados em condições de fluxo (Figura 2 L,N). No entanto, após 24 h de cultura estática, os vasos sanguíneos exibiram colapso parcial, evidenciado por sua aparência visual alterada (Figura 2M, indicada pelas pontas das setas). Essa deterioração dos vasos sanguíneos dentro do ambiente de cultura estática pareceu exacerbar-se com o tempo de cultivo prolongado. Em resumo, a avaliação morfológica descritiva dos explantes vilosos subsequentes à cultura de fluxo e estática indicou que a integridade tecidual parece ser preservada mais efetivamente dentro do sistema de fluxo quando contrastada com o modo de cultura estático3.

Análise ultraestrutural do tecido cultivado

Microscopia eletrônica de transmissão
Para um exame mais detalhado da morfologia dos explantes vilosos, análises ultraestruturais adicionais foram realizadas usando microscopia eletrônica de transmissão (MET) (Figura 3A-E). Esses achados corroboraram os resultados das investigações histológicas. No tecido que foi diretamente incluído imediatamente após o preparo, a morfologia foi excepcionalmente bem preservada (Figura 3A). As microvilosidades eram claramente discerníveis na superfície do sinciciotrofoblasto. O sinciciotrofoblasto apresentou sua distinta camada contínua sem limites celulares laterais, estabelecendo contato direto com a membrana basal. O estroma do tecido fresco exibiu tamponamento denso, sem perfurações ou rupturas significativas. Além disso, o aspecto ultra-estrutural dos vasos sanguíneos e os eritrócitos intravasculares individualizados também demonstraram excelente preservação (Figura 3A).

Mesmo após 24 h de cultura em fluxo, a morfologia geral das amostras de tecido permaneceu relativamente bem mantida (Figura 3D). Enquanto havia um pouco menos de microvilosidades na superfície do sinciciotrofoblasto em comparação com o tecido fresco, o sinciciotrofoblasto permaneceu primariamente aderido à membrana basal. Núcleos e ocasionais pequenos vacúolos foram observados dentro da porção interna do sinciciotrofoblasto. O estroma dentro das vilosidades placentárias parecia bem preservado e muito parecido com tecido fresco (Figura 3D). Mesmo após 48 h de cultura em fluxo, as células estromais exibiram preservação relativamente boa, embora com algumas perfurações presentes (Figura 3E). Curiosamente, gotículas lipídicas foram detectadas no interior do tecido. Enquanto o sinciciotrofoblasto exibia vacúolos e redução no número de microvilosidades, ele permanecia aderido à membrana basal em várias regiões, e os núcleos sincicial e celular eram claramente visíveis (Figura 3E).

Em contraste com o tecido da cultura em fluxo, a morfologia do tecido viloso submetido à cultura estática exibiu deterioração tão cedo quanto 24 h (Figura 3B). O sinciciotrofoblasto dissociava-se da membrana basal em múltiplos locais e apresentava perfurações relativamente substanciais. Além disso, gotículas lipídicas foram frequentemente evidentes tanto no sinciciotrofoblasto quanto no estroma (Figura 3B). Após 48 h de cultura estática, um declínio progressivo da ultraestrutura foi aparente (Figura 3C). O sinciciotrofoblasto apresentou numerosas perfurações e descolamento da membrana basal em grande extensão. A identificação das células do estroma, bem como das células endoteliais que compõem os vasos sanguíneos, tornou-se um desafio. Além disso, houve um notável acúmulo de gotículas lipídicas no interior dos explantes vilosos após 48 h de cultura estática (Figura 3C). Em resumo, a ultraestrutura do tecido em cultura estática exibiu deterioração sucessiva ao longo do período de cultivo, tendência que foi atenuada pelo cultivo em condições de fluxo3.

Microscopia eletrônica de varredura
Utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV), um exame detalhado da superfície dos explantes vilosos foi facilitado (Figura 4A-J). O tecido recém-incluído exibiu uma matriz densamente povoada de microvilosidades em toda a sua superfície (Figura 4 A,B). Algumas regiões exibiram estruturas vesiformes. Em contraste, o tecido da cultura estática manifestou uma redução substancial das microvilosidades após 24 h (Figura 4C,D), uma redução que persistiu após 48 h (Figura 4E,F). Enquanto algumas áreas apresentavam agregação de estruturas vesiformes que não haviam sido liberadas, outras regiões pareciam nuas e erodidas (Figura 4D,F). Nos tecidos submetidos à cultura em fluxo, as microvilosidades ainda estavam presentes na superfície após 24 h (Figura 4G,H), bem como após 48 h (Figura 4I,J), embora em menor extensão do que no tecido fresco. Em comparação com a cultura estática, a prevalência de estruturas vesiculares na superfície foi reduzida. Curiosamente, essas estruturas vesículas estavam notavelmente concentradas em recessos específicos, onde o fluxo poderia estar reduzido ou ausente (Figura 4H,J), sugerindo que elas poderiam ter sido deslocadas da superfície do tecido exposto ao fluxo devido ao fluxo do meio3.

Figure 1
Figura 1: Configuração do sistema de vazão. (A) O sistema de vazão montado, composto pelo reservatório e cinco câmaras de fluxo, é conectado a uma das bombas peristálticas. No lado direito há uma placa de seis poços na qual os explantes são cultivados estaticamente. (B,C) Para ambos os métodos de cultivo, as amostras placentárias são dissecadas em explantes vilosos de aproximadamente 0,5cm2, dos quais quatro explantes são usados por poço ou câmara. Em uma abordagem experimental, cinco câmaras ou poços são usados. (D,E) Para cultura de fluxo, uma placa de metal com elevações estreitas em forma de agulha é usada para fixar os explantes. (F,G) As aberturas dos tubos estão localizadas na cabeça das câmaras e, portanto, são usadas de cabeça para baixo para garantir que o tecido seja exposto ao fluxo direto. Esse dado é reproduzido de Kupper et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise morfológica dos explantes vilosos placentários em fluxo e cultura estática. (A-E) Coloração por imunofluorescência para β-actina para visualização do citoesqueleto de explantes em cultura. Para a análise, foram utilizados seis pontos por lâmina, selecionados aleatoriamente. Imagens representativas são mostradas. (A) Visualização do citoesqueleto do tecido embutido diretamente após o preparo. Barra de escala: 20 μm. (B-E) Representação representativa da degeneração dependente do tempo e do citoesqueleto da actina em explantes cultivados de fluxo e cultura estática. (C-E) Os asteriscos significam aumento do acúmulo de microfilamentos de actina, o que é uma indicação de degradação do citoesqueleto da actina. (F-J) Coloração hematoxilina-eosina de explantes vilosos. Barra de escala: 100 μm. (F,G) Explantes de tecido recém-embutido (F) e cultura em fluxo por 24 h (G) mostram uma morfologia bem preservada de um explante viloso. (I) Explantes cultivados em fluxo por 48 h mostram áreas intermitentemente destacadas do sinciciotrofoblasto (seta). (H,J) Deterioração tempo-dependente da integridade estrutural após cultura estática de explantes, indicada pelo deslocamento do sinciciotrofoblasto (seta) e estroma perfurado. (K-O) CD34 II foi usado para corar as células endoteliais vilosas. Barra de escala: 100 μm. (K,L) Tecido fresco (K) e explantes cultivados por 24 h em condições de fluxo (L) exibem um padrão característico de células endoteliais estruturalmente alinhadas. (N) Após 48 h em cultura de fluxo, a integridade vascular diminui até certo ponto. (M,O) Na cultura estática, vasos sanguíneos colapsados já são visíveis após 24 h (M), o que foi observado aumentar com o maior tempo de cultivo estático (O). Esse dado é reproduzido de Kupper et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Exame ultraestrutural pré e pós-cultivo de explantes vilosos utilizando microscopia eletrônica de transmissão. Tecido de três experimentos independentes foi utilizado para analisar as imagens. (A) Uma imagem representativa de tecido recém-incorporado mostra uma grande quantidade de microvilosidades (MV) na superfície do sinciciotrofoblasto (ST). Capilares estruturalmente intactos (Ca) são visíveis no estroma (S) bem preservado. (B) No tecido cultivado estaticamente por 24 h, há deterioração da integridade estrutural do sinciciotrofoblasto, que parece estar desconectado da membrana basal em algumas áreas. Há também um acúmulo perceptível de gotículas lipídicas (DL). (C) Após 48 h em cultura estática, observa-se grave deterioração ultra-estrutural. Tanto o estroma quanto o sinciciotrofoblasto são perfurados e um acúmulo maciço de gotículas lipídicas é evidente. Os vasos sanguíneos mal puderam ser rastreados. (D,E) A ultraestrutura do tecido da cultura em fluxo foi relativamente bem preservada após 24 h (D) e após 48 h (E). Barra de escala: 2 μm. MV: Microvilosidades, ST: Sinciciotrofoblasto, S: Estroma, Ca: Capilar, LD: Gotículas lipídicas. Esse dado é reproduzido de Kupper et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Exame ultraestrutural pré e pós-cultivo de explantes vilosos por microscopia eletrônica de varredura. (A,C,E,G,I) Imagens gerais da superfície das árvores vilosas placentárias com respectivas imagens detalhadas (B,D,F,H,J). (A,B) O tecido recém-incorporado exibe uma densa costura de microvilosidades. (B) Estruturas vesiculares podem ser notadas em alguns locais. (C-F) Após 24 h e 48 h em cultura estática, é visível uma diminuição das microvilosidades na superfície do sinciciotrofoblasto. Impressionante é o extenso acúmulo de partículas vesiculares na superfície do explante. (F) As partículas parecem murchar após 48 h em cultura estática. (G-J) A superfície do tecido da cultura em fluxo parece estar mais preservada após 24 h (G,H) e após 48 h (I,J) em comparação com a cultura estática. As microvilosidades são visíveis na superfície (H,J), embora não na mesma densidade elevada que no tecido fresco. (B) Partículas vesiculares podem ser vistas espalhadas nos nichos com fluxo reduzido. Esse dado é reproduzido de Kupper et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela suplementar 1: Configurações experimentais para fluxo viloso placentário e cultura estática. Clique aqui para baixar este arquivo.

Quadro Suplementar 2: Especificações do sistema de escoamento e estático. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Anticorpos para imunoistoquímica e imunofluorescência utilizados neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Este estudo introduz uma perspectiva única sobre uma técnica de cultura em fluxo para explantes placentários projetada para replicar a dinâmica no ambiente uterino 3,23. Os achados revelam que a morfologia dos tecidos cultivados em condições de fluxo está mais preservada em comparação com o método tradicional de cultivo estático3. Notadamente, embora as condições de cultura estática ou de fluxo não facilitem a perfusão dos vasos placentários, a destruição dos vasos sanguíneos fetoplacentários dentro do estroma viloso foi predominantemente observada na cultura estática, enquanto a integridade dos vasos sanguíneos pareceu ser mais bem mantida por um período mais longo na cultura de fluxo3.

Uma possível explicação para essa observação poderia estar ligada ao crucial papel protetor e endócrino do sinciciotrofoblasto, função bem documentada na literatura 12,24,25,26. Diante disso, é concebível que a integridade geral da camada externa das vilosidades contribua significativamente para a manutenção do estroma subjacente, incluindo os vasos sanguíneos. Consequentemente, a integridade celular sustentada dos vasos sanguíneos sob condições de fluxo pode ser atribuída ao fluxo contínuo do meio. Esse movimento auxilia no movimento passivo dos explantes, facilitando a troca de gases, nutrientes e nanopartículas (como vesículas extracelulares) através da barreira placentária. Isso, por sua vez, poderia impactar positivamente na preservação da morfologia dos vasos sanguíneos. Além disso, o fenômeno da mecanosensação desempenha um papel na morfogênese tecidual em vários tecidos27,28. Estudos têm demonstrado que a mecanossensibilidade influencia os processos celulares em múltiplos níveis, desencadeando uma série de respostas bioquímicas que, em última instância, influenciam a funcionalidade de tecidos e órgãos29. Notadamente, as proteínas mecanossensíveis são expressas pelo sinciciotrofoblasto ao longo da gestação28. Além disso, o estudo sugere que microvilosidades na superfície tecidual podem estar implicadas nesse contexto28.

Uma perspectiva adicional que vale a pena considerar é o papel potencial das mitocôndrias na resposta celular ao fluxo. Por exemplo, em células endoteliais, as mitocôndrias servem como transdutores de sinal para respostas celulares a estímulos ambientais30. O aumento do acúmulo de gotículas lipídicas, observado em cultura estática de tecidos através da TEM3, tem sido associado à indução de apoptose por disfunção mitocondrial31. Investigações adicionais são necessárias para desvendar os mecanismos subjacentes e os fatores-chave, ligando-os às vias de sinalização a jusante. Essa exploração poderia melhorar nossa compreensão de como o tecido percebe e reage ao estresse de cisalhamento, traduzindo-se em melhor viabilidade e integridade dos explantes vilosos em cultura23.

Várias etapas críticas do protocolo devem ser reiteradas e executadas com cuidado. Após o parto placentário, o tecido deve ser cultivado o mais rápido possível. Durante o preparo do explante, evitar áreas com infartos visíveis é crucial. Manusear suavemente os explantes com pinça para evitar o aperto é importante. Recomenda-se manter o tecido coberto com líquido durante todo o procedimento e conduzi-lo rapidamente.

É importante reconhecer que este estudo não é capaz de especificar a tensão de cisalhamento exata dentro do sistema de fluxo apresentado, o que deve ser considerado como uma limitação em futuras investigações 3,23. No entanto, é importante reconhecer que a velocidade precisa do fluxo e a tensão de cisalhamento para uma vilosidade placentária específica in vivo são influenciadas por inúmeros parâmetros, tais como as características geométricas do espaço interviloso, a localização das vilosidades dentro desse espaço e sua proximidade e ângulo com as artérias espirais maternas e veias uterinas 3,19,23,32 . A complexidade da estrutura geométrica da placenta, que varia entre os indivíduos, também deve ser levada em consideração23,32. Já existem modelos matemáticos estimando o fluxo sanguíneo no espaço interviloso32 e cálculos da tensão de cisalhamento da parede no sinciciotrofoblasto 19,28. Curiosamente, um estudo previu que a tensão de cisalhamento no sinciciotrofoblasto é menor no terceiro trimestre em comparação com o primeiro trimestre28, enquanto outro demonstrou tensão de cisalhamento da parede espacialmente heterogênea no sinciciotrofoblasto19. A determinação precisa da velocidade de fluxo e da tensão de cisalhamento para uma vilosidade placentária específica permanece um desafio 3,19,23,32. Tais cálculos oferecem uma aproximação da faixa de tensão de cisalhamento para futuras investigações, mas podem exigir ajustes anatômicos contínuos e otimização23. Além disso, estudos futuros poderão desenvolver novas e refinadas técnicas de cultura em fluxo que levem em conta a intrincada geometria do espaço interviloso e estratégias para aumentar o número de espécimes porexperimento3. Espera-se o progresso contínuo e o desenvolvimento do sistema de fluxo, potencialmente empregando câmaras de fluxo alternativas (Brugger et al., dados não publicados, 2023).

Em conclusão, este estudo estabelece uma base robusta ao demonstrar uma técnica de cultura de fluxo ex vivo facilmente implementável que mantém a integridade estrutural de explantes vilosos cultivados. Isso ressalta a importância das técnicas dinâmicas nos estudos da biologia funcional placentária, abrindo caminho para novos avanços nos sistemas de cultura de fluxo e a geração de novas ideias e hipóteses 3,23.

Disclosures

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores agradecem o excelente suporte técnico de Bettina Amtmann e Petra Winkler para amostragem de tecidos. Esta pesquisa foi financiada pelo Austrian Science Fund FWF (DOC 31-B26) e pela Medical University of Graz, Áustria, através do Programa de Doutorado Doenças Inflamatórias na Gravidez (DP-iDP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plates NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 140675
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA A21422 Diluted in PBS, 1:200
antibody diluent Dako, Santa Clara, CA, USA S3022
anti-β-actin (AC-15) Abcam, Cambridge, UK ab6276 Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000
Bioreactor TEB500 TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117
CD34 Class II (QBEnd-10) Dako, Santa Clara, CA, USA M7165 Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500
CPD 030 critically point dryer Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) Critically point dryer
DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA D21490 Diluted in PBS, 1:1000
Ebers TEB505 Series Software TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain  Series Software 1.4
Endothelial Cell Growth Medium MV PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;  C-22120 Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used
Excelsior AS Tissue Processor  ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Exosome-depleted fetal bovine serum Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA A2720803
Histolab Clear Histolab, Askim, Sweden 14250-TY
Hydrogen Peroxide Block ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TA125H202Q
Kaiser’s Glycerin Gelatine Merck, Darmstadt, Germany 1092420100
Leica DM 6000 B microscope Leica, Wetzlar, Germany Equipped with an Olympus DP 72 Camera
Leica UC7 ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna, Austria)
Metal plate with needles In-house construction
Microtome  Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Microwave oven Miele, Guetersloh, Germany
Olympus microscope  (BX63) Olympus, Hamburg, Germany Serial Number: 1A52421
PBS ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Penicillin/Streptomycin  Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 2585627
Primary antibody enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TL-125-PB
ProLong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA P36934
Pumping tube Tygon, Bartelt, Graz, Austria 6.078 175  1.02 mm diameter 
QV500 Flow chambers Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK QV500  Other chambers would work as well
SCD 500, sputter coater Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein Sputter coater
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit Abcam, Cambridge, UK ab64252
Superfrost Plus slides  Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
Syringe Filter Corning Incorporated, NY, USA 431219 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle 
TAAB epoxy resin Agar Scientific, Stansted, Essex, UK T001
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer  ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TL-125-HL
UltraVision Protein Block ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA TA125BPQ
Zeiss EM 900 transmission electron microscope Zeiss, Oberkochen, Germany
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope Zeiss, Cambridge, UK Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage

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References

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Cultura de Fluxo de Explante Placentário Ex Vivo Condições Dinâmicas In Utero Sistemas de Cultura Estática Placas de Poço Tensão de Cisalhamento Fluxo Plasmático Fluxo Sanguíneo Sistema de Cultura de Fluxo Concentrações Fisiológicas de Oxigênio Taxa de Fluxo Morfologia Tecidual Métodos Estáticos Técnica Inovadora Cultura de Explantes Placentários Ex Vivo Ambiente In Vivo Dinâmica Funcional Interface Feto-materna Biologia Placentária Saúde Materno-fetal
<em>Ex Vivo</em> Cultura do Fluxo de Explantes Placentários - Mimetizando as Condições Dinâmicas <em>no Útero</em>
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Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M.,… More

Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero. J. Vis. Exp. (199), e65919, doi:10.3791/65919 (2023).

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