Summary
Här är ett protokoll för odling av placenta-explantat under konstanta flödesförhållanden. Detta tillvägagångssätt förbättrar traditionella statiska villösa odlingssystem genom att möjliggöra replikering av dynamiska fysiologiska miljöer.
Abstract
De befintliga ex vivo-explanteringsodlingsmodellerna för placenta är i första hand baserade på statiska odlingssystem med hjälp av brunnsplattor. Dessa modeller återspeglar dock inte dynamiken i livmodern , där moderkakan utsätts för konstant lätt skjuvspänning på grund av plasma- eller blodflöde. För att ta itu med denna begränsning har ett flödesodlingssystem utformats för att föra ex vivo placenta-explantodling närmare de flödesförhållanden som upplevs i livmodern i moderns kropp. Inom detta tillvägagångssätt odlas placentaplantor i en sekvens av fem sammankopplade flödeskammare. Denna inställning upprätthåller fysiologiska syrekoncentrationer och en jämn flödeshastighet. Insamlade data visar att under flödesförhållanden uppvisar bevarandet av vävnadsmorfologi en anmärkningsvärd förbättring jämfört med konventionella statiska metoder. Denna innovativa teknik introducerar ett enkelt sätt att ex vivo placenta explantkultur, vilket ger en mer trogen representation av den dynamiska in vivo-miljön . Dessutom introducerar denna studie nya möjligheter att undersöka den funktionella dynamiken i gränssnittet mellan foster och mamma. Genom att anamma genomförbara dynamiska metoder underlättas en djupare förståelse av placentabiologi, vilket understryker dess relevans för moderns och fostrets hälsa.
Introduction
Sedan 1960-talet har odling av placentaplantor på botten av en brunnsplatta använts för att studera gränssnittet mellan foster och moder 1,2,3. Denna metod är väletablerad och okomplicerad, vilket gör det möjligt att använda mänsklig vävnad för olika studier, förutom odlingar av enskilda celler 2,3. Med tiden har försöksdesignen för placentaexplantkulturer modifierats med avseende på syrekoncentration4 och för att förhindra att vävnaden sätter sig vid brunnsplattans botten 2,5,6. Denna metod har dock inte anpassats till in vivo-förhållandena i livmodern, särskilt närvaron av ett konstant flöde3.
Framgången för en graviditet beror på en adekvat och konsekvent perfusion av det intervillösa utrymmet med moderns blod, vilket etablerar en dynamisk krets med kontinuerligt inflöde och utflöde av blod och blodburna ämnen 7,8,9,10,11,12. Moderkakan har två distinkta blodtillförselsystem, ett för moderns blod och ett för fostrets blod, vilket resulterar i dubbel perfusion av både fostrets och moderns system13. Moderns blod börjar perfusionera moderkakans intervillösa utrymme i slutet av den första trimestern och strömmar långsamt genom vidgade spiralartärer i livmodern10,11,14. Följaktligen badar moderkakans villösa träd i moderns blod och levererar näringsämnen och syre till fostret. Detta moderns blod strömmar genom det intervillösa utrymmet innan det återvänder till moderns cirkulation via livmoderkakans vener. Under dess passage genom det intervillösa utrymmet leder diffusion och aktivt upptag av syre och näringsämnen i fostrets blod till lägre syre- och näringsnivåer i moderns blod12,15. Blodet i det intervillösa utrymmet ersätts dock helt av färskt, syrerikt blod ungefär två till tre gånger per minut, vilket säkerställer en kontinuerlig tillförsel av näringsämnen ochgaser. Noterbart är att syncytiotrofoblasten, den yttersta delen av placentabarriären, är den enda komponenten i placentaträdet som är direkt exponerat för moderns blod15,16,17. Följaktligen upplever syncytiotrofoblasten en konstant mild skjuvspänning från det strömmande maternella blodet 3,14.
Aktuell vetenskaplig kunskap om placentaflödesmiljön och moderna tekniska framsteg möjliggör nu en anpassad och fysiologiskt approximerad odling av placentaplantor under flödesförhållanden. Dessutom tyder bevis på att skjuvkrafter påverkar de biologiska funktionerna hos syncytiotrofoblasten 18,19,20,21. En välkänd metod som står för blodflödet är placenta-perfusionssystemet med dubbla lober22. Dessa experiment kräver dock betydande expertis, är tidsbegränsade (utförs endast i några timmar) och är endast genomförbara med moderkaksproverfrån tredje trimestern 3,23. Däremot har vi utvecklat en enkel och icke-påträngande teknik för ex vivo placenta villös explantkultur under konstanta flödesinställningar, som rymmer både första och tredje trimestern placentavävnader3. I denna uppställning odlas placentaplantor i fem seriekopplade flödeskammare. Villösa explantor fästs i kammarens botten med hjälp av nålformade upphöjningar på tunna metallplattor. Den konstruerade flödeskretsen överförs sedan till en bioreaktor, där både syrekoncentration och flödeshastighet regleras3. Flödesodlingsresultaten visar att vävnadsintegriteten bevaras bättre jämfört med den vanligtvis använda statiska metoden3. Dessutom möjliggör detta dynamiska tillvägagångssätt nya och anpassade experimentella designer för vävnadsexplantodling, vilket möjliggör in vitro-experiment som närmare efterliknar den naturliga miljön3.
Protocol
Den etiska kommittén vid det medicinska universitetet i Graz godkände denna studie (31-019 ex 18/19 version 1.2 och 29-319 ex 16/17). Informerat samtycke inhämtades från alla försökspersoner som deltog i studien.
1. Förberedelse för flödesexperimentet
OBS: Experimenten utförs i en bioreaktor med integrerade peristaltiska pumpar (se materialtabell). Luftfuktigheten, temperaturen och gasnivån inuti bioreaktorn kan justeras.
- Slå på bioreaktorn och gör alla förberedelser (t.ex. kalibrering av pumparna, förvärmning, gasförhållanden och luftfuktighet) för experimentet enligt manualen för bioreaktorn. Innan experimentet påbörjas bör de nödvändiga inställningarna (temperatur, gasinnehåll, luftfuktighet) stabiliseras i några timmar eller över natten. För att göra detta, starta bioreaktorn och programvaran och klicka sedan på Ändra börvärden under menyalternativet "Inkubator".
- Förvärm PBS och erforderligt medium (endotelcellstillväxtmedium kompletterat med medföljande tillskott hEGF-5, HC-500 samt 5 % exosomutarmat fosterbovint serum, 1 % penicillin/streptomycin) (se materialförteckning) till 37 °C.
2. Dissektion av moderkaksprov
- Omedelbart efter förlossningen, skär tre gånger 2 cm 3 placentaprover från mitten av moderkakan enligt beskrivningen i Kupper etal.3 Kortfattat, förvara proverna i PBS. Kassera korionplattan, modersdecidua och områden med synliga infarkter från provet.
- Dissekera det återstående vävnadsprovet i villösa explantat med en tvärsnittsdiameter på ca 0,5 cm (våtvikt ca 7,5 mg). Överför dem till en petriskål med färsk PBS.
- Tvätta explantorna i PBS genom att försiktigt skaka dem i vätskan med en pincett för att ta bort blodrester.
OBS: Dissekera proverna i en petriskål med PBS för att förtvätta och förhindra att de torkar ut och använd steriliserade/autoklaverade verktyg för bearbetning av vävnaden.
3. Flödesexperiment
- Under en steril huv, anslut fem kammare i serie till reservoarflaskan med hjälp av luerlåsen enligt bruksanvisningen för flödeskamrarna (se materialtabell).
OBS: Sterilisera och/eller autoklavera allt material före användning, enligt respektive manual. Använd ett luftfilter på reservoarflaskan för sterilt gasutbyte. För att öppna och stänga kamrarna, kläm försiktigt in klackarna på kamrarna. Steg 3.1. kan också beredas tidigare. - Vänd kamrarna upp och ner och öppna dem genom att ta bort botten. Använd en pincett för att överföra metallplattorna centralt i den övre delen av kamrarna med stiften pekande uppåt.
- Fyll kamrarna med 1 ml förvärmt medium (37 °C). Fyll sedan behållaren med ytterligare 20 ml. Kretsen kräver totalt 25 ml, inklusive volymen i varje flödeskammare, i rören och reservoarflaskan. Under flödet är den slutliga volymen av mediet i en fylld kammare 2 ml.
- Använd en pincett och överför den ena villösa explanten efter den andra mellan nålarna på metallplattan i kammaren. Låt nålarna glida mellan moderkakans villi för att undvika punktering av vävnaden. Överför fyra explantor till en kammare. Stäng kamrarna genom att försiktigt sätta tillbaka botten. En komplett krets innehåller totalt 20 explantor. Kamrarna måste förbli i ett upp och nedvänt läge.
OBS: Ta försiktigt tag i explantorna med pincetten; Försök att inte klämma på dem. Se till att kamrarna och kretsen är helt förseglade för att förhindra läckage. Kamrarna används alltid upp och ner. Antalet explantat per kammare och antalet kammare varierar. Proceduren för vävnad i första trimestern liknar den för vävnad i tredje trimestern med ett litet tillägg: för att fixera villi, böj nålarna något över explantaten efter att vävnaden har överförts till metallplattan (personlig kommunikation Brugger et al.). Detta fixerar den ömtåliga vävnaden på metallplattan och förhindrar att proverna glider av. - Överför flödesenheten till bioreaktorn.
- Anslut flödeskretsen till den peristaltiska pumpen i bioreaktorn genom att ansluta pumpslangen till pumpen. Fixa det på 4:e steget (man kommer att höra det klicka fyra gånger).
- Om en statisk kontroll krävs, placera även brunnsplattan i bioreaktorn.
OBS: För statisk odling fylls fem brunnar med en platta med sex brunnar med 4 ml medium per brunn och 4 villösa explantor per brunn. Den fyllda brunnsplattan placeras också i bioreaktorn och odlas i samma atmosfär som flödeskulturen explanterar. Ytterligare detaljer beskrivs i Kupper et al.3 - Ställ in pumpläget på Manuell under menypunkten "Pumpar". Ställ sedan in pumphastigheten på 1 ml/min och börja pumpa in mediet i slangen genom att klicka på Kör. Medan kretsen fylls med medium, håll kamrarna i en vinkel så att de är helt fyllda med medium.
OBS: Se tilläggstabell 1 för försöksmiljöerna för placentaflöde och statisk odling. Specifikationer för flödessystemet och det statiska systemet finns i tilläggstabell 2.
VARNING: Luta försiktigt kammaren under fyllningen för att förhindra att proverna glider av nålarna. - När påfyllningen är klar förblir kamrarna i sitt upp och nedvända läge. Se till att kamrarna står säkert och upprätt och stäng båda locken på bioreaktorn.
OBS: Den slutliga volymen av mediet i en fylld flödeskammare är 2 ml. Experimentinställningarna och specifikationerna för de flödeskammare och brunnsplattor som används i experimenten beskrivs i Kupper et al.3 - Inkubera vävnaden under önskad tid.
OBS: Temperatur, gasnivå och flödeshastighet kan övervakas på datorn utan att öppna locket på bioreaktorn igen. - Stoppa pumpen efter inkubation av vävnaden under önskad tid genom att klicka på Avbryt under menypunkten "Pumpar". Öppna de två locken på bioreaktorn och sedan en flödeskammare i taget. Ta försiktigt bort explanterna från metallplattan med en pincett.
- Bearbeta vävnaden och supernatanten enligt den valda nedströmsanalysen. I detta fall utfördes immunhistokemisk färgning och elektronmikroskopi3. Se tilläggstabell 3 för närmare uppgifter om de antikroppar som används för immunhistokemi och immunofluorescens.
OBS: Efter att ha tagit bort vävnaden, töm mediet från kretsen genom att rotera pumpen moturs. - Demontera och rengör flödeskretsen enligt tillverkarens instruktioner för flödeskamrarna och slangarna.
Representative Results
Delar av denna publikation och dess resultat har redan publicerats (se referenserna 3 och 23).
Experimentell uppställning
En experimentell uppställning illustreras i figur 1. En sammansatt flödescykel består av fem flödeskammare som är seriekopplade (figur 1A). I varje flödeskammare odlas fyra explantor, var och en med en tvärsnittsdiameter på cirka 0,5 cm (figur 1 A,C). För det statiska bekämpningsförsöket odlas explantorna i enskilda brunnar på en platta med sex brunnar (figur 1B). För att förhindra att explantorna spolas ut fästs de på metallplattor med smala nålformade utsprång (figur 1 D, E). För att expoterna ska utsättas för ett direkt flöde av mediet vänds kamrarna upp och ned, med inloppen och utloppen placerade vid huvudsektionen (figur 1 F,G). I bioreaktorn är flödescykeln kopplad till en peristaltisk pump. För att jämföra vävnadsintegriteten mellan flödesodlad vävnad och konventionellt statiskt odlad vävnad placeras explantat i en platta med sex brunnar intill flödescykeln. Detta säkerställer verifiering av konsekventa odlingsförhållanden med avseende på syre, temperatur och luftfuktighet (Figur 1A)3.
Morfologisk analys
β-aktin
Olika immunhistokemiska färgningsprocedurer utfördes för att undersöka histologiska skillnader i vävnadsintegritet i samband med olika odlingsförhållanden (Figur 2). Explantat som omedelbart bäddades in efter dissektion fungerade som referens för baslinjen. För analys av aktincytoskelettet i villösa explantat utfördes β-aktinfärgning (Figur 2A-E). Deskriptiv analys avslöjade en välstrukturerad och organiserad visuell presentation av cytoskelettet i nyerhållen vävnad (Figur 2A). Med tiden, när odlingen fortskred, fanns det en observerbar aggregering av mikrofilament, vilket innebar en nedbrytning av cytoskelettstrukturen. Detta fenomen observerades konsekvent i villösa explantor som genomgick statisk odling3 (Figur 2C,E, indikerad med asterisker).
H&E-färgning
H&E-färgning gav ytterligare förstärkning till observationen att vävnadsintegriteten minskar under loppet av statisk odling, en trend som förbättras i samband med flödesodling (Figur 2F-J). Färsk vävnad uppvisade en strukturerad och karakteristisk histologisk presentation av de villösa explantaten, kännetecknad av ett tätt och tätt packat stroma (Figur 2F). Dessutom var syncytiotrofoblasten fast förankrad i det underliggande stromat (Figur 2F). Ett jämförbart utseende noterades hos villösa explantor odlade i en flödesmiljö under 24 timmar (Figur 2G). Efter 48 timmars odling under flödet observerades dock att delar av syncytiotrofoblasten var delvis lossnade (Figur 2I, markerad med pil), åtföljda av sporadiska små luckor i stromat. Histologisk undersökning av vävnaden indikerade att vävnadens integritet efter 24 timmar i ett statiskt odlingstillstånd var otillräckligt bevarad (Figur 2H). Dessutom försämrades denna integritet ytterligare markant efter 48 timmar i statisk odling (Figur 2J). Stromat uppvisade ett poröst och gropigt utseende, och en betydande avlossning av syncytiotrofoblasten från stromat var tydlig i större områden (Figur 2J, pilar)3.
CD34II
CD34II-färgning användes för att visualisera endotelceller och följaktligen blodkärlen mellan foster och placenta i de villösa explantaten (Figur 2K-O). Vävnad som bäddades in direkt efter dissektion uppvisade ett distinkt organiserat arrangemang av endotelcellerna (Figur 2K). Den morfologiska integriteten hos blodkärlen hos fostret och placenta förblev väl bibehållen efter 24 timmars flödesodling och ofta även efter 48 timmar, även om enstaka fall av kollapsade blodkärl noterades under flödesförhållanden (Figur 2 L,N). Efter 24 timmars statisk odling uppvisade dock blodkärlen partiell kollaps, vilket framgår av deras störda visuella utseende (Figur 2M, indikerad av pilspetsar). Denna försämring av blodkärlen i den statiska odlingsmiljön tycktes förvärras med förlängd odlingstid. Sammanfattningsvis indikerade den deskriptiva morfologiska bedömningen av de villösa explantaten efter både flödes- och statisk odling att vävnadsintegriteten verkar bevaras mer effektivt i flödessystemet i motsats till det statiska odlingssättet3.
Ultrastrukturell analys av den odlade vävnaden
Transmissionselektronmikroskopi
För att genomföra en mer detaljerad undersökning av morfologin hos de villösa explantaten utfördes ytterligare ultrastrukturella analyser med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM) (Figur 3A-E). Dessa fynd bekräftade resultaten av de histologiska undersökningarna. I vävnad som bäddades in direkt efter preparationen var morfologin exceptionellt välbevarad (Figur 3A). Mikrovilli kunde tydligt urskiljas på ytan av syncytiotrofoblasten. Synkytiotrofoblasten uppvisade sitt distinkta kontinuerliga skikt utan laterala cellgränser, vilket etablerade direktkontakt med basalmembranet. Stromat i den färska vävnaden uppvisade tät packning utan signifikanta perforeringar eller bristningar. Dessutom visade det ultrastrukturella utseendet på blodkärlen och individualiserade intravaskulära erytrocyter också utmärkt bevarande (Figur 3A).
Även efter 24 timmars flödesodling förblev vävnadsprovernas övergripande morfologi relativt väl bibehållen (Figur 3D). Även om det fanns något färre mikrovilli på ytan av syncytiotrofoblasten jämfört med färsk vävnad, förblev syncytiotrofoblasten huvudsakligen fäst vid basalmembranet. Kärnor och enstaka små vakuoler kunde observeras i den inre delen av syncytiotrofoblasten. Stromat i moderkakans villi verkade välbevarat och liknade färsk vävnad (Figur 3D). Även efter 48 timmars flödesodling uppvisade stromacellerna relativt god konservering, om än med vissa perforeringar (Figur 3E). Intressant nog upptäcktes lipiddroppar i vävnaden. Medan syncytiotrofoblasten uppvisade vakuoler och en minskning av antalet mikrovilli, förblev den fäst vid basalmembranet i många regioner, och syncytial- och cellkärnor var tydligt synliga (Figur 3E).
I skarp kontrast till vävnaden från flödeskulturen uppvisade morfologin hos villös vävnad som utsattes för statisk odling försämring så tidigt som 24 timmar (Figur 3B). Synkytiotrofoblasten blev dissocierad från basalmembranet på flera ställen och uppvisade relativt betydande perforeringar. Dessutom var lipiddroppar ofta synliga i både syncytiotrofoblasten och stromat (Figur 3B). Efter 48 timmars statisk odling sågs en progressiv försämring av ultrastrukturen (Figur 3C). Synkytiotrofoblasten uppvisade ett stort antal perforeringar och avlossning från basalmembranet i betydande utsträckning. Att identifiera celler i stromat, liksom endotelceller som ingår i blodkärlen, blev utmanande. Dessutom fanns det en anmärkningsvärd ackumulering av lipiddroppar i de villösa explantaten efter 48 timmars statisk odling (Figur 3C). Sammanfattningsvis uppvisade ultrastrukturen hos vävnad i statisk odling successiv försämring under odlingsperioden, en trend som mildrades av odling under flödesförhållanden3.
Svepelektronmikroskopi
Med hjälp av svepelektronmikroskopi (SEM) underlättades en detaljerad undersökning av ytan på de villösa explantaten (Figur 4A-J). Vävnad som nyligen hade bäddats in uppvisade en tätbefolkad mängd mikrovilli över sin yta (Figur 4 A,B). Vissa regioner uppvisade vesikelliknande strukturer. Däremot uppvisade vävnad från den statiska kulturen en betydande minskning av mikrovilli efter 24 timmar (Figur 4C,D), en minskning som kvarstod efter 48 timmar (Figur 4E,F). Medan vissa områden uppvisade ansamling av vesikelliknande strukturer som inte hade frigjorts, verkade andra regioner kala och eroderade (figur 4D,F). I vävnad som genomgått flödesodling fanns mikrovilli kvar på ytan efter 24 timmar (Figur 4G,H), liksom efter 48 timmar (Figur 4I,J), om än i mindre utsträckning än i färsk vävnad. I jämförelse med den statiska kulturen minskade förekomsten av vesikelliknande strukturer på ytan. Intressant nog var dessa vesikelliknande strukturer särskilt koncentrerade till specifika fördjupningar där flödet kunde minskas eller utebli (Figur 4H,J), vilket tyder på att de kan ha lossnat från den flödesexponerade vävnadsytan på grund av flödet av mediet3.
Figur 1: Uppställning av flödessystemet. (A) Det monterade flödessystemet, som består av reservoaren och fem flödeskammare, är anslutet till en av de peristaltiska pumparna. På höger sida finns en platta med sex brunnar där explantorna odlas statiskt. (B,C) För båda odlingsmetoderna dissekeras placentaproverna till villösa explantor på cirka 0,5cm2, varav fyra explantor sedan används per brunn eller kammare. I ett experimentellt tillvägagångssätt används fem kammare eller brunnar. (D,E) För flödesodling används en metallplatta med smala nålformade förhöjningar för att säkra explantan. (F,G) Rörens öppningar är placerade vid kamrarnas huvud, och används därmed upp och ner för att garantera att vävnaden utsätts för direkt flöde. Denna figur är hämtad från Kupper et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologisk analys av placenta vilous explantat vid flöde och statisk odling. (A-E) Immunofluorescensfärgning för β-aktin för att visualisera cytoskelettet hos explantat vid odling. För analysen användes sex slumpmässigt utvalda punkter per bild. Representativa bilder visas. (A) Visualisering av cytoskelettet i vävnad inbäddad direkt efter beredning. Skalstapel: 20 μm. (B-E) Representativ avbildning av både tidsberoende och odlingslägesberoende degeneration av aktincytoskelettet i odlade explantat av flödes- och statisk odling. (C-E) Asterisker betecknar ökad ackumulering av aktinmikrofilament, vilket är en indikation på nedbrytning av aktincytoskelettet. (F-J) Hematoxylin-eosinfärgning av villösa explantat. Skalstapel: 100 μm. (F,G) Nyinbäddad vävnad (F) och flödeskulturexplantat i 24 timmar (G) visar en välbevarad morfologi av en villös explantat. (I) Flödesodlade explantat under 48 timmar visar periodvis avskilda områden av syncytiotrofoblasten (pil). (H,J) Tidsberoende försämring av strukturell integritet efter statisk explanteringsodling, indikerad av att syncytiotrofoblasten (pilen) och det perforerade stromat lossnar. (K-O) CD34 II användes för att färga villösa endotelceller. Skalstreck: 100 μm. (K,L) Färsk vävnad (K) och explantat odlade i 24 timmar under flödesförhållanden (L) uppvisar ett karakteristiskt strukturellt anpassat endotelcellsmönster. (N) Efter 48 timmar i flödesodling minskar den vaskulära integriteten i viss utsträckning. (M,O) I statisk odling är kollapsade blodkärl synliga redan efter 24 timmar (M), vilket observerades öka med längre statisk odlingstid (O). Denna figur är hämtad från Kupper et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ultrastrukturell undersökning före och efter odling av villösa explantat med hjälp av transmissionselektronmikroskopi. Vävnad från tre oberoende experiment användes för att analysera bilderna. (A) En representativ bild av nyinbäddad vävnad visar en stor mängd mikrovilli (MV) på ytan av syncytiotrofoblasten (ST). Strukturellt intakta kapillärer (Ca) är synliga i det välbevarade stromat (S). (B) I vävnad som har odlats statiskt i 24 timmar sker en försämring av den strukturella integriteten hos syncytiotrofoblasten, som verkar vara bortkopplad från basalmembranet i vissa områden. Det finns också en märkbar ansamling av lipiddroppar (LD). (C) Efter 48 timmar i statisk odling observeras allvarlig ultrastrukturell försämring. Stroma såväl som syncytiotrofoblasten är perforerade och en massiv ansamling av lipiddroppar är uppenbar. Blodkärlen kunde knappt spåras. (D,E) Ultrastrukturen hos vävnaden från flödeskulturen var relativt välbevarad efter 24 timmar (D) samt efter 48 timmar (E). Skalstapel: 2 μm. MV: Mikrovilli, ST: Syncytiotrofoblast, S: Stroma, Ca: Kapillär, LD: Lipiddroppar. Denna figur är hämtad från Kupper et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ultrastrukturell undersökning före och efter odling av villösa explantat med hjälp av svepelektronmikroskopi. (A,C,E,G,I) Översiktsbilder av ytan på placentaträden med respektive detaljerade bilder (B,D,F,H,J). (A,B) Nyinbäddad vävnad uppvisar en tät söm av mikrovilli. (B) Kärlliknande strukturer kan märkas på vissa platser. (C-F) Efter 24 timmar och 48 timmar i statisk odling är en minskning av mikrovilli på ytan av syncytiotrofoblasten synlig. Slående är den omfattande ansamlingen av vesikulärliknande partiklar på explantans yta. (F) Partiklarna verkar vissna efter 48 timmar i statisk odling. (G-J) Ytan på vävnaden från flödeskulturen verkar vara bättre bevarad efter 24 timmar (G,H) samt efter 48 timmar (I,J) jämfört med den statiska kulturen. Mikrovilli är synliga på ytan (H,J), men inte i samma höga densitet som i den färska vävnaden. (B) Vesikulära partiklar kan ses spridda i nischerna med reducerat flöde. Denna figur är hämtad från Kupper et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggstabell 1: Experimentella miljöer för placentaflöde och statisk odling. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 2: Specifikationer för flödessystemet och det statiska systemet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 3: Antikroppar för immunhistokemi och immunofluorescens som används för denna studie. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Denna studie introducerar ett unikt perspektiv på en flödesodlingsteknik för placenta-explantat som är utformad för att replikera dynamiken i livmodermiljön 3,23. Resultaten visar att morfologin hos vävnad som odlats under flödesförhållanden bevaras bättre jämfört med den traditionella statiska odlingsmetoden3. Noterbart är att även om varken statiska eller flödesodlingsförhållanden underlättar perfusion av placentakärl, observerades förstörelsen av blodkärl från foster och placenta inuti det villösa stromat främst vid statisk odling, medan blodkärlens integritet verkade bibehållas bättre under en längre tid i flödesodling3.
En möjlig förklaring till denna observation kan kopplas till syncytiotrofoblastens avgörande skyddande och endokrina roll, en funktion som är väldokumenterad i litteraturen 12,24,25,26. Med tanke på detta är det tänkbart att den övergripande integriteten hos det yttre lagret av villi avsevärt bidrar till underhållet av det underliggande stromat, inklusive blodkärlen. Följaktligen kan blodkärlens bibehållna cellulära integritet under flödesförhållanden tillskrivas mediets kontinuerliga flöde. Denna rörelse hjälper till med explantens passiva rörelse, vilket underlättar utbytet av gaser, näringsämnen och nanopartiklar (som extracellulära vesiklar) över placentabarriären. Detta kan i sin tur ha en positiv inverkan på bevarandet av blodkärlens morfologi. Dessutom spelar fenomenet mekanosensation en roll i vävnadsmorfogenes i olika vävnader27,28. Studier har visat att mekanokänslighet påverkar cellulära processer på flera nivåer, vilket utlöser en rad biokemiska reaktioner som i slutändan påverkar vävnads- och organfunktionalitet29. Noterbart är att mekanokänsliga proteiner uttrycks av syncytiotrofoblasten under hela dräktigheten28. Vidare tyder studien på att mikrovilli på vävnadsytan kan vara inblandade i detta sammanhang28.
Ett ytterligare perspektiv som är värt att överväga är mitokondriernas potentiella roll i cellernas svar på flöde. Till exempel, i endotelceller, fungerar mitokondrier som signalomvandlare för cellulära svar på miljöstimuli30. Ökad ackumulering av lipiddroppar, observerad i statisk odlad vävnad genom TEM3, har associerats med apoptosinduktion på grund av mitokondriell dysfunktion31. Ytterligare undersökningar är nödvändiga för att avslöja de underliggande mekanismerna och nyckelfaktorerna, och koppla dem till signalvägar nedströms. Denna utforskning kan öka vår förståelse för hur vävnaden uppfattar och reagerar på skjuvspänning, vilket kan översättas till förbättrad livskraft och integritet hos villösa explantat i kultur23.
Flera kritiska protokollsteg måste upprepas och utföras med försiktighet. Efter moderkaksförlossningen ska vävnaden odlas så snabbt som möjligt. Under explantationsberedningen är det viktigt att undvika områden med synliga infarkter. Det är viktigt att försiktigt hantera explantat med en pincett för att förhindra att det kläms. Det rekommenderas att vävnaden är täckt med vätska under hela proceduren och att den utförs snabbt.
Det är viktigt att erkänna att denna studie inte kan specificera den exakta skjuvspänningen inom det presenterade flödessystemet, vilket bör betraktas som en begränsning i framtida undersökningar 3,23. Ändå är det viktigt att inse att exakt flödeshastighet och skjuvspänning för en specifik placentavilla in vivo påverkas av många parametrar, såsom de geometriska egenskaperna hos det intervillösa utrymmet, villusens placering inom detta utrymme och dess närhet och vinkel till moderns spiralartärer och livmodervener 3,19,23,32 . Komplexiteten i moderkakans geometriska struktur, som varierar mellan individer, måste också beaktas23,32. Matematiska modeller som uppskattar blodflödet inom det intervillösa utrymmet32 och beräkningar på väggskjuvspänning på syncytiotrofoblasten19,28 finns redan. Intressant nog förutspådde en studie att skjuvspänningen på syncytiotrofoblasten är lägre under den tredje trimestern jämfört med den första trimestern28, medan en annan studie visade rumsligt heterogen väggskjuvspänning på syncytiotrofoblasten19. Att bestämma den exakta flödeshastigheten och skjuvspänningen för en specifik placentavillus är fortfarande en utmaning 3,19,23,32. Sådana beräkningar ger en approximation av skjuvspänningsområdet för framtida undersökningar, men de kan kräva pågående anatomiska justeringar och optimering23. Dessutom kan framtida studier utveckla nya och förfinade genomströmningsodlingstekniker som tar hänsyn till den intrikata geometrin i det intervilösa utrymmet och strategier för att öka antalet prover per experiment3. Pågående framsteg och utveckling av flödessystemet förväntas, eventuellt med användning av alternativa flödeskammare (Brugger et al., opublicerade data, 2023).
Sammanfattningsvis lägger denna studie en robust grund genom att demonstrera en lätt implementerbar ex vivo-flödesodlingsteknik som upprätthåller den strukturella integriteten hos odlade villösa explantat. Det understryker betydelsen av dynamiska tekniker i studier av placentafunktionell biologi, vilket banar väg för ytterligare framsteg inom flödesodlingssystem och generering av nya idéer och hypoteser 3,23.
Disclosures
Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för det utmärkta tekniska stödet från Bettina Amtmann och Petra Winkler för vävnadsprovtagning. Denna forskning finansierades av Austrian Science Fund FWF (DOC 31-B26) och Medical University of Graz, Österrike, genom doktorandprogrammet Inflammatory Disorders in Pregnancy (DP-iDP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
| Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
| antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
| anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
| Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
| CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
| CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
| Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
| Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
| Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
| Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
| Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
| Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
| Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
| Metal plate with needles | In-house construction | ||
| Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
| Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
| Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
| Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
| QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
| SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
| Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
| Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
| TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
| UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
| UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
| Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |
References
- Villee, C. A. The metabolism of human placenta in vitro. Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: Approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Placental villous explant culture 2.0: flow culture allows studies closer to the in vivo situation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7464 (2021).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell and Tissue Research. 328 (3), 607-616 (2007).
- Simán, C. M., Sibley, C. P., Jones, C. J. P., Turner, M. A., Greenwood, S. L. The functional regeneration of syncytiotrophoblast in cultured explants of term placenta. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 280 (4), R1116-R1122 (2001).
- Toro, A. R., et al. Leptin is an anti-apoptotic effector in placental cells involving p53 downregulation. PLoS ONE. 9 (6), e99187 (2014).
- Morley, L. C., Debant, M., Walker, J. J., Beech, D. J., Simpson, N. A. B. Placental blood flow sensing and regulation in fetal growth restriction. Placenta. 113, 23-28 (2021).
- Wang, Y. Z. S., Wang, Y., Zhao, S.
- Huppertz, B.
- Weiss, G., Sundl, M., Glasner, A., Huppertz, B., Moser, G. The trophoblast plug during early pregnancy: a deeper insight. Histochemistry and Cell Biology. 146 (6), 749-756 (2016).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Gude, N. M., Roberts, C. T., Kalionis, B., King, R. G. Growth and function of the normal human placenta. Thrombosis Research. 114 (5-6), 397-407 (2004).
- Wang, Y.
- Moser, G., Windsperger, K., Pollheimer, J., de Sousa Lopes, S. C., Huppertz, B. Human trophoblast invasion: new and unexpected routes and functions. Histochemistry and Cell Biology. 150 (4), 361-370 (2018).
- Kupper, N., Huppertz, B. The endogenous exposome of the pregnant mother: Placental extracellular vesicles and their effect on the maternal system. Molecular Aspects of Medicine. 87 (October 2020), 100955 (2022).
- Huppertz, B. IFPA award in placentology lecture: biology of the placental syncytiotrophoblast - myths and facts. Placenta. 31 (SUPPL), S75-S81 (2010).
- Gauster, M., Moser, G., Wernitznig, S., Kupper, N., Huppertz, B. Early human trophoblast development: from morphology to function. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (6), 345 (2022).
- Lecarpentier, E., et al. Fluid shear stress promotes placental growth factor upregulation in human syncytiotrophoblast through the cAMP-pKA signaling pathway. Hypertension. 68 (6), 1438-1446 (2016).
- Lecarpentier, E., et al. Computational fluid dynamic simulations of maternal circulation: wall shear stress in the human placenta and its biological implications. PLOS ONE. 11 (1), e0147262 (2016).
- Miura, S., Sato, K., Kato-Negishi, M., Teshima, T., Takeuchi, S. Fluid shear triggers microvilli formation via mechanosensitive activation of TRPV6. Nature Communications. 6 (1), 8871 (2015).
- Jauniaux, E., et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. The American Journal of Pathology. 157 (6), 2111-2122 (2000).
- Sodha, R. J., Proegler, M., Schneider, H. Transfer and metabolism of norepinephrine studied from maternal-to-fetal and fetal-to-maternal sides in the in vitro perfused human placental lobe. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 148 (4), 474-481 (1984).
- Kupper, N. Extracellular vesicles from advanced placental explant flow culture and their role in preeclampsia [Dissertation]. , Medical University of Graz, Austria. (2022).
- Burton, G. J., Fowden, A. L. The placenta: a multifaceted, transient organ. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1663), 20140066 (2015).
- Arora, N., Sadovsky, Y., Dermody, T. S., Coyne, C. B. Microbial vertical transmission during human pregnancy. Cell Host & Microbe. 21 (5), 561-567 (2017).
- Cheong, M. L., et al. A Positive feedback loop between glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCGβ expression and cell differentiation. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 197-209 (2016).
- Heisenberg, C. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Lee, T. C., Moulvi, A., James, J. L., Clark, A. R. Multi-scale modelling of shear stress on the syncytiotrophoblast: could maternal blood flow impact placental function across gestation. Annals of Biomedical Engineering. 51 (6), 1256-1269 (2023).
- Kamkin, A., Kiseleva, I. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. 49 (0), Academia. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21290773 (2005).
- Kluge, M. A., Fetterman, J. L., Vita, J. A.
- Boren, J., Brindle, K. M. Apoptosis-induced mitochondrial dysfunction causes cytoplasmic lipid droplet formation. Cell Death & Differentiation. 19 (9), 1561-1570 (2012).
- Chernyavsky, I. L., Jensen, O. E., Leach, L. A Mathematical model of intervillous blood flow in the human placentone. Placenta. 31 (1), 44-52 (2010).
