Summary
İşte sabit akış koşulları altında plasental eksplantların kültürlenmesi için bir protokol. Bu yaklaşım, dinamik fizyolojik ortamların replikasyonunu sağlayarak geleneksel statik villöz kültür sistemlerini geliştirir.
Abstract
Mevcut ex vivo plasental eksplant kültür modelleri, öncelikle kuyu plakaları kullanılarak statik kültür sistemlerinde topraklanır. Bununla birlikte, bu modeller, plasentanın plazma veya kan akışı nedeniyle sürekli hafif kesme stresi ile karşılaştığı utero ortamdaki dinamiği yetersiz bir şekilde yansıtmaktadır. Bu sınırlamayı ele almak için, ex vivo plasental eksplant yetiştiriciliğini maternal vücutta yaşanan in utero akış koşullarına yaklaştırmak için bir akış kültürü sistemi tasarlanmıştır. Bu yaklaşımda, plasental eksplantlar, birbirine bağlı beş akış odası dizisinde yetiştirilir. Bu ayar, fizyolojik oksijen konsantrasyonlarını ve tutarlı bir akış hızını korur. Toplanan veriler, akış koşulları altında, doku morfolojisinin korunmasının, geleneksel statik yöntemlere kıyasla kayda değer bir gelişme gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bu yenilikçi teknik, dinamik in vivo ortamın daha sadık bir temsilini sunarak, ex vivo plasental eksplant kültürünün basit bir yolunu sunar. Ayrıca, bu çalışma, fetö-maternal arayüzün işlevsel dinamiklerini araştırmak için yeni olanaklar sunmaktadır. Uygulanabilir dinamik metodolojileri benimseyerek, plasental biyolojinin daha derin bir şekilde anlaşılması kolaylaştırılır ve maternal-fetal sağlık için öneminin altı çizilir.
Introduction
1960'lardan bu yana, bir kuyu plakasının dibinde plasental eksplant yetiştiriciliği, feto-maternal arayüzü 1,2,3'ü incelemek için kullanılmıştır. Bu yöntem köklü ve basittir, tek hücre kültürlerine ek olarak çeşitli çalışmalar için insan dokusunun kullanılmasını sağlar 2,3. Zamanla, plasental eksplant kültürleri için deneysel tasarımlar, oksijen konsantrasyonu4 ve dokunun kuyu plakasının dibine çökelmesini önlemek için 2,5,6 ile ilgili olarak değiştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem uterus içindeki in vivo koşullara, özellikle sabit bir akışın varlığınauyarlanmamıştır 3.
Gebeliğin başarısı, intervillöz boşluğun maternal kanla yeterli ve tutarlı bir şekilde perfüzyonuna, kan ve kan yoluyla bulaşan maddelerin sürekli giriş ve çıkışı ile dinamik bir devre oluşturmasınabağlıdır 7,8,9,10,11,12. Plasenta, biri maternal kan ve diğeri fetal kan için olmak üzere iki farklı kan tedarik sistemine sahiptir ve bu da hem fetal hem de maternal sistemler tarafından ikili perfüzyonla sonuçlanır13. Maternal kan, ilk trimesterin sonunda plasentanın intervillöz boşluğunu perfüze etmeye başlar ve genişlemiş uterus spiral arterlerindenyavaşça akar 10,11,14. Sonuç olarak, plasentalı villöz ağaçlar anne kanıyla yıkanır ve fetüse besin ve oksijen sağlar. Bu maternal kan, uteroplasental venler yoluyla maternal dolaşıma geri dönmeden önce intervillöz boşluktan akar. İntervillöz boşluktan geçişi sırasında, oksijen ve besin maddelerinin fetal kana difüzyonu ve aktif alımı, anne kanında daha düşük oksijen ve besin seviyelerine yol açar12,15. Bununla birlikte, intervillöz boşluğun kanı, dakikada yaklaşık iki ila üç kez tamamen taze, oksijen açısından zengin kanla değiştirilir ve sürekli bir besin ve gaz kaynağı sağlanır13. Özellikle, plasenta bariyerinin en dış kısmı olan sinsitiotrofoblast, doğrudan anne kanına maruz kalan plasental villöz ağacın tek bileşenidir15,16,17. Sonuç olarak, sinsitiyotrofoblast, akan maternal kandan sürekli hafif bir kayma gerilimi yaşar 3,14.
Plasental akış ortamı ile ilgili mevcut bilimsel bilgiler ve modern teknik gelişmeler, artık akış koşulları altında plasental eksplantların uyarlanmış ve fizyolojik olarak yaklaşık bir şekilde yetiştirilmesine izin vermektedir. Ayrıca, kanıtlar, kesme kuvvetlerinin sinsitiyotrofoblast 18,19,20,21'in biyolojik işlevlerini etkilediğini göstermektedir. Kan akışını açıklayan iyi bilinen bir yaklaşım plasental çift lob perfüzyon sistemidir22. Bununla birlikte, bu deneyler önemli bir uzmanlık gerektirir, zaman kısıtlamalıdır (sadece birkaç saat boyunca yapılır) ve yalnızca üçüncü trimester plasental örneklerle uygulanabilir 3,23. Buna karşılık, hem birinci hem de üçüncü trimester plasental dokuları barındıran, sabit akış ayarları altında ex vivo plasental villöz eksplant kültürü için basit ve müdahaleci olmayan bir teknik geliştirdik3. Bu kurulumda, plasental eksplantlar seri bağlı beş akış odasında yetiştirilir. Villöz eksplantlar, ince metal plakalar üzerinde iğne şeklindeki yükseltiler kullanılarak odanın tabanına sabitlenir. İnşa edilen akış devresi daha sonra hem oksijen konsantrasyonunun hem de akış hızınındüzenlendiği bir biyoreaktöre aktarılır 3. Akış kültürü sonuçları, doku bütünlüğünün tipik olarak kullanılan statik yönteme kıyasla daha iyi korunduğunu göstermektedir3. Ayrıca, bu dinamik yaklaşım, doku eksplant kültürü için yeni ve uyarlanmış deneysel tasarımlara olanak tanıyarak, doğal çevreyi daha yakından taklit eden in vitro deneylere olanak tanır3.
Protocol
Graz Tıp Üniversitesi etik kurulu bu çalışmayı onayladı (31-019 ex 18/19 versiyon 1.2 ve 29-319 ex 16/17). Çalışmaya dahil olan tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Akış deneyi için hazırlık
NOT: Deneyler, entegre peristaltik pompalara sahip bir biyoreaktörde gerçekleştirilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). Biyoreaktör içindeki nem, sıcaklık ve gaz seviyesi ayarlanabilir.
- Biyoreaktörü açın ve biyoreaktörün kılavuzuna göre deney için tüm ön düzenlemeleri (örn. pompaların kalibrasyonu, ön ısıtma, gaz koşulları ve nem) yapın. Deneye başlamadan önce, gerekli ayarlar (sıcaklık, gaz içeriği, nem) birkaç saat veya gece boyunca sabitlenmelidir. Bunu yapmak için biyoreaktörü ve yazılımı başlatın ve ardından "İnkübatör" menü öğesinin altındaki Ayar Noktalarını Değiştir'e tıklayın.
- PBS ve gerekli ortamı önceden ısıtın (sağlanan hEGF-5, HC-500 takviyeleri ile desteklenmiş Endotel Hücre Büyüme Ortamı ve% 5 eksozomu tükenmiş fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin) (bkz.
2. Plasenta örneği diseksiyonu
- Doğumdan hemen sonra, Kupper ve ark.3'te tarif edildiği gibi orta plasental bölgeden üç kez 2 cm 3 plasenta örneğikesin.3 Kısaca, örnekleri PBS'de saklayın. Koryonik plakayı, maternal desiduayı ve numuneden görünür enfarktüs alanlarını atın.
- Kalan doku örneğini, kesit çapı yaklaşık 0.5 cm (ıslak ağırlık yaklaşık 7.5 mg) olan villöz eksplantlara diseke edin. Bunları taze PBS içeren bir Petri kabına aktarın.
- Kan kalıntılarını gidermek için eksplantları cımbızla sıvı içinde hafifçe çalkalayarak PBS'de yıkayın.
NOT: Numuneleri ön yıkamak ve kurumasını önlemek için PBS'li bir Petri kabında inceleyin ve dokuyu işlemek için sterilize edilmiş/otoklavlanmış aletler kullanın.
3. Akış deneyi
- Steril bir başlık altında, akış odalarının kullanım kılavuzuna göre luer kilitlerini kullanarak beş odayı seri olarak rezervuar şişesine bağlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Kullanmadan önce tüm malzemeleri ilgili kılavuza göre sterilize edin ve/veya otoklavlayın. Steril gaz değişimi için rezervuar şişesinde bir hava filtresi kullanın. Hazneleri açmak ve kapatmak için, haznelerin pabuçlarını hafifçe sıkın. Adım 3.1. daha önce de hazırlanabilir. - Hazneleri ters çevirin ve altını çıkararak açın. Metal plakaları, pimler yukarı bakacak şekilde odaların üst kısmında merkezi olarak aktarmak için forseps kullanın.
- Hazneleri 1 mL önceden ısıtılmış ortamla (37 °C) doldurun. Ardından rezervuarı 20 mL daha doldurun. Devre, her bir akış odasındaki, tüplerdeki ve rezervuar şişesindeki hacim dahil olmak üzere toplam 25 mL gerektirir. Akış altında, dolu bir odadaki ortamın son hacmi 2 mL'dir.
- Forseps kullanın ve odadaki metal plakanın iğneleri arasında birbiri ardına bir villöz eksplant aktarın. Dokunun delinmesini önlemek için iğnelerin plasental villus arasında kaymasına izin verin. Dört eksplantı bir odaya aktarın. Tabanı dikkatlice yeniden takarak odaları kapatın. Tam bir devre toplam 20 eksplant içerir. Odaların baş aşağı konumda kalması gerekir.
NOT: Eksplantları forseps ile nazikçe kavrayın; Onları sıkmamaya çalışın. Sızıntıyı önlemek için odaların ve devrenin tamamen kapatıldığından emin olun. Odalar her zaman baş aşağı kullanılır. Oda başına eksplant sayısı ve oda sayısı değişkendir. İlk trimester dokusu için prosedür, küçük bir ilaveyle üçüncü trimester dokusuna benzer: villusu sabitlemek için, doku metal plakaya aktarıldıktan sonra iğneleri eksplantların üzerinde hafifçe bükün (kişisel iletişim Brugger ve ark.). Bu, kırılgan dokuyu metal plaka üzerinde sabitler ve numunelerin kaymasını önler. - Akış tertibatını biyoreaktöre aktarın.
- Pompa borusunu pompaya bağlayarak akış devresini biyoreaktör içindeki peristaltik pompaya bağlayın. 4. aşamada düzeltin (biri dört kez tıkladığını duyacaktır).
- Statik kontrol gerekiyorsa, kuyu plakasını da biyoreaktöre yerleştirin.
NOT: Statik kültür için, altı oyuklu bir plakanın beş oyu, kuyu başına 4 mL ortam ve kuyu başına 4 villöz eksplant ile doldurulur. Doldurulmuş kuyu plakası da biyoreaktöre yerleştirilir ve akış kültürü eksplantları ile aynı atmosferde kültürlenir. Daha fazla ayrıntı Kupper ve ark.3'te açıklanmıştır. - Pompa modunu "Pompalar" menü öğesi altında Manuel olarak ayarlayın. Ardından pompa hızını 1 mL/dk'ya ayarlayın ve Çalıştır'a tıklayarak ortamı boruya pompalamaya başlayın. Devre ortamla doldurulurken, bölmeleri tamamen ortamla doldurulacak şekilde bir açıyla tutun.
NOT: Plasental villöz akış ve statik kültür için deneysel ayarlar için Ek Tablo 1'e bakınız. Akış ve statik sistemin özellikleri Ek Tablo 2'de verilmiştir.
DİKKAT: Numunelerin iğnelerden kaymasını önlemek için doldurma sırasında hazneyi dikkatlice eğin. - Doldurma tamamlandıktan sonra, odalar baş aşağı konumlarında kalır. Odaların güvenli ve dik durduğundan emin olun ve biyoreaktörün her iki kapağını da kapatın.
NOT: Dolu bir akış odasındaki ortamın son hacmi 2 mL'dir. Deneylerde kullanılan akış odalarının ve kuyu plakalarının deney ortamları ve özellikleri Kupper ve ark.3'te açıklanmıştır. - Dokuyu istenen süre boyunca inkübe edin.
NOT: Biyoreaktörün kapağı tekrar açılmadan sıcaklık, gaz seviyesi ve debi bilgisayar üzerinden izlenebilir. - Dokunun inkübasyonundan sonra, "Pompalar" menü öğesinin altındaki İptal'e tıklayarak istenen süre boyunca pompayı durdurun. Biyoreaktörün iki kapağını ve ardından her seferinde bir akış odasını açın. Forseps kullanarak eksplantları metal plakadan dikkatlice çıkarın.
- Dokuyu ve süpernatanı seçilen aşağı akış analizine göre işleyin. Bu olguda immünohistokimyasal boyama ve elektron mikroskobu yapıldı3. İmmünohistokimya ve immünofloresan için kullanılan antikorların ayrıntıları için Ek Tablo 3'e bakınız.
NOT: Dokuyu çıkardıktan sonra, pompayı saat yönünün tersine çevirerek ortamı devreden boşaltın. - Akış devresini, üreticinin akış odaları ve borular için talimatlarına göre sökün ve temizleyin.
Representative Results
Bu yayının bazı bölümleri ve sonuçları zaten yayınlanmıştır (Bkz. referans 3 ve 23).
Deney düzeneği
Şekil 1'de bir deney düzeneği gösterilmektedir. Kompozit bir akış döngüsü, seri olarak birbirine bağlanmış beş akış odasından oluşur (Şekil 1A). Her akış odasında, her biri yaklaşık 0,5 cm kesit çapına sahip dört eksplant yetiştirilir (Şekil 1 A,C). Statik kontrol deneyi için, eksplantlar altı oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarında yetiştirilir (Şekil 1B). Eksplantların dışarı atılmasını önlemek için, dar iğne şeklindeki çıkıntılara sahip metal plakalara yapıştırılırlar (Şekil 1 D,E). Eksplantları ortamın doğrudan akışına maruz bırakmak için, girişler ve çıkışlar baş bölümünde konumlandırılmış olarak bölmeler ters çevrilir (Şekil 1 F,G). Biyoreaktör içinde, akış döngüsü peristaltik bir pompaya bağlıdır. Akış kültürlü doku ile geleneksel olarak statik kültürlenmiş doku arasındaki doku bütünlüğünü karşılaştırmak amacıyla, eksplantlar akış döngüsüne bitişik altı oyuklu bir plakaya yerleştirilir. Bu, oksijen, sıcaklık ve nem açısından tutarlı kültür koşullarının doğrulanmasını sağlar (Şekil 1A)3.
Morfolojik analiz
β-aktin
Çeşitli yetiştirme koşullarıyla ilişkili doku bütünlüğündeki histolojik ayrımları incelemek için çeşitli immünohistokimyasal boyama prosedürleri uygulanmıştır (Şekil 2). Diseksiyon sonrası derhal gömülen eksplantlar, temel referans olarak görev yaptı. Villöz eksplantlar içindeki aktin hücre iskeletinin analizi için β-aktin boyaması yapıldı (Şekil 2A-E). Tanımlayıcı analiz, hücre iskeletinin yeni elde edilmiş dokuda iyi yapılandırılmış ve organize edilmiş bir görsel sunumunu ortaya çıkardı (Şekil 2A). Zamanla, yetiştirme ilerledikçe, hücre iskeleti yapısında bir bozulma olduğunu gösteren gözlemlenebilir bir mikrofilament birikimi oldu. Bu fenomen, statik yetiştirme3 geçiren villöz eksplantlarda tutarlı bir şekilde gözlenmiştir (Şekil 2C, E, yıldızlarla gösterilmiştir).
H & E boyama
H&E boyama, doku bütünlüğünün statik kültür boyunca azaldığı gözlemine ek takviye sağlamıştır, bu eğilim akış kültürü bağlamında iyileştirilmiştir (Şekil 2F-J). Taze doku, yoğun ve sıkı bir şekilde paketlenmiş bir stroma ile karakterize edilen villöz eksplantların yapılandırılmış ve karakteristik bir histolojik sunumunu sergiledi (Şekil 2F). Ek olarak, sinsityotrofoblast alttaki stromaya sıkıca yapışmıştır (Şekil 2F). 24 saat boyunca bir akış ortamında kültürlenen villöz eksplantlarda karşılaştırılabilir bir görünüm kaydedilmiştir (Şekil 2G). Bununla birlikte, akış altında 48 saatlik ekimden sonra, sinsitiyotrofoblastın bölümlerinin kısmen ayrıldığı gözlendi (Şekil 2I, okla gösterilmiştir), stroma içinde sporadik küçük lakunalar eşlik eder. Dokunun histolojik incelemesi, statik kültür koşulunda 24 saat sonra doku bütünlüğünün yeterince korunmadığını gösterdi (Şekil 2H). Ayrıca, bu bütünlük statik kültürde 48 saat sonra belirgin bir şekilde bozulmuştur (Şekil 2J). Stroma gözenekli ve çukurlu bir görünüm sergiledi ve sinsityotrofoblastın stromadan önemli ölçüde ayrılması daha geniş bölgelerde belirgindi3.
CD34II
CD34II boyama, endotel hücrelerini ve sonuç olarak villöz eksplantlar içindeki feto-plasental kan damarlarını görselleştirmek için kullanıldı (Şekil 2K-O). Diseksiyondan hemen sonra doğrudan gömülen doku, endotel hücrelerinin belirgin bir şekilde organize edilmiş bir düzenini sergiledi (Şekil 2K). Feto-plasental kan damarlarının morfolojik bütünlüğü, akış kültüründen 24 saat sonra ve sıklıkla 48 saat sonra bile iyi korunmuştur, ancak akış koşulları altında ara sıra çökmüş kan damarları vakaları kaydedilmiştir (Şekil 2 L, N). Bununla birlikte, 24 saatlik statik kültürü takiben, kan damarları, bozulmuş görsel görünümlerinin kanıtladığı gibi kısmi çökme sergiledi (Şekil 2M, ok uçlarıyla gösterilmiştir). Statik kültür ortamındaki kan damarlarının bu bozulmasının, uzun ekim süresi ile daha da kötüleştiği görülmüştür. Özetle, hem akış hem de statik kültürden sonra villöz eksplantların tanımlayıcı morfolojik değerlendirmesi, statik kültür modu3 ile karşılaştırıldığında doku bütünlüğünün akış sistemi içinde daha etkili bir şekilde korunduğunu göstermiştir.
Ekili dokunun ultrastrüktürel analizi
Transmisyon elektron mikroskobu
Villöz eksplantların morfolojisinin daha ayrıntılı bir incelemesini yapmak için, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak ek ultrastrüktürel analizler yapıldı (Şekil 3A-E). Bu bulgular histolojik araştırmaların sonuçlarını doğruladı. Preparasyondan hemen sonra doğrudan gömülen dokuda, morfoloji son derece iyi korunmuştur (Şekil 3A). Mikrovilluslar, sinsitiyotrofoblastın yüzeyinde açıkça fark edilebilirdi. Sinsitiyotrofoblast, bazal membran ile doğrudan temas kurarak, yanal hücre sınırları olmayan kendine özgü sürekli katmanını sundu. Taze dokunun stroması, önemli delikler veya yırtılmalar olmaksızın yoğun bir paketleme sergiledi. Ayrıca, kan damarlarının ultrastrüktürel görünümü ve bireyselleştirilmiş intravasküler eritrositler de mükemmel koruma göstermiştir (Şekil 3A).
24 saatlik akış kültüründen sonra bile, doku örneklerinin genel morfolojisi nispeten iyi korunmuştur (Şekil 3D). Sinsityotrofoblastın yüzeyinde taze dokuya kıyasla biraz daha az mikrovillus bulunurken, sinsityotrofoblast esas olarak bazal membrana bağlı kalmıştır. Sinsityotrofoblastın iç kısmında çekirdekler ve ara sıra küçük vakuoller gözlenebilirdi. Plasental villus içindeki stroma iyi korunmuş görünüyordu ve taze dokuya çok benziyordu (Şekil 3D). 48 saatlik akış kültürünü takiben bile, stromal hücreler, bazı delikler mevcut olsa da, nispeten iyi bir koruma sergilemiştir (Şekil 3E). Şaşırtıcı bir şekilde, doku içinde lipit damlacıkları tespit edildi. Sinsitiyotrofoblast vakuoller ve mikrovillus sayısında azalma gösterirken, birçok bölgede bazal membrana bağlı kaldı ve sinsityal ve hücre çekirdekleri açıkça görülebiliyordu (Şekil 3E).
Akış kültüründen elde edilen dokunun tam tersine, statik kültüre maruz kalan villöz dokunun morfolojisi 24 saat gibi erken bir sürede bozulma gösterdi (Şekil 3B). Sinsitiyotrofoblast, birçok bölgede bazal membrandan ayrıldı ve nispeten önemli delikler gösterdi. Ek olarak, lipid damlacıkları hem sinsityotrofoblastta hem de stromada sıklıkla belirgindi. 48 saatlik statik kültürü takiben, üst yapıda ilerleyici bir düşüş belirgindi. Sinsitiyotrofoblast, bazal membrandan önemli ölçüde çok sayıda delik ve ayrılma gösterdi. Stroma içindeki hücrelerin yanı sıra kan damarlarını oluşturan endotel hücrelerini tanımlamak zorlaştı. Ayrıca, 48 saatlik statik kültürden sonra villöz eksplantlarda kayda değer bir lipit damlacıkları birikimi vardı (Şekil 3C). Özetle, statik kültürdeki dokunun üst yapısı, yetiştirme süresi boyunca art arda bozulma sergiledi, bu eğilim akış koşulları altında yetiştirme ile hafifletildi3.
Taramalı elektron mikroskobu
Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak, villöz eksplantların yüzeyinin ayrıntılı bir incelemesi kolaylaştırılmıştır (Şekil 4A-J). Yeni gömülmüş doku, yüzeyi boyunca yoğun nüfuslu bir mikrovillus dizisi sergiledi (Şekil 4 A, B). Bazı bölgelerde vezikül benzeri yapılar sergilenmiştir. Buna karşılık, statik kültürden alınan doku, 24 saat sonra mikrovilluslarda önemli bir azalma gösterdi (Şekil 4C, D), 48 saat sonra devam eden bir azalma (Şekil 4E, F). Bazı bölgeler serbest bırakılmamış vezikül benzeri yapıların toplanmasını gösterirken, diğer bölgeler çıplak ve aşınmış görünüyordu (Şekil 4D, F). Akış kültürüne maruz kalan dokuda, mikrovilluslar 24 saat sonra (Şekil 4G, H) ve 48 saat sonra (Şekil 4I, J) yüzeyde hala mevcuttu, ancak taze dokudan daha az ölçüde mevcuttu. Statik kültürle karşılaştırıldığında, yüzeydeki vezikül benzeri yapıların prevalansı azalmıştır. Şaşırtıcı bir şekilde, bu vezikül benzeri yapılar, akışın azaltılabileceği veya hiç olmadığı belirli girintilerde yoğunlaşmıştır (Şekil 4H, J), bu da ortamın akışı nedeniyle akışa maruz kalan doku yüzeyinden yerinden çıkmış olabileceklerini düşündürmektedir3.
Şekil 1: Akış sisteminin kurulumu . (A) Rezervuar ve beş akış odasından oluşan monte edilmiş akış sistemi, peristaltik pompalardan birine bağlanır. Sağ tarafta, eksplantların statik olarak kültürlendiği altı oyuklu bir plaka bulunur. (B,C) Her iki yetiştirme yöntemi için de plasental numuneler, yaklaşık 0.5cm2'lik villöz eksplantlara diseke edilir, bunlardan daha sonra oyuk veya oda başına dört eksplant kullanılır. Deneysel bir yaklaşımda, beş oda veya kuyu kullanılır. (D,E) Akış kültürü için, eksplantları sabitlemek için dar iğne şeklindeki yüksekliklere sahip metal bir plaka kullanılır. (F,G) Tüplerin açıklıkları odacıkların başında bulunur ve bu nedenle dokunun doğrudan akışa maruz kalmasını sağlamak için baş aşağı kullanılır. Bu rakam Kupper ve ark.3'ten alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Plasental villöz eksplantların akış ve statik kültür üzerine morfolojik analizi. (A-E) Kültür üzerine eksplantların hücre iskeletini görselleştirmek için β-aktin için immünofloresan boyama. Analiz için, slayt başına rastgele seçilen altı nokta kullanıldı. Temsili resimler gösterilir. (A) Hazırlandıktan hemen sonra gömülü doku hücre iskeletinin görselleştirilmesi. Ölçek çubuğu: 20 μm. (BE) Aktin hücre iskeletinin hem zamana bağlı hem de yetiştirme moduna bağlı dejenerasyonunun kültürlenmiş akış ve statik kültür eksplantlarında temsili tasviri. (C-E) Yıldız işaretleri, aktin hücre iskeleti bozulmasının bir göstergesi olan aktin mikrofilament birikiminin arttığını gösterir. (F-J) Villöz eksplantların hematoksilen-eozin boyaması. Ölçek çubuğu: 100 μm. (F,G) 24 saat (G) boyunca taze gömülü doku (F) ve akış kültürü eksplantları, villöz bir eksplantın iyi korunmuş bir morfolojisini gösterir. (I) 48 saat boyunca akış kültürlü eksplantlar, sinsitiyotrofoblastın aralıklı olarak ayrılmış alanlarını gösterir (ok). (H,J) Statik eksplant kültüründen sonra yapısal bütünlüğün zamana bağlı bozulması, sinsitiyotrofoblastın (ok) ve delikli stroma'nın yerinden çıkması ile gösterilir. (K-O) CD34 II, villöz endotel hücrelerini boyamak için kullanıldı. Ölçek çubuğu: 100 μm. (K,L) Akış koşulları (L) altında 24 saat boyunca kültürlenen taze doku (K) ve eksplantlar, karakteristik yapısal olarak hizalanmış bir endotel hücre modeli sergiler. (N) Akım kültüründe 48 saat sonra vasküler bütünlük bir dereceye kadar azalır. (M,O) Statik kültürde, çökmüş kan damarları 24 saat (M) sonra zaten görülebilir ve bunun daha uzun statik ekim süresi (O) ile arttığı gözlemlenmiştir. Bu rakam Kupper ve ark.3'ten alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak villöz eksplantların ultrastrüktürel öncesi ve sonrası incelemesi. Görüntüleri analiz etmek için üç bağımsız deneyden elde edilen doku kullanıldı. (A) Yeni gömülmüş dokunun temsili bir görüntüsü, sinsitiyotrofoblastın (ST) yüzeyinde büyük miktarda mikrovillus (MV) gösterir. Yapısal olarak sağlam kılcal damarlar (Ca) iyi korunmuş stromada (S) görülebilir. (B) 24 saat boyunca statik olarak kültürlenen dokuda, bazı bölgelerde bazal membrandan kopmuş gibi görünen sinsityotrofoblastın yapısal bütünlüğünde bir bozulma vardır. Ayrıca gözle görülür bir lipit damlacıkları (LD) birikimi vardır. (C) Statik kültürde 48 saat sonra, ciddi ultrastrüktürel bozulma gözlenir. Stroma ve sinsityotrofoblast deliklidir ve büyük bir lipit damlacıkları birikimi belirgindir. Kan damarları neredeyse hiç izlenemiyordu. (D,E) Akış kültüründen alınan dokunun üst yapısı, 24 saat (D) ve 48 saat (E) sonra nispeten iyi korunmuştur. Ölçek çubuğu: 2 μm. MV: Mikrovillus, ST: Sinsitiotrofoblast, S: Stroma, Ca: Kılcal, LD: Lipid damlacıkları. Bu rakam Kupper ve ark.3'ten alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak villöz eksplantların ultrastrüktürel uygulama öncesi ve sonrası incelemesi. (A,C,E,G,I) Plasentalı villöz ağaçlarının yüzeyinin ilgili ayrıntılı görüntülerle (B,D,F,H,J) genel görünümü. (A,B) Yeni gömülmüş doku, yoğun bir mikrovillus dikişi sergiler. (B) Veziküler benzeri yapılar bazı yerlerde fark edilebilir. (C-F) Statik kültürde 24 saat ve 48 saat sonra, sinsitiyotrofoblastın yüzeyindeki mikrovilluslarda bir azalma görülür. Çarpıcı olan, eksplantın yüzeyinde veziküler benzeri parçacıkların yoğun bir şekilde birikmesidir. (F) Parçacıklar statik kültürde 48 saat sonra soluyor gibi görünüyor. (G-J) Akış kültüründen gelen dokunun yüzeyi, statik kültüre kıyasla 24 saat (G, H) ve 48 saat (I, J) sonra daha iyi korunmuş gibi görünmektedir. Mikrovilluslar, taze dokuda olduğu gibi aynı yüksek yoğunlukta olmasa da, yüzeyde (H,J) görülebilir. (B) Veziküler parçacıklar, akışı azaltılmış nişlere dağılmış olarak görülebilir. Bu rakam Kupper ve ark.3'ten alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Plasental villöz akış ve statik kültür için deneysel ayarlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 2: Akış ve statik sistemin özellikleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 3: Bu çalışma için kullanılan immünohistokimya ve immünofloresan için antikorlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu çalışma, utero ortamdaki dinamiği çoğaltmak için tasarlanmış plasental eksplantlar için bir akış kültürü tekniğine benzersiz bir bakış açısı sunmaktadır 3,23. Bulgular, akış koşulları altında kültürlenen doku morfolojisinin geleneksel statik kültivasyon yöntemine kıyasla daha iyi korunduğunu ortaya koymaktadır3. Özellikle, ne statik ne de akış kültürü koşulları plasental damarların perfüzyonunu kolaylaştırmasa da, villöz stroma içindeki feto-plasental kan damarlarının yıkımı ağırlıklı olarak statik kültürde gözlenirken, kan damarlarının bütünlüğünün akış kültüründe daha uzun bir süre boyunca daha iyi korunduğu görülmüştür3.
Bu gözlem için olası bir açıklama, literatürdeiyi belgelenmiş bir işlev olan sinsitiyotrofoblastın önemli koruyucu ve endokrin rolüyle bağlantılı olabilir 12,24,25,26. Bu göz önüne alındığında, villusun dış tabakasının genel bütünlüğünün, kan damarları da dahil olmak üzere altta yatan stroma'nın korunmasına önemli ölçüde katkıda bulunduğu düşünülebilir. Sonuç olarak, akış koşulları altında kan damarlarının sürekli hücresel bütünlüğü, ortamın sürekli akışına bağlanabilir. Bu hareket, eksplantların pasif hareketine yardımcı olarak plasenta bariyeri boyunca gazların, besinlerin ve nanopartiküllerin (hücre dışı veziküller gibi) değişimini kolaylaştırır. Bu da, kan damarı morfolojisinin korunmasını olumlu yönde etkileyebilir. Ayrıca, mekanosensasyon fenomeni, çeşitli dokularda doku morfogenezinde rol oynar27,28. Çalışmalar, mekanosensitivitenin hücresel süreçleri birden fazla düzeyde etkilediğini ve sonuçta doku ve organ işlevselliğini etkileyen bir dizi biyokimyasal yanıtı tetiklediğini göstermiştir29. Özellikle, mekanosensitif proteinler, gebelik28 boyunca sinsitiyotrofoblast tarafından eksprese edilir. Ayrıca, çalışma, doku yüzeyindeki mikrovillusların bu bağlamda rol oynayabileceğini düşündürmektedir28.
Dikkate değer ek bir bakış açısı, mitokondrinin akışa hücresel tepkideki potansiyel rolüdür. Örneğin, endotel hücrelerinde mitokondri, çevresel uyaranlara30 hücresel tepkiler için sinyal dönüştürücüler olarak hizmet eder. TEM3 yoluyla statik kültürlenmiş dokuda gözlenen lipid damlacıklarının artmış birikimi, mitokondriyal disfonksiyona bağlı apoptoz indüksiyonu ile ilişkilendirilmiştir31. Altta yatan mekanizmaları ve temel faktörleri ortaya çıkarmak ve bunları aşağı akış sinyal yollarına bağlamak için daha fazla araştırma gereklidir. Bu keşif, dokunun kayma stresini nasıl algıladığı ve buna nasıl tepki verdiğine dair anlayışımızı geliştirebilir ve kültürde villöz eksplantların canlılığının ve bütünlüğünün iyileştirilmesine dönüşebilir23.
Birkaç kritik protokol adımı tekrarlanmalı ve dikkatle yürütülmelidir. Plasental doğumdan sonra, doku mümkün olduğunca çabuk kültürlenmelidir. Eksplant hazırlığı sırasında, görünür enfarktüsleri olan alanlardan kaçınmak çok önemlidir. Sıkışmayı önlemek için eksplantların forseps ile nazikçe tutulması önemlidir. İşlem boyunca dokunun sıvı ile kapalı tutulması ve hızlı bir şekilde yürütülmesi önerilir.
Bu çalışmanın, sunulan akış sistemi içindeki kesin kesme gerilimini belirleyemediğini kabul etmek önemlidir, bu da gelecekteki araştırmalardabir sınırlama olarak düşünülmelidir 3,23. Bununla birlikte, in vivo belirli bir plasental villus için kesin akış hızının ve kayma geriliminin, intervillöz boşluğun geometrik özellikleri, villusun bu boşluk içindeki konumu ve maternal spiral arterlere ve uterus venlerine yakınlığı ve açısı gibi çok sayıda parametreden etkilendiğini kabul etmek önemlidir 3,19,23,32 . Plasentanın bireyler arasında değişen geometrik yapısının karmaşıklığı da dikkate alınmalıdır23,32. İntervöz boşluk32 içindeki kan akışını tahmin eden matematiksel modeller ve sinsityotrofoblast19,28 üzerindeki duvar kayma gerilimi hesaplamaları zaten mevcuttur. İlginç bir şekilde, bir çalışma, sinsityotrofoblast üzerindeki kayma geriliminin üçüncü trimesterde ilk trimester28'e kıyasla daha düşük olduğunu tahmin ederken, bir diğeri sinsitiotrofoblast19 üzerinde uzamsal olarak heterojen duvar kesme gerilimi gösterdi. Belirli bir plasental villus için kesin akış hızının ve kayma geriliminin belirlenmesi bir zorluk olmaya devam etmektedir 3,19,23,32. Bu tür hesaplamalar, gelecekteki araştırmalar için kayma gerilimi aralığının yaklaşık bir tahminini sunar, ancak devam eden anatomik ayarlamalar ve optimizasyon gerektirebilirler23. Ayrıca, gelecekteki çalışmalar, intervillöz uzayın karmaşık geometrisini ve deney başına örnek sayısını artırmak için stratejileri açıklayan yeni ve rafine akışlı kültür teknikleri geliştirebilir3. Potansiyel olarak alternatif akış odalarının kullanılmasıyla akış sisteminin devam eden ilerlemesi ve geliştirilmesi beklenmektedir (Brugger ve diğerleri, yayınlanmamış veriler, 2023).
Sonuç olarak, bu çalışma, kültürlenmiş villöz eksplantların yapısal bütünlüğünü koruyan, kolayca uygulanabilir bir ex vivo akış kültürü tekniği göstererek sağlam bir temel oluşturmaktadır. Plasental fonksiyonel biyoloji çalışmalarında dinamik tekniklerin önemini vurgulayarak, akış kültürü sistemlerinde daha fazla ilerlemenin ve yeni fikirlerin ve hipotezlerin üretilmesinin önünü açmaktadır 3,23.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Yazarlar, doku örneklemesi için Bettina Amtmann ve Petra Winkler'in mükemmel teknik desteğini minnetle takdir ediyorlar. Bu araştırma, Avusturya Bilim Fonu FWF (DOC 31-B26) ve Avusturya Graz Tıp Üniversitesi tarafından Gebelikte İnflamatuar Bozukluklar Doktora Programı (DP-iDP) aracılığıyla finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
| Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
| antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
| anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
| Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
| CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
| CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
| Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
| Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
| Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
| Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
| Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
| Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
| Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
| Metal plate with needles | In-house construction | ||
| Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
| Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
| Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
| Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
| QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
| SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
| Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
| Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
| TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
| UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
| UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
| Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |
References
- Villee, C. A. The metabolism of human placenta in vitro. Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: Approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. Placental villous explant culture 2.0: flow culture allows studies closer to the in vivo situation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7464 (2021).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell and Tissue Research. 328 (3), 607-616 (2007).
- Simán, C. M., Sibley, C. P., Jones, C. J. P., Turner, M. A., Greenwood, S. L. The functional regeneration of syncytiotrophoblast in cultured explants of term placenta. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 280 (4), R1116-R1122 (2001).
- Toro, A. R., et al. Leptin is an anti-apoptotic effector in placental cells involving p53 downregulation. PLoS ONE. 9 (6), e99187 (2014).
- Morley, L. C., Debant, M., Walker, J. J., Beech, D. J., Simpson, N. A. B. Placental blood flow sensing and regulation in fetal growth restriction. Placenta. 113, 23-28 (2021).
- Wang, Y. Z. S., Wang, Y., Zhao, S.
- Huppertz, B.
- Weiss, G., Sundl, M., Glasner, A., Huppertz, B., Moser, G. The trophoblast plug during early pregnancy: a deeper insight. Histochemistry and Cell Biology. 146 (6), 749-756 (2016).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Gude, N. M., Roberts, C. T., Kalionis, B., King, R. G. Growth and function of the normal human placenta. Thrombosis Research. 114 (5-6), 397-407 (2004).
- Wang, Y.
- Moser, G., Windsperger, K., Pollheimer, J., de Sousa Lopes, S. C., Huppertz, B. Human trophoblast invasion: new and unexpected routes and functions. Histochemistry and Cell Biology. 150 (4), 361-370 (2018).
- Kupper, N., Huppertz, B. The endogenous exposome of the pregnant mother: Placental extracellular vesicles and their effect on the maternal system. Molecular Aspects of Medicine. 87 (October 2020), 100955 (2022).
- Huppertz, B. IFPA award in placentology lecture: biology of the placental syncytiotrophoblast - myths and facts. Placenta. 31 (SUPPL), S75-S81 (2010).
- Gauster, M., Moser, G., Wernitznig, S., Kupper, N., Huppertz, B. Early human trophoblast development: from morphology to function. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (6), 345 (2022).
- Lecarpentier, E., et al. Fluid shear stress promotes placental growth factor upregulation in human syncytiotrophoblast through the cAMP-pKA signaling pathway. Hypertension. 68 (6), 1438-1446 (2016).
- Lecarpentier, E., et al. Computational fluid dynamic simulations of maternal circulation: wall shear stress in the human placenta and its biological implications. PLOS ONE. 11 (1), e0147262 (2016).
- Miura, S., Sato, K., Kato-Negishi, M., Teshima, T., Takeuchi, S. Fluid shear triggers microvilli formation via mechanosensitive activation of TRPV6. Nature Communications. 6 (1), 8871 (2015).
- Jauniaux, E., et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. The American Journal of Pathology. 157 (6), 2111-2122 (2000).
- Sodha, R. J., Proegler, M., Schneider, H. Transfer and metabolism of norepinephrine studied from maternal-to-fetal and fetal-to-maternal sides in the in vitro perfused human placental lobe. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 148 (4), 474-481 (1984).
- Kupper, N. Extracellular vesicles from advanced placental explant flow culture and their role in preeclampsia [Dissertation]. , Medical University of Graz, Austria. (2022).
- Burton, G. J., Fowden, A. L. The placenta: a multifaceted, transient organ. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1663), 20140066 (2015).
- Arora, N., Sadovsky, Y., Dermody, T. S., Coyne, C. B. Microbial vertical transmission during human pregnancy. Cell Host & Microbe. 21 (5), 561-567 (2017).
- Cheong, M. L., et al. A Positive feedback loop between glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCGβ expression and cell differentiation. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 197-209 (2016).
- Heisenberg, C. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Lee, T. C., Moulvi, A., James, J. L., Clark, A. R. Multi-scale modelling of shear stress on the syncytiotrophoblast: could maternal blood flow impact placental function across gestation. Annals of Biomedical Engineering. 51 (6), 1256-1269 (2023).
- Kamkin, A., Kiseleva, I. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. 49 (0), Academia. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21290773 (2005).
- Kluge, M. A., Fetterman, J. L., Vita, J. A.
- Boren, J., Brindle, K. M. Apoptosis-induced mitochondrial dysfunction causes cytoplasmic lipid droplet formation. Cell Death & Differentiation. 19 (9), 1561-1570 (2012).
- Chernyavsky, I. L., Jensen, O. E., Leach, L. A Mathematical model of intervillous blood flow in the human placentone. Placenta. 31 (1), 44-52 (2010).
