Summary
Näthinneproteser har förmågan att generera visuella uppfattningar. För att främja utvecklingen av nya proteser behövs ex vivo-metoder för att testa enheter före implantation. Den här artikeln ger ett omfattande protokoll för att studera kalciumaktivitet i retinala gangliecellskiktet när de utsätts för elektrisk stimulering.
Abstract
Retinal dystrofi är en ledande orsak till blindhet över hela världen. Omfattande arbete pågår för att utveckla avancerade näthinneproteser som kan kringgå de nedsatta ljusavkännande fotoreceptorcellerna i den degenererade näthinnan, med målet att delvis återställa synen genom att inducera visuella percept. En vanlig undersökningsväg är design och produktion av implanterbara enheter med en flexibel fysisk struktur, som rymmer ett stort antal elektroder. Detta möjliggör effektiv och exakt generering av visuella uppfattningar. Med varje tekniskt framsteg uppstår dock ett behov av en tillförlitlig och hanterbar ex vivo-metod för att verifiera produktens funktionalitet innan man går vidare till in vivo-experiment , där faktorer utöver produktens prestanda spelar in. Denna artikel presenterar ett omfattande protokoll för att studera kalciumaktivitet i retinala gangliecellskiktet (GCL) efter elektrisk stimulering. Specifikt beskrivs följande steg: (1) fluorescerande märkning av råttans näthinna med hjälp av genetiskt kodade kalciumindikatorer, (2) fånga fluorescenssignalen med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop samtidigt som man tillämpar distinkta mönster av elektrisk stimulering, och (3) extrahera och analysera kalciumspåren från enskilda celler inom GCL. Genom att följa denna procedur kan forskare effektivt testa nya stimuleringsprotokoll innan de utför in vivo-experiment .
Introduction
Näthinnan innehåller fotoreceptorer, som är celler som ansvarar för att känna av ljus. De fångar fotoner och omvandlar dem till nervimpulser. Dessa impulser bearbetas sedan i näthinnan och överförs till synbarken, vilket resulterar i bildandet av en visuell bild1. Retinitis pigmentosa (RP) och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är degenerativa sjukdomar som kännetecknas av progressiv förlust av fotoreceptorer. Dessa retinopatier är bland de främsta orsakerna till blindhet över hela världen1, påverkar miljontals individer och har betydande medicinska, personliga och socioekonomiska konsekvenser för patienter, hälso- och sjukvårdssystem och samhället som helhet. Dessutom, med den åldrande befolkningen, beräknas AMD-fallen öka med 15 % fram till 20502.
För närvarande pågår många forskningsinsatser för att återställa synen hos patienter som drabbats av dessa tillstånd3. Ett lovande tillvägagångssätt är användningen av näthinneproteser, som har visat sig vara effektiva när det gäller att delvis återställa synen 4,5. Dessa enheter fångar upp ljus från den visuella scenen och omvandlar det till elektriska pulser. Dessa pulser levereras genom elektroder i en mikroelektrodmatris (MEA) implanterad i ögat, vilket stimulerar de överlevande neuronerna och kringgår funktionen hos de förlorade fotoreceptorerna. De aktiverade retinala gangliecellerna (RGC) överför utsignalen till hjärnan, där den tolkas som visuell perception. De största begränsningarna för nuvarande implantat ligger dock i upplösningen av elektrod-vävnadsgränssnittet6 och den icke-selektiva stimuleringen av olika celltyper. För att optimera utformningen av nya implanterbara enheter för effektivare synåterställning är det därför avgörande att förstå hur stimuleringsparadigm kan utvecklas för att selektivt aktivera celler i närheten av elektroderna.
Kalciumavbildning är en allmänt använd teknik för att studera neural aktivitet, vilket ger flera fördelar jämfört med icke-optiska metoder 7,8. För det första ger det cellulär och subcellulär upplösning. För det andra kan kalciummarkörer rikta in sig på specifika celltyper. För det tredje möjliggör det långsiktig spårning, och för det fjärde möjliggör det observation av hela cellpopulationer samtidigt som man skiljer mellan aktiva och inaktiva celler. Denna metod ger indirekta bevis på cellulär aktivitet med en tidsupplösning i intervallet hundratals millisekunder. Genetiskt kodade fluorescerande kalciumindikatorer, såsom GCaMP-sensorer, genomgår en konformationsförändring vid bindning till kalcium, vilket resulterar i ökad fluorescens9. Rekombinanta adenoassocierade virala vektorer (AAV) är ett effektivt sätt att transducera näthinneceller med GCaMP10.
Detta protokoll presenterar en effektiv metod som använder kalciumavbildning för att testa stimuleringsprotokoll för näthinneimplantat. Specifikt fokuserar vi på ex vivo råtta retinal vävnad och ger detaljerade steg-för-steg-instruktioner, från provtagning till dataanalys. Genom att erbjuda denna omfattande guide kan forskare från olika bakgrunder ge sig ut på experiment med elektrisk stimulering med tillförsikt.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med standardiserade djuretiska riktlinjer (EU-direktiv 86/609/EU) och godkändes av de lokala djurförsöksetiska kommittéerna. 8 veckor gamla Long Evans-råttor användes för den aktuella studien. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning).
1. Förberedelse av media och planmontering
- Ames Medium (1 L)
- Kombinera Ames Medium-pulver, 1,9 g/L NaHCO3, 10 ml penicillin/streptomycin 100x och 1 l avjoniserat vatten i en 1 l glasflaska (se materialförteckning). Justera pH till 7,4 och osmolariteten till 280 mOsm med avjoniserat vatten eller NaHCO3. Sterilisera lösningen genom att filtrera den genom ett filter med en porstorlek på 0,2 μm under en huv.
OBS: Förvara det steriliserade mediet vid 4 °C. Denna lösning förblir stabil och kan användas i upp till 1 månad.
- Kombinera Ames Medium-pulver, 1,9 g/L NaHCO3, 10 ml penicillin/streptomycin 100x och 1 l avjoniserat vatten i en 1 l glasflaska (se materialförteckning). Justera pH till 7,4 och osmolariteten till 280 mOsm med avjoniserat vatten eller NaHCO3. Sterilisera lösningen genom att filtrera den genom ett filter med en porstorlek på 0,2 μm under en huv.
- Montering av membran
- Fäst ett poröst PTFE-membran (se materialförteckning) på en bricka med små droppar lim. Låt torka i minst 15 min.
- För att uppnå genomskinlighet, sänk ner membranen i 70 % etanol i 1 min.
- Skölj membranen två gånger med avjoniserat vatten för att helt ta bort etanolen. Förvara dem i avjoniserat vatten för att förhindra opacitet.
2. GCL-märkning och platt montering av råttnäthinnan
OBS: Denna märkningsmetod skiljer inte RGC från förskjutna amakrina celler. Om selektiv märkning av RGC önskas, överväg att använda AAV:er med RGC-specifika promotorer11 och/eller retrograd märkning genom synnerven12. För att skilja mellan klasser av ON- och OFF-center RGC, klassificera RGC:er baserat på deras ljusrespons13,14 och använd nyare versioner av genetiskt kodade kalciumindikatorer som erbjuder ökad känslighet och förmågan att mäta enkelverkande potentialer15.
- Intravitreal injektion
- Bedöva den 8 veckor gamla Long Evans-råttan med 2 % isofluran/1 % O2 tills det inte finns någon pedalreflex och bibehåll bedövningen med en näsmask på råtta (se materialförteckningen).
OBS: Under anestesi, placera djuret på en värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen. - Administrera en droppe kommersiellt tillgängliga ögondroppar (se materialförteckning) för att vidga pupillen.
- Innan du fortsätter med operationen, undersök ögat för avvikelser med hjälp av fundoskopi och optisk koherenstomografi (OCT) med ett in vivo retinalt avbildningssystem. Applicera en droppe Methocel 2 % för att underlätta kontakten mellan hornhinnan och objektivt kontakt (se materialförteckning).
OBS: Om några avvikelser upptäcks, fortsätt inte med de efterföljande stegen för det ögat. - Applicera en droppe Prescaine som lokalbedövning. Fixera ögonlocket och den limbala bindhinnan med ett kommersiellt tillgängligt suturfilament (se materialförteckning). Skapa en 1 mm sklerotomi 4 mm från limbus med hjälp av en 30 G nål.
- Fäst en 36 G trubbig nål på en precisionsspruta och injicera AAV-partiklarna med den genetiskt kodade kalciumindikatorn i glaskroppen i 30 s, i 45° vinkel. I den här studien använde vi AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 1011 GC/ml i HBSS) (se Materialförteckning).
AAV-konstruktioner som inte kodar för potentiellt tumörframkallande genprodukter eller toxinmolekyler och som produceras utan hjälparvirus kan hanteras i BSL-1-anläggningar (Biosafety Level 1). Annars, om det anses vara biologiskt farligt material under BSL-2-inneslutning, måste lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas16. AAV:er som kodar för GCaMP anses vara BSL-1 och kräver inte manipulation under biosäkerhetsskåp.
- Fäst en 36 G trubbig nål på en precisionsspruta och injicera AAV-partiklarna med den genetiskt kodade kalciumindikatorn i glaskroppen i 30 s, i 45° vinkel. I den här studien använde vi AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 1011 GC/ml i HBSS) (se Materialförteckning).
- Applicera en droppe Tobradex (se materialförteckning) för att förebygga inflammation och som antibiotikaprofylax.
- Om så önskas, upprepa steg 2, 3 och 4 med det andra ögat.
OBS: Kontrollera djuren 12-24 timmar efter operationen för att säkerställa att det inte finns några biverkningar. - Tre dagar efter injektionen, undersök näthinnans struktur med fundoskopi och OCT med ett in vivo retinalt avbildningssystem (se materialtabell).
- Två veckor efter injektionen bör GCL avge fluorescens. Bedöma näthinnans struktur och AAV-uttryck genom fluorescensfundoskopi med hjälp av ett in vivo retinalt avbildningssystem.
OBS: Enligt Weitz et al.12 blir fluorescens från AAV2-CAG-GCaMP5G märkbar 1 vecka efter injektion och intensifieras med 2 veckor. Från och med den fjärde veckan inducerar överuttryck av GCaMP cytomorbiditet. Döende celler uppvisar en hög fluorescenssignal i kärnan och cytoplasman som inte fluktuerar som svar på stimulering. I friska celler är GCaMP-uttrycket begränsat till cytoplasman och uteslutet från kärnan 7,8,12,17,18. Dessa egenskaper kan observeras ex vivo under mikroskopiavbildning. Fönstret för genuttryck kan variera beroende på virusvektorn och vald promotor.
- Bedöva den 8 veckor gamla Long Evans-råttan med 2 % isofluran/1 % O2 tills det inte finns någon pedalreflex och bibehåll bedövningen med en näsmask på råtta (se materialförteckningen).
- Näthinneexcision och platt montering
OBS: Två till tre veckor efter injektionen avlivas intravitrealt injicerade råttor omedelbart innan det elektrofysiologiska protokollet börjar, i enlighet med standardiserade etiska riktlinjer (EU-direktiv 86/609/EU) och godkända av lokala etiska kommittéer. Inandning av koldioxid (CO2) används som metod för avlivning i detta protokoll.- Ögonenukleation
- Tryck försiktigt på utsidan av orbiten med en böjd pincett för att sticka ut ögat något från ögonhålan.
- Använd en fjädersax för att klippa av musklerna som håller ögat och enukleera det, var noga med att inte punktera ögongloben.
OBS: Från och med detta steg, dissekera näthinnan under ett stereomikroskop i syresatt (95 % O2 / 5 % CO2) Ames Medium.
- Excision av näthinnan
- Använd en liten böjd pincett och en fin fjädersax för att ta bort all omgivande vävnad från ögongloben.
- Ta en bit på cirka 3 cm x 3 cm filterpapper och lägg den på locket på en 3,5 cm form. Blötlägg pappret med Ames Medium.
- Placera ögongloben ovanpå papperet, med det främre segmentet vänt mot operatören. Använd en rak pincett för att hålla ögongloben och placera dem ovanpå ora serrata i ungefär 45° vinkel från skålens yta. Gör ett litet snitt med ett blad och använd utrymmet mellan den raka pincetten som referens.
- Återbetala ögongloben till Ames Medium. Använd en rak pincett och en fin fjädersax för att separera de främre och bakre segmenten av ögat.
- Ta försiktigt bort linsen med två par raka pincetter. Separera sedan näthinnan från sklera.
- Klipp sclera mot synnerven med en fin fjädersax tills näthinnan är isolerad från ögonmusslan.
- Använd ett fluorescensstereomikroskop för att identifiera det område i näthinnan med det bästa kalciumindikatoruttrycket.
OBS: Omfattningen av virusspridningen beror på framgången med den intravitreala injektionen. Att uppnå fluorescens över stora delar av näthinnan kan kräva övning. Utredarens erfarenhet spelar en avgörande roll för att få optimala resultat. - Använd en plastpipett med skuren spets och överför den valda delen av näthinnan till monteringsmembranet (monteringsmembransteg). Använd en rak pincett för att platta näthinnan med GCL uppåt.
- Med en plastpipett fäst vid en 100 μL pipettspets tar du bort mediet så att näthinnebiten kan fästa vid det porösa membranet. Vänd enheten på MEA så att GCL vilar ovanpå elektroderna.
- Fyll provbadet med syresatt Ames Medium.
- Ögonenukleation
3. Ex vivo kalciumavbildning vid elektrisk stimulering
OBS: I detta arbete användes en proof-of-concept MEA för ex vivo-experiment . De anpassade MEA:erna tillverkades med porösa grafenbaserade elektroder med en diameter på 25 μm på 500 μm tjockt borosilikatglas med Ti/Au-spår och isolerades senare med kiselnitrid och SU-8 fotoresist12. Kalciumavbildningsmetoderna är dock giltiga oavsett vilket elektrodmaterial som används för stimulering.
- Ställ in perfusionssystemet så att det syresatta Ames' Medium konstant perfusionerar provbadet vid 33 °C med en konstant flödeshastighet på 5 ml/min.
- Använd ett inverterat fluorescensmikroskop utrustat med ett lysrör, en FITC-filterkub och en CMOS-kamera, inspektera näthinnan för ett område där de stimulerande elektroderna och fluorescensen från GCaMP-uttryckande celler är synliga. Ett 20x NA 0,75 luftobjektiv användes för denna studie.
OBS: För att effektivt stimulera (och registrera) cellerna med elektroderna måste näthinnan och elektroden vara i nära kontakt. Således är cellerna synligt i samma fokalplan som elektroderna. Om så inte är fallet, upprepa stegen för näthinneexcision från steg 8 och framåt. När du använder näthinnor från friska djurmodeller (med fungerande fotoreceptorer), observera att varje gång lysröret slås på kommer det att finnas några framkallade svar som genereras av ljuset eftersom näthinnan är ljuskänslig för den våglängd som används för att excitera GCaMP-sensorn. Dessa ljusinducerade kalciumförändringar kan användas för att bedöma vävnadens hälsostatus. För att undvika att blanda ljus med elektriskt framkallade svar, slå på lysröret lamp minst 1 minut innan du påbörjar bildtagningen. - För att framkalla elektriskt framkallade svar i GCL, välj en elektrod för att skicka strömstyrda pulser. Ställ in de elektriska stimuleringsparametrarna i programvaran för pulsgeneratorenheten, såsom: form, amplitud, varaktighet, fasfördröjning och frekvens för pulser som ska appliceras.
OBS: Effektiva stimulusparametrar kan variera kraftigt från pulsbredder på 50 μs till 100 ms, med amplituder från 0.1 μA till 10 μA. Dessa parametrar, tillsammans med stimulusfrekvens, stimuluspolaritet, antal pulser och interfasfördröjningar, kan påverka den spatiotemporala responsen som observeras med kalciumavbildning 19,20,21,22. Ett tåg med 40 bifasiska pulser som levererar 1 ms, 2 μA-stimulering genererar ofta ett synligt svar i märkta neuroner. - För att synkronisera bildinsamlingen med stimuleringsleveransen, använd pulsgeneratorn som en extern utlösare för att styra starten av bildinsamlingen. Anslut kameran (se materialtabell) till pulsgeneratorn med hjälp av utgångstriggersignalen och ställ in "Capture Mode" för kamerans programvara på "External Start Trigger". Tryck på Start i kamerans programvara så att den väntar på att en extern utlösare ska starta. Starta bildinsamlingen med pulsgeneratorns programvara.
OBS: Den externa triggerkontrollen kan ställas in på olika sätt för olika kameror. Denna studie tog vanligtvis bilder (512 x 512 pixlar, 16-bitars gråskala) med 10 bilder per sekund i 1 minut samtidigt som de gav skurar av bifasiska pulståg var 10:e sekund. Pulsleveransen börjar efter 10 s, så de första bilderna i alla experiment motsvarar spontan aktivitet. Beroende på GCaMP-sensorn och analysen man kommer att utföra, kan man behöva justera registreringshastigheten efter uppgångs- och avklingningstiderna för din kalciumindikator8. Tänk på känsligheten för att detektera enstaka aktionspotentialer för kalciumindikatorn15. - Spara bilderna med ett filnamn som innehåller de elektriska stimuleringsparametrarna som tillämpas, till exempel [Elektrodnummer]_[Pulsamplitud]_[Pulslängd]_[Pulsfrekvens]_Image001.
4. Analys av data
- ImageJ/FIJI för att extrahera fluorescensintensitetsprofilen över tid och de rumsliga koordinaterna från cellsomorna
- Segmentera intresseområdet (ROI) med "Verktyg för områdesval" och lägg till det i ROI Manager (Analysera > verktyg > ROI Manager > Lägg till). Från ROI Manager-menyn sparar du den som en .zip mapp (Mer > Spara).
OBS: Vanligtvis kan samma ROI tillämpas på alla stimuleringsexperiment eftersom de motsvarar samma FOV. - Välj "Medelvärde för grått" som den parameter som ska extraheras (Analysera > Ställ in mätningar).
- Extrahera "Medelvärde för grått" från cellsoma genom att klicka på Mer > Multimått. En dialogruta visas. Aktivera alternativen Mät alla 600 sektorer och En rad per sektor för att få en enda tabell där kolumner motsvarar ROI och rader motsvarar tidsramar. Spara den genererade tabellen som ett .xls kalkylblad.
- Välj "Centroid" som den parameter som ska extraheras (Analysera > Ställ in mätningar).
- Extrahera "Centroid" från ROI genom att klicka på Mät. Den genererade tabellen motsvarar koordinaterna (X,Y) för ROI:erna. Spara den som ett .xls kalkylblad.
- Segmentera intresseområdet (ROI) med "Verktyg för områdesval" och lägg till det i ROI Manager (Analysera > verktyg > ROI Manager > Lägg till). Från ROI Manager-menyn sparar du den som en .zip mapp (Mer > Spara).
- Specialbyggt skript för att identifiera celler som svarar på stimuli
OBS: MATLAB (se Materialtabell) användes här, men de beskrivna stegen kan uppnås i vilket programmeringsspråk som helst. Användare kan få vårt specialbyggda skript genom att begära motsvarande författare.- Korrigering av fotoblekningseffekt: För att mildra bakgrunden och fotoblekningseffekten, ta 15-20 bilder från de icke-stimulerande perioderna före varje burst och anpassa dem till en linjär kurva [fit (poly1)].
OBS: I det här fallet, för en film med totalt 600 bilder där periodiska skurar av pulståg skickades var 10:e sekund, betraktades bildrutorna 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 som icke-stimulerande perioder. - Normalisera med formeln: (X-min) / (max-min)
- Identifiering av svarande celler
- Beräkna kvadratroten ur medelvärdet (RMS) för de icke-stimulerande perioderna från normaliserade data. Detta kommer att betraktas som baslinjesignalen.
- Beräkna det maximala av de stimulerande perioderna (ramar mellan de icke-stimulerande perioderna). I det här fallet, för en film med totalt 600 bilder där periodiska skurar av pulståg skickades var 10:e sekund, betraktades bildrutorna 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569 som stimulerande perioder.
- Om det maximala värdet överstiger baslinjesignalen med 2,5 gånger för en specifik ROI, tagga cellen som svarar på den stimulerande perioden. Om cellen svarar på tre av de fem stimuleringsperioderna, klassificera den som en svarande cell.
- Korrigering av fotoblekningseffekt: För att mildra bakgrunden och fotoblekningseffekten, ta 15-20 bilder från de icke-stimulerande perioderna före varje burst och anpassa dem till en linjär kurva [fit (poly1)].
Representative Results
Protokollet som beskrivs i denna studie är baserat på fluorescensavbildning och elektriska stimuleringsstudier utförda av Weitz et al.12. Protokollet består av tre huvuddelar: (1) fluorescerande märkning av GCL och platt montering av näthinnan på MEA (figur 1 till vänster), (2) visualisering av kalciumaktivitet i GCL under elektrisk stimulering (figur 1 i mitten) och (3) extraktion, bearbetning och tolkning av bilddata (figur 1 till höger).
För det första, som visas i figur 1 till vänster, injiceras Long Evans-råttor intravitrealistiskt med AAV2-CAG-GCaMP5G före avbildningssessionen. Det optimala virusuttrycket för denna vektor inträffar 2 till 3 veckor efter injektion12,18. Efter att djuret har sövts helt görs ett pilothål med hjälp av en 30 G nål, och sedan injiceras 5 μL AAV2-CAG-GCaMP5G långsamt i glaskroppen med hjälp av en 36 G trubbig nål fäst vid en precisionsspruta för att förhindra reflux. Under viral expression används ett in vivo retinalt avbildningssystem för att bedöma näthinnans tillstånd efter operationen, med OCT-bilder som ger detaljerad visualisering av näthinnelagren. När genuttrycket har uppnåtts extraheras näthinnan försiktigt från ögonmusslan med hjälp av ett stereomikroskop och dissektionsverktyg med hög precision. Från och med denna tidpunkt manipuleras vävnaden i syresatta medier för att bevara provet. Den utskurna näthinnan, med GCL uppåt, monteras sedan på en plattform som är utformad för platt montering för att säkerställa stabilitet och förhindra att provet flyter. Provet är monterat på MEA-ytan med GCL vänd mot elektroderna.
Därefter monteras MEA på sitt gränssnittskort på ett inverterat fluorescerande mikroskop (figur 1-mitten). Näthinneprovet perfunderas med syresatta medier vid 33 °C med hjälp av ett perfusionssystem. Exemplet kan underhållas i den här konfigurationen i flera timmar. Det önskade stimuleringsschemat programmeras och bilder tas med en hastighet av 10 bilder per sekund. Det rekommenderas att namnge filmerna enligt de tillämpade elektriska stimuleringsparametrarna. Bildinsamlingen bör påbörjas innan stimuleringen påbörjas för att få några baslinjebilder utan stimulering, vilket kommer att fungera som en negativ kontroll.
Slutligen, som illustreras i figur 1 till höger, extraheras data från time-lapse-bilderna genom att segmentera cellsomas. Fotoblekningseffekter korrigeras genom anpassning av data och responsiva celler identifieras. Responsiva celler definieras som de med fluorescenstoppar under stimulering som överstiger deras baslinje med 2,5 gånger. Om en cell svarar på tre av de fem stimuleringsskurarna anses den svara på den specifika stimuleringssekvensen.
Figur 1: Översikt över studien. Schematisk illustration av protokollet för (vänster) fluorescerande märkning av näthinnans GCL och provmontering, (mitten) förberedelse för ex vivo-inspelningar med elektrisk stimulering tillhandahållen av en MEA, och (höger) analys av kalciumavbildningsdata för att klassificera responsiva celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Intravitreal-injicerad näthinna
Incidensen av komplikationer i samband med intravitreala injektioner är mycket låg. Det finns dock vissa komplikationer som kan uppstå från själva operationen, oavsett vilken komponent som injiceras. Dessa komplikationer inkluderar kataraktbildning, glaskroppsblödning, förhöjt intraokulärt tryck och endoftalmit23. För att avgöra om dessa komplikationer orsakas av operationen måste djuret genomgå utvärdering före ingreppet med hjälp av fundusskopi och OCT. Tre dagar efter injektionen ska djuren följas upp. I figur 2A-D visas näthinnan hos ett friskt injicerat djur. Efter två veckors injektion börjar RGC uttrycka fluorescens, vilket kan visualiseras med hjälp av fluorescensfundoskopi (Figur 2B,C). OCT-bilder ger detaljerad visualisering av näthinneskiktens disposition och tjocklek (figur 2D), vilket ger högre upplösning jämfört med fundusskopi, särskilt vid bedömning av näthinneavlossning. När näthinnan är plattmonterad och avbildad med ett inverterat fluorescensmikroskop blir det möjligt att urskilja cellerna och axonbuntarna. Till skillnad från andra kalciumindikatorer är GCaMP-indikatorn begränsad till cytoplasman7, och fluorescens utesluts från kärnan (Figur 2E).
Figur 2: Representativa bilder av den intravitreala injicerade näthinnan. (A) Fundoskopi, (B) fluorescensfundoskopi, (C) inzoomning av fluorescensfundoskopin, (D) OCT-bild, och (E) epifluorescensbild av den utskurna näthinnan monterad på en anpassad MEA med grafenbaserade elektroder på 500 μm tjockt borosilikatglas. I (E) motsvarar svarta linjer Ti/Au-spår. Skalstreck: 115 μm (D) och 100 μm (E). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Elektroder och GCL-kontakt
För att framkalla neurala reaktioner effektivt är det avgörande att se till att den plattmonterade näthinnan är i nära kontakt med ytan på MEA. Ett enkelt sätt att verifiera detta är genom att visuellt bekräfta om cellerna och elektroderna är placerade i samma fokalplan (Figur 3A). Om cellerna inte befinner sig i samma fokalplan som elektroderna (Figur 3B) indikerar det att kontakten är suboptimal, vilket kommer att resultera i mindre effektiv stimulering.
Figur 3: Elektroder och GCL-kontakt. (A) Celler och elektroden (asterisk) i samma fokalplan. (B) Celler och elektroder som inte befinner sig i samma fokalplan, vilket indikerar suboptimal kontakt för elektrisk stimulering i det området. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Ex vivo kalciumavbildning vid elektrisk stimulering av en MEA-mottagning
De resulterande data från kalciumavbildning består av time-lapse-bilder som övervakar den neurala aktiviteten hos hundratals celler som svar på elektrisk stimulering. Supratröskelstimuli orsakar ett kalciuminflöde i cellsoma, vilket resulterar i en plötslig förändring av fluorescensintensiteten (Video 1). Detta protokoll gör det möjligt att avgöra om en elektrod-, MEA- och/eller stimuleringsalgoritm framkallar det önskade svaret i neural vävnad. Storleken och tonhöjden på elektroderna på MEA, liksom andelen vävnad som studeras, kommer att avgöra vilken objektiv förstoring som är lämplig att välja. För studier av stimulering av en elektrod med diametrar från 5 μm till 100 μm är vanligtvis en objektiv förstoring på 20–25x lämplig (figur 4A), vilket ger ett synfält på cirka 600 μm x 600 μm. För experiment som involverar stimulering med flera elektroder kan en 4-10x objektivförstoring vara nödvändig för att bedöma ett större område på cirka 2 mm x 2 mm. Responsiva celler kan enkelt identifieras genom att generera en bildprojektion med standardavvikelse av timelapse-filmen (figur 4B och video 1).
Figur 4: Kalciumavbildning av GCL med elektrisk stimulering från en elektrod med en diameter på 25 μm. (A) Maximal projektion av en 60 s time-lapse-film och (B) standardavvikelseprojektion som tydligt visar celler som svarar på elektriska stimuli från en porös grafenbaserad elektrod med en diameter på 25 μm. Stimulerande elektroden är markerad med en asterisk. Skalstapel: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Analys av kalciumdynamiken över tid vid kontrollerad stimulering
För varje identifierad cellsoma extraherades de genomsnittliga intensitetsvärdena över tid. Figur 5A visar de fotoblekningskorrigerade kalciumspåren från de responsiva cellerna. I det här exemplet levererades fem skurar av bifasiska pulståg (katodiskt först, 40 cykler, 1 ms varaktighet, 2 μA amplitud) var 10:e sekund (indikerad med svarta linjer) under en 60 sekunders bildtagning. Inom ett givet experiment används samma fem pulståg för att testa konsistensen i svaret. De bildrutor som tas under de icke-stimulerande perioderna (markerade i rött) används för att utföra en linjär passning och korrigera för fotoblekningseffekten.
När de svarande cellerna har identifierats, och deras koordinater (x,y) är kända i förhållande till stimulerande elektroden, kan man undersöka förhållandet mellan den ström som krävs för att aktivera cellerna och avståndet från den stimulerande elektroden (figur 5B). Som förväntat kräver celler som ligger närmare den stimulerande elektroden lägre strömvärden för att framkalla ett svar.
Figur 5: Representation av de elektriskt framkallade svaren. (A) Kalciumspår av cellsoma vid 5 skurar av pulståg (bifasisk, kathodisk först, 40 cykler, 1 ms varaktighet, 2 μA amplitud) var 10:e sekund (svarta linjer) under en 60 s bildtagning. Icke-stimulerande (rödmarkerade rutor) och stimulerande perioder (gulmarkerade rutor) visas. Spår som överstiger baslinjesignalen (kvadratroten ur medelvärdet av de icke-stimulerande perioderna) med 2,5 gånger anses vara framkallade svar. Celler som svarar i tre av de fem stimuleringsperioderna klassificeras som svarande celler. (B) Karta över fördelningen av kalciumaktivitet som visar stimulerande elektroden (svart konturerad cirkel) och celler (grå konturerad cirkel). Färgkoden representerar den minsta pulsamplitud som krävs för att framkalla ett cellulärt svar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Kalciumavbildning av GCL med elektrisk stimulering från en elektrod med en diameter på 25 μm. Videon visar skillnader i fluorescensintensitet på grund av elektrisk stimulering från en porös grafenbaserad elektrod med en diameter på 25 μm. Den vänstra sidan visar originalfilmen, och den högra sidan visar standardavvikelseprojektionen där svarande celler lätt kan identifieras. Skalstapel: 50 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Protokollet som beskrivs här tjänar till att studera kalciumdynamiken som uppstår i råttans retinala GCL vid elektrisk stimulering försedd med en MEA. Det är en pålitlig och hanterbar metod men kräver viss utbildning, särskilt för att enhetligt märka GCL effektivt och för att montera näthinnan ordentligt för att säkerställa optimal kontakt mellan vävnad och elektrod. Detta protokoll är specifikt för gnagare och måste anpassas om det tillämpas på en annan laboratorieart. Metodens kritiska punkter, modifieringar och begränsningar presenteras i detalj.
Intravitreala injektioner
Injektioner används i stor utsträckning för okulär genleverans, med intravitreala injektioner som det föredragna förfarandet. De har visat sig vara säkrare och mindre invasiva jämfört med subretinala injektioner, som introducerar molekylerna av intresse direkt mellan fotoreceptorerna och näthinnans pigmentepitel (RPE), vilket riskerar näthinneavlossning10. Det finns dock begränsningar, särskilt när man utför dessa injektioner i gnagarmodeller. Glaskroppen är geléartad och hindrar viral spridning. Dessutom är linsen i gnagarögon stor, vilket gör det inte trivialt att föra in nålen utan att repa den. Precisionssprutnålarna är ömtåliga och måste bytas ut ofta. För att förhindra hinder, tvätta dem med avjoniserat vatten före och efter varje användning och byt ut dem regelbundet. Injicera dessutom innehållet långsamt för att förhindra återflöde av lösningen och förändringar i det intraokulära trycket. Att uppnå stor och enhetlig fluorescens över näthinnan kan kräva övning.
Transduktion av näthinneceller
Virala vektorer är en utmärkt metod för in vivo-genleverans, och AAV har använts i stor utsträckning för att transducera näthinneceller10. De har godkänts som behandling för vissa retinopatier som orsakar blindhet hos människor. Deras bärarkapacitet är dock begränsad till 5 kb, inklusive de nödvändiga rättsliga elementen (t.ex. initiativtagaren)10,25. Det finns flera serotyper tillgängliga, var och en med olika tropism. Välj den lämpligaste AAV:n baserat på de gener som ska levereras och de celler som ska transduceras26. För märkning av RGC:erna rekommenderas att du använder AAV227.
Fönster för genuttryck
Det optimala virusuttrycket för AAV2-CAG-GCaMP5G är 2 till 3 veckor efter injektion12,18. Efter den tidsramen blir kärnorna från transfekterade celler fluorescerande, cellerna slutar svara på stimuli och dör slutligen 7,28,29. Detta beror på överuttrycket av GCaMP-indikatorn, som translokeras in i kärnan. Tidsfönstret för optimalt genuttryck kommer att variera beroende på virusvektorn och den valda promotorn30 och måste bestämmas experimentellt innan man fortsätter med detta protokoll.
Kontakt mellan vävnad och elektrod
För optimala och reproducerbara resultat är det avgörande att uppnå god kontakt mellan vävnad och elektrod. Dålig kontakt beror vanligtvis på näthinnans naturliga krökning. Ett tillvägagångssätt är att skära näthinnan i fjärdedelar, montera och avbilda en sektion i taget. Små delar av näthinnan kan plattas till bättre, vilket resulterar i effektivare kontakt med MEA:s yta. En annan potentiell orsak till dålig kontakt är förekomsten av glasaktig humor. När man utför stimuleringsexperiment som simulerar ett epi-retinalt implantat är det viktigt att försiktigt ta bort glaskroppen under näthinneexcision eftersom den kan fungera som en isolator för ström. Här beskrivs en enkel metod för att kontrollera om kontakten är tillräcklig genom att visualisera elektroden och cellerna i samma fokalplan.
Ett alternativ till ex vivo retinala mätningar är att odla neuroner direkt på elektrodernas yta. Primär odling av nervceller, såsom hippocampusnervceller31, kan vara användbar för inledande tester för att utvärdera funktionaliteten hos den nya stimulerande anordningen. Detta tillvägagångssätt kräver dock fortfarande användning av försöksdjur och representerar inte komplexiteten i näthinnans nätverk, vilket är viktigt för att utvärdera synaptiska svar på stimulering.
För att visualisera cellerna under elektroden och elektrodspåren kan MEA tillverkade med transparenta material som indiumtennoxid (ITO) användas 19,20,32. Förutom optiska mätningar kan GCL-aktivitet vid elektrisk stimulering bedömas genom elektriska inspelningar. MEA kan användas för att registrera vävnadens lokala fältpotential (LFP). Detta äventyrar dock den rumsliga upplösningen, eftersom varje elektrod fångar upp aktivitet från flera celler samtidigt (beroende på elektroddimensionerna). Optisk inspelning övervinner denna begränsning och erbjuder mappning med högre rumslig upplösning. Dess främsta fördel är förmågan att skilja mellan aktiva och inaktiva celler samtidigt som man mäter ett stort synfält med encellsupplösning. Bland alla rapportörer av cellulär aktivitet är kalciumindikatorer väl beskrivna och används oftast33.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden att lägga till manuskriptet.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandra Ortonobés Lara och Alina Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) för deras tekniska support, till Anna Duarri (VHIR, Vall d'Hebron Institute of Research) från Ophthalmology Research group för deras stöd med intravitreala injektioner och in vivo retinal avbildning.
De finansiärer som har stött detta arbete är: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa-programmet för spetsforsknings- och utvecklingscentrum (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya genom CERCA-programmet; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr 871124); La Caixa-stiftelsen (LCF/HR19/52160003); och Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | - |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | - |
| 30 G needle | VWR | 613-5373 | - |
| 36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | - |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | - |
| AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | - | - |
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | - |
| Blade | Swann-morton | 0308 | - |
| Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | - |
| Carbogen | Air liquide | - | - |
| Curved-forceps | - | - | - |
| Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | - |
| FITC filter cube | Nikon | Standard series | - |
| Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | - |
| Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | - |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | - |
| ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | - |
| In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | - |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | - |
| Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | - | - |
| Long-Evans rat | Janvier | - | - |
| MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | - | - |
| Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | - |
| Methocel 2% | Omni Vision | - | - |
| Microelectrode array (MEA) | - | Custom-made | |
| NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | - |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | - |
| Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
| Plastic pipette | VWR | 612-1793 | - |
| Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | - |
| Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | - |
| Prescaina | Llorens | - | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
| Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | - |
| Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | - |
| Spring-scissors | FST | 15040-11 | - |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | - |
| Straight forceps | FST | 11252-20 | - |
| Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
| Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | - | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
| Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
| Washer | Thorlabs | W8S038 | - |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections. British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).
- Li, J. Q., et al. Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).
- Roska, B., Sahel, J. A.
- Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. Implantable Sensor Systems for Medical Applications. , Elsevier. 469-496 (2013).
- Lewis, P. M., et al. Advances in implantable bionic devices for blindness: a review. ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).
- Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision. Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
- Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. The ocular gene delivery landscape. Biomolecules. 11 (8), 1135 (2021).
- Hanlon, K. S., et al. A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse. Nature. 529, 345-350 (2016).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615, 884-891 (2023).
- Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K.
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chang, Y. -C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system. Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018 (2017).
- Weitz, A. C., et al. Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration. Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).
- Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction. Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017 (2019).
- Im, M., Fried, S. I. Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type. Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002 (2016).
- Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).
- Ramos, M. S., et al. Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors. Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy. Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).
- Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. Developing new vectors for retinal gene therapy. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291 (2023).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Hellström, M., et al. Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection. Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).
- Yang, Y., et al. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP. Nature Communications. 9, 1504 (2018).
- Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters. Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).
- Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis. Journal of Visualized Experiments. 184, e63829 (2022).
- Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
