Summary
这份手稿详细介绍了一种优化的接种方案，该方案使用分离的玉米叶鞘对玉米与真菌植物病原体的相互作用进行可重复的细胞学、生理学和分子学研究。叶鞘有助于实时观察未固定组织中活植物和真菌之间的细胞相互作用。
Abstract
我们优化了一种方案，用半生物营养和坏死性叶面病原真菌接种玉米叶鞘。该方法从最初应用于水稻叶鞘的方法进行了修改，并允许直接在显微镜下观察活植物细胞中的真菌生长和发育。从具有两个完全出现的叶领的玉米幼苗收集的叶鞘接种20μL滴5×105 孢子/ mL真菌孢子悬浮液，并在连续荧光下在23°C的湿度室中孵育。24-72小时后，用剃须刀片去除多余的组织，留下单层表皮细胞，这是一种光学透明的样品，可以直接成像，无需化学固定或清除。植物和真菌细胞在实验期间保持活力，相互作用可以实时可视化。可以对鞘进行染色或进行等离子体分解，以研究感染和定植过程中宿主和病原体细胞的发育细胞学和活力。转化为表达荧光蛋白的真菌菌株可以接种或共接种在鞘上，以提高分辨率并促进竞争或协同相互作用的评估。表达荧光融合蛋白的真菌菌株可用于跟踪和量 化植物中这些单个蛋白的产生和靶向。可以提取接种的鞘组织以表征核酸、蛋白质或代谢物。这些鞘测定的使用极大地推进了对玉米真菌致病机制以及真菌蛋白效应物和次生代谢物的详细研究。
Introduction
细胞水平的空间和时间分析对于理解真菌-植物相互作用的生理学和细胞学至关重要。过去曾使用化学固定的叶面组织 1,2,3 或清除和染色 4 以及人造膜5 来研究叶面病原体发育和植物-真菌相互作用的细胞学。然而，由于与制备用于成像的光学透明样品相关的技术问题，在不固定或清除的情况下实时研究活体宿主组织中的感染事件具有挑战性。
1940 年代后期开发了一种分离的叶鞘接种方案，用于明场显微镜研究活水稻表皮细胞对稻瘟病真菌 Magnaporthe oryza6 的抗性。最近，通过将这种叶鞘方法的改良版本与表达荧光蛋白的真菌转化体相结合，以及高性能活细胞成像方案（包括落射荧光和共聚焦显微镜）7,8,9,10，11,12,13.
本文详细介绍了一种优化的接种方案，该方案使用分离的玉米叶鞘来观察半生物营养和坏死性叶面真菌病原体的感染过程。我们专门用它来研究炭疽病叶枯病和茎腐病的病原体禾本科菌（C. graminicola）和引起双枯病叶枯病和茎腐病的Stenocarpella maydis。但该方法应适用于其他半生物营养性和坏死性叶面真菌病原体。这些切除的叶鞘在感染和定植事件期间的细胞学和生理反应与整个叶片中的细胞学和生理反应相似12,14,15。此外，禾谷梭菌对鞘状表皮细胞的半生物营养定植类似于茎髓细胞的定植16,17。与叶片或茎髓组织相比，分离的鞘显示出更大的真菌渗透和定植的同步性和实验可重复性14,16,17,18。大多数玉米品种可用于该协议。然而，鞘中紫色颜料过多的近交系或杂交种不太合适，因为颜料会干扰成像。金禧甜玉米对我们的研究特别有用，因为未经处理的种子是市售的，植物极易受到许多叶面病害的影响，而且它们在温室中生长良好。1970 年代，美国炭疽病茎腐病的第一次流行导致印第安纳州甜玉米作物完全损失19,20。这种叶鞘接种方法可用于直接观察和量化活细胞与局部杀死的植物细胞中的真菌生长和发育，以证明对真菌感染的相容/不相容反应中的抗性反应，并实时测试同一鞘上的真菌菌株之间的相互作用。
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Protocol
注：该方法的工作流程如 图1所示。
图1：使用分离的玉米叶鞘优化接种方案的步骤。 孢子悬浮液制备、叶鞘接种和活细胞显微镜样品制备分别以绿色 （A）、紫色 （B） 和橙色 （C） 框突出显示。用 BioRender.com 创建。 请点击这里查看此图的较大版本.
1.植物和真菌材料
- 植物生长
- 在SC10容器（见材料表）的温室（14小时光照/ 27°C和10小时黑暗/ 22°C）中种植玉米幼苗（见材料表）。使用由三份商业盆栽土（见材料表）和两份蒸汽灭菌表土组成的生长培养基。
- 每天早上用高架灌溉系统给幼苗浇水 2 分钟。
- 通过在土壤水平上切割幼苗，在 V2 阶段收获幼苗。当幼苗高 5 至 10 厘米并有两片可见的有领叶时，达到 V2 生长阶段21.
- 用湿纸巾包裹植物，然后将它们放入塑料袋中，以便运送到实验室进行进一步处理。
- 真菌培养物
- 通过在适当的琼脂培养基上撒上约50粒受感染的二氧化硅，在无菌条件下22重新激活储存的真菌二氧化硅原料培养物。为了避免形态变化和致病性丧失，传代菌株在重新激活后不超过 3 倍。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA;见 材料表）通常用于培养 禾谷梭 菌，而燕麦琼脂（OA;见 材料表）用于 培养梅迪斯葡萄球菌。
- 为了制备用于培养真菌储备液的PDA，将19.5g商业制备的脱水PDA悬浮在500mL去离子（DI）水中。为了制备OA，将36g商业制备的脱水OA在去离子水中煮沸15-30分钟，过滤三层粗棉布，并用去离子水将滤液带入500毫升。高压灭菌培养基进行灭菌。
- 在处理转化菌株时，用适当的抗生素（例如潮霉素 B、遗传素）增强熔融的冷却培养基。500 mL 培养基中潮霉素或遗传素的最终浓度分别为 250 μg/mL 和 100 μg/mL。
- 在最佳条件下孵育培养物，直到孢子菌丝体发育。 Colletotrichum graminicola 和 S. maydis 在 23 °C 下生长良好，具有连续荧光和环境湿度水平。孢子形成发生在接种后 7 天 （dai） （S. maydis ） 或 14 dai （ C. graminicola） 接种后 14 天。
2.叶鞘接种
- 玻璃棉过滤单元总成
- 使用重型剪刀或剪刀剪掉盖子，距离 1.5 mL 微量离心管的锥形底部约 0.5 毫米（参见 材料表）。
- 将一块玻璃棉（约 0.5 cm x 0.5 cm;参见 材料表）放入切割管内以覆盖中心孔，如 图 2 所示。
- 切割玻璃棉时戴上手套，因为硼硅酸盐玻璃会引起刺激。
- 叶鞘支撑架的制备
- 如图3A所示，将无裙边的96孔PCR板（参见材料表）切成六个两柱（8×2孔）支持架。
- 翻转两柱架，使孔的锥形底部朝上，平顶朝下（图3B）。
- 将每个支架放入装有湿润滤纸的玻璃培养皿中，并用盖子盖住（参见 材料表）。该装置用作护套的小型湿度室。
- 接种物制备
- 对于每种真菌菌株，将一个组装好的玻璃棉过滤单元放入完整的无菌 1.5 mL 微量离心管中，如 图 2 所示。后者用作收集管。
- 给试管贴上标签。
- 首先用 3-4 mL 无菌 DI 水淹没每个板，从孢子培养物中收获分生孢子。在某些情况下，可能需要更多的水才能在菌落表面产生一层液体。该系统不需要润湿剂。
- 使用无菌锥形尖杵（参见 材料表）从琼脂中松开孢子，以均匀地刮擦整个平板。
- 无菌将 1 mL 孢子悬浮液施加到玻璃棉过滤装置上，并让孢子通过重力流入收集管。
- 将含有过滤的孢子悬浮液的收集管以3,500× g 离心5分钟。孢子应在微量离心管底部沉淀。
注意：以高于此处推荐的速度离心 禾谷梭 菌孢子会导致活力显着丧失。 - 将液体倒入可高压灭菌的容器中，加入 1 mL 无菌去离子水，轻轻搅拌以重悬沉淀的孢子。如步骤2.3.6所示离心。
- 洗涤孢子 3 次以去除任何可能含有可能减少发芽或渗透的自身抑制剂的分生孢子基质。
- 第三次洗涤后，加入 300-500 μL 无菌去离子水以重悬孢子进行定量。
- 在复合显微镜下以100倍放大倍率使用血细胞计数器测定孢子浓度。计数前不需要孢子染色。
- 用无菌去离子水制备 5 x 105 孢子/mL 悬浮液。
注意： C. graminicola 孢子悬浮液可以在室温下保持不超过 4 小时，然后迅速失去活力。冷藏分生孢子不会增加存活率。
- 鞘接种
- 在用真菌菌株接种植物之前，检查相关的生物安全实践和程序。
- 沿着鞘的重叠边缘运行拇指指甲，从 V2 幼苗的第一片真叶上取下鞘，然后轻轻地将其从枝条上松开。在尝试取下枝条之前，先松开枝条两侧的护套。
- 将回收的叶鞘切成 3-5 厘米的段。接种前无需对护套进行表面消毒。
- 非常轻柔地展开每个部分，露出内（近轴）表皮层。
- 在准备接种鞘时，请用湿纸巾包裹剩余的切除鞘，以免干燥。
- 将 20 μL 真菌孢子悬浮液放在鞘片中心的内表面上，中肋正上方，如 图 4 所示。
- 将接种的叶鞘水平放置，中肋位于底部，在含有湿润滤纸的玻璃培养皿内的支架中，如 图5所示。
- 每个机架最多可容纳七个护套。每个菌株至少接种五个鞘，以补偿样品制备或孵育过程中可能发生的重复损失。
- 将小湿度室放入衬有湿发芽纸的透明储物盒中（参见 材料表）。
- 用盖子盖住盒子。将盒子在23°C下连续照明孵育预期的时间过程，这取决于真菌和将要观察到的真菌发育阶段。表1总结了接种禾谷梭菌的玉米鞘的时程。
- 每天检查护套上是否有疾病的迹象/症状，并保持发芽纸和滤纸湿润。在没有接种的情况下，叶鞘可以保留长达 6 天，而不会出现明显的植物细胞死亡或降解。
图 2：玻璃棉过滤装置的制备。（A） 将一个 0.5 cm x 0.5 cm 的玻璃棉球放置在微量离心管 1 内，该离心管 1 的锥形底部被移除。 （B-C） 然后将过滤管放入微量离心管2中，以产生用于孢子悬浮液制备的组装过滤单元。用 BioRender.com 创建。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：切割无裙边 96 孔 PCR 板的方法。（A） 将PCR板切成6个支撑架，8 x 2孔。 （B ）中描述了单个护套支架的示例。叶鞘水平放置在支架上。用 BioRender.com 创建。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：鞘接种方法。 将单滴接种物直接施用于鞘切面的近轴表面。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：鞘培养方法。 接种的叶鞘水平放置在装有湿滤纸的玻璃培养皿内的支撑架中。 请点击这里查看此图的较大版本.
3. 活细胞显微镜
- 显微镜样品制备
- 用无菌去离子水轻轻冲洗鞘片，以去除任何未粘附的孢子或浅表真菌生长。
- 将护套放在干净的玻璃显微镜载玻片上（参见 材料表），护套片的近轴（内）面朝下，背轴（外）表面最上方。
- 使用新的单刃剃须刀片（见 材料表）从鞘端修剪约 1 厘米，并去除中肋两侧的大部分椎板组织。
- 将剃须刀片与刀鞘成 90° 角，从远轴中肋上剃除组织，并暴露接种点上方近轴表面上的表皮层。尽量保持均匀的厚度。一旦叶鞘被剃掉，不建议进一步修剪，因为这可能会损坏样品。
- 确保剃光部分的尺寸不超过 1 厘米 x 1 厘米。在此过程中避免按压护套的中心。当使用接种有不同孢子悬浮液的护套时，请消毒手套并在样品之间更换剃须刀片。
- 准备好干净的玻璃显微镜载玻片。从一侧抬起护套部分，然后小心地将其转移到新的滑轨上。鞘的接种（近轴）表面应位于最上方，最靠近物镜。轻柔地安装部分以避免损坏真菌结构。
- 将 60 μL 无菌去离子水施加到切片中，并加入 24 mm x 60 mm 玻璃盖玻片（参见 材料表）。慢慢做以避免气泡。
- 准备进行显微镜检查时，用透明指甲油密封盖玻片（参见 材料表），在每个边缘放置一小滴，然后用指甲油刷将滴液连接在一起以形成无缝密封。
注：该鞘方案可用于细胞学染色，例如 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）、中性红或台盼蓝，或用于观察细胞等离子体分解以评估植物细胞活力。对于鞘染色或细胞浆溶解测定，不要密封盖玻片。 - 对于等离子体分解测定，将高渗溶液（0.75 M 蔗糖或 1 M 氯化钠）添加到盖玻片的一个边缘，并使用折叠的无绒薄纸将溶液穿过样品到盖玻片的另一边缘。对于染色，使用类似的方法涂抹染色溶液。
- 宽视场显微镜
- 将叶鞘安装在显微镜载玻片上后，使用400倍放大倍率的宽视场光学显微镜检查它们是否有真菌定植。
- 要详细观察真菌结构，请使用水浸物镜而不是油，以获得更好的样品图像质量。由于折射率不匹配导致的球面像差可能会导致图像质量下降。水物镜可用于宽视场光学显微镜和共聚焦显微镜。
- 为了确定每个鞘的相对定植量，使用100倍放大倍率的宽场光学显微镜计算从每个真菌穿透位点侵入的玉米细胞的数量。在比较菌株、治疗和/或发育阶段的任何统计分析之前，这种定量是一个适当的筛选步骤。
- 共聚焦激光扫描显微镜
- 为了观察转基因真菌菌株发育过程中玉米组织中的荧光蛋白，调整基本图像采集参数。根据所选荧光标记确定最佳激发/发射设置。
注意：在分析用分泌蛋白构建的荧光融合物时，最好使用 60 倍水物镜。现代共聚焦显微镜具有高度校正的水浸物镜，以避免伪影和形状像差。 - 如果打算对荧光蛋白进行活细胞成像，请使用未转化的真菌菌株作为自发荧光的对照。使用以下图像采集参数在倒置共聚焦显微镜上捕获真菌宿主动力学和 mCherry 荧光蛋白。根据表达水平，将激光功率设置为 5%，450-600 高压 （HV），1.375 倍增益，3% 偏移，光学变焦系数为 1，用于分析每个切片最多 5 个玉米细胞，光学变焦系数为 2-5 单个菌丝。
注意：高分辨率 Z 堆叠共聚焦图像提供三维数据，并更好地了解宿主与病原体之间的实时相互作用。 - 对于与分泌的融合蛋白相对应的荧光强度的定量，请使用共聚焦制造商的图像分析软件或图像处理程序，如ImageJ，可以在线免费下载。有关如何相应地量化荧光信号的详细信息，请参阅手册。
- 为了观察转基因真菌菌株发育过程中玉米组织中的荧光蛋白，调整基本图像采集参数。根据所选荧光标记确定最佳激发/发射设置。
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Representative Results
以下示例描述了使用玉米叶鞘接种方法后的代表性结果。这些示例表明，使用这种优化的检测方法可以实时完成玉米-真菌相互作用的观察和比较的便利性、速度和精确性。活细胞成像还可以提取定量信息，为比较分子、细胞学和生理学研究提供有用的工具。详情可参阅每份成功申请所引用的原始刊物。
示例数据1：在接种的叶鞘中使用染色和浆溶解来评估真菌状态和检测植物对真菌感染的反应
玉米叶鞘已被用于用明场显微镜观察和比较活宿主细胞中 禾谷菌 和 梅果 硬果的感染过程，从而可以详细描述定植模式和时间过程（未发表的结果; 图6）。
这些研究表明，梅氏链球菌通过未分化的菌丝肿胀直接迅速侵入表皮细胞，这与产生黑色化压迫感的禾谷球菌不同。一旦进入表皮细胞，两种病原体都会通过看似完整的细胞壁从一个细胞到另一个细胞（图6A，B）。
鞘可以用台盼蓝或DAPI染色，以更容易地评估定植真菌菌丝的性质和程度（图6）。台盼蓝染色显示，禾谷梭菌最初通过厚厚的初级菌丝侵入，这些菌丝通过非常狭窄的连接在细胞之间移动。之后，真菌切换到坏死性阶段，在菌落中心产生更薄的次生菌丝（图6 C-E）12,14,16,17。
图6：用明场或落射荧光显微镜成像的未染色或染色的接种玉米叶鞘。 （A） 接种后 48 小时 （hpi） 的细胞内菌丝。感染通过轻微肿胀的菌丝尖端发生（箭头）。（B） 细胞内菌丝 48 hpi 与禾谷菌。感染通过黑色化压迫（箭头）发生。（C） 禾谷梭菌的菌丝，用台盼蓝染色，通过狭窄的连接（箭头）在前进的菌落边缘进行细胞间进展，72 hpi。（D） 72 hpi 的禾谷梭菌的台盼蓝染色菌丝的近距离观察，通过狭窄的连接（箭头）穿过玉米细胞壁。（E） 禾本科苔藓菌丝，用台盼蓝染色，在菌落中心72 hpi。可以看到较窄的次级菌丝从较厚的初级菌丝（箭头）中出现。（F） 禾谷梭菌菌丝 72 hpi，在用DAPI染色的叶鞘上的推进菌落边缘。染色的真菌和植物细胞核在紫外光下发出荧光。每个面板中的比例尺等于 50 μm。使用单色数码相机和落射荧光显微镜获得的显微照片。请点击这里查看此图的较大版本.
鞘可以用中性红染色和/或进行等离子体分解，以研究病原真菌感染和定植期间玉米细胞的发育细胞学和活力（图7）。
Colletotrichum graminicola 是一种半生物营养真菌，它侵入具有厚初级菌丝的活玉米细胞，这些菌丝通过膜与宿主细胞质分离（图 7A-C）12、14、16、17。另一方面，Stenocarpella maydis是一种坏死性真菌，可产生植物毒素23并在表皮细胞侵入表皮细胞之前杀死表皮细胞（表皮细胞变成颗粒状，无法进行等离子分解）（图7D）。
玉米对禾谷梭菌和其他叶面病原体的防御涉及活性氧（ROS）的积累，特别是过氧化氢（H 2 O2）12,15。为了研究植物-病原体相互作用的氧化化学，3,3′-二氨基联苯胺 （DAB） 可用于细胞染色24。DAB被H 2 O2氧化，产生深棕色沉淀物，在玉米叶鞘中可见（图7 E，F）12,24。色素的产生是与宿主抗性反应相关的氧化爆发的指标。
图7：用明场显微镜成像的染色和/或等离子浆解接种的玉米叶鞘。 （A） 接种 禾谷梭 菌 24 hpi 的叶鞘，进行等离子体分解和中性红染色。在appressoria（箭头）下的活玉米细胞进行等离子体分解和染色，表明病原体在入侵前不会杀死细胞。 （B） 叶鞘 48 hpi 与 禾谷梭菌，进行等离子体分解并用中性红色染色。被初级菌丝（箭头）定植的玉米细胞仍然活着，确定 禾谷梭 菌作为生物营养生物侵入细胞。 （C） 叶鞘 48 hpi，带有 C. graminicola，显示菌丝在菌落的前进边缘细胞间移动。鞘已等离子体分解但未染色。与集落边缘相邻的未定植细胞（箭头）继续进行等离子体分解。 （D） 叶鞘 24 hpi 与 S. maydis，在渗透之前。萌发孢子下方的细胞（箭头）呈颗粒状，无法进行等离子分解，表明 S. maydis 在渗透之前杀死了它们，并且它表现为坏死菌。 （E） 抗性玉米自交系Mp305 24 hpi与 禾本科苔 藓的叶鞘，并用DAB染色。深色染色表明图像中心的单个细胞有强烈的氧化反应，而在大多数单个压迫物周围可以看到棕色色素的光晕，并且在照片顶部的细胞中可以观察到肉芽。（ F） 近距离观察在appressoria周围积聚的棕色色素光晕，以及色素在附近玉米细胞壁中的沉积（箭头）。每个面板中的比例尺等于 50 μm，但 （F） 除外，它是 20 μm。使用单色数码相机和落射荧光显微镜获得的显微照片。 请点击这里查看此图的较大版本.
示例数据 2：使用表达荧光蛋白的真菌进行活细胞成像
通过使用落射荧光或共聚焦显微镜，可以在活鞘细胞中以高分辨率观察表达细胞质荧光蛋白的真菌菌丝，而无需任何染色（图8）。
荧光蛋白可以靶向各种真菌细胞器，例如线粒体、细胞核或内膜系统，以跟踪它们在植物活真菌细胞中的位置和活性（图 8C）25、26、27、28（未发表的结果）。荧光蛋白也可以由不同的真菌启动子驱动，作为各种功能的报告基因：例如，由BiP伴侣分泌应激反应蛋白驱动的RFP（图8D）29（未发表的结果）。叶鞘的使用可以可视化单独标记的荧光融合蛋白，这些蛋白在定植宿主细胞8,9时由真菌菌丝积累和分泌（图8E）。表达靶向各种细胞区室（例如细胞核或质膜）的荧光蛋白的转基因玉米系也可用30,31，可用于接种以评估感染对玉米细胞结构（例如细胞核）的影响。使用这些转基因玉米品系表明，未被侵染的玉米细胞中的细胞核通常会迁移到最接近已经被禾谷梭菌定植的细胞的细胞壁（未发表的结果;图8F）。
图 8：表达荧光蛋白的 Colletotrichum graminicola 的落射荧光 （A， B） 或共聚焦 （C， D， E， F） 成像。（A） 未染色的、等离子体解解的叶鞘 48 hpi，在 ToxA 启动子34 的控制下，用 C. graminicola 菌株在细胞质上表达 mRFP。在这些叶鞘中也注意到显着的自发荧光。（B） 未染色的叶鞘 48 hpi，在 ToxA 启动子的控制下，用细胞质表达 SGFP 的 C. graminicola 菌株。（C）表达 SGFP 的 Colletotrichum graminicola 用 HDEL 锚35 靶向内膜系统。（D） 未染色的叶鞘 24 hpi，在 BiP 伴侣的 C. graminicola 同源物的启动子的控制下，用 mRFP 转化的 C. graminicola。初级菌丝中的红色荧光是响应分泌应激而激活 BiP 的指标。（E） 阿拉伯呋喃糖苷酶：：mCherry融合蛋白在禾谷梭菌WT初级菌丝中的积累，该菌丝在44 hpi时穿过玉米叶鞘细胞壁。（F） 在ToxA启动子的控制下，以30,31,48 hpi为靶向植物细胞核的YFP的转基因玉米品系的叶鞘。每个面板中的比例尺等于 20 μm，但面板 A 等于 50 μm。使用单色数码相机和落射荧光显微镜获得显微照片。（C-F）中的图像是用激光扫描共聚焦显微镜拍摄的。请点击这里查看此图的较大版本.
示例数据 3：使用玉米叶鞘检查真菌菌株之间相容/不相容反应和相互作用的详细细胞学
将玉米叶鞘中的非致病性禾谷梭菌突变株（cpr1 MT）与野生型（WT）菌株进行了比较（图9A，B）12。
用细胞质荧光蛋白标记的菌株的活细胞成像表明，突变体在玉米叶鞘内从一个细胞到另一个细胞的运动受到特异性损伤。鞘方案能够实现精确定量，显示 cpr1 MT 在 95% 的时间内局限于第一个定植细胞（图 9C）12。这与WT形成鲜明对比，WT在同一时间范围内，只有不到5%的感染保留在第一个定植细胞内12。有趣的是， cpr1 MT能够在局部冻死的鞘中腐生地生长到第一个最初感染的细胞之外，如WT菌株（图9D）。这表明 cpr1 MT无法定植与活玉米细胞的主动反应特别相关。
叶鞘接种试验用于测试表达 GFP 的 cpr1 MT 和表达 RFP 的 WT 菌株之间的相互作用，方法是将它们共接种在同一叶鞘12 上。当菌株接种在一起（相距不超过8个玉米细胞）时，cpr1 MT能够作为生物营养生物在细胞之间正常生长（图9E，F）。等离子体分解试验证实cpr1 MT真菌进入活细胞12。所有这些详细的观察结果都是通过鞘测定实现的，并暗示存在一种可扩散因子，该因子诱导了由禾谷梭菌的WT菌株产生的相容性，但在cpr1 MT12中缺乏。
图 9：涉及 Colletotrichum graminicola 的 WT 和 cpr1 MT 菌株的相容和不相容相互作用。使用不同的荧光蛋白可以使两种菌株在玉米叶鞘上共接种时被区分12.（A） 在48 hpi的玉米叶鞘中表达细胞质mRFP的WT C. graminicola菌株。（B） 在72 hpi的玉米叶鞘中表达SGFP的C. graminicola cpr1 MT菌株。cpr1 MT 很少（<5% 的时间）定植到第一个感染细胞之外，甚至在接种后长达 6 天。（C） 在 72 dpi 下表达 SGFP 的 C. graminicola cpr1 MT 菌株的近距离观察。在这种情况下，它设法穿过细胞壁进入下一个细胞，但随后它停止了发育。（D） 在杀死的鞘组织中表达 SGFP 的 C. graminicola cpr1 MT 菌株，48 hpi。（E）当WT-mRFP C. graminicola和cpr1 MT-GFP C. graminicola菌株在玉米叶鞘（48 hpi）上紧密共接种时，cpr1 MT-GFP菌株重新获得正常通过活玉米鞘细胞的能力，作为生物营养菌。通过等离子体分解测定证实了活细胞内的生物营养生长。（F） 表达 SGFP 的 C. graminicola cpr1 MT 菌株的近距离观察，当接种在 WT 附近（相距不超过 8 个玉米细胞）时，该菌株从一个细胞生长到另一个细胞。比例尺等于 50 μm（A、B 和 E）或 20 μm（C、D 和 F）。使用单色数码相机和落射荧光显微镜获得显微照片。请点击这里查看此图的较大版本.
接种的鞘也被用于生产用于转录活性分析的RNA提取的组织32,33。护套是理想的选择，因为它们可以在提取前进行检查以监测感染过程，从而确保样品在多次重复中的均匀性。这些研究允许鉴定 Colletotrichum 生活方式过渡阶段之间的差异表达基因波32,33。
示例数据 4：次优实验的结果
不令人满意的活细胞成像可能是由于叶鞘修剪不足，导致表皮细胞层重叠和光学不透明样品（图10）。
图10：由于叶鞘修剪不足导致的实验结果欠佳。A） 多个表皮细胞层干扰体内真菌发育检查的示例。 （B） 影响活细胞成像的重叠细胞层示例。比例尺等于 20 μm。使用单色数码相机和落射荧光显微镜获得显微照片。 请点击这里查看此图的较大版本.
另一个潜在的次优实验结果是未调整的接种物浓度，可能导致孢子数量低（图11A）或高：后者可能导致萌发或压迫渗透减少（图11B）。后者还会阻碍定植在每个真菌渗透位点的玉米细胞的定量。
图11：由于接种物浓度调整不当导致的实验结果欠佳。 答：接种在鞘上的禾谷梭菌孢子悬浮液浓度低，导致真菌渗透位点数量少。湾。禾本科梭菌接种物在叶鞘上的浓度高，导致邻近的多个压裂，并降低宿主细胞的渗透。比例尺等于 20 μm。使用单色数码相机和落射荧光显微镜获得显微照片。请点击这里查看此图的较大版本.
| 显微观察时间 （hpi） | 玉米叶鞘上接种的禾谷梭菌发育阶段 |
| 12 | 阿普雷索里亚 |
| 24 | 初级菌丝 |
| 36 | 次生菌丝 |
| 48 | 次生菌丝 |
| 60 | 阿塞武里 |
| 72 | 阿塞武里 |
| 108 | 阿塞武里 |
表1：禾谷禾谷菌感染时程：基于生活方式转变过程中真菌发育里程碑接种禾谷菌株M1.001的玉米叶鞘时程总结。每12小时进行一次显微镜观察。
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Discussion
这里描述的优化的叶鞘接种方法是从为水稻叶鞘6,8,36开发并已应用于水稻叶鞘的原始方案修改而来的。它允许使用宽场或共聚焦显微镜直接、详细地观察活植物细胞中的真菌生长和发育。该方案适用于玉米定植过程中各种微观现象的表征、比较和定量，包括相容与不相容相互作用期间的真菌发育和宿主反应;植物中特定真菌蛋白的产生和分泌;以及玉米-真菌相互作用过程中产生的常见或新型致病因子的细胞学和生物化学。我们已将这种方法用于玉米的半生物营养和坏死性病原体。我们还没有尝试接种生物营养病原体（例如锈菌），但由于它们仍然活着，因此鞘对该应用也很有用。我们还将这种方法应用于高粱鞘，以研究宿主和品种特异性抗性的细胞学 7,37。对于高粱鞘，对方案的唯一调整是用孢子悬浮液填充整个鞘，而不是在中心滴一滴。由于高粱鞘的直径较小，这是必要的。
这些鞘测定的使用极大地推进了我们对宿主定植机制和对致病性至关重要的真菌分子的详细研究。例如，该方法的应用表明，玉米对 亚线梭 菌和高粱对 禾谷苔 藓的非宿主识别，包括两种情况下的超敏抗性反应7。玉米叶鞘也用于测试同一鞘上远距离真菌菌株之间的相互作用。在这种情况下，将致病性 WT 和非致病性 cpr1 MT 菌株一起接种在活鞘上证明了 WT 菌株对玉米细胞易感性的诱导，并为参与致病性的扩散因子提供了证据12。鞘允许区分表达不同荧光蛋白的两种菌株，并对单独或一起接种的菌株的定植过程进行定量和统计比较。
与用于活细胞成像的全株接种相比，这种玉米叶鞘测定具有几个优点。首先，该协议提供了与活宿主细胞相互作用的病原体的卓越成像，无需清除或固定。例如，使用玉米叶鞘的研究能够检测到半生物营养禾谷梭菌从生物营养到坏死的明显转变，并促进了与非致病性突变体 7,12,16,17 的功能比较。尽管据报道，接种了米分枝杆菌的切除水稻叶鞘可能出现与在全水稻植株中观察到的症状不符的症状36，但玉米鞘中定植、组织塌陷和病变发展的时间和外观与全叶相似12,14。鞘测定的第二个优点是它显示出更大的复制同步性和真菌定植的实验可重复性12,18。虽然全株接种可导致不规则水平的真菌渗透18，但鞘接种的更高度受控条件提供了更多的同步性，并允许更精确地研究和量化相互作用。这种增加的同步性促进了鞘在转录组分析中的使用32,33。此外，鞘方案实现了转录组分析所需的样品制备速度：修剪、冲洗和筛选每个鞘在快速冷冻用于 RNA 提取之前不超过 2 分钟32,33。
成功对感染进行活细胞成像的关键步骤包括：1）切割后应立即使用鞘进行实验。切除的接种鞘不应保留超过 6 天：如果真菌定植量大，它们会降解得更快12;2）谨慎选择发育年龄相同的鞘，以确保结果更具可重复性;3）使用来自已达到最大孢子形成的培养物的新鲜孢子悬浮液;4） 使用锋利的剃须刀片进行更有效的修剪，以产生光学透明的样品;5） 尽量减少对样品的过度和不必要的操作，因为这个过程会对实时结构和图像质量产生负面影响;6）每天检查湿度室，确保滤纸充分湿润;7）在共聚焦显微镜上对样品进行成像时，在实验过程中保持采集设置固定，以避免在比较样品之间的荧光信号时引入强度变化或偏差。如果激光强度和持续时间过高，荧光蛋白可能会进行光漂白，如果组织切片长时间保持在密封的盖玻片下，它们可能会发出较弱的信号。应进行初步实验，包括所有适当的对照，以标准化和优化条件、材料和时间表，以获得最可重复的结果。
故障 排除
手工修整不足以产生光学透明的护套
剃须刀片可能变钝了。如果是这种情况，请妥善处理并改用新的单刃剃须刀片。使用适度的压力，使刀片与护套成 90° 角。轻轻但始终如一地刮擦样品，直到观察到平坦和半透明的部分。建议在进行共聚焦激光扫描显微镜之前，先在复合显微镜下检查护套。
接种的玉米鞘极易脆弱
当真菌定植于大部分植物组织时，就会发生这种情况。因此，组织被降解和塌陷。当制备已经处于坏死阶段的样品时，轻轻地将切片压在显微镜载玻片上，滴一滴无菌去离子水，并用干净的盖玻片刮擦样品一到两次。
孢子萌发和体内渗透率低
这可能是由于大量孢子抑制发芽或渗透。确保将接种浓度调节至 5 x 105 个孢子/mL。如果问题仍然存在，请将浓度调整至 5 x 104 个孢子/mL。作为 体内 实验的对照，将 50 μL 相同的孢子悬浮液置于新鲜的 PDA 板上并均匀涂抹。每天检查孢子活力和发芽情况。
跨鞘的异步真菌发育阶段
确保玉米植株处于相同的生长阶段，并且从同一节点获得鞘切片。此外，确保孢子是可行的，并且真菌培养物处于接种制备的最佳阶段（例如， 禾谷梭菌的培养物不超过 2 周龄）。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益，也没有什么可披露的。
Acknowledgments
作者感谢USDA-NIFA的财政支持（资助号2018-67013-28489和2020-70410-32901）。本手稿中表达的任何意见、发现、结论或建议仅代表作者的观点，并不一定反映美国农业部的观点。我们感谢来自巴西的无国界科学访问学生Mayara de Silva提供的图像，这些图像出现在图 6A 和 图7D中。我们还要感谢肯塔基大学植物病理学系提供奥林巴斯共聚焦显微镜。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
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