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Biology

फंगल पर्ण मक्का रोगजनकों द्वारा संक्रमण के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए अलग मक्का म्यान

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65755
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1, 1
1Department of Plant Pathology, University of Kentucky, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Bayer Crop Science, 4Everglades Research and Education Center, University of Florida

Summary

यह पांडुलिपि एक अनुकूलित टीकाकरण प्रोटोकॉल का विवरण देती है जो फंगल पौधे रोगजनकों के साथ मक्का इंटरैक्शन के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साइटोलॉजिकल, शारीरिक और आणविक अध्ययन के लिए अलग मक्का पत्ती म्यान का उपयोग करती है। पत्ती म्यान अनफिक्स ऊतकों में जीवित पौधे और कवक के बीच सेलुलर इंटरैक्शन के वास्तविक समय के अवलोकन की सुविधा प्रदान करता है।

Abstract

हमने हेमीबायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रॉफिक पर्ण रोगजनक कवक के साथ मक्का पत्ती म्यान को टीका लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है। विधि को मूल रूप से चावल के पत्ते के म्यान पर लागू एक से संशोधित किया जाता है और जीवित पौधों की कोशिकाओं में कवक के विकास और विकास के प्रत्यक्ष सूक्ष्म अवलोकन की अनुमति देता है। दो पूरी तरह से उभरे हुए पत्ती कॉलर के साथ मक्का के अंकुरों से एकत्र किए गए पत्ती के आवरण को 5 x 105 बीजाणुओं/एमएल कवक बीजाणु निलंबन की 20 माइक्रोन बूंदों के साथ टीका लगाया जाता है और निरंतर फ्लोरोसेंट प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रता कक्षों में ऊष्मायन किया जाता है। 24-72 घंटे के बाद, एपिडर्मल कोशिकाओं की एक परत छोड़ने के लिए रेजर ब्लेड के साथ अतिरिक्त ऊतक को हटा दिया जाता है, एक ऑप्टिकली स्पष्ट नमूना जिसे रासायनिक निर्धारण या समाशोधन की आवश्यकता के बिना सीधे इमेज किया जा सकता है। पौधे और कवक कोशिकाएं प्रयोग की अवधि के लिए जीवित रहती हैं और वास्तविक समय में बातचीत की कल्पना की जा सकती है। संक्रमण और उपनिवेशण के दौरान मेजबान और रोगज़नक़ कोशिकाओं के विकासात्मक कोशिका विज्ञान और व्यवहार्यता का अध्ययन करने के लिए म्यान को दाग दिया जा सकता है या प्लास्मोलिसिस के अधीन किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए परिवर्तित फंगल उपभेदों को बढ़े हुए संकल्प के लिए म्यान पर टीका लगाया या सह-टीका लगाया जा सकता है और प्रतिस्पर्धी या सहक्रियात्मक बातचीत के मूल्यांकन की सुविधा प्रदान की जा सकती है। फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन को व्यक्त करने वाले फंगल उपभेदों का उपयोग प्लांटा में इन व्यक्तिगत प्रोटीनों के उत्पादन और लक्ष्यीकरण को ट्रैक और मापने के लिए किया जा सकता है। Inoculated म्यान ऊतकों न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन, या चयापचयों को चिह्नित करने के लिए निकाला जा सकता है. इन म्यान परखों के उपयोग ने मक्का में फंगल रोगजनकता के तंत्र के विस्तृत अध्ययन और रोगजनकता में योगदान देने वाले कवक प्रोटीन प्रभावकों और माध्यमिक चयापचयों के विस्तृत अध्ययन को बहुत उन्नत किया है।

Introduction

सेलुलर स्तर पर स्थानिक और लौकिक विश्लेषण शरीर विज्ञान और कवक संयंत्र बातचीत के कोशिका विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं. पर्णीय ऊतक जिन्हें रासायनिक रूपसे 1,2,3 या साफ और दाग 4 के साथ-साथ कृत्रिम झिल्ली 5 तय किया गया है, का उपयोग अतीत में पर्ण रोगज़नक़ विकास और पौधे-कवक इंटरैक्शन के कोशिका विज्ञान की जांच के लिए किया गया है। हालांकि, निर्धारण या समाशोधन के बिना वास्तविक समय में रहने वाले मेजबान ऊतकों में संक्रमण की घटनाओं की जांच इमेजिंग के लिए वैकल्पिक रूप से पारदर्शी नमूने तैयार करने से संबंधित तकनीकी मुद्दों के कारण चुनौतीपूर्ण है।

चावल विस्फोट कवक मैग्नापोर्थे ओरिज़ा6 के लिए जीवित चावल एपिडर्मल कोशिकाओं के प्रतिरोध की उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्म जांच के लिए 1940 के दशक के उत्तरार्ध में एक अलग पत्ती म्यान टीका प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। हाल ही में, Colletotrichum और Magnaporthe प्रजातियों द्वारा मेजबान उपनिवेशण के विस्तृत आणविक, शारीरिक, और cytological टिप्पणियों को फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले कवक ट्रांसफार्मर के साथ इस पत्ती म्यान विधि के संशोधित संस्करणों के संयोजन से बहुत सुविधा प्रदान की गई है, और उच्च प्रदर्शन लाइव-सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल, जिसमें एपिफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 7,8,9,10,11,12,13.

यह पत्र हेमीबायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रॉफिक पर्ण कवक रोगजनकों द्वारा संक्रमण प्रक्रियाओं के अवलोकन के लिए अलग मक्का पत्ती म्यान का उपयोग करके एक अनुकूलित टीकाकरण प्रोटोकॉल का विवरण देता है। हमने विशेष रूप से इसका अध्ययन करने के लिए इसका उपयोग किया है Colletotrichum graminicola (सी. ग्रैमिनिकोला), एन्थ्रेक्नोज लीफ ब्लाइट और डंठल सड़ांध का कारण एजेंट, और स्टेनोकार्पेला मेडिस, जो डिप्लोडिया लीफ ब्लाइट और डंठल सड़ांध का कारण बनता है। हालांकि, विधि अन्य हेमिबायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रॉफिक पर्ण कवक रोगजनकों पर लागू होनी चाहिए। इन उत्तेजित पत्ती म्यान में संक्रमण और उपनिवेशण की घटनाओं के दौरान साइटोलॉजिकल और शारीरिक प्रतिक्रियाएं पूरे पत्तीब्लेड 12,14,15 में समान हैं। इसके अलावा, सी. graminicola द्वारा म्यान एपिडर्मल कोशिकाओं के hemibiotrophic उपनिवेशण डंठल पिथ कोशिकाओं16,17 के उपनिवेशण के समान है. अलग म्यान पत्ती ब्लेड या डंठल पिथ ऊतकों14,16,17,18 की तुलना में कवक प्रवेश और उपनिवेशण की अधिक समकालिकता और प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता दिखा. अधिकांश मक्का किस्मों इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, म्यान में अत्यधिक बैंगनी वर्णक के साथ इनब्रेड्स या संकर कम उपयुक्त होते हैं क्योंकि पिगमेंट इमेजिंग में हस्तक्षेप करते हैं। गोल्डन जुबली स्वीट कॉर्न हमारे अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी रहा है क्योंकि अनुपचारित बीज व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, पौधे कई पर्ण रोगों के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, और वे ग्रीनहाउस में अच्छी तरह से विकसित होते हैं। संयुक्त राज्य अमेरिका में एन्थ्रेक्नोज डंठल सड़ांध की पहली महामारी के परिणामस्वरूप 1970के दशक में इंडियाना में स्वीट कॉर्न की फसलों का कुल नुकसान हुआ। इस लीफ शीथ इनोक्यूलेशन विधि को जीवित बनाम स्थानीय रूप से मारे गए पौधों की कोशिकाओं में फंगल विकास और विकास को सीधे देखने और मापने के लिए लागू किया जा सकता है, ताकि फंगल संक्रमण के संगत / असंगत प्रतिक्रियाओं में प्रतिरोध प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जा सके, और वास्तविक समय में एक ही म्यान पर फंगल उपभेदों के बीच बातचीत का परीक्षण किया जा सके।

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Protocol

नोट:: विधि के लिए वर्कफ़्लो चित्र 1 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: अलग मक्का पत्ती म्यान का उपयोग अनुकूलित टीका प्रोटोकॉल में कदम. बीजाणु निलंबन की तैयारी, पत्ती म्यान इनोक्यूलेशन, और लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करना क्रमशः हरे (ए), बैंगनी (बी), और नारंगी (सी) बक्से में हाइलाइट किया गया है। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. पौधे और कवक सामग्री

  1. पौधों की वृद्धि
    1. SC10 कंटेनरों में ग्रीनहाउस (14 घंटे प्रकाश/27 डिग्री सेल्सियस और 10 घंटे अंधेरे/22 डिग्री सेल्सियस) में मक्का के पौधे (सामग्री की तालिकादेखें) उगाएं ( सामग्री की तालिकादेखें)। एक विकास माध्यम का उपयोग करें जिसमें तीन भाग वाणिज्यिक पॉटिंग मिट्टी ( सामग्री की तालिकादेखें) और दो भाग भाप-निष्फल टॉपसॉइल शामिल हैं।
    2. हर दिन एक बार सुबह में एक ओवरहेड सिंचाई प्रणाली के साथ 2 मिनट के लिए पानी के अंकुर।
    3. V2 चरण में रोपाई को मिट्टी के स्तर पर काटकर कटाई करें। V2 विकास चरण तक पहुँच जाता है जब अंकुर 5 से 10 सेमी लंबा होता है और दो दिखाई कॉलर वाले पत्तेहोते हैं 21.
    4. पौधों को एक नम कागज़ के तौलिये से लपेटें और उन्हें आगे की प्रक्रिया के लिए प्रयोगशाला में परिवहन के लिए प्लास्टिक की थैली में रखें।
  2. फंगल संस्कृतियों
    1. एक उपयुक्त अगर माध्यम पर संक्रमित सिलिका के लगभग 50 granules छिड़ककर सड़न रोकनेवाला शर्तों22के तहत संग्रहीत कवक सिलिका स्टॉक संस्कृतियों को पुनः सक्रिय. रूपात्मक परिवर्तनों और रोगजनकता के नुकसान से बचने के लिए, पुनर्सक्रियन के बाद उपसंस्कृति 3x से अधिक नहीं होती है। आलू डेक्सट्रोज अगर (पीडीए; सामग्री की तालिकादेखें) नियमित रूप से संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है सी. graminicola जबकि दलिया अगर (OA; सामग्री की तालिकादेखें) एस के लिए प्रयोग किया जाता है.
    2. फंगल स्टॉक की खेती के लिए पीडीए तैयार करने के लिए, 500 एमएल विआयनीकृत (डीआई) पानी में व्यावसायिक रूप से तैयार निर्जलित पीडीए के 19.5 ग्राम को निलंबित करें। ओए बनाने के लिए, 15-30 मिनट के लिए डीआई पानी में व्यावसायिक रूप से तैयार निर्जलित ओए के 36 ग्राम उबालें, चीज़क्लोथ की तीन परतों के माध्यम से फ़िल्टर करें, और डीआई पानी के साथ 500 एमएल तक छानना लाएं। आटोक्लेव मीडिया निष्फल करने के लिए।
    3. ट्रांसफार्मर उपभेदों के साथ काम करते समय एक उपयुक्त एंटीबायोटिक (जैसे, हाइग्रोमाइसिन बी, जेनेटिसिन) के साथ पिघला हुआ, ठंडा मीडिया को बढ़ाएं। मीडिया के 500 एमएल में हाइग्रोमाइसिन या जेनेटिसिन की अंतिम सांद्रता क्रमशः 250 माइक्रोग्राम / एमएल और 100 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    4. इष्टतम परिस्थितियों में संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें जब तक कि एक स्पोरुलेटिंग मायसेलियम विकसित नहीं हो जाता। Colletotrichum graminicola और S. maydis निरंतर फ्लोरोसेंट प्रकाश और परिवेश आर्द्रता के स्तर के साथ 23 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से विकसित होते हैं। स्पोरुलेशन एस मेडिस के लिए टीकाकरण (दाई) या सी ग्रैमिनिकोला के लिए 14 दिन बाद होता है।

2. लीफ शीथ इनोक्यूलेशन

  1. ग्लास-ऊन फिल्टर इकाई विधानसभा
    1. टोपी को काटने के लिए भारी शुल्क कैंची या कैंची का उपयोग करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के शंक्वाकार तल से लगभग 0.5 मिमी ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. केंद्र छेद को कवर करने के लिए कट ट्यूब के अंदर कांच ऊन (लगभग 0.5 सेमी x 0.5 सेमी; सामग्री की तालिकादेखें) का एक टुकड़ा रखें, जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है।
    3. ग्लास ऊन काटते समय दस्ताने पहनें, क्योंकि बोरोसिलिकेट ग्लास जलन पैदा कर सकता है।
  2. पत्ती म्यान समर्थन रैक की तैयारी
    1. चित्रा 3 ए में दर्शाया के रूप में छह दो स्तंभ (8 एक्स 2 कुओं) समर्थन रैक में एक गैर स्कर्ट 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट (सामग्री की तालिकादेखें) कटौती.
    2. दो स्तंभ रैक फ्लिप तो कुओं के शंक्वाकार बोतलों का सामना करना पड़ता है और फ्लैट सबसे ऊपर नीचे (चित्रा 3 बी) का सामना करना पड़ता है.
    3. सिक्त फिल्टर पेपर युक्त एक ग्लास पेट्री प्लेट में प्रत्येक समर्थन प्लेस और ढक्कन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कवर. यह इकाई म्यान के लिए एक छोटे आर्द्रता कक्ष के रूप में कार्य करती है।
  3. इनोकुलम की तैयारी
    1. प्रत्येक कवक तनाव के लिए, एक इकट्ठे ग्लास-ऊन फिल्टर इकाई को एक अक्षुण्ण बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है। उत्तरार्द्ध एक संग्रह ट्यूब के रूप में कार्य करता है।
    2. ट्यूबों को लेबल करें।
    3. पहले बाँझ डीआई पानी के 3-4 एमएल के साथ प्रत्येक प्लेट बाढ़ द्वारा sporulating संस्कृतियों से फसल कोनिडिया. कॉलोनी की सतह पर तरल की एक परत का उत्पादन करने के लिए कुछ मामलों में अधिक पानी आवश्यक हो सकता है। इस प्रणाली में गीला एजेंट आवश्यक नहीं हैं।
    4. एक बाँझ शंक्वाकार टिप मूसल का उपयोग करके अगर से बीजाणुओं ढीला ( सामग्री की तालिकादेखें) पूरी प्लेट भर में समान रूप से परिमार्जन करने के लिए.
    5. बीजाणु निलंबन के 1 एमएल को एक ग्लास ऊन फिल्टर इकाई में एसेप्टिक रूप से लागू करें और बीजाणुओं को गुरुत्वाकर्षण द्वारा संग्रह ट्यूब में प्रवाहित करने की अनुमति दें।
    6. 5 मिनट के लिए 3,500 x ग्राम पर फ़िल्टर्ड बीजाणु निलंबन युक्त संग्रह ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। बीजाणुओं को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर गोली लगाई जानी चाहिए।
      नोट: यहां अनुशंसित की तुलना में उच्च गति पर सेंट्रीफ्यूजिंग सी ग्रैमिनिकोला बीजाणुओं के परिणामस्वरूप व्यवहार्यता का एक महत्वपूर्ण नुकसान होता है।
    7. तरल को एक आटोक्लेवबल कंटेनर में डालें, 1 एमएल बाँझ डीआई पानी डालें, और धीरे से पेलेट बीजाणुओं को फिर से निलंबित करने के लिए आंदोलन करें। चरण 2.3.6 के रूप में अपकेंद्रित्र।
    8. किसी भी शंकुधारी मैट्रिक्स को हटाने के लिए बीजाणुओं को 3x धोएं जिसमें ऑटो अवरोधक हो सकते हैं जो अंकुरण या प्रवेश को कम कर सकते हैं।
    9. तीसरे धोने के बाद, मात्रा का ठहराव के लिए बीजाणुओं को फिर से निलंबित करने के लिए बाँझ डीआई पानी के 300-500 माइक्रोन जोड़ें।
    10. बीजाणु एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 100x आवर्धन पर एक यौगिक माइक्रोस्कोप के तहत एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें। गिनती से पहले बीजाणु धुंधला होना आवश्यक नहीं है।
    11. बाँझ DI पानी के साथ 5 x 105 बीजाणु/mL निलंबन तैयार करें।
      नोट: सी graminicola बीजाणु निलंबन व्यवहार्यता के तेजी से नुकसान से पहले 4 घंटे से अधिक नहीं के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है। रेफ्रिजरेटिंग कोनिडिया व्यवहार्यता में वृद्धि नहीं करता है।
  4. म्यान का टीका
    1. फंगल उपभेदों के साथ पौधों को टीका लगाने से पहले प्रासंगिक जैव सुरक्षा प्रथाओं और प्रक्रियाओं की जाँच करें।
    2. म्यान के अतिव्यापी मार्जिन के साथ एक थंबनेल चलाकर V2 अंकुरों के पहले सच्चे पत्ते से म्यान निकालें, और धीरे से इसे शूट से ढीला करें। इसे हटाने की कोशिश करने से पहले शूट के दोनों किनारों से म्यान को ढीला करें।
    3. बरामद पत्ती म्यान को 3-5 सेमी खंडों में काटें। टीकाकरण से पहले म्यान कीटाणुरहित करना आवश्यक नहीं है।
    4. आंतरिक (अडैक्सियल) एपिडर्मल परत को बेनकाब करने के लिए प्रत्येक खंड को बहुत धीरे से अनियंत्रित करें।
    5. टीकाकरण के लिए म्यान तैयार करते समय, शेष उत्तेजित म्यान को एक नम कागज़ के तौलिये से लपेटकर रखें ताकि निर्जलीकरण से बचा जा सके।
    6. म्यान के टुकड़े के केंद्र में आंतरिक सतह पर फंगल बीजाणु निलंबन के 20 माइक्रोन रखें, सीधे मिडरिब के ऊपर, जैसा कि चित्र 4में दर्शाया गया है।
    7. इनोक्यूलेटेड पत्ती म्यान क्षैतिज रूप से, नीचे की ओर रखी मिडरिब के साथ, एक ग्लास पेट्री प्लेट के अंदर समर्थन में रखें जिसमें एक सिक्त फिल्टर पेपर होता है जैसा कि चित्रा 5 में दर्शाया गया है।
    8. प्रत्येक रैक में सात म्यान होते हैं। नमूना तैयार करने या इनक्यूबेशन के दौरान होने वाली प्रतिकृतियों के नुकसान की भरपाई के लिए प्रति तनाव कम से कम पांच म्यान का टीका लगाएं।
    9. छोटे आर्द्रता कक्षों को सिक्त अंकुरण कागज के साथ पंक्तिबद्ध एक स्पष्ट भंडारण बॉक्स में रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    10. ढक्कन के साथ बॉक्स को कवर करें। इच्छित समय पाठ्यक्रम के लिए निरंतर रोशनी के साथ 23 डिग्री सेल्सियस पर बॉक्स को इनक्यूबेट करें, जो कवक पर और कवक विकास चरणों पर निर्भर करता है जो मनाया जाएगा। सी. ग्रामिनिकोला के साथ टीका लगाए गए मक्का म्यान के लिए समय पाठ्यक्रम का सारांश तालिका 1में प्रदान किया गया है।
    11. म्यान पर रोग के संकेतों/लक्षणों के लिए हर दिन जाँच करें और अंकुरण और फिल्टर पेपर दोनों को नम रखें। टीकाकरण की अनुपस्थिति में स्पष्ट पौधे कोशिका मृत्यु या गिरावट के बिना पत्ती म्यान को 6 दिनों तक बनाए रखा जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: ग्लास-ऊन फिल्टर इकाई की तैयारी। (ए) एक 0.5 सेमी x 0.5 सेमी ग्लास-ऊन की गेंद को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब 1 के अंदर रखा जाता है जिसमें इसका शंक्वाकार तल हटा दिया जाता है। (बी-सी) फिल्टर ट्यूब को तब बीजाणु निलंबन की तैयारी के लिए एक इकट्ठे फिल्टर इकाई उत्पन्न करने के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब 2 में रखा जाता है। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक गैर स्कर्ट 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट काटने की विधि. (ए) पीसीआर प्लेट छह समर्थन रैक, 8 x 2 कुओं में कटौती। एकल म्यान समर्थन का एक उदाहरण (बी) में दर्शाया गया है। पत्ती म्यान समर्थन पर क्षैतिज रूप से रखी जाती है। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: म्यान टीका विधि। इनोकुलम की एकल बूंद सीधे म्यान अनुभाग की समायोज्य सतह पर लागू होती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: म्यान इनक्यूबेशन विधि। Inoculated पत्ती म्यान सिक्त फिल्टर पेपर युक्त एक गिलास पेट्री प्लेट के अंदर एक समर्थन रैक में क्षैतिज रखा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी

  1. माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करना
    1. किसी भी अनजाने बीजाणुओं या सतही कवक विकास को हटाने के लिए बाँझ डीआई पानी के साथ धीरे म्यान के टुकड़े कुल्ला।
    2. म्यान को एक साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड ( सामग्री की तालिकादेखें) पर म्यान के टुकड़े की समायोज्य (अंदर) सतह के साथ नीचे की ओर और अबाक्सियल (बाहर) सतह ऊपर रखें।
    3. म्यान के सिरों से लगभग 1 सेमी ट्रिम करने के लिए एक नए सिंगल-एज रेजर ब्लेड ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें और मिडरिब के दोनों ओर अधिकांश लैमिना ऊतक को हटा दें।
    4. रेजर ब्लेड को म्यान के सापेक्ष 90 डिग्री के कोण पर पकड़ें ताकि अबाक्सियल मिडरिब से ऊतक को दाढ़ी दी जा सके और टीका लगाए गए स्थान के ऊपर एडैक्सियल सतह पर एपिडर्मल परत को उजागर किया जा सके। एक समान मोटाई बनाए रखने की कोशिश करें। एक बार पत्ती म्यान मुंडा रहे हैं, आगे ट्रिमिंग की सिफारिश नहीं की है क्योंकि यह नमूना नुकसान हो सकता है.
    5. सुनिश्चित करें कि मुंडा अनुभाग आकार में 1 सेमी x 1 सेमी से अधिक नहीं हैं। इस प्रक्रिया के दौरान म्यान के केंद्र पर दबाने से बचें। विभिन्न बीजाणु निलंबन के साथ टीका लगाए गए म्यान के साथ काम करते समय, दस्ताने कीटाणुरहित करें और नमूनों के बीच रेजर ब्लेड को बदलें।
    6. एक साफ कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार रखें. म्यान अनुभाग को एक किनारे से उठाएं और इसे ध्यान से एक नई स्लाइड में स्थानांतरित करें। म्यान की टीका (एडक्सियल) सतह सबसे ऊपर, उद्देश्य लेंस के सबसे करीब होनी चाहिए। फंगल संरचनाओं को नुकसान से बचने के लिए धीरे से माउंट अनुभाग।
    7. अनुभाग में बाँझ डीआई पानी के 60 माइक्रोन लागू करें और 24 मिमी x 60 मिमी ग्लास कवरस्लिप जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। हवा के बुलबुले से बचने के लिए धीरे-धीरे ऐसा करें।
    8. माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार होने पर, प्रत्येक किनारे पर एक छोटी सी बूंद रखकर और फिर एक निर्बाध सील बनाने के लिए नेल पॉलिश ब्रश के साथ बूंदों को जोड़कर स्पष्ट नेल पॉलिश ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कवरस्लिप को सील करें।
      नोट: इस म्यान प्रोटोकॉल का उपयोग साइटोलॉजिकल दाग, जैसे, 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई), तटस्थ लाल, या ट्रिपैन नीले, या प्लांट सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए सेल प्लास्मोलिसिस के अवलोकन के लिए किया जा सकता है। म्यान धुंधला हो जाना या सेल plasmolysis assays के लिए, coverslip सील नहीं है.
    9. प्लास्मोलिसिस परख के लिए, कवरस्लिप के एक किनारे पर एक हाइपरटोनिक समाधान (0.75 एम सुक्रोज या 1 एम सोडियम क्लोराइड) जोड़ें और कवरस्लिप के दूसरे किनारे पर नमूने में समाधान खींचने के लिए एक मुड़ा हुआ लिंट-फ्री टिशू पेपर का उपयोग करें। धुंधला होने के लिए, दाग समाधान को लागू करने के लिए एक समान विधि का उपयोग करें।
  2. वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी
    1. एक बार पत्ती म्यान खुर्दबीन स्लाइड पर मुहिम शुरू कर रहे हैं, 400x बढ़ाई पर एक widefield प्रकाश खुर्दबीन का उपयोग कर कवक उपनिवेशण के लिए उन्हें निरीक्षण.
    2. कवक संरचनाओं का विस्तार से निरीक्षण करने के लिए, नमूनों की बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए तेल के बजाय पानी के विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें। अपवर्तक-सूचकांक बेमेल के कारण गोलाकार विपथन छवि क्षरण का कारण बन सकता है। पानी के उद्देश्य वाइडफील्ड प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ-साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपलब्ध हैं।
    3. प्रति म्यान उपनिवेशण के सापेक्ष राशि का निर्धारण करने के लिए, 100x बढ़ाई पर एक widefield प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रत्येक कवक प्रवेश साइट से आक्रमण मक्का कोशिकाओं की संख्या की गिनती. यह मात्रा का ठहराव उपभेदों, उपचारों और/या विकासात्मक चरणों की तुलना करने वाले किसी भी सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले एक उपयुक्त स्क्रीनिंग कदम है।
  3. कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी
    1. ट्रांसजेनिक कवक उपभेदों के विकास के दौरान मक्का के ऊतकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का निरीक्षण करने के लिए, बुनियादी छवि अधिग्रहण मापदंडों को समायोजित करें। चयनित फ्लोरोसेंट मार्कर के आधार पर सर्वोत्तम उत्तेजना/उत्सर्जन सेटिंग्स की पहचान करें।
      नोट: स्रावित प्रोटीन के साथ निर्मित फ्लोरोसेंट फ्यूजन का विश्लेषण करते समय एक 60x पानी का उद्देश्य बेहतर होता है। आधुनिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ने कलाकृतियों और आकार विपथन से बचने के लिए अत्यधिक सही जल विसर्जन उद्देश्यों को सही किया है।
    2. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लाइव सेल इमेजिंग इरादा है, autofluorescence के लिए नियंत्रण के रूप में untransformed कवक उपभेदों का उपयोग करें. एक उल्टे confocal खुर्दबीन पर और mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए fungal-मेजबान गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए निम्न छवि अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग करें. अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर 5%, 450-600 उच्च वोल्टेज (एचवी) तक लेजर पावर सेट करें, 1.375 एक्स लाभ, 3% ऑफसेट, प्रति अनुभाग पांच मक्का कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए 1 का ऑप्टिकल ज़ूम फैक्टर, और व्यक्तिगत हाइप के लिए 2-5 का ऑप्टिकल ज़ूम फैक्टर।
      नोट: उच्च-रिज़ॉल्यूशन जेड-स्टैक कॉन्फोकल छवियां त्रि-आयामी डेटा और मेजबान और रोगज़नक़ के बीच वास्तविक समय की बातचीत का बेहतर दृश्य प्रदान करती हैं।
    3. स्रावित संलयन प्रोटीन के अनुरूप प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा का ठहराव के लिए, कॉन्फोकल निर्माता या इमेजजे जैसे इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, जिसे स्वतंत्र रूप से ऑनलाइन डाउनलोड किया जा सकता है। तदनुसार फ्लोरोसेंट संकेतों की मात्रा निर्धारित करने के तरीके के विवरण के लिए एक मैनुअल से परामर्श करें।

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Representative Results

नीचे दिए गए उदाहरण मक्का पत्ती म्यान टीकाकरण विधि के उपयोग के बाद प्रतिनिधि परिणामों का वर्णन करते हैं। ये उदाहरण आसानी, गति और सटीकता प्रदर्शित करते हैं जिसके साथ मक्का-कवक इंटरैक्शन के अवलोकन और तुलना को इस अनुकूलित परख के साथ वास्तविक समय में पूरा किया जा सकता है। लाइव-सेल इमेजिंग मात्रात्मक जानकारी के निष्कर्षण की भी अनुमति देता है, तुलनात्मक आणविक, साइटोलॉजिकल और शारीरिक अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है। अधिक विवरण प्रत्येक सफल आवेदन के लिए उद्धृत मूल प्रकाशनों में पाया जा सकता है।

उदाहरण डेटा 1: फंगल स्थिति के मूल्यांकन और फंगल संक्रमण के लिए पौधों की प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए टीका पत्ती म्यान में धुंधला और प्लास्मोलिसिस का उपयोग
मक्का पत्ती म्यान का उपयोग उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ जीवित मेजबान कोशिकाओं में कोलेटोट्रिचम ग्रैमिनिकोला और स्टेनोकार्पेला मेडिस की संक्रमण प्रक्रियाओं की कल्पना और तुलना करने के लिए किया गया है, जिससे उपनिवेश पैटर्न और समय पाठ्यक्रम (अप्रकाशित परिणाम; चित्र 6)।

इन अध्ययनों से पता चला है कि एस मेडिस तेजी से एपिडर्मल कोशिकाओं पर सीधे उदासीन हाइफल सूजन के माध्यम से आक्रमण करता है, सी. ग्रैमिनिकोला के विपरीत जो मेलेनाइज्ड एप्रेसोरिया पैदा करता है। एक बार एपिडर्मल कोशिकाओं के अंदर, दोनों रोगजनक स्पष्ट रूप से बरकरार सेल दीवारों (चित्रा 6 ए, बी) से गुजरते हुए सेल से सेल तक आगे बढ़ते हैं।

फंगल हाइपहे को उपनिवेशित करने की प्रकृति और सीमा का मूल्यांकन करने के लिए शीथ को ट्रिपैन ब्लू या डीएपीआई के साथ दाग दिया जा सकता है (चित्र 6)। ट्रिपैन ब्लू धुंधला होने से पता चलता है कि सी ग्रैमिनिकोला शुरू में मोटी प्राथमिक हाइप के माध्यम से आक्रमण करता है जो बहुत संकीर्ण कनेक्शन के माध्यम से कोशिकाओं के बीच चलते हैं। बाद में, कवक एक नेक्रोट्रॉफिक चरण में बदल जाता है, कॉलोनी के केंद्र में पतले माध्यमिक हाइपहे का उत्पादन करता है (चित्र 6 सीई)12,14,16,17।

Figure 6
चित्रा 6: उज्ज्वल क्षेत्र या एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ छवि रहित या दाग टीका लगाया गया मक्का पत्ती म्यान। (ए) इंट्रासेल्युलर हाइपहे 48 एच पोस्ट-इनोक्यूलेशन (एचपीआई) स्टेनोकार्पेला मेडिस के साथ। संक्रमण थोड़ा सूजा हुआ हाइफल टिप्स (तीर) के माध्यम से होता है। (बी) इंट्रासेल्युलर हाइपहे 48 एचपीआई कोलेटोट्रिचम ग्रैमिनिकोला के साथ। संक्रमण मेलेनाइज्ड एप्रेसोरिया (तीर) के माध्यम से होता है। (सी) सी. ग्रैमिनिकोला का हाइपहे, ट्रिपैन ब्लू के साथ दाग, संकीर्ण कनेक्शन (तीर), 72 एचपीआई के माध्यम से आगे बढ़ने वाली कॉलोनी किनारे पर सेल-टू-सेल की प्रगति। (डी) 72 एचपीआई पर सी. ग्रैमिनिकोला के ट्रिपैन-ब्लू सना हुआ हाइफा का नज़दीकी दृश्य, एक संकीर्ण कनेक्शन (तीर) के माध्यम से मक्का सेल की दीवार से गुजरता है। (ई) कॉलोनी केंद्र 72 एचपीआई में ट्रिपैन ब्लू के साथ सना हुआ सी. ग्रैमिनिकोला का हाइपहे। संकीर्ण माध्यमिक हाइप को मोटे प्राथमिक हाइप (तीर) से उभरते हुए देखा जा सकता है। (एफ) सी. ग्रैमिनिकोला 72 एचपीआई का हाइफे, डीएपीआई के साथ दाग वाली पत्ती म्यान पर आगे बढ़ने वाली कॉलोनी के किनारे पर। यूवी प्रकाश के तहत सना हुआ कवक और पौधे नाभिक प्रतिदीप्ति। 50 माइक्रोन के बराबर प्रत्येक पैनल में स्केल सलाखों. माइक्रोग्राफ एक मोनोक्रोमैटिक डिजिटल कैमरा का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है जो एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ मिलकर होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

म्यान को तटस्थ लाल और/या प्लास्मोलिसिस के अधीन किया जा सकता है ताकि रोगजनक कवक (चित्रा 7) द्वारा संक्रमण और उपनिवेशण के दौरान मक्का कोशिकाओं के विकासात्मक कोशिका विज्ञान और व्यवहार्यता का अध्ययन किया जा सके।

कोलेटोट्रिचम ग्रैमिनिकोला एक हेमिबायोट्रॉफ़िक कवक है जो मोटी प्राथमिक हाइप के साथ जीवित मक्का कोशिकाओं पर हमला करता है जो एक झिल्ली (चित्रा 7ए-सी)12,14,16,17द्वारा मेजबान साइटोप्लाज्म से अलग होते हैं। दूसरी ओर, स्टेनोकार्पेला मेडिस, एक नेक्रोट्रॉफिक कवक है जो फाइटोटॉक्सिन23 का उत्पादन करता है और एपिडर्मल कोशिकाओं (जो दानेदार हो जाते हैं और प्लास्मोलाइज़ करने में विफल रहते हैं) को मारता है, इससे पहले कि यह उन पर हमला करता है (चित्र 7D)।

सी. graminicola और अन्य पर्ण रोगजनकों के खिलाफ मक्का रक्षा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के संचय शामिल (आरओएस), विशेष रूप से हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2 ओ2)12,15. पौधे रोगज़नक़ बातचीत के oxidative रसायन विज्ञान की जांच करने के लिए, 3,3′-diaminobenzidine (डीएबी) सेल धुंधला24 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. डीएबी एच 2 ओ2 द्वाराऑक्सीकरण किया जाता है, एक गहरे भूरे रंग के अवक्षेप का उत्पादन करता है जो मक्का पत्ती शीथ (चित्रा 7 ई, एफ)12,24में दिखाई देता है। वर्णक का उत्पादन एक मेजबान प्रतिरोध प्रतिक्रिया से संबंधित ऑक्सीडेटिव फट का एक संकेतक है।

Figure 7
चित्रा 7: दाग और / या प्लास्मोलिज़्ड इनोक्यूलेटेड मक्का पत्ती म्यान उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ imaged. (ए) पत्ती म्यान सी graminicola 24 एचपीआई के साथ inoculated और plasmolysis और तटस्थ लाल के साथ धुंधला हो जाना के अधीन. एप्रेसोरिया (तीर) प्लास्मोलाइज़ और दाग के नीचे रहने वाली मक्का कोशिकाएं, यह दर्शाती हैं कि रोगज़नक़ आक्रमण से पहले कोशिकाओं को नहीं मारता है। (बी) पत्ती म्यान 48 एचपीआई सी ग्रैमिनिकोला के साथ, प्लास्मोलिसिस के अधीन और तटस्थ लाल रंग के साथ धुंधला हो जाना। मक्का कोशिकाएं जो प्राथमिक हाइप (तीर) द्वारा उपनिवेशित होती हैं, अभी भी जीवित हैं, यह स्थापित करते हुए कि सी. ग्रैमिनिकोला कोशिकाओं पर बायोट्रॉफ के रूप में आक्रमण करता है। (सी) सी. ग्रैमिनिकोला के साथ लीफ म्यान 48 एचपीआई, कॉलोनी के अग्रिम किनारे पर हाइपहे चलती सेल-टू-सेल दिखा रहा है। म्यान को प्लास्मोलाइज्ड किया गया है लेकिन दाग नहीं दिया गया है। कॉलोनी किनारे (तीर) से सटे अउपनिवेशित कोशिकाएं प्लास्मोलाइज़ करना जारी रखती हैं। (डी) पत्ती म्यान 24 एचपीआई एस मेडिस के साथ, प्रवेश से पहले। अंकुरित बीजाणु (तीर) के नीचे की कोशिकाएं दानेदार दिखाई देती हैं और प्लास्मोलाइज़ करने में विफल रहती हैं, यह दर्शाता है कि एस मेडिस उन्हें प्रवेश से पहले मारता है और यह एक नेक्रोट्रॉफ़ के रूप में व्यवहार करता है। (ङ) प्रतिरोधी मक्का की पत्ती आवरण एमपी 305 24 एचपीआई के साथ सी. ग्रामिनिकोला और डीएबी से सना हुआ। डार्क धुंधला छवि के केंद्र में एकल कोशिका की एक मजबूत ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रिया को इंगित करता है, जबकि भूरे रंग के वर्णक के हेलो को अधिकांश व्यक्तिगत एप्रेसोरिया के आसपास देखा जा सकता है, और फोटो के शीर्ष पर कोशिकाओं में दानेदार बनाना देखा जा सकता है। (एफ) एप्रेसोरिया के चारों ओर जमा भूरे रंग के वर्णक के प्रभामंडल का एक नज़दीकी दृश्य, और पास के मक्का सेल की दीवारों (तीर) में वर्णक का जमाव। प्रत्येक पैनल में स्केल बार 50 माइक्रोन के बराबर होते हैं, (एफ) को छोड़कर जो 20 माइक्रोन है। माइक्रोग्राफ एक मोनोक्रोमैटिक डिजिटल कैमरा का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है जो एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ मिलकर होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उदाहरण डेटा 2: फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कवक के साथ लाइव-सेल इमेजिंग
साइटोप्लाज्मिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाले फंगल हाइपहे को एक एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(चित्रा 8)का उपयोग करके किसी भी दाग की आवश्यकता के बिना लाइव शीथ कोशिकाओं में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर देखा जा सकता है।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन को विभिन्न कवक अंगों, जैसे, माइटोकॉन्ड्रिया, नाभिक, या एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम को लक्षित किया जा सकता है, ताकि प्लांटा (चित्रा 8सी)25,26,27,28(अप्रकाशित परिणाम) में जीवित कवक कोशिकाओं में उनके स्थानों और गतिविधियों को ट्रैक किया जा सके। फ्लोरोसेंट प्रोटीन को विभिन्न फंगल प्रमोटरों द्वारा विभिन्न कार्यों के लिए संवाददाताओं के रूप में सेवा करने के लिए भी संचालित किया जा सकता है: उदाहरण के लिए, बीआईपी चैपरोन स्राव तनाव प्रतिक्रिया प्रोटीन द्वारा संचालित आरएफपी दिखाया गया है(चित्रा 8डी)29(अप्रकाशित परिणाम)। पत्ती म्यान का उपयोग व्यक्तिगत रूप से टैग किए गए फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन के दृश्य को सक्षम बनाता है जो फंगल हाइपहे द्वारा संचित और स्रावित होते हैं क्योंकि वे मेजबान कोशिकाओं 8,9(चित्रा 8ई)को उपनिवेशित करते हैं। ट्रांसजेनिक मक्का लाइनों विभिन्न सेलुलर डिब्बों, जैसे, नाभिक या प्लाज्मा झिल्ली के लिए लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त भी30,31 उपलब्ध हैं, और मक्का सेलुलर संरचनाओं जैसे, नाभिक पर संक्रमण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए टीका के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन ट्रांसजेनिक मक्का लाइनों के उपयोग से पता चला है कि अप्रभावित मक्का कोशिकाओं में नाभिक आमतौर पर सेल की दीवार पर पलायन करते हैं जो कोशिकाओं के सबसे करीब है जो पहले से ही उपनिवेशित हैं सी। चित्रा 8 एफ)।

Figure 8
चित्रा 8: एपिफ्लोरेसेंस (ए, बी) या कॉन्फोकल (सी, डी, ई, एफ) फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले कोलेटोट्रिचम ग्रैमिनिकोला की इमेजिंग। (ए) बिना दागदार, प्लास्मोलाइज़्ड लीफ म्यान 48 एचपीआई के साथ सी. ग्रैमिनिकोला स्ट्रेन जो एमआरएफपी को टोक्सा प्रमोटर34 के नियंत्रण में साइटोप्लाज्मिक रूप से व्यक्त करता है। इन पत्ती आवरण में महत्वपूर्ण ऑटोफ्लोरेसेंस भी देखा जाता है। (बी) बिना दाग वाली पत्ती म्यान 48 एचपीआई के साथ सी. ग्रैमिनिकोला स्ट्रेन एसजीएफपी को टोक्सा प्रमोटर के नियंत्रण में साइटोप्लाज्मिक रूप से व्यक्त करता है। (सी) Colletotrichum graminicola एक HDEL लंगर35 के साथ endomembrane प्रणाली को लक्षित SGFP व्यक्त. (डी) सी. ग्रैमिनिकोला के साथ 24 एचपीआई के साथ बिना दाग वाला पत्ता म्यान बीआईपी चैपरोन के प्रमोटर के नियंत्रण में एमआरएफपी के साथ बदल गया। प्राथमिक हाइफा में लाल प्रतिदीप्ति स्राव तनाव के जवाब में बीआईपी सक्रियण का एक संकेतक है। (ई) अरबीनोफ्यूरानोसिडेस का संचय:: सी. ग्रामिनिकोला डब्ल्यूटी प्राथमिक हाइफा में एमचेरी फ्यूजन प्रोटीन जो 44 एचपीआई पर मक्का पत्ती म्यान सेल की दीवार को पार कर रहा है। (एफ) एक ट्रांसजेनिक मक्का लाइन की पत्ती म्यान वाईएफपी को पौधे के नाभिक30,31, 48 एचपीआई को लक्षित करती है, जिसमें सी ग्रैमिनिकोला का एक तनाव होता है, जो टोक्सा प्रमोटर के नियंत्रण में एमआरएफपी साइटोप्लाज्मिक रूप से व्यक्त करता है। प्रत्येक पैनल में स्केल बार 20 माइक्रोन के बराबर होते हैं, पैनल ए को छोड़कर जहां यह 50 माइक्रोन के बराबर होता है। माइक्रोग्राफ एक मोनोक्रोमैटिक डिजिटल कैमरा का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे जो एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ मिलकर था। (सीएफ) में छवियाँ एक लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ कब्जा कर लिया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उदाहरण डेटा 3: फंगल उपभेदों के बीच संगत/असंगत प्रतिक्रियाओं और इंटरैक्शन के विस्तृत कोशिका विज्ञान की जांच करने के लिए मक्का के पत्ते के आवरण का उपयोग
एक गैर-रोगजनक सी. ग्रैमिनिकोला उत्परिवर्ती तनाव (सीपीआर 1 एमटी) की तुलना मक्का पत्ती म्यान(चित्रा 9ए,बी)12में जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) तनाव से की गई थी।

साइटोप्लाज्मिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए उपभेदों की लाइव-सेल इमेजिंग ने प्रदर्शित किया कि उत्परिवर्ती विशेष रूप से मक्का पत्ती म्यान के भीतर सेल से सेल तक आंदोलन में बिगड़ा हुआ था। म्यान प्रोटोकॉल ने सटीक मात्रा का ठहराव सक्षम किया जिससे पता चला कि सीपीआर 1 एमटी पहले उपनिवेशित सेल 95% समय (चित्रा 9 सी)12तक ही सीमित था। यह डब्ल्यूटी के विपरीत चिह्नित था, जिसमें 5% से कम संक्रमण एक ही समय सीमा12 में पहले उपनिवेशित सेल के भीतर बने रहे। दिलचस्प बात यह है कि सीपीआर 1 एमटी स्थानीय रूप से फ्रीज-मारे गए म्यान में पहले शुरू में संक्रमित सेल से परे सैप्रोफाइटिक रूप से बढ़ने में सक्षम था, जैसे डब्ल्यूटी स्ट्रेन (चित्रा 9 डी)। इससे संकेत मिलता है कि उपनिवेश बनाने के लिए सीपीआर 1 एमटी की अक्षमता विशेष रूप से जीवित मक्का सेल की सक्रिय प्रतिक्रिया से संबंधित थी।

पत्ती म्यान टीका परख जीएफपी-व्यक्त सीपीआर 1 एमटी और आरएफपी-व्यक्त डब्ल्यूटी उपभेदों के बीच बातचीत का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, उन्हें एक ही पत्ती म्यान12 पर सह-टीका लगाकर। जब उपभेदों को एक साथ करीब टीका लगाया गया था (8 से अधिक मक्का कोशिकाओं के अलावा), सीपीआर 1 एमटी सामान्य रूप से सेल से सेल (चित्रा 9ई, एफ) तक बायोट्रॉफ के रूप में विकसित करने में सक्षम था। प्लास्मोलिसिस परख ने पुष्टि की कि सीपीआर 1 एमटी कवक जीवित कोशिकाओं12 में प्रवेश किया। इन सभी विस्तृत टिप्पणियों को म्यान परख द्वारा संभव बनाया गया था और एक फैलाने योग्य कारक के अस्तित्व को निहित किया गया था जो सी. ग्रामिनिकोला के डब्ल्यूटी तनाव द्वारा उत्पादित संगतता को प्रेरित करता है लेकिन सीपीआर 1 एमटी12 में कमी है।

Figure 9
चित्रा 9: कोलेटोट्रिचम ग्रैमिनिकोला के डब्ल्यूटी और सीपीआर 1 एमटी उपभेदों को शामिल करने वाले संगत और असंगत इंटरैक्शन। विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग दो उपभेदों को प्रतिष्ठित करने की अनुमति दी जब मक्का पत्ती म्यान12 पर सह-टीका लगाया गया। (ए) डब्ल्यूटी सी ग्रैमिनिकोला तनाव 48 एचपीआई पर मक्का पत्ती म्यान में साइटोप्लाज्मिक एमआरएफपी व्यक्त करता है। (ख) सी. ग्रामिनिकोला सीपीआर 1 एमटी स्ट्रेन 72 एचपीआई पर मक्का पत्ती के आवरण में एसजीएफपी व्यक्त करता है। सीपीआर 1 एमटी केवल शायद ही कभी (< 5% समय) पहले संक्रमित सेल से परे उपनिवेश करता है, यहां तक कि टीकाकरण के 6 दिन बाद भी। (सी) 72 डीपीआई पर एसजीएफपी व्यक्त करने वाले सी. ग्रामिनिकोला सीपीआर 1 एमटी स्ट्रेन का नज़दीकी दृश्य। इस मामले में, यह सेल की दीवार को अगले सेल में पार करने में कामयाब रहा, लेकिन फिर यह विकसित होना बंद हो गया। (डी) सी. ग्रामिनिकोला सीपीआर 1 एमटी स्ट्रेन एसजीएफपी, 48 एचपीआई को मारे गए शीथ ऊतकों में व्यक्त करता है। cpr1 MT स्ट्रेन WT के समान गैर-जीवित मक्का म्यान कोशिकाओं को तेजी से उपनिवेशित करता है। (E) जब WT-mRFP C. graminicola और cpr1 MT-GFP C. GRAMINICOLA उपभेदों को मक्का पत्ती म्यान (48 HPI) पर एक साथ सह-टीका लगाया जाता है, cpr1 MT-GFP तनाव बायोट्रॉफ के रूप में सामान्य रूप से जीवित मक्का म्यान कोशिकाओं के माध्यम से प्रगति करने की क्षमता प्राप्त करता है। प्लास्मोलिसिस परख द्वारा जीवित कोशिकाओं के अंदर बायोट्रॉफिक वृद्धि की पुष्टि की गई थी। (एफ) एसजीएफपी को व्यक्त करने वाले सी. ग्रैमिनिकोला सीपीआर 1 एमटी तनाव का एक नज़दीकी दृश्य, डब्ल्यूटी (8 से अधिक मक्का कोशिकाओं के अलावा) के निकट टीका लगाए जाने पर सेल-टू-सेल से बढ़ रहा है। स्केल बार 50 माइक्रोन (ए, बी, और ई) या 20 माइक्रोन (सी, डी, और एफ) के बराबर हैं। माइक्रोग्राफ एक मोनोक्रोमैटिक डिजिटल कैमरा का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे जो एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ मिलकर था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

टीका म्यान भी ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि विश्लेषण32,33 के लिए शाही सेना निष्कर्षण के लिए ऊतकों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. म्यान इस उद्देश्य के लिए आदर्श थे क्योंकि संक्रमण प्रक्रिया की निगरानी के लिए निष्कर्षण से पहले उनका निरीक्षण किया जा सकता था, इस प्रकार कई प्रतिकृतियों में नमूना एकरूपता सुनिश्चित करना। इन अध्ययनों ने कोलेटोट्रिचम जीवन शैली संक्रमण चरणों32,33 के बीच अलग-अलग व्यक्त जीन की तरंगों की पहचान की अनुमति दी।

उदाहरण डेटा 4: उप-इष्टतम प्रयोगों के परिणाम
असंतोषजनक लाइव-सेल इमेजिंग पत्ती म्यान की अपर्याप्त ट्रिमिंग का परिणाम हो सकता है, जिससे एपिडर्मल सेल परतों और ऑप्टिकली अपारदर्शी नमूनों(चित्रा 10)को ओवरलैप किया जा सकता है।

Figure 10
चित्रा 10: पत्ती म्यान की अपर्याप्त ट्रिमिंग के कारण उप-इष्टतम प्रयोगात्मक परिणाम। ए) कई एपिडर्मल सेल परतों का उदाहरण जो कवक विकास की परीक्षा में हस्तक्षेप करता हैऔर एन विवो करता है। (बी) लाइव सेल इमेजिंग को प्रभावित सेल परतों अतिव्यापी का उदाहरण. स्केल सलाखों 20 माइक्रोन के बराबर. माइक्रोग्राफ एक मोनोक्रोमैटिक डिजिटल कैमरा का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे जो एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ मिलकर था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक अन्य संभावित उप-इष्टतम प्रयोग परिणाम एक असमायोजित इनोकुलम एकाग्रता है जिसके परिणामस्वरूप कम (चित्रा 11 ए) या बीजाणुओं की उच्च संख्या हो सकती है: उत्तरार्द्ध के परिणामस्वरूप अंकुरण या दमनकारी पैठ(चित्रा 11बी)कम हो सकता है। उत्तरार्द्ध प्रत्येक कवक प्रवेश स्थल पर उपनिवेशित मक्का कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव भी बाधित कर सकता है।

Figure 11
चित्रा 11: अनुचित तरीके से समायोजित इनोकुलम एकाग्रता के कारण उप-प्रयोग परिणाम। ए। कम सी. graminicola बीजाणु निलंबन एकाग्रता म्यान पर टीका जिसके परिणामस्वरूप कवक प्रवेश साइटों की कम संख्या में है। जन्‍म। पत्ती के आवरण पर उच्च सी. ग्रैमिनिकोला इनोकुलम एकाग्रता के कारण निकटता में कई एप्रेसोरिया होता है, और मेजबान सेल प्रवेश कम हो जाता है। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन के बराबर. माइक्रोग्राफ एक मोनोक्रोमैटिक डिजिटल कैमरा का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे जो एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ मिलकर था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सूक्ष्म अवलोकन का समय (एचपीआई) मक्के की पत्ती के आवरण पर लगाया गया सी. ग्रामिनिकोला का विकासात्मक चरण
12 अपप्रेसोरिया
24 प्राथमिक हाइपहे
36 माध्यमिक हाइपहे
48 माध्यमिक हाइपहे
60 असरवुली
72 असरवुली
108 असरवुली

तालिका 1: Colletotrichum graminicola संक्रमण समय पाठ्यक्रम: जीवन शैली संक्रमण के दौरान कवक विकास मील के पत्थर के आधार पर C. graminicola तनाव M1.001 के साथ टीका मक्का पत्ती म्यान के समय पाठ्यक्रम का सारांश. सूक्ष्म अवलोकन हर 12 घंटे में किए गए थे।

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Discussion

अनुकूलित पत्ती म्यान टीका यहाँ वर्णित एक मूल प्रोटोकॉल है कि के लिए विकसित किया गया था और चावल पत्ती म्यान 6,8,36 के लिए लागू किया गया है से संशोधित किया गया है. यह वाइडफील्ड या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ जीवित पौधों की कोशिकाओं में कवक के विकास और विकास के प्रत्यक्ष, विस्तृत अवलोकन की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है, तुलना, और मक्का उपनिवेशण के दौरान सूक्ष्म घटनाओं की एक किस्म की मात्रा का ठहराव, संगत बनाम असंगत बातचीत के दौरान कवक विकास और मेजबान प्रतिक्रियाओं सहित; प्लांटा में विशिष्ट कवक प्रोटीन का उत्पादन और स्राव; और मक्का-कवक बातचीत के दौरान उत्पादित सामान्य या उपन्यास रोगजनकता कारकों के कोशिका विज्ञान और जैव रसायन। हमने मक्का के हेमिबायोट्रॉफ़िक और नेक्रोट्रॉफ़िक रोगजनकों के साथ इस विधि का उपयोग किया है। हमने बायोट्रॉफिक रोगजनकों (जैसे, जंग कवक) के साथ टीकाकरण का प्रयास नहीं किया है, लेकिन म्यान, क्योंकि वे जीवित रहते हैं, उस आवेदन के लिए भी उपयोगी होंगे। हम भी मेजबान और खेती विशिष्ट प्रतिरोध 7,37 की कोशिका विज्ञान की जांच के लिए ज्वार म्यान के लिए इस विधि लागू किया है. ज्वार म्यान के लिए, प्रोटोकॉल के लिए एकमात्र समायोजन केंद्र में एक बूंद को लागू करने के बजाय बीजाणु निलंबन के साथ पूरे म्यान को भरना था। ज्वार के आवरण के छोटे व्यास के कारण यह आवश्यक था।

इन म्यान परखों के उपयोग ने मेजबान उपनिवेशण और फंगल अणुओं के तंत्र पर हमारे विस्तृत अध्ययनों को बहुत उन्नत किया है जो रोगजनकता के लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, विधि के आवेदन ने मक्का द्वारा सी. सबलीनोला की गैर-मेजबान मान्यता का प्रदर्शन किया, और ज्वार द्वारा सी. ग्रामिनिकोला ,दोनों मामलों में अतिसंवेदनशील प्रतिरोध प्रतिक्रियाओं सहित। मक्का के पत्ते के म्यान का उपयोग एक ही म्यान पर दूरी पर फंगल उपभेदों के बीच बातचीत का परीक्षण करने के लिए भी किया गया था। इस मामले में, एक रोगजनक WT और गैर रोगजनक cpr1 मीट्रिक टन तनाव के सह-टीकाकरण एक साथ रहने वाले म्यान पर डब्ल्यूटी तनाव द्वारा मक्का कोशिकाओं की संवेदनशीलता के प्रेरण का प्रदर्शन किया और रोगजनकता12 में शामिल एक विसारक कारक के लिए सबूत प्रदान की. म्यान ने अलग-अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाले दो उपभेदों के भेदभाव की अनुमति दी, और उपभेदों के लिए उपनिवेशीकरण प्रक्रिया की मात्रा का ठहराव और सांख्यिकीय तुलना या तो अकेले या एक साथ टीका लगाई।

इस मक्का पत्ती म्यान परख लाइव-सेल इमेजिंग के लिए पूरे संयंत्र के टीकाकरण पर कई फायदे हैं। सबसे पहले, प्रोटोकॉल बेहतर इमेजिंग प्रदान करता है, समाशोधन या निर्धारण के लिए आवश्यकता के बिना, रोगजनकों वास्तविक समय में रहने वाले मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत. उदाहरण के लिए, मक्का पत्ती म्यान का उपयोग कर अध्ययन हेमीबायोट्रॉफिक सी graminicola में बायोट्रॉफी से नेक्रोट्रॉफी के लिए एक अलग स्विच का पता लगाने में सक्षम और एक गैर रोगजनक उत्परिवर्ती 7,12,16,17 के लिए कार्यात्मक तुलना की सुविधा. हालांकि एम के साथ टीका लगाया गया चावल पत्ती म्यान कथित तौर पर लक्षण है कि पूरे चावल के पौधों36 में मनाया उन लोगों के अनुरूप नहीं है पेश कर सकते हैं, समय और उपनिवेश की उपस्थिति, ऊतक पतन, और मक्का म्यान में घाव के विकास पूरे पत्तियों 12,14 में है कि के समान है. म्यान परख का दूसरा लाभ यह है कि यह प्रतिकृति और फंगल उपनिवेशण12,18 के प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता भर में अधिक से अधिक synchronicity से पता चलता है. जबकि पूरे संयंत्र टीका कवक प्रवेश18 के अनियमित स्तर में परिणाम कर सकते हैं, म्यान inoculations के अधिक उच्च नियंत्रित शर्तों अधिक synchronicity प्रदान करते हैं और अधिक सटीक जांच और बातचीत की मात्रा का ठहराव की अनुमति. इस वृद्धि हुई synchronicity प्रतिलेख विश्लेषण32,33 में म्यान के उपयोग की सुविधा प्रदान की. इसके अलावा, म्यान प्रोटोकॉल प्रतिलेख विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करने की आवश्यक गति सक्षम: ट्रिमिंग, rinsing, और स्क्रीनिंग प्रत्येक म्यान 2 मिनट से अधिक नहीं ले लिया इससे पहले कि वे आरएनए निष्कर्षण32,33 के लिए जमे हुए फ्लैश थे.

संक्रमण के सफल लाइव-सेल इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण कदमों में शामिल हैं: 1) प्रयोगों के लिए काटने के तुरंत बाद म्यान का उपयोग किया जाना चाहिए। उत्तेजित टीका म्यान को 6 दिनों से अधिक समय तक बरकरार नहीं रखा जाना चाहिए: यदि फंगल उपनिवेशण भारी है, तो वे अधिक तेज़ी से नीचा दिखाएंगे12; 2) अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए एक ही विकासात्मक आयु के म्यान चुनने के लिए सावधान रहें; 3) संस्कृतियों से एक ताजा बीजाणु निलंबन का उपयोग करें जिन्होंने अधिकतम स्पोरुलेशन हासिल किया है; 4) ऑप्टिकली स्पष्ट नमूने बनाने के लिए अधिक कुशल ट्रिमिंग के लिए तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करें; 5) नमूनों के अत्यधिक और अनावश्यक हेरफेर को कम करें क्योंकि यह प्रक्रिया लाइव संरचनाओं और छवि गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है; 6) यह सुनिश्चित करने के लिए दैनिक आर्द्रता कक्षों की जांच करें कि फिल्टर पेपर पर्याप्त रूप से नम है; और 7) जब एक confocal खुर्दबीन पर इमेजिंग नमूने, अधिग्रहण सेटिंग्स प्रयोग के दौरान तय रखने के लिए तीव्रता परिवर्तन या पूर्वाग्रह शुरू करने से बचने के लिए जब नमूनों भर में फ्लोरोसेंट संकेतों की तुलना. फ्लोरोसेंट प्रोटीन फोटोब्लीच कर सकते हैं यदि लेजर तीव्रता और अवधि बहुत अधिक है, और वे कमजोर संकेत दे सकते हैं यदि ऊतक वर्गों को लंबे समय तक सीलबंद कवरस्लिप के नीचे रखा जाता है। सभी उपयुक्त नियंत्रणों सहित प्रारंभिक प्रयोगों को मानकीकृत करने और सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए स्थितियों, सामग्रियों और समयसीमा को अनुकूलित करने के लिए किया जाना चाहिए।

समस्या निवारण
ऑप्टिकली स्पष्ट म्यान का उत्पादन करने के लिए हाथ-ट्रिमिंग अपर्याप्त है
यह संभव है कि रेजर ब्लेड सुस्त हो गया हो। यदि ऐसा है, तो इसे ठीक से निपटाएं और एक नए सिंगल-एज रेजर ब्लेड पर स्विच करें। मध्यम दबाव का प्रयोग करें और ब्लेड को म्यान से 90° के कोण पर रखें। नमूना धीरे परिमार्जन, लेकिन लगातार, एक फ्लैट और पारभासी खंड के अवलोकन तक. यह confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के लिए आगे बढ़ने से पहले एक यौगिक खुर्दबीन के तहत म्यान की जांच करने के लिए सलाह दी जाती है.

टीका लगाया हुआ मक्का म्यान बेहद नाजुक होता है
यह तब होता है जब कवक ने पौधे के अधिकांश ऊतकों को उपनिवेशित कर दिया है। नतीजतन, ऊतक नीचा और ढह जाता है। नेक्रोट्रॉफ़िक चरण में पहले से ही नमूने तैयार करते समय, धीरे से एक खुर्दबीन स्लाइड के खिलाफ अनुभाग दबाएं, बाँझ डि पानी की एक बूंद लागू करें, और नमूना को एक साफ कवरस्लिप के साथ एक-दो बार परिमार्जन करें।

विवो में कम बीजाणु अंकुरण और प्रवेश
यह अंकुरण या प्रवेश को रोकने वाले बीजाणुओं की एक उच्च संख्या के कारण हो सकता है। सुनिश्चित करें कि इनोकुलम एकाग्रता 5 x 105 बीजाणु/एमएल पर समायोजित है। यदि समस्या बनी रहती है, तो एकाग्रता को 5 x 104 बीजाणु/एमएल में समायोजित करें। विवो प्रयोग में नियंत्रण के रूप में, एक ताजा पीडीए प्लेट पर एक ही बीजाणु निलंबन के 50 माइक्रोन रखें और इसे समान रूप से फैलाएं। बीजाणु व्यवहार्यता और अंकुरण की दैनिक जाँच करें।

म्यान में अतुल्यकालिक कवक विकास चरण
सुनिश्चित करें कि मक्का के पौधे एक ही विकास के चरण में हैं और म्यान अनुभाग एक ही नोड से प्राप्त किए गए थे। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि बीजाणु व्यवहार्य हैं और फंगल संस्कृतियां इष्टतम चरण में हैं (उदाहरण के लिए, इनोकुलम तैयारी के लिए सी ग्रैमिनिकोला के लिए 2 सप्ताह पुरानी संस्कृतियों से अधिक नहीं)।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है और खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक यूएसडीए-एनआईएफए को उनके वित्तीय समर्थन (अनुदान संख्या 2018-67013-28489 और 2020-70410-32901) के लिए धन्यवाद देते हैं। इस पांडुलिपि में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें पूरी तरह से लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि अमेरिकी कृषि विभाग के विचारों को प्रतिबिंबित करें। हम साइंस विदाउट बॉर्डर्स को धन्यवाद देते हैं, ब्राजील के छात्र मायारा डी सिल्वा का दौरा करते हैं, चित्र 6A और चित्र 7D में दिखाई देने वाली छवियों के लिए। हम ओलंपस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप तक पहुंच प्रदान करने के लिए केंटकी विश्वविद्यालय में प्लांट पैथोलॉजी विभाग को भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiocam monochrome microscope camera ZEISS 426560-9010-000 Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscope ZEISS N/A Allows live viewing and image/video capture of biological samples 
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL Thermo Fisher Scientific 75002431 Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lid Fisher Scientific 08-757-105 Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper  Fisher Scientific 09-920-115 Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscope Olympus N/A For visualization of fungal transformants' 
Germination paper Anchor Paper Co. SD7615L 76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishes VWR International 75845-542 Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass;
complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool  Ohio Valley Specialty Chemical  3350 For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass VWR International 15170-172 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslips Fisher Scientific 12-553-457  Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seeds West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada CN361 Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes  USA Scientific   1415-2500 1.5 mL capacity
Microscope slides  Fisher Scientific 12-550-123  Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA) VWR International 255210 Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polish Revlon 43671 Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plate USA Sientific 1402-9500 100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubes USA Scientific  1415-5390 Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective  Olympus 1-UB933 Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA) VWR International 90000-758 Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BX Premium Horticulture Supply Co. N/A Premium general-purpose growing medium formulated to provide
a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers  Greenhouse Megastore  CN-SS-SC-10B 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers tray Greenhouse Megastore  CN-SS-SCTR98 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor blade Thermo Fisher Scientific 17-989-145 AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closure Target 002-02-0405 Clear view storage boxes for rmoist chamber;
outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity

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References

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अलग मक्का शीथ लाइव-सेल इमेजिंग फंगल पर्ण मक्का रोगजनकों प्रोटोकॉल अनुकूलन हेमिबायोट्रॉफिक कवक नेक्रोट्रॉफिक कवक सूक्ष्म अवलोकन फंगल विकास और विकास जीवित संयंत्र कोशिकाएं बीजाणु निलंबन आर्द्रता कक्ष निरंतर फ्लोरोसेंट प्रकाश एपिडर्मल कोशिकाएं ऑप्टिकल स्पष्टता वास्तविक समय दृश्य धुंधला प्लास्मोलिसिस विकासात्मक कोशिका विज्ञान मेजबान और रोगज़नक़ कोशिकाओं की व्यवहार्यता फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रतिस्पर्धी बातचीत सहक्रियात्मक बातचीत फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन
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Belisário, R., Torres, M. F., Buiate, E. A. S., Xavier, K. V., Nuckles, E. M., Vaillancourt, L. J. Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens. J. Vis. Exp. (199), e65755, doi:10.3791/65755 (2023).

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