Summary
Dette manuskript beskriver en optimeret podningsprotokol, der bruger løsrevne majsbladskeder til reproducerbare cytologiske, fysiologiske og molekylære undersøgelser af majsinteraktioner med svampeplantepatogener. Bladskederne letter realtidsobservation af cellulære interaktioner mellem den levende plante og svamp i ikke-fikserede væv.
Abstract
Vi har optimeret en protokol til podning af majsbladskeder med hemibiotrofe og nekrotrofe bladpatogene svampe. Metoden er modificeret fra en, der oprindeligt blev anvendt på risbladskeder og tillader direkte mikroskopisk observation af svampevækst og udvikling i levende planteceller. Bladskeder opsamlet fra majsplanter med to fuldt fremkomne bladkraver podes med 20 μL dråber 5 x 105 sporer/ml svampesporesuspensioner og inkuberes i fugtighedskamre ved 23 °C under kontinuerligt fluorescerende lys. Efter 24-72 timer fjernes overskydende væv med et barberblad for at efterlade et enkelt lag epidermale celler, en optisk klar prøve, der kan afbildes direkte uden behov for kemisk fiksering eller clearing. Plante- og svampeceller forbliver i live i eksperimentets varighed, og interaktioner kan visualiseres i realtid. Skeder kan farves eller udsættes for plasmolyse for at studere udviklingscytologi og levedygtighed af værts- og patogenceller under infektion og kolonisering. Svampestammer, der omdannes til at udtrykke fluorescerende proteiner, kan podes eller co-inokuleres på skederne for øget opløsning og for at lette evalueringen af konkurrencedygtige eller synergistiske interaktioner. Svampestammer, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner, kan bruges til at spore og kvantificere produktionen og målretningen af disse individuelle proteiner i planta. Inokuleret kappevæv kan ekstraheres for at karakterisere nukleinsyrer, proteiner eller metabolitter. Anvendelsen af disse skedeanalyser har i høj grad fremmet de detaljerede undersøgelser af mekanismerne for svampepatogenicitet i majs og også af svampeproteineffektorer og sekundære metabolitter, der bidrager til patogenicitet.
Introduction
Rumlige og tidsmæssige analyser på celleniveau er afgørende for at forstå fysiologien og cytologien af svampe-plante-interaktioner. Bladvæv, der er blevet kemisk fikseret 1,2,3 eller ryddet og farvet4, samt kunstige membraner5, er tidligere blevet brugt til at undersøge cytologien af bladpatogenudvikling og plante-svampeinteraktioner. Imidlertid er undersøgelse af infektionshændelser i levende værtsvæv i realtid uden fiksering eller clearing udfordrende på grund af tekniske problemer i forbindelse med forberedelse af optisk gennemsigtige prøver til billeddannelse.
En løsrevet bladkappe podningsprotokol blev udviklet i slutningen af 1940'erne til lys felt mikroskopisk undersøgelse af resistens af levende ris epidermale celler til risblastsvampen Magnaporthe oryza6. For nylig er detaljerede molekylære, fysiologiske og cytologiske observationer af værtskolonisering af Colletotrichum og Magnaporthe-arter blevet stærkt lettet ved at kombinere modificerede versioner af denne bladkappemetode med svampetransformanter, der udtrykker fluorescerende proteiner, og højtydende levende cellebilleddannelsesprotokoller, herunder epifluorescens og konfokalmikroskopi 7,8,9,10,11,12,13.
Dette papir beskriver en optimeret podningsprotokol ved hjælp af løsrevne majsbladskeder til observation af infektionsprocesser ved hemibiotrofe og nekrotrofe bladsvampepatogener. Vi har specifikt brugt det til at studere Colletotrichum graminicola (C. graminicola), årsagsmidlet til anthracnose bladrødme og stilkrot og Stenocarpella maydis, som forårsager Diplodia bladrødme og stilkrot. Metoden bør dog kunne anvendes på andre hemibiotrofe og nekrotrofiske bladsvampepatogener. Cytologiske og fysiologiske reaktioner under infektion og koloniseringshændelser i disse udskårne bladskeder svarer til dem i hele bladblade12,14,15. Desuden svarer hemibiotrofisk kolonisering af skedeepidermale celler af C. graminicola til kolonisering af stilkpithceller16,17. Løsrevne skeder viser større synkronicitet og eksperimentel reproducerbarhed af svampeindtrængning og kolonisering end bladblade eller stilkvæv14,16,17,18. De fleste majssorter kan anvendes til denne protokol. Imidlertid er indavlede eller hybrider med overdreven lilla pigmenter i skederne mindre egnede, da pigmenterne forstyrrer billeddannelsen. Golden Jubilee sukkermajs har været særlig nyttig til vores undersøgelser, fordi ubehandlede frø er kommercielt tilgængelige, planterne er meget modtagelige for mange bladsygdomme, og de vokser godt i drivhuset. De første epidemier af anthracnose stilkrot i USA resulterede i det samlede tab af sukkermajsafgrøder i Indiana i 1970'erne19,20. Denne bladkappeinokulationsmetode kan anvendes til direkte at observere og kvantificere svampevækst og udvikling i levende vs. lokalt dræbte planteceller, til at demonstrere resistensreaktioner i kompatible / inkompatible reaktioner på svampeinfektion og til at teste interaktioner mellem svampestammer på den samme kappe i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Arbejdsprocessen for metoden er vist i figur 1.
Figur 1: Trin i den optimerede podningsprotokol ved hjælp af løsrevne majsbladskeder. Sporesuspensionspræparat, bladskedepodning og prøveforberedelse til levende cellemikroskopi fremhæves i henholdsvis grønne (A), lilla (B) og orange (C) kasser. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Plante- og svampemateriale
- Plantevækst
- Dyrk majsplanter (se materialetabellen) i drivhuset (14 timer lys/27 °C og 10 timer mørk/22 °C) i SC10-beholdere (se materialetabel). Brug et vækstmedium bestående af tre dele kommerciel pottejord (se materialetabel) og to dele dampsteriliseret muldjord.
- Vandplanter i 2 minutter med et overliggende vandingssystem en gang hver dag om morgenen.
- Høst kimplanter på V2-stadiet ved at skære dem på jordniveau. V2-vækststadiet nås, når frøplanterne er 5 til 10 cm høje og har to synlige blade med krave21.
- Pakk planterne med et fugtigt papirhåndklæde og læg dem i en plastikpose til transport til laboratoriet til videre behandling.
- Svampekulturer
- Oplagrede silicastamkulturer med svampe genaktiveres under aseptiske forhold22ved at drysse ca. 50 granulater af det angrebne silica på et passende agarmedium. For at undgå morfologiske ændringer og tab af patogenicitet stammer subkultur ikke mere end 3x efter reaktivering. Kartoffeldextroseagar (PDA; se materialetabel) bruges rutinemæssigt til dyrkning af C. graminicola, mens havregrynagar (OA; se materialetabel) bruges til S. maydis.
- For at forberede PDA til dyrkning af svampebestande suspenderes 19,5 g kommercielt fremstillet dehydreret PDA i 500 ml deioniseret (DI) vand. For at fremstille OA koges 36 g kommercielt fremstillet dehydreret OA i DI-vand i 15-30 minutter, filtreres gennem tre lag ostekloth og bringes filtrat til 500 ml med DI-vand. Autoklavemedier til sterilisering.
- Det smeltede, afkølede medie suppleres med et passende antibiotikum (f.eks. hygromycin B, geneticin), når der arbejdes med transformeringsstammer. De endelige koncentrationer af hygromycin eller geneticin i 500 ml medier er henholdsvis 250 μg/ml og 100 μg/ml.
- Inkuber kulturer under optimale forhold, indtil et sporulerende mycelium har udviklet sig. Colletotrichum graminicola og S. maydis vokser godt ved 23 °C med kontinuerligt fluorescerende lys og luftfugtighed. Sporulation forekommer 7 dage efter podning (dai) for S. maydis eller 14 dai for C. graminicola.
2. Inokulationer af bladskeder
- Montering af glasuldsfilterenhed
- Brug kraftige sakse eller sakse til at afskære hætten og ca. 0,5 mm fra den koniske bund af et 1,5 ml mikrocentrifugerør (se materialetabel).
- Anbring et stykke glasuld (ca. 0,5 cm x 0,5 cm; se materialetabel) inde i det afskårne rør for at dække det midterste hul, som vist i figur 2.
- Brug handsker, mens du skærer glasuld, da borosilikatglas kan forårsage irritation.
- Forberedelse af støttestativer til bladkappe
- Skær en PCR-plade uden nederdel med 96 brønde (se materialetabellen) i seks støttestativer med to kolonner (8 x 2 brønde) som vist i figur 3A.
- Vend stativerne med to søjler, så brøndenes koniske bund vender opad og de flade toppe vender nedad (figur 3B).
- Læg hver støtte i en petriplade af glas, der indeholder fugtet filtrerpapir, og dæk den med låget (se materialetabellen). Denne enhed fungerer som et lille fugtighedskammer til skederne.
- Forberedelse af podning
- For hver svampestamme anbringes en samlet glasuldsfilterenhed i et intakt sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør som vist i figur 2. Sidstnævnte fungerer som et opsamlingsrør.
- Mærk rørene.
- Høst konidier fra sporulerende kulturer ved først at oversvømme hver plade med 3-4 ml sterilt DI-vand. Mere vand kan i nogle tilfælde være nødvendigt for at producere et lag væske på kolonioverfladen. Befugtningsmidler er ikke nødvendige i dette system.
- Løsn sporerne fra agaren ved hjælp af en steril konisk spids støder, (se tabel over materialer) for at skrabe jævnt over hele pladen.
- Påfør 1 ml sporeophæng aseptisk på en glasuldsfilterenhed, og lad sporerne strømme igennem i opsamlingsrøret ved tyngdekraften.
- Opsamlingsglassene indeholdende de filtrerede sporesuspensioner centrifugeres ved 3.500 x g i 5 min. Sporerne skal pelleteres i bunden af mikrocentrifugerøret.
BEMÆRK: Centrifugering af C. graminicola-sporer ved højere hastigheder end anbefalet her resulterer i et betydeligt tab af levedygtighed. - Hæld væsken af i en autoklaverbar beholder, tilsæt 1 ml sterilt DI-vand, og omrør forsigtigt for at resuspendere de pelleterede sporer. Der centrifugeres som i trin 2.3.6.
- Vask sporer 3x for at fjerne enhver konidial matrix, der kan indeholde autohæmmere, der kan reducere spiring eller penetration.
- Efter den tredje vask tilsættes 300-500 μL sterilt DI-vand for at resuspendere sporer til kvantificering.
- Brug et hæmocytometer under et sammensat mikroskop ved 100x forstørrelse for at bestemme sporekoncentrationen. Sporefarvning er ikke nødvendig før tælling.
- Forbered en 5 x 105 sporer/ml suspension med sterilt DI-vand.
BEMÆRK: C. graminicola spore suspension kan opbevares ved stuetemperatur i højst 4 timer før hurtigt tab af levedygtighed. Køling af konidier øger ikke levedygtigheden.
- Podninger af skeder
- Kontroller relevante biosikkerhedspraksis og -procedurer, før du inokulerer planter med svampestammer.
- Fjern kappen fra det første ægte blad af V2-frøplanter ved at køre et miniaturebillede langs den overlappende kant af kappen, og løsn det forsigtigt fra skuddet. Løsn kappen fra begge sider af skuddet, før du prøver at fjerne den.
- Skær de genvundne bladskeder i segmenter på 3-5 cm. Det er ikke nødvendigt at desinficere kapperne før podning.
- Rul hvert segment meget forsigtigt ud for at udsætte det indre (adaxiale) epidermale lag.
- Mens du forbereder skeder til podning, skal du holde de resterende udskårne skeder indpakket med et fugtigt papirhåndklæde for at undgå udtørring.
- 20 μL af svampesporeopslæmningen anbringes på den indre overflade i midten af kappestykket, direkte over midterribben, som vist i figur 4.
- De podede bladskeder anbringes vandret med midtribben placeret nederst i understøtningen inde i en petriplade af glas, der indeholder et fugtet filtrerpapir som vist i figur 5.
- Hvert stativ rummer op til syv kapper. Der podes mindst fem hylstre pr. stamme for at kompensere for det tab af replikater, der kan opstå under prøveforberedelse eller inkubation.
- Anbring de små fugtkamre i en klar opbevaringsboks beklædt med fugtet spirepapir (se Materialetabel).
- Dæk kassen med låget. Kassen inkuberes ved 23 °C med kontinuerlig belysning i det planlagte tidsforløb, hvilket afhænger af svampen og af de svampeudviklingsstadier, der vil blive observeret. Tabel 1 indeholder en oversigt over tidsforløbet for majsskeder podet med C. graminicola.
- Kontroller hver dag for tegn / symptomer på sygdom på skederne og hold både spire- og filterpapir fugtigt. Bladskeder kan opbevares i op til 6 dage uden åbenbar plantecelledød eller nedbrydning i fravær af podning.
Figur 2: Forberedelse af glasuldsfilterenhed. (A) En 0,5 cm x 0,5 cm glasuldskugle placeres inde i mikrocentrifugerør 1, der har sin koniske bund fjernet. (B-C) Filterrøret anbringes derefter i mikrocentrifugerør 2 for at generere en samlet filterenhed til forberedelse af sporesuspension. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Metode til skæring af en PCR-plade uden nederdel med 96 brønde. (A) PCR-plade skåret i seks støttestativer, 8 x 2 brønde. Et eksempel på en enkelt kappestøtte er afbildet i (B). Bladskeder lægges vandret på støtten. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Metode til podning af kappe. Enkelt dråbe inokulum direkte påført den adaxiale overflade af kappesektionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kappe inkubationsmetode. Podede bladskeder anbragt vandret i et støttestativ inde i en petriplade af glas indeholdende fugtet filterpapir. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Levende cellemikroskopi
- Prøveforberedelse til mikroskopi
- Skyl kappestykker forsigtigt med sterilt DI-vand for at fjerne eventuelle ikke-klæbende sporer eller overfladisk svampevækst.
- Anbring kappen på et rent glasmikroskopglas (se materialetabel) med den adaxiale (indvendige) overflade af kappestykket nedad og den abaxiale (udvendige) overflade øverst.
- Brug et nyt barberblad med én kant (se materialetabellen) til at trimme ca. 1 cm af kappeenderne og fjerne det meste af laminavævet på hver side af midterribben.
- Hold barberbladet i en vinkel på 90° i forhold til kappen for at barbere væv fra den abaxiale midrib og eksponere det epidermale lag på den adaxiale overflade over det podede sted. Prøv at opretholde en ensartet tykkelse. Når bladskederne er barberet, anbefales yderligere trimning ikke, da dette kan beskadige prøven.
- Sørg for, at de barberede sektioner ikke er mere end 1 cm x 1 cm store. Undgå at trykke på midten af kappen under denne proces. Når du arbejder med skeder podet med forskellige sporesuspensioner, skal du desinficere handsker og skifte barberblad mellem prøverne.
- Hold et rent glasmikroskopglas klar. Løft kappesektionen fra den ene kant og overfør den forsigtigt til et nyt dias. Den podede (adaxiale) overflade af kappen skal være øverst, tættest på objektivlinsen. Monter sektioner forsigtigt for at undgå beskadigelse af svampestrukturer.
- Påfør 60 μL sterilt DI-vand på sektionen, og tilsæt et 24 mm x 60 mm glasdæksel (se materialetabel). Gør dette langsomt for at undgå luftbobler.
- Når du er klar til mikroskopi, forsegles dæksedlen med klar neglelak (se materialetabellen) ved at placere en lille dråbe på hver kant og derefter forbinde dråberne sammen med en neglelakbørste for at gøre en sømløs forsegling.
BEMÆRK: Denne kappeprotokol kan bruges med cytologiske pletter, fx 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), neutral rød eller trypanblå, eller til observation af celleplasmolyse for at evaluere plantecellelevedygtighed. Ved kappefarvning eller celleplasmolyseassays må dækslet ikke forsegles. - Til plasmolyseanalyser tilsættes en hypertonisk opløsning (0,75 M saccharose eller 1 M natriumchlorid) til den ene kant af dæksedlen, og der anvendes et foldet, fnugfrit tissuepapir til at trække opløsningen hen over prøven til den anden kant af dæksedlen. Til farvning skal du bruge en lignende metode til at påføre pletopløsningen.
- Widefield mikroskopi
- Når bladskederne er monteret på mikroskopglas, skal du inspicere dem for svampekolonisering ved hjælp af et widefield lysmikroskop ved 400x forstørrelse.
- For at observere svampestrukturer i detaljer skal du bruge et vandnedsænkningsmål i stedet for olie for bedre billedkvalitet af prøverne. Sfærisk aberration på grund af en uoverensstemmelse mellem brydningsindeks kan forårsage billedforringelse. Vandmål er tilgængelige for widefield lysmikroskoper såvel som konfokale mikroskoper.
- For at bestemme den relative mængde kolonisering pr. kappe skal du tælle antallet af majsceller, der invaderes fra hvert svampeindtrængningssted ved hjælp af et widefield lysmikroskop ved 100x forstørrelse. Denne kvantificering er et passende screeningstrin forud for statistiske analyser, der sammenligner stammer, behandlinger og/eller udviklingsstadier.
- Konfokal laserscanningsmikroskopi
- For at observere fluorescerende proteiner i majsvæv under udvikling af transgene svampestammer skal du justere de grundlæggende billedoptagelsesparametre. Identificer de bedste excitations-/emissionsindstillinger baseret på den valgte fluorescerende markør.
BEMÆRK: Et 60x vandmål foretrækkes ved analyse af fluorescerende fusioner konstrueret med udskillede proteiner. Moderne konfokale mikroskoper har stærkt korrigerede vandnedsænkningsmål for at undgå artefakter og formafvigelser. - Hvis levende cellebilleddannelse af fluorescerende proteiner er beregnet, skal du bruge utransformerede svampestammer som kontrol for autofluorescens. Brug følgende billedoptagelsesparametre til at fange svampeværtsdynamik på et inverteret konfokalmikroskop og til mCherry fluorescerende protein. Indstil lasereffekt op til 5%, 450-600 højspænding (HV) afhængigt af udtryksniveauet, 1,375 x forstærkning, 3% forskydning, en optisk zoomfaktor på 1 til analyse af op til fem majsceller pr. sektion og optisk zoomfaktor på 2-5 for individuelle hyfer.
BEMÆRK: Højopløselige Z-stack konfokale billeder giver tredimensionelle data og et bedre overblik over realtidsinteraktioner mellem værten og patogenet. - Til kvantificering af fluorescensintensiteter svarende til udskillede fusionsproteiner skal du bruge billedanalysesoftware fra den konfokale producent eller et billedbehandlingsprogram som ImageJ, som frit kan downloades online. Se en manual for detaljer om, hvordan du kvantificerer fluorescerende signaler i overensstemmelse hermed.
- For at observere fluorescerende proteiner i majsvæv under udvikling af transgene svampestammer skal du justere de grundlæggende billedoptagelsesparametre. Identificer de bedste excitations-/emissionsindstillinger baseret på den valgte fluorescerende markør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksemplerne nedenfor beskriver repræsentative resultater efter anvendelse af podningsmetoden for majsbladskeder. Disse eksempler demonstrerer den lethed, hastighed og præcision, hvormed observation og sammenligning af majs-svampeinteraktioner kan opnås i realtid med dette optimerede assay. Levende cellebilleddannelse tillader også ekstraktion af kvantitativ information, hvilket giver et nyttigt værktøj til sammenlignende molekylære, cytologiske og fysiologiske undersøgelser. Yderligere oplysninger findes i de originale publikationer, der er citeret for hver vellykket ansøgning.
Eksempeldata 1: Anvendelse af farvning og plasmolyse i podede bladskeder til evaluering af svampestatus og påvisning af planters reaktioner på svampeinfektion
Majsbladskeder er blevet brugt til at visualisere og sammenligne infektionsprocesserne af Colletotrichum graminicola og Stenocarpella maydis i levende værtsceller med lysfeltmikroskopi, hvilket muliggør detaljerede beskrivelser af koloniseringsmønstre og tidsforløb (upublicerede resultater; Figur 6).
Disse undersøgelser afslørede, at S. maydis hurtigt invaderer epidermale celler direkte via udifferentierede hyphal hævelser, i modsætning til C. graminicola , der producerer melaniseret appressoria. En gang inde i epidermale celler fortsætter begge patogener fra celle til celle ved at passere gennem tilsyneladende intakte cellevægge (figur 6A, B).
Skeder kan farves med trypanblå eller DAPI for lettere at evaluere arten og omfanget af koloniserende svampehyfer (figur 6). Trypanblå farvning afslører, at C. graminicola oprindeligt invaderer via tykke primære hyfer, der bevæger sig mellem celler gennem meget smalle forbindelser. Senere skifter svampen til et nekrotrofisk stadium og producerer tyndere sekundære hyfer i midten af kolonien (figur 6 C-E)12,14,16,17.
Figur 6: Ufarvede eller farvede podede majsbladskeder afbildet med lysfelts- eller epifluorescensmikroskopi. A) Intracellulære hyfer 48 timer efter podning (hpi ) med Stenocarpella maydis. Infektion sker via let hævede hyphal spidser (pil). B) Intracellulære hyfer 48 hpi med Colletotrichum graminicola. Infektion sker via melaniseret appressoria (pile). (C) Hyfer af C. graminicola, farvet med trypanblåt, der udvikler celle-til-celle ved den fremrykkende kolonikant via smalle forbindelser (pil), 72 hpi. (D) Nærmere billede af trypanblåfarvet hypha af C. graminicola ved 72 hpi, der passerer gennem majscellevæggen via en smal forbindelse (pil). (E) Hyfer af C. graminicola, farvet med trypanblå, i kolonicentret 72 hpi. Smallere sekundære hyfer kan ses komme ud af de tykkere primære hyfer (pile). F) Hyfer af C. graminicola 72 hpi, ved den fremrykkende kolonikant på en bladkappe farvet med DAPI. De farvede svampe- og plantekerner fluorescerer under UV-lys. Skalastænger i hvert panel svarende til 50 μm. Mikrografier opnået ved hjælp af et monokromatisk digitalkamera kombineret med et epifluorescensmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Skeder kan farves med neutralt rødt og/eller underkastes plasmolyse for at undersøge majscellernes udviklingscytologi og levedygtighed under infektion og kolonisering af patogene svampe (figur 7).
Colletotrichum graminicola er en hemibiotrofisk svamp, der invaderer levende majsceller med tykke primære hyfer, der adskilles fra værtscytoplasmaet af en membran (figur 7A-C) 12,14,16,17. Stenocarpella maydis er derimod en nekrotrofisk svamp, der producerer et fytotoksin23 og dræber epidermale celler (som bliver granuleret og undlader at plasmolysere), før det invaderer dem (figur 7D).
Majsforsvar mod C. graminicola og andre bladpatogener involverer akkumulering af reaktive oxygenarter (ROS), især hydrogenperoxid (H2O2)12,15. For at undersøge den oxidative kemi af plantepatogeninteraktioner kan 3,3′-diaminobenzidin (DAB) anvendes til cellefarvning24. DAB oxideres afH2O2, hvilket giver et mørkebrunt bundfald, der er synligt i majsbladskederne (figur 7 E,F)12,24. Produktion af pigmentet er en indikator for en oxidativ burst relateret til et værtsresistensrespons.
Figur 7: Farvede og/eller plasmolyserede podede majsbladskeder afbildet med lysfeltmikroskopi. A) Bladkappe podet med C. graminicola 24 hpi og underkastet plasmolyse og farvning med neutralt rødt. Levende majsceller under appressoria (pile) plasmolyserer og pletter, hvilket viser, at patogenet ikke dræber cellerne før invasion. B) Bladkappe 48 hpi med C. graminicola, underkastet plasmolyse og farvning med neutralt rødt. Majsceller, der er koloniseret af primære hyfer (pil), lever stadig, hvilket fastslår, at C. graminicola invaderer celler som en biotrof. (C) Bladskede 48 hpi med C. graminicola, der viser hyfer, der bevæger celle til celle ved koloniens fremrykkende kant. Skeder er blevet plasmolyseret, men ikke farvet. Ukoloniserede celler, der støder op til kolonikanten (pile), fortsætter med at plasmolysere. (D) Bladskede 24 hpi med S. maydis, før gennemtrængning. Cellerne under den spirede spore (pil) ser granulerede ud og undlader at plasmolysere, hvilket indikerer, at S. maydis dræber dem før penetration, og at den opfører sig som en nekrotrof. E) Bladskede af resistent majs indavlet Mp305 24 hpi med C. graminicola og bejdset med DAB. Mørk farvning indikerer en stærk oxidativ reaktion af den enkelte celle i midten af billedet, mens haloer af brunt pigment kan ses omkring det meste af de enkelte appressoria, og granulering kan observeres i cellerne øverst på billedet. (F) Et nærmere billede af haloer af brunt pigment akkumuleret omkring appressoria og aflejring af pigment i majscellevæggene i nærheden (pile). Skalastænger i hvert panel er lig med 50 μm, undtagen (F), som er 20 μm. Mikrografier opnået ved hjælp af et monokromatisk digitalkamera kombineret med et epifluorescensmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Eksempeldata 2: Billeddannelse af levende celler med svampe, der udtrykker fluorescerende proteiner
Svampehyfer, der udtrykker cytoplasmatiske fluorescerende proteiner, kan visualiseres ved høj opløsning i levende kappeceller uden behov for pletter ved hjælp af et epifluorescens eller konfokalmikroskop (figur 8).
Fluorescerende proteiner kan målrettes mod forskellige svampeorganeller, fx mitokondrier, kerner eller endomembransystemet, for at spore deres placeringer og aktiviteter i de levende svampeceller i planta (figur 8C) 25,26,27,28 (upublicerede resultater). Fluorescerende proteiner kan også drives af forskellige svampepromotorer til at fungere som reportere til forskellige funktioner: for eksempel vises RFP drevet af BiP chaperonsekretionsstressresponsproteinet (figur 8D)29 (ikke-offentliggjorte resultater). Brugen af bladskeder muliggør visualisering af individuelt mærkede fluorescerende fusionsproteiner, der akkumuleres og udskilles af svampehyfer, når de koloniserer værtsceller 8,9 (figur 8E). Transgene majslinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner rettet mod forskellige cellulære rum, f.eks. kerner eller plasmamembraner, er også tilgængelige30,31 og kan bruges til podninger for at evaluere virkningerne af infektion på majscellestrukturer, f.eks. kerner. Anvendelse af disse transgene majslinjer viste, at kerner i ikke-invaderede majsceller typisk migrerer til den cellevæg, der er nærmest celler, der allerede er koloniseret af C. graminicola (ikke-offentliggjorte resultater; Figur 8F).
Figur 8: Epifluorescens (A, B) eller konfokal (C, D, E, F) billeddannelse af Colletotrichum graminicola, der udtrykker fluorescerende proteiner. A) Ufarvet, plasmolyseret bladkappe 48 hpi med en C. graminicola-stamme, der udtrykker mRFP cytoplasmatisk under kontrol af ToxA-promotoren34. Signifikant autofluorescens bemærkes også i disse bladskeder. B) Ufarvet bladkappe 48 hpi med en C. graminicola-stamme, der udtrykker SGFP cytoplasmatisk under kontrol af ToxA-promotoren. C)Colletotrichum graminicola, der udtrykker SGFP målrettet mod endomembransystemet med et HDEL-anker35. (D) Ufarvet bladkappe 24 hpi med C. graminicola transformeret med mRFP under kontrol af promotoren for C. graminicola-homologen af BiP-chaperonen. Den røde fluorescens i den primære hypha er en indikator for BiP-aktivering som reaktion på sekretionsstress. E) Akkumulering af arabinofuranosidase::mCherry fusionsprotein i C. graminicola WT primær hypha, som krydser majsbladskedens cellevæg ved 44 hpi. F) Bladkappe af en transgen majslinje, der udtrykker YFP rettet mod plantekernerne30,31, 48 hpi med en stamme af C. graminicola, der udtrykker mRFP cytoplasmatisk under kontrol af ToxA-promotoren. Skalabjælker i hvert panel er lig med 20 μm, undtagen for panel A, hvor det er lig med 50 μm. Mikrografier blev opnået ved hjælp af et monokromatisk digitalkamera kombineret med et epifluorescensmikroskop. Billeder i (C-F) blev taget med et laserscanning konfokalmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Eksempeldata 3: Anvendelse af majsbladskeder til undersøgelse af den detaljerede cytologi af kompatible/uforenelige reaktioner og interaktioner mellem svampestammer
En ikke-patogen C. graminicola-mutantstamme (cpr1 MT) blev sammenlignet med vildtypestammen (WT) i majsbladskeder (figur 9A,B)12.
Levende cellebilleddannelse af stammerne mærket med cytoplasmatiske fluorescerende proteiner viste, at mutanten specifikt var nedsat i bevægelse fra celle til celle i majsbladskeder. Kappeprotokollen muliggjorde præcis kvantificering, der afslørede, at cpr1 MT var begrænset til den første koloniserede celle 95% af tiden (figur 9C)12. Dette var i markant kontrast til WT, hvor mindre end 5% af infektionerne forblev inden for den første koloniserede celle i samme tidsramme12. Interessant nok var cpr1 MT i stand til at vokse saprofytisk ud over den første oprindeligt inficerede celle i lokalt frysedræbte kapper, som WT-stammen (figur 9D). Dette indikerede, at cpr1 MT's manglende evne til at kolonisere specifikt var relateret til en aktiv reaktion fra den levende majscelle.
Bladkappepodningsanalysen blev brugt til at teste interaktioner mellem GFP-udtrykkende cpr1 MT og RFP-ekspressive WT-stammer ved at co-inokulere dem på den samme bladkappe12. Når stammerne blev podet tæt sammen (højst 8 majsceller fra hinanden), kunne cpr1 MT vokse normalt som en biotroph fra celle til celle (figur 9E, F). Plasmolyseanalyser bekræftede, at cpr1 MT-svampen kom ind i levende celler12. Alle disse detaljerede observationer blev muliggjort af kappeanalyserne og antydede eksistensen af en diffusibel faktor, der inducerer kompatibilitet produceret af WT-stammen af C. graminicola , men mangler i cpr1 MT12.
Figur 9: Kompatible og inkompatible interaktioner, der involverer WT- og cpr1 MT-stammer af Colletotrichum graminicola. Anvendelse af forskellige fluorescerende proteiner gjorde det muligt at skelne mellem de to stammer, når de blev podet sammen på majsbladskeder12. A) WT C. graminicola-stammen, der udtrykker cytoplasmatisk mRFP i majsbladskeder ved 48 hpi. B) C. graminicola cpr1 MT-stammen, der udtrykker SGFP i majsbladskeder ved 72 hpi. CPR1 MT koloniserer kun sjældent (<5% af tiden) ud over den første inficerede celle, selv op til 6 dage efter podning. (C) Et nærmere billede af C. graminicola cpr1 MT-stammen, der udtrykker SGFP ved 72 dpi. I dette tilfælde lykkedes det at krydse cellevæggen ind i den næste celle, men så stoppede den med at udvikle sig. D) C. graminicola cpr1 MT-stammen, der udtrykker SGFP, 48 hpi i dræbt kappevæv. CPR1 MT-stammen koloniserer hurtigt ikke-levende majskappeceller, svarende til WT. (E) Når WT-mRFP C. graminicola og cpr1 MT-GFP C. graminicola-stammerne co-podes tæt sammen på majsbladskeder (48 hpi), genvinder cpr1 MT-GFP-stammen evnen til at udvikle sig gennem levende majskappeceller normalt som en biotrof. Biotrofisk vækst inde i de levende celler blev bekræftet ved plasmolyseassays. F) Et nærmere billede af C. graminicola cpr1 MT-stammen, der udtrykker SGFP, og som vokser fra celle til celle, når den podes ved siden af WT (højst 8 majsceller fra hinanden). Skalabjælker er lig med 50 μm (A, B og E) eller 20 μm (C, D og F). Mikrografier blev opnået ved hjælp af et monokromatisk digitalkamera kombineret med et epifluorescensmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Podede skeder er også blevet brugt til at producere væv til RNA-ekstraktion til transkriptionel aktivitetsanalyse32,33. Skederne var ideelle til dette formål, da de kunne inspiceres før ekstraktion for at overvåge infektionsprocessen og dermed sikre prøveensartethed på tværs af flere replikationer. Disse undersøgelser tillod identifikation af bølger af differentielt udtrykte gener mellem Colletotrichum livsstilsovergangsstadier32,33.
Eksempeldata 4: Resultater af suboptimale eksperimenter
Utilfredsstillende billeddannelse af levende celler kan skyldes utilstrækkelig trimning af bladskeder, hvilket fører til overlappende epidermale cellelag og optisk uigennemsigtige prøver (figur 10).
Figur 10: Suboptimalt eksperimentelt resultat på grund af utilstrækkelig trimning af bladskeder.( A) Eksempel på flere epidermale cellelag, der forstyrrer undersøgelsen af svampeudvikling invivo. (B) Eksempel på overlappende cellelag, der påvirker levende cellebilleddannelse. Skalastænger svarende til 20 μm. Mikrografier blev opnået ved hjælp af et monokromatisk digitalkamera kombineret med et epifluorescensmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Et andet potentielt suboptimalt eksperimentresultat er en ujusteret podekoncentration, der kan resultere i lavt (figur 11A) eller højt antal sporer: sidstnævnte kan resultere i reduceret spiring eller appressorial penetration (figur 11B). Sidstnævnte kan også hæmme kvantificeringen af majsceller, der koloniseres på hvert svampeindtrængningssted.
Figur 11: Suboptimalt eksperimentresultat på grund af forkert justeret podekoncentration. A. Lav C. graminicola spore suspension koncentration inokuleret på skeder, hvilket resulterer i lavt antal svampepenetrationssteder. B. Høj C. graminicola inokulum koncentration på bladskeder forårsager flere appressoria i umiddelbar nærhed, og reduceret værtscelle penetration. Skalastænger svarende til 20 μm. Mikrografier blev opnået ved hjælp af et monokromatisk digitalkamera kombineret med et epifluorescensmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Tidspunkt for mikroskopisk observation (hpi) | Udviklingsstadiet af C. graminicola podet på majsbladskeder |
| 12 | Appressoria |
| 24 | Primære hyfer |
| 36 | Sekundære hyfer |
| 48 | Sekundære hyfer |
| 60 | Acervuli |
| 72 | Acervuli |
| 108 | Acervuli |
Tabel 1: Colletotrichum graminicola infektion tidsforløb: Resumé af tidsforløbet for majsbladskeder podet med C. graminicola stamme M1.001 baseret på svampeudviklingsmilepæle gennem livsstilsovergangen. Mikroskopiske observationer blev udført hver 12. time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den optimerede bladkappepodningsmetode, der er beskrevet her, er ændret fra en original protokol, der blev udviklet til og er blevet anvendt på risbladskeder 6,8,36. Det giver mulighed for direkte, detaljerede observationer af svampevækst og udvikling i levende planteceller med enten widefield eller konfokal mikroskopi. Protokollen er velegnet til karakterisering, sammenligning og kvantificering af en række mikroskopiske fænomener under majskolonisering, herunder svampeudvikling og værtsresponser under kompatible versus inkompatible interaktioner; produktion og sekretion af specifikke svampeproteiner i planta; og cytologi og biokemi af almindelige eller nye patogenicitetsfaktorer, der frembringes under interaktionen mellem majs og svampe. Vi har brugt denne metode med hemibiotrofe og nekrotrofiske patogener af majs. Vi har ikke forsøgt vaccinationer med biotrofiske patogener (f.eks. rustsvampe), men skeder, da de forbliver i live, ville også være nyttige til denne anvendelse. Vi har også anvendt denne metode på sorghumskeder til undersøgelser af cytologien af værts- og sortsspecifik resistens 7,37. For sorghumskeder var den eneste justering af protokollen at fylde hele kappen med sporeophæng i stedet for at anvende en enkelt dråbe i midten. Dette var nødvendigt på grund af sorghumskedens mindre diameter.
Brugen af disse kappeassays har i høj grad avanceret vores detaljerede undersøgelser af mekanismerne for værtskolonisering og svampemolekyler, der er kritiske for patogenicitet. For eksempel viste anvendelsen af metoden ikke-værtsgenkendelse af C. sublineola ved majs og af C. graminicola ved sorghum, herunder overfølsom resistensrespons i begge tilfælde7. Majsbladskeder blev også brugt til at teste interaktioner mellem svampestammer på afstand på samme kappe. I dette tilfælde viste sampodning af en patogen WT og ikke-patogen cpr1 MT-stamme sammen på levende skeder WT-stammens induktion af majscellers modtagelighed og gav dokumentation for en diffusibel faktor involveret i patogenicitet12. Skederne tillod differentiering af de to stammer, der udtrykte forskellige fluorescerende proteiner, og kvantificering og statistiske sammenligninger af koloniseringsprocessen for de stammer, der blev podet enten alene eller sammen.
Denne majsbladskedeanalyse har flere fordele i forhold til hele plantepodninger til billeddannelse af levende celler. For det første giver protokollen overlegen billeddannelse uden behov for rydning eller fiksering af patogener, der interagerer med levende værtsceller i realtid. For eksempel muliggjorde undersøgelser med majsbladskeder påvisning af et tydeligt skift fra biotrofi til nekrotrofi i hemibiotrofisk C. graminicola og lettede funktionelle sammenligninger med en ikke-patogen mutant 7,12,16,17. Selvom udskårne risbladskeder podet med M. oryzae angiveligt kan frembyde symptomer, der ikke svarer til dem, der observeres i hele risplanter36, svarer tidspunktet og udseendet af kolonisering, vævskollaps og læsionsudvikling i majsskeder til det i hele blade12,14. En anden fordel ved kappeanalysen er, at den viser større synkronicitet på tværs af replikationer og eksperimentel reproducerbarhed af svampekolonisering12,18. Mens podning af hele planten kan resultere i uregelmæssige niveauer af svampepenetration18, giver de mere stærkt kontrollerede betingelser for kappepodningerne mere synkronicitet og muliggør mere præcis undersøgelse og kvantificering af interaktioner. Denne øgede synkronicitet lettede brugen af skederne i transkriptomanalyser32,33. Desuden muliggjorde kappeprotokollen den nødvendige hastighed af prøveforberedelse til transkriptomanalyse: trimning, skylning og screening af hver kappe tog ikke mere end 2 minutter, før de blev flashfrosset til RNA-ekstraktion32,33.
Kritiske trin for vellykket levende cellebilleddannelse af infektion omfatter: 1) Skeder skal bruges umiddelbart efter skæring til forsøg. Udskårne inokulerede skeder bør ikke opbevares i mere end 6 dage: hvis svampekolonisering er tung, nedbrydes de hurtigere12; 2) Vær omhyggelig med at vælge kapper, der er af samme udviklingsalder for at sikre mere reproducerbare resultater; 3) Brug en frisk sporesuspension fra kulturer, der har opnået maksimal sporulation; 4) Brug skarpe barberblade til mere effektiv trimning for at producere optisk klare prøver; 5) Minimer overdreven og unødvendig manipulation af prøver, da denne proces kan påvirke levende strukturer og billedkvalitet negativt; 6) Kontroller fugtighedskamrene dagligt for at sikre, at filterpapiret er tilstrækkeligt fugtigt; og 7) Når du billeddanner prøver på et konfokalmikroskop, skal du holde erhvervelsesindstillingerne faste under eksperimentet for at undgå at indføre intensitetsændringer eller bias, når du sammenligner fluorescerende signaler på tværs af prøver. Fluorescerende proteiner kan fotobleges, hvis laserintensiteten og varigheden er for høj, og de kan give svagere signaler, hvis vævssektioner holdes under et forseglet dæksel i lang tid. Indledende forsøg, herunder alle passende kontroller, bør udføres for at standardisere og optimere betingelser, materialer og tidslinjer for de mest reproducerbare resultater.
Fejlfinding
Håndtrimning er utilstrækkelig til at producere optisk klare hylstre
Det er muligt, at barberbladet er blevet kedeligt. Hvis dette er tilfældet, skal du bortskaffe det korrekt og skifte til et nyt barberblad med en kant. Brug moderat tryk og hold bladet i en vinkel på 90° i forhold til kappen. Skrab prøven forsigtigt, men konsekvent, indtil observation af en flad og gennemskinnelig sektion. Det anbefales at kontrollere skeder under et sammensat mikroskop, før du fortsætter til det konfokale laserscanningsmikroskop.
Inokuleret majskappe er ekstremt skrøbelig
Dette sker, når svampen har koloniseret det meste af plantevævet. Derfor nedbrydes vævet og kollapser. Når du forbereder prøver, der allerede er i det nekrotrofiske stadium, skal du forsigtigt trykke sektionen mod et mikroskopglas, anvende en dråbe sterilt DI-vand og skrabe prøven en-to gange med en ren dæksel.
Lav sporespiring og penetration in vivo
Dette kan skyldes et stort antal sporer, der hæmmer spiring eller penetration. Sørg for, at podekoncentrationen er justeret til 5 x 105 sporer/ml. Hvis problemet fortsætter, skal du justere koncentrationen til 5 x 104 sporer/ml. Som kontrol for in vivo-forsøget anbringes 50 μL af samme sporeopslæmning på en frisk PDA-plade og fordeles jævnt. Kontroller sporens levedygtighed og spiring dagligt.
Asynkrone svampeudviklingsstadier på tværs af skeder
Sørg for, at majsplanterne er på samme vækststadium, og at kappesektionerne er fremstillet fra samme knude. Sørg også for, at sporer er levedygtige, og svampekulturer er på det optimale stadium (f.eks. Ikke længere end 2 uger gamle kulturer for C. graminicola) til podning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser og intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker USDA-NIFA for deres økonomiske støtte (tilskudsnumre 2018-67013-28489 og 2020-70410-32901). Alle meninger, resultater, konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette manuskript, er udelukkende forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis det amerikanske landbrugsministeriums synspunkter. Vi takker Science Without Borders besøgende studerende fra Brasilien, Mayara de Silva, for billederne, der vises i figur 6A og i figur 7D. Vi anerkender også Institut for Plantepatologi ved University of Kentucky for at give adgang til Olympus konfokale mikroskoper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. Plant pathological methods: fungi and bacteria. , Burgess Publishing Co. (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
