Løsrevne majsskeder til billeddannelse af levende celler af infektion med svampepatogener i bladmajs
Summary
Dette manuskript beskriver en optimeret podningsprotokol, der bruger løsrevne majsbladskeder til reproducerbare cytologiske, fysiologiske og molekylære undersøgelser af majsinteraktioner med svampeplantepatogener. Bladskederne letter realtidsobservation af cellulære interaktioner mellem den levende plante og svamp i ikke-fikserede væv.
Abstract
Vi har optimeret en protokol til podning af majsbladskeder med hemibiotrofe og nekrotrofe bladpatogene svampe. Metoden er modificeret fra en, der oprindeligt blev anvendt på risbladskeder og tillader direkte mikroskopisk observation af svampevækst og udvikling i levende planteceller. Bladskeder opsamlet fra majsplanter med to fuldt fremkomne bladkraver podes med 20 μL dråber 5 x 105 sporer/ml svampesporesuspensioner og inkuberes i fugtighedskamre ved 23 °C under kontinuerligt fluorescerende lys. Efter 24-72 timer fjernes overskydende væv med et barberblad for at efterlade et enkelt lag epidermale celler, en optisk klar prøve, der kan afbildes direkte uden behov for kemisk fiksering eller clearing. Plante- og svampeceller forbliver i live i eksperimentets varighed, og interaktioner kan visualiseres i realtid. Skeder kan farves eller udsættes for plasmolyse for at studere udviklingscytologi og levedygtighed af værts- og patogenceller under infektion og kolonisering. Svampestammer, der omdannes til at udtrykke fluorescerende proteiner, kan podes eller co-inokuleres på skederne for øget opløsning og for at lette evalueringen af konkurrencedygtige eller synergistiske interaktioner. Svampestammer, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner, kan bruges til at spore og kvantificere produktionen og målretningen af disse individuelle proteiner i planta. Inokuleret kappevæv kan ekstraheres for at karakterisere nukleinsyrer, proteiner eller metabolitter. Anvendelsen af disse skedeanalyser har i høj grad fremmet de detaljerede undersøgelser af mekanismerne for svampepatogenicitet i majs og også af svampeproteineffektorer og sekundære metabolitter, der bidrager til patogenicitet.
Introduction
Rumlige og tidsmæssige analyser på celleniveau er afgørende for at forstå fysiologien og cytologien af svampe-plante-interaktioner. Bladvæv, der er blevet kemisk fikseret 1,2,3 eller ryddet og farvet4, samt kunstige membraner5, er tidligere blevet brugt til at undersøge cytologien af bladpatogenudvikling og plante-svampeinteraktioner. Imidlertid er undersøgelse af infektionshændelser i levende værtsvæv i realtid uden fiksering eller clearing udfordrende på grund af tekniske problemer i forbindelse med forberedelse af optisk gennemsigtige prøver til billeddannelse.
En løsrevet bladkappe podningsprotokol blev udviklet i slutningen af 1940’erne til lys felt mikroskopisk undersøgelse af resistens af levende ris epidermale celler til risblastsvampen Magnaporthe oryza6. For nylig er detaljerede molekylære, fysiologiske og cytologiske observationer af værtskolonisering af Colletotrichum og Magnaporthe-arter blevet stærkt lettet ved at kombinere modificerede versioner af denne bladkappemetode med svampetransformanter, der udtrykker fluorescerende proteiner, og højtydende levende cellebilleddannelsesprotokoller, herunder epifluorescens og konfokalmikroskopi 7,8,9,10,11,12,13.
Dette papir beskriver en optimeret podningsprotokol ved hjælp af løsrevne majsbladskeder til observation af infektionsprocesser ved hemibiotrofe og nekrotrofe bladsvampepatogener. Vi har specifikt brugt det til at studere Colletotrichum graminicola (C. graminicola), årsagsmidlet til anthracnose bladrødme og stilkrot og Stenocarpella maydis, som forårsager Diplodia bladrødme og stilkrot. Metoden bør dog kunne anvendes på andre hemibiotrofe og nekrotrofiske bladsvampepatogener. Cytologiske og fysiologiske reaktioner under infektion og koloniseringshændelser i disse udskårne bladskeder svarer til dem i hele bladblade12,14,15. Desuden svarer hemibiotrofisk kolonisering af skedeepidermale celler af C. graminicola til kolonisering af stilkpithceller16,17. Løsrevne skeder viser større synkronicitet og eksperimentel reproducerbarhed af svampeindtrængning og kolonisering end bladblade eller stilkvæv14,16,17,18. De fleste majssorter kan anvendes til denne protokol. Imidlertid er indavlede eller hybrider med overdreven lilla pigmenter i skederne mindre egnede, da pigmenterne forstyrrer billeddannelsen. Golden Jubilee sukkermajs har været særlig nyttig til vores undersøgelser, fordi ubehandlede frø er kommercielt tilgængelige, planterne er meget modtagelige for mange bladsygdomme, og de vokser godt i drivhuset. De første epidemier af anthracnose stilkrot i USA resulterede i det samlede tab af sukkermajsafgrøder i Indiana i 1970’erne19,20. Denne bladkappeinokulationsmetode kan anvendes til direkte at observere og kvantificere svampevækst og udvikling i levende vs. lokalt dræbte planteceller, til at demonstrere resistensreaktioner i kompatible / inkompatible reaktioner på svampeinfektion og til at teste interaktioner mellem svampestammer på den samme kappe i realtid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den optimerede bladkappepodningsmetode, der er beskrevet her, er ændret fra en original protokol, der blev udviklet til og er blevet anvendt på risbladskeder 6,8,36. Det giver mulighed for direkte, detaljerede observationer af svampevækst og udvikling i levende planteceller med enten widefield eller konfokal mikroskopi. Protokollen er velegnet til karakterisering, sammenligning og kvantificering af en række mikroskopiske fæ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker USDA-NIFA for deres økonomiske støtte (tilskudsnumre 2018-67013-28489 og 2020-70410-32901). Alle meninger, resultater, konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette manuskript, er udelukkende forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis det amerikanske landbrugsministeriums synspunkter. Vi takker Science Without Borders besøgende studerende fra Brasilien, Mayara de Silva, for billederne, der vises i figur 6A og i figur 7D. Vi anerkender også Institut for Plantepatologi ved University of Kentucky for at give adgang til Olympus konfokale mikroskoper.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
