Summary
Detta manuskript beskriver ett optimerat inokuleringsprotokoll som använder fristående majsbladshöljen för reproducerbara cytologiska, fysiologiska och molekylära studier av majsinteraktioner med svampväxtpatogener. Bladslidorna gör det möjligt att i realtid observera cellulära interaktioner mellan den levande växten och svampen i ofixerade vävnader.
Abstract
Vi har optimerat ett protokoll för att inokulera majsbladsskidor med hemibiotrofa och nekrotrofa bladpatogena svampar. Metoden är modifierad från en metod som ursprungligen tillämpades på risbladsskidor och möjliggör direkt mikroskopisk observation av svamptillväxt och utveckling i levande växtceller. Bladslidor som samlats in från majsplantor med två fullt utvecklade bladkragar inokuleras med 20 μl droppar av 5 x 105 sporer/ml svampsporsuspensioner och inkuberas i fuktkammare vid 23 °C i kontinuerligt lysrörsljus. Efter 24-72 timmar avlägsnas överflödig vävnad med ett rakblad för att lämna ett enda lager av epidermala celler, ett optiskt klart prov som kan avbildas direkt utan behov av kemisk fixering eller rensning. Växt- och svampceller förblir vid liv under hela experimentet och interaktioner kan visualiseras i realtid. Slidor kan färgas eller utsättas för plasmolys för att studera utvecklingen av cytologi och livskraft hos värd- och patogenceller under infektion och kolonisering. Svampstammar som omvandlats till att uttrycka fluorescerande proteiner kan inokuleras eller saminokuleras på manteln för ökad upplösning och för att underlätta utvärderingen av konkurrerande eller synergistiska interaktioner. Svampstammar som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner kan användas för att spåra och kvantifiera produktionen och inriktningen av dessa enskilda proteiner i planta. Inokulerade mantelvävnader kan extraheras för att karakterisera nukleinsyror, proteiner eller metaboliter. Användningen av dessa manteltester har i hög grad främjat de detaljerade studierna av mekanismerna för svamppatogenicitet i majs och även av svampproteineffektorer och sekundära metaboliter som bidrar till patogenicitet.
Introduction
Rumsliga och tidsmässiga analyser på cellulär nivå är avgörande för att förstå fysiologin och cytologin hos interaktioner mellan svampar och växter. Bladvävnader somhar fixerats kemiskt 1,2,3 eller rensats och färgats4, samt konstgjorda membran5, har tidigare använts för att undersöka cytologin för bladpatogenutveckling och interaktioner mellan växter och svampar. Att undersöka infektionshändelser i levande värdvävnader i realtid utan fixering eller rensning är dock utmanande på grund av tekniska problem relaterade till beredning av optiskt transparenta prover för avbildning.
I slutet av 1940-talet utvecklades ett protokoll för inokulering av lösryckta bladhöljen för mikroskopisk undersökning av resistens hos levande epidermala risceller mot risblastsvampen Magnaporthe oryza6. På senare tid har detaljerade molekylära, fysiologiska och cytologiska observationer av värdkolonisering av Colletotrichum- och Magnaporthe-arter i hög grad underlättats genom att kombinera modifierade versioner av denna bladmantelmetod med svamptransformanter som uttrycker fluorescerande proteiner, och högpresterande avbildningsprotokoll för levande celler, inklusive epifluorescens och konfokalmikroskopi 7,8,9,10,11,12,13.
Denna artikel beskriver ett optimerat inokuleringsprotokoll med hjälp av fristående majsbladshöljen för observation av infektionsprocesser av hemibiotrofa och nekrotrofa bladsvamppatogener. Vi har specifikt använt den för att studera Colletotrichum graminicola (C. graminicola), orsaken till bladmögel och stjälkröta, och Stenocarpella maydis, som orsakar bladmögel och stjälkröta. Metoden bör dock kunna tillämpas på andra hemibiotrofa och nekrotrofa bladsvamppatogener. Cytologiska och fysiologiska reaktioner under infektion och kolonisering i dessa utskurna bladskidor liknar dem i hela bladblad12,14,15. Dessutom liknar hemibiotrofisk kolonisering av mantelepidermala celler av C. graminicola kolonisering av stjälkmärgceller16,17. Fristående höljen uppvisar större synkronicitet och experimentell reproducerbarhet av svamppenetration och kolonisering än bladblad eller stjälkmärgsvävnader14,16,17,18. De flesta majssorter kan användas för detta protokoll. Inavlade eller hybrider med för mycket lila pigment i höljet är dock mindre lämpliga eftersom pigmenten stör avbildningen. Golden Jubilee sockermajs har varit särskilt användbar för våra studier eftersom obehandlade frön är kommersiellt tillgängliga, växterna är mycket mottagliga för många bladsjukdomar och de växer bra i växthuset. De första epidemierna av anthracnose stjälkröta i USA resulterade i en total förlust av sockermajsskördar i Indiana på1970-talet 19,20. Denna metod för ympning av bladhöljen kan användas för att direkt observera och kvantifiera svamptillväxt och utveckling i levande kontra lokalt dödade växtceller, för att påvisa resistensreaktioner i kompatibla/inkompatibla svar på svampinfektion och för att testa interaktioner mellan svampstammar på samma hölje i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Arbetsflödet för metoden visas i figur 1.
Figur 1: Steg i det optimerade inokuleringsprotokollet med hjälp av lösryckta majsbladshöljen. Förberedelse av sporsuspension, inokulering av bladhölje och provberedning för mikroskopi av levande celler är markerade i gröna (A), lila (B) respektive orange (C) rutor. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Växt- och svampmaterial
- Växternas tillväxt
- Odla majsplantor (se materialtabell) i växthuset (14 timmar ljus/27 °C och 10 timmar mörkt/22 °C) i SC10-behållare (se materialtabell). Använd ett odlingsmedium som består av tre delar kommersiell krukjord (se materialtabell) och två delar ångsteriliserad matjord.
- Vattna plantor i 2 minuter med ett bevattningssystem en gång om dagen, på morgonen.
- Skörda plantor i V2-stadiet genom att klippa dem på jordnivå. V2-tillväxtstadiet uppnås när plantorna är 5 till 10 cm höga och har två synliga halsbandsblad21.
- Slå in växterna med en fuktig pappershandduk och lägg dem i en plastpåse för transport till laboratoriet för vidare bearbetning.
- Svamp kulturer
- Återaktivera lagrade stamkulturer av kvartssvamp under aseptiska förhållanden22genom att strö cirka 50 korn av den angripna kiseldioxiden på ett lämpligt agarmedium. För att undvika morfologiska förändringar och förlust av patogenicitet stammar subkulturer inte mer än 3 gånger efter reaktivering. Potatisdextrosagar (PDA; se Materialtabell) används rutinmässigt för att odla C. graminicola medan havregrynagar (OA; se Materialtabell) används för S. maydis.
- För att förbereda PDA för odling av svampbestånd, suspendera 19.5 g kommersiellt framställd dehydratiserad PDA i 500 ml avjoniserat (DI) vatten. För att göra OA, koka 36 g kommersiellt framställd torkad OA i DI-vatten i 15-30 minuter, filtrera genom tre lager ostduk och värm filtratet till 500 ml med DI-vatten. Autoklavmedia för sterilisering.
- Förstärk det smälta, kylda mediet med ett lämpligt antibiotikum (t.ex. hygromycin B, geneticin) när du arbetar med transformativa stammar. De slutliga koncentrationerna av hygromycin eller genetikin i 500 ml media är 250 μg/ml respektive 100 μg/ml.
- Inkubera kulturerna under optimala förhållanden tills ett sporbildande mycel har utvecklats. Colletotrichum graminicola och S. maydis växer bra vid 23 °C med kontinuerligt fluorescerande ljus och omgivande luftfuktighetsnivåer. Sporulation inträffar 7 dagar efter inokulering (dai) för S. maydis eller 14 dai för C. graminicola.
2. Inokulering av bladmantel
- Montering av filterenhet av glasull
- Använd en kraftig sax eller sax för att klippa av locket och cirka 0.5 mm från den koniska botten av ett 1.5 ml mikrocentrifugrör (se materialförteckning).
- Placera en bit glasull (cirka 0.5 cm x 0.5 cm; se materialtabell) inuti det skurna röret för att täcka mitthålet, som visas i figur 2.
- Använd handskar när du skär glasull, eftersom borosilikatglas kan orsaka irritation.
- Förberedelse av stödställ för bladmantel
- Skär en 96-håls PCR-platta utan kjol (se materialtabellen) i sex stödställ med två kolumner (8 x 2 brunnar) som visas i figur 3A.
- Vänd de två pelarställena så att de koniska bottnarna på brunnarna är vända uppåt och de platta topparna nedåt (Figur 3B).
- Placera varje stöd i en petriskål av glas som innehåller fuktat filterpapper och täck den med locket (se Materialförteckning). Denna enhet fungerar som en liten fuktkammare för manteln.
- Förberedelse av inokulat
- För varje svampstam, placera en monterad glasullsfilterenhet i ett intakt sterilt 1.5 ml mikrocentrifugrör som visas i figur 2. Den senare fungerar som ett uppsamlingsrör.
- Märk rören.
- Skörda konidier från sporbildande kulturer genom att först översvämma varje tallrik med 3-4 ml sterilt DI-vatten. Mer vatten kan i vissa fall behövas för att producera ett lager vätska på kolonins yta. Vätmedel är inte nödvändiga i detta system.
- Lossa sporerna från agarn genom att använda en steril stöt med konisk spets (se materialtabell) för att skrapa jämnt över hela plattan.
- Applicera 1 ml av sporsuspensionen på en glasullsfilterenhet aseptiskt och låt sporerna flöda in i uppsamlingsröret genom gravitationen.
- Centrifugera uppsamlingsrören med de filtrerade sporsuspensionerna vid 3 500 x g i 5 minuter. Sporerna ska pelleteras i botten av mikrocentrifugröret.
OBS: Centrifugering av C. graminicola-sporer med högre hastigheter än vad som rekommenderas här resulterar i en betydande förlust av livskraft. - Häll av vätskan i en autoklaverbar behållare, tillsätt 1 ml sterilt DI-vatten och skaka försiktigt för att återsuspendera de pelleterade sporerna. Centrifugera enligt punkt 2.3.6.
- Tvätta sporer 3x för att ta bort eventuell konidial matris som kan innehålla autohämmare som kan minska groning eller penetration.
- Efter den tredje tvätten, tillsätt 300-500 μL sterilt DI-vatten för att återsuspendera sporer för kvantifiering.
- Använd en hemocytometer under ett sammansatt mikroskop vid 100x förstoring för att bestämma sporkoncentrationen. Sporfärgning är inte nödvändig före räkning.
- Bered en 5 x 105 sporer/ml suspension med sterilt DI-vatten.
OBS: C. graminicola sporsuspension kan förvaras i rumstemperatur i högst 4 timmar innan livsdugligheten snabbt försämras. Kylning av konidier ökar inte livskraften.
- Inokulering av manteln
- Kontrollera relevanta rutiner och förfaranden för biosäkerhet innan du inokulerar växter med svampstammar.
- Ta bort manteln från det första riktiga bladet på V2-plantor genom att köra en miniatyrbild längs den överlappande kanten på manteln och lossa den försiktigt från skottet. Lossa slidan från båda sidor av skottet innan du försöker ta bort den.
- Skär de återvunna bladslidorna i 3-5 cm stora klyftor. Det är inte nödvändigt att ytdesinficera manteln före inokulering.
- Rulla ut varje segment mycket försiktigt för att exponera det inre (adaxiala) epidermala lagret.
- När du förbereder hylsorna för inokulering, håll de återstående utskurna hylsorna inslagna med adamp pappershandduk för att undvika uttorkning.
- Placera 20 μL av svampsporsuspensionen på insidan i mitten av mantelstycket, direkt ovanför mittribban, såsom visas i figur 4.
- Placera de inokulerade bladslidorna horisontellt, med mittribban placerad längst ner, i stödet inuti en petriskål av glas som innehåller ett fuktat filterpapper enligt figur 5.
- Varje rack rymmer upp till sju höljen. Inokulera minst fem hylsor per stam för att kompensera för förlust av replikat som kan uppstå under provberedning eller inkubation.
- Placera de små fuktkamrarna i en genomskinlig förvaringslåda fodrad med fuktat groningspapper (se materialförteckning).
- Täck lådan med locket. Inkubera lådan vid 23 °C med kontinuerlig belysning under det avsedda tidsförloppet, vilket beror på svampen och på de svamputvecklingsstadier som kommer att observeras. En sammanfattning av tidsförloppet för majsskidor som inokulerats med C. graminicola finns i tabell 1.
- Kontrollera varje dag om det finns tecken/symtom på sjukdom på slidorna och håll både groning och filterpapper fuktiga. Bladslidor kan behållas i upp till 6 dagar utan uppenbar växtcellsdöd eller nedbrytning i frånvaro av ympning.
Figur 2: Förberedelse av glasullsfilterenhet. (A) En 0,5 cm x 0,5 cm glasullskula placeras inuti mikrocentrifugrör 1 som har sin koniska botten borttagen. (B-C) Filterröret placeras sedan i mikrocentrifugrör 2 för att generera en monterad filterenhet för beredning av sporsuspension. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Metod för skärning av en 96-håls PCR-platta utan kjol. (A) PCR-platta skuren i sex stödställ, 8 x 2 brunnar. Ett exempel på ett enda mantelstöd visas i (B). Bladslidorna läggs horisontellt på stödet. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Metod för inokulering av manteln. En droppe inokulat appliceras direkt på mantelns adaxiala yta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Inkubationsmetod för manteln. Inokulerade bladhöljen placerade horisontellt i ett stödställ inuti en petriskål av glas som innehåller fuktat filterpapper. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Mikroskopi av levande celler
- Provberedning för mikroskopi
- Skölj mantelbitarna försiktigt med sterilt DI-vatten för att ta bort eventuella sporer som inte fastnat eller ytlig svamptillväxt.
- Placera manteln på ett rent glasmikroskopglas (se materialtabell) med den adaxiala (insidan) ytan av mantelstycket vänd nedåt och den abaxiala (utvändiga) ytan uppåt.
- Använd ett nytt enkeleggat rakblad (se materialförteckning) för att trimma cirka 1 cm från mantelns ändar och ta bort det mesta av lamellvävnaden på vardera sidan av mittrevbenet.
- Håll rakbladet i en vinkel på 90° i förhållande till manteln för att raka vävnad från det abaxiala mittrevbenet och exponera epidermisskiktet på den adaxiala ytan ovanför den inokulerade punkten. Försök att hålla en jämn tjocklek. När bladslidorna är rakade rekommenderas inte ytterligare trimning eftersom detta kan skada provet.
- Se till att de rakade sektionerna inte är mer än 1 cm x 1 cm stora. Undvik att trycka på mitten av manteln under denna process. När du arbetar med hylsor som inokulerats med olika sporsuspensioner, desinficera handskar och byt rakblad mellan proverna.
- Ha ett rent glasmikroskopglas redo. Lyft manteldelen från ena kanten och överför den försiktigt till ett nytt objektglas. Den inokulerade (adaxiala) ytan på manteln ska vara överst, närmast objektivlinsen. Montera sektioner försiktigt för att undvika skador på svampstrukturer.
- Applicera 60 μL sterilt DI-vatten på sektionen och lägg till ett 24 mm x 60 mm glastäcke (se materialtabell). Gör detta långsamt för att undvika luftbubblor.
- När du är redo för mikroskopi, försegla täckglaset med genomskinligt nagellack (se Materialförteckning) genom att placera en liten droppe på varje kant och sedan koppla ihop dropparna med en nagellacksborste för att göra en sömlös tätning.
OBS: Detta mantelprotokoll kan användas med cytologiska färgämnen, t.ex. 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), neutralröd eller trypanblå, eller för observation av cellplasmolys för att utvärdera växtcellernas livskraft. För mantelfärgning eller cellplasmolysanalyser, försegla inte täckglaset. - För plasmolysanalyser, tillsätt en hyperton lösning (0,75 M sackaros eller 1 M natriumklorid) på ena kanten av täckglaset och använd ett vikt luddfritt silkespapper för att dra lösningen över sample till den andra kanten av täckglaset. För färgning, använd en liknande metod för att applicera fläcklösningen.
- Vidvinkelmikroskopi
- När bladslidorna är monterade på objektglas, inspektera dem för svampkolonisering med hjälp av ett bredfältsljusmikroskop vid 400x förstoring.
- För att observera svampstrukturer i detalj, använd ett vattennedsänkningsobjektiv snarare än olja för bättre bildkvalitet på proverna. Sfärisk aberration på grund av en felmatchning av brytningsindex kan orsaka bildförsämring. Vattenmål finns tillgängliga för vidfältsljusmikroskop såväl som konfokalmikroskop.
- För att bestämma den relativa mängden kolonisering per mantel, räkna antalet majsceller som invaderats från varje svamppenetrationsställe med hjälp av ett bredfältsljusmikroskop vid 100x förstoring. Denna kvantifiering är ett lämpligt screeningsteg före statistiska analyser som jämför stammar, behandlingar och/eller utvecklingsstadier.
- Konfokal laserskanningsmikroskopi
- För att observera fluorescerande proteiner i majsvävnad under utvecklingen av transgena svampstammar, justera de grundläggande bildtagningsparametrarna. Identifiera de bästa excitations-/emissionsinställningarna baserat på den valda fluorescerande markören.
OBS: Ett 60x vattenobjektiv är att föredra vid analys av fluorescerande fusioner konstruerade med utsöndrade proteiner. Moderna konfokalmikroskop har mycket korrigerade vattennedsänkningsmål för att undvika artefakter och formavvikelser. - Om avbildning av fluorescerande proteiner med levande celler är avsedd, använd otransformerade svampstammar som kontroller för autofluorescens. Använd följande bildinsamlingsparametrar för att fånga dynamiken mellan svamp och värd i ett inverterat konfokalmikroskop och för mCherry fluorescerande protein. Ställ in lasereffekten på upp till 5 %, 450–600 högspänning (HV) beroende på uttrycksnivå, 1,375 X förstärkning, 3 % offset, en optisk zoomfaktor på 1 för analys av upp till fem majsceller per sektion och en optisk zoomfaktor på 2-5 för enskilda hyfer.
OBS: Högupplösta Z-stack konfokala bilder ger tredimensionella data och en bättre bild av realtidsinteraktioner mellan värden och patogenen. - För kvantifiering av fluorescensintensiteter som motsvarar utsöndrade fusionsproteiner, använd bildanalysprogramvara från konfokaltillverkaren eller ett bildbehandlingsprogram som ImageJ, som kan laddas ner fritt online. Se en manual för detaljer om hur du kvantifierar fluorescerande signaler i enlighet med detta.
- För att observera fluorescerande proteiner i majsvävnad under utvecklingen av transgena svampstammar, justera de grundläggande bildtagningsparametrarna. Identifiera de bästa excitations-/emissionsinställningarna baserat på den valda fluorescerande markören.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exemplen nedan beskriver representativa resultat efter användning av inokuleringsmetoden för majsbladsmantel. Dessa exempel visar hur enkelt, snabbt och exakt det är att observera och jämföra interaktioner mellan majs och svamp i realtid med denna optimerade analys. Avbildning av levande celler gör det också möjligt att extrahera kvantitativ information, vilket ger ett användbart verktyg för jämförande molekylära, cytologiska och fysiologiska studier. Ytterligare detaljer finns i de originalpublikationer som citeras för varje framgångsrik ansökan.
Exempeldata 1: Användning av färgning och plasmolys i inokulerade bladskidor för utvärdering av svampstatus och detektion av växters respons på svampinfektion
Majsbladsskidor har använts för att visualisera och jämföra infektionsprocesserna hos Colletotrichum graminicola och Stenocarpella maydis i levande värdceller med ljusfältsmikroskopi, vilket möjliggör detaljerade beskrivningar av koloniseringsmönster och tidsförlopp (opublicerade resultat; Figur 6).
Dessa studier visade att S. maydis snabbt invaderar epidermala celler direkt via odifferentierade hyfsvullnader, till skillnad från C. graminicola som producerar melaniserade appressorier. Väl inne i epidermala celler fortsätter båda patogenerna från cell till cell genom att passera genom till synes intakta cellväggar (Figur 6A,B).
Höljen kan färgas med trypanblått eller DAPI för att lättare utvärdera arten och omfattningen av koloniserande svamphyfer (Figur 6). Trypan blue färgning avslöjar att C. graminicola initialt invaderar via tjocka primära hyfer som rör sig mellan celler genom mycket smala anslutningar. Senare växlar svampen till ett nekrotroft stadium, vilket producerar tunnare sekundära hyfer i mitten av kolonin (Figur 6 C-E)12,14,16,17.
Figur 6: Ofärgade eller färgade inokulerade majsbladshöljen avbildade med ljusfälts- eller epifluorescensmikroskopi. A) Intracellulära hyfer 48 timmar efter inokulering (hpi ) med Stenocarpella maydis. Infektion sker via lätt svullna hyfspetsar (pil). (B) Intracellulära hyfer 48 hpi med Colletotrichum graminicola. Infektion sker via melaniserade appressorier (pilar). (C) Hyfer av C. graminicola, färgade med trypanblått, fortskrider cell-till-cell vid den framryckande kolonikanten via smala förbindelser (pil), 72 hpi. (D) Närmare bild av trypanblåfärgade hyfer av C. graminicola vid 72 hpi som passerar genom majsens cellvägg via en smal förbindelse (pil). (E) Hyfer av C. graminicola, färgade med trypanblått, i kolonins centrum 72 hpi. Smalare sekundära hyfer kan ses komma ut från de tjockare primära hyferna (pilar). (F) Hyfer av C. graminicola 72 hpi, vid den framskjutande kolonikanten på ett bladhölje färgat med DAPI. De färgade svamp- och växtkärnorna fluorescerar i UV-ljus. Skala staplar i varje panel lika med 50 μm. Mikrofotografier erhållna med hjälp av en monokromatisk digitalkamera i kombination med ett epifluorescensmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Höljen kan färgas med neutralrött och/eller utsättas för plasmolys för att studera majscellernas cytologi och livsduglighet under infektion och kolonisering av patogena svampar (figur 7).
Colletotrichum graminicola är en hemibiotrofisk svamp som invaderar levande majsceller med tjocka primära hyfer som är separerade från värdcytoplasman med ett membran (figur 7A-C)12,14,16,17. Stenocarpella maydis, å andra sidan, är en nekrotrofisk svamp som producerar ett fytotoxin23 och dödar epidermala celler (som blir granulerade och misslyckas med att plasmolysera) innan den invaderar dem (Figur 7D).
Majsens försvar mot C. graminicola och andra bladpatogener innebär ackumulering av reaktiva syreradikaler (ROS), särskilt väteperoxid (H2O2)12,15. För att undersöka den oxidativa kemin av växt-patogeninteraktioner kan 3,3′-diaminobensidin (DAB) användas för cellfärgning24. DAB oxideras av H 2 O2och ger en mörkbrun fällning som är synlig i majsbladshöljena (figur 7 E,F)12,24. Produktionen av pigmentet är en indikator på en oxidativ explosion relaterad till ett värdmotståndssvar.
Figur 7: Färgade och/eller plasmolyserade inokulerade bladhöljen av majs avbildade med ljusfältsmikroskopi. A) Bladhölje inokulerat med C. graminicola 24 hpi och genomgått plasmolys och färgning med neutralrött. Levande majsceller under appressorier (pilar) plasmolyserar och färgas, vilket visar att patogenen inte dödar cellerna före invasionen. B) Bladmantel 48 hpi med C. graminicola, utsatt för plasmolys och färgning med neutralrött. Majsceller som koloniseras av primära hyfer (pilar) är fortfarande vid liv, vilket visar att C. graminicola invaderar celler som en biotrof. (C) Bladmantel 48 hpi med C. graminicola, som visar hyfer som rör sig cell till cell vid den framskjutande kanten av kolonin. Höljena har plasmolyserats men inte färgats. Okoloniserade celler som ligger intill kolonins kant (pilar) fortsätter att plasmolysera. (D) Bladmantel 24 hpi med S. maydis, före penetration. Cellerna under den grodda sporen (pilen) verkar granulerade och misslyckas med att plasmolysera, vilket tyder på att S. maydis dödar dem innan den penetrerar och att den beter sig som en nekrotrof. E) Bladhölje av resistent majs inavlad Mp305 24 hpi med C. graminicola och färgad med DAB. Mörk färgning indikerar en stark oxidativ respons hos den enda cellen i mitten av bilden, medan halos av brunt pigment kan ses som omger de flesta av de enskilda appressorierna, och granulering kan observeras i cellerna högst upp på fotot. (F) En närmare bild av halos av brunt pigment som ackumulerats runt appressorier och deponering av pigment i majsens cellväggar i närheten (pilar). Skalstreck i varje panel är lika med 50 μm, utom (F) som är 20 μm. Mikrofotografier erhållna med hjälp av en monokromatisk digitalkamera i kombination med ett epifluorescensmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Exempeldata 2: Avbildning av levande celler med svampar som uttrycker fluorescerande proteiner
Svamphyfer som uttrycker cytoplasmatiska fluorescerande proteiner kan visualiseras med hög upplösning i levande mantelceller utan behov av några fläckar genom att använda ett epifluorescens- eller konfokalmikroskop (figur 8).
Fluorescerande proteiner kan riktas mot olika svamporganeller, t.ex. mitokondrier, kärnor eller endomembransystemet, för att spåra deras platser och aktiviteter i de levande svampcellerna i planta (Figur 8C)25,26,27,28 (opublicerade resultat). Fluorescerande proteiner kan också drivas av olika svamppromotorer för att fungera som rapportörer för olika funktioner: till exempel visas RFP som drivs av BiP-chaperonsekretionsstressresponsproteinet (Figur 8D)29 (opublicerade resultat). Användningen av bladhöljen gör det möjligt att visualisera individuellt märkta fluorescerande fusionsproteiner som ackumuleras och utsöndras av svamphyfer när de koloniserar värdceller 8,9 (figur 8E). Transgena majslinjer som uttrycker fluorescerande proteiner riktade till olika cellulära kompartment, t.ex. kärnor eller plasmamembran, finns också tillgängliga30,31 och kan användas för inokulering för att utvärdera effekterna av infektion på majsens cellulära strukturer, t.ex. kärnor. Användning av dessa transgena majslinjer visade att kärnor i oinvaderade majsceller vanligtvis migrerar till den cellvägg som är närmast celler som redan är koloniserade av C. graminicola (opublicerade resultat; Figur 8F).
Figur 8: Epifluorescens (A, B) eller konfokal (C, D, E, F) avbildning av Colletotrichum graminicola som uttrycker fluorescerande proteiner. (A) Ofärgad, plasmolyserad bladskida 48 hpi med en C. graminicola-stam som uttrycker mRFP cytoplasmatiskt under kontroll av ToxA-promotorn34. Betydande autofluorescens märks också i dessa bladhöljen. B) Ofärgat bladhölje 48 hpi med en stam av C. graminicola som uttrycker SGFP cytoplasmatiskt under kontroll av ToxA-promotorn. (C)Colletotrichum graminicola som uttrycker SGFP riktad mot det endomembrana systemet med ett HDEL-ankare35. (D) Ofärgad bladmantel 24 hpi med C. graminicola transformerad med mRFP under kontroll av promotorn för C. graminicola-homologen i BiP-chaperonen. Den röda fluorescensen i den primära hyfen är en indikator på BiP-aktivering som svar på sekretionsstress. (E) Ackumulering av arabinofuranosidas::mKörsbärsfusionsprotein i den primära hyfen C. graminicola WT som passerar cellväggen i majsbladsmanteln vid 44 hpi. F) Bladmantel av en transgen majslinje som uttrycker YFP riktad mot växtkärnan30,31, 48 hpi med en stam av C. graminicola som uttrycker mRFP cytoplasmatiskt under kontroll av ToxA-promotorn. Skalstaplarna i varje panel är lika med 20 μm, förutom panel A där den är lika med 50 μm. Mikrobilder togs med hjälp av en monokromatisk digitalkamera i kombination med ett epifluorescensmikroskop. Bilderna i (C-F) togs med ett laserskannande konfokalmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Exempeldata 3: Användning av majsbladsskidor för att undersöka den detaljerade cytologin av kompatibla/oförenliga reaktioner och interaktioner mellan svampstammar
En icke-patogen stam av C. graminicola (cpr1 MT) jämfördes med vildtypsstammen (WT) i majsbladsskidor (figur 9A,B)12.
Avbildning av levande celler av stammar märkta med cytoplasmatiska fluorescerande proteiner visade att mutanten var specifikt nedsatt i sin rörelse från cell till cell i majsbladshöljena. Mantelprotokollet möjliggjorde exakt kvantifiering som avslöjade att cpr1 MT var begränsad till den första koloniserade cellen 95 % av tiden (Figur 9C)12. Detta stod i skarp kontrast till WT, där mindre än 5 % av infektionerna stannade kvar i den första koloniserade cellen under samma tidsram12. Intressant nog kunde cpr1 MT växa saprofytiskt bortom den första initialt infekterade cellen i lokalt frysdödade skidor, som WT-stammen (Figur 9D). Detta indikerade att cpr1 MT:s oförmåga att kolonisera var specifikt relaterad till en aktiv respons från den levande majscellen.
Bladmantelinokuleringsanalysen användes för att testa interaktioner mellan de GFP-uttryckande cpr1 MT- och RFP-uttryckande WT-stammarna genom saminokulering av dem på samma bladhylsa12. När stammarna inokulerades nära varandra (högst 8 majsceller från varandra) kunde cpr1 MT växa normalt som en biotrof från cell till cell (figur 9E,F). Plasmolysanalyser bekräftade att cpr1 MT-svampen trängde in i levande celler12. Alla dessa detaljerade observationer möjliggjordes av mantelanalyserna och antydde existensen av en diffusibel faktor som inducerar kompatibilitet som produceras av WT-stammen av C. graminicola men som saknas i cpr1 MT12.
Figur 9: Kompatibla och inkompatibla interaktioner som involverar WT- och cpr1 MT-stammar av Colletotrichum graminicola. Användning av olika fluorescerande proteiner gjorde det möjligt att skilja de två stammarna åt när de inokulerades samtidigt på majsbladshöljen12. (A) WT C. mucciola-stammen som uttrycker cytoplasmatisk mRFP i majsbladsskidor vid 48 hpi. B) Stammen C. graminicola cpr1 MT som uttrycker SGFP i majsbladslidor vid 72 hpi. CPR1 MT koloniserar endast sällan (<5 % av tiden) bortom den första infekterade cellen, även upp till 6 dagar efter vaccination. (C) En närmare bild av C. graminicola cpr1 MT-stammen som uttrycker SGFP vid 72 dpi. I det här fallet lyckades den korsa cellväggen in i nästa cell, men sedan slutade den att utvecklas. (D) C. graminicola cpr1 MT-stam som uttrycker SGFP, 48 hpi i avdödad mantelvävnad. CPR1 MT-stammen koloniserar snabbt icke-levande majsmandelsceller, på samma sätt som WT. (E) När stammarna WT-mRFP C. graminicola och cpr1 MT-GFP C. graminicola saminokuleras nära varandra på majsbladsskidor (48 hpi) återfår cpr1 MT-GFP-stammen förmågan att utvecklas genom levande majshöljen på normalt sätt, som en biotrof. Biotrofisk tillväxt inuti de levande cellerna bekräftades genom plasmolysanalyser. F) En närmare bild av den stam av C. graminicola cpr1 MT som uttrycker SGFP och som växer från cell till cell när den inokuleras intill WT (högst 8 majsceller från varandra). Skalstaplar är lika med 50 μm (A, B och E) eller 20 μm (C, D och F). Mikrobilder togs med hjälp av en monokromatisk digitalkamera i kombination med ett epifluorescensmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Inokulerade skidor har också använts för att producera vävnader för RNA-extraktion för transkriptionsaktivitetsanalys32,33. Höljena var idealiska för detta ändamål eftersom de kunde inspekteras före extraktion för att övervaka infektionsprocessen, vilket säkerställde provenhetlighet över flera replikationer. Dessa studier gjorde det möjligt att identifiera vågor av differentiellt uttryckta gener mellan Colletotrichum livsstilsövergångsstadier32,33.
Exempeldata 4: Resultat av suboptimala experiment
Otillfredsställande avbildning av levande celler kan vara ett resultat av otillräcklig trimning av bladhöljen, vilket leder till överlappande epidermala cellager och optiskt ogenomskinliga prover (figur 10).
Figur 10: Suboptimalt experimentellt resultat på grund av otillräcklig trimning av bladslidor.( A) Exempel på multipla epidermala cellager som stör undersökningen av svamputveckling invivo. (B) Exempel på överlappande cellager som påverkar avbildning av levande celler. Skalstreck lika med 20 μm. Mikrobilder togs med hjälp av en monokromatisk digitalkamera i kombination med ett epifluorescensmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Ett annat potentiellt suboptimalt experimentresultat är en ojusterad inokulumkoncentration som kan resultera i lågt (Figur 11A) eller högt antal sporer: det senare kan resultera i minskad groning eller appressoriell penetration (Figur 11B). Det senare kan också försvåra kvantifieringen av majsceller som koloniserats på varje svamppenetrationsställe.
Figur 11: Suboptimalt experimentresultat på grund av felaktigt justerad inokulatkoncentration. A. Låg koncentration av C. graminicola sporsuspension inokulerad på skidor vilket resulterar i ett lågt antal svamppenetrationsställen. B. B. Hög koncentration av C. graminicola inokulum på bladskidor som orsakar multipla appressorier i närheten och minskad penetration av värdceller. Skalstreck lika med 20 μm. Mikrobilder togs med hjälp av en monokromatisk digitalkamera i kombination med ett epifluorescensmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tid för mikroskopisk observation (hpi) | Utvecklingsstadium av C. graminicola inokulerat på majsbladsslidor |
| 12 | Appressoria |
| 24 | Primära hyfer |
| 36 | Sekundära hyfer |
| 48 | Sekundära hyfer |
| 60 | Acervuli |
| 72 | Acervuli |
| 108 | Acervuli |
Tabell 1: Tidsförlopp för infektion med Colletotrichum graminicola: Sammanfattning av tidsförloppet för majsbladsskidor som inokulerats med C. graminicola stam M1.001 baserat på milstolpar i svamputvecklingen under hela livsstilsövergången. Mikroskopiska observationer utfördes var 12:e timme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den optimerade ympningsmetoden för bladslidor som beskrivs här är modifierad från ett originalprotokoll som utvecklades för och har tillämpats på risbladsskidor 6,8,36. Det möjliggör direkta, detaljerade observationer av svamptillväxt och utveckling i levande växtceller med antingen vidvinkel- eller konfokalmikroskopi. Protokollet är lämpligt för karakterisering, jämförelse och kvantifiering av en mängd olika mikroskopiska fenomen under majskolonisering, inklusive svamputveckling och värdrespons under kompatibla kontra oförenliga interaktioner; produktion och utsöndring av specifika svampproteiner i planta; cytologi och biokemi för vanliga eller nya patogenicitetsfaktorer som produceras under interaktionen mellan majs och svamp. Vi har använt denna metod med hemibiotrofa och nekrotrofa patogener av majs. Vi har inte försökt ympa med biotrofa patogener (t.ex. rostsvampar) men slidorna, eftersom de förblir vid liv, skulle också vara användbara för den tillämpningen. Vi har också tillämpat denna metod på durraskidor för undersökningar av cytologin för värd- och sortspecifik resistens 7,37. För durraskidor var den enda justeringen av protokollet att fylla hela skidan med sporsuspension, i stället för att applicera en enda droppe i mitten. Detta var nödvändigt på grund av durrahöljenas mindre diameter.
Användningen av dessa mantelanalyser har i hög grad främjat våra detaljerade studier av mekanismerna för värdkolonisering och svampmolekyler som är kritiska för patogenicitet. Till exempel visade tillämpningen av metoden att C. sublineola inte var värd för majs och för C. graminicola för sorghum, inklusive överkänslighetsresistens i båda fallen7. Majsbladsslidor användes också för att testa interaktioner mellan svampstammar på avstånd på samma mantel. I detta fall visade saminokulering av en patogen WT-stam och en icke-patogen cpr1 MT-stam tillsammans på levande skidor att WT-stammen inducerade majscellers känslighet och gav belägg för en diffusibel faktor som är involverad i patogeniciteten12. Höljena möjliggjorde differentiering av de två stammar som uttrycker olika fluorescerande proteiner, och kvantifiering och statistiska jämförelser av koloniseringsprocessen för de stammar som inokulerades, antingen ensamma eller tillsammans.
Denna analys av majsbladsmantel har flera fördelar jämfört med ympningar av hela växter för avbildning av levande celler. För det första ger protokollet överlägsen avbildning, utan behov av rensning eller fixering, av patogener som interagerar med levande värdceller i realtid. Till exempel har studier med majsbladsskidor gjort det möjligt att upptäcka en tydlig övergång från biotrofi till nekrotrofi i hemibiotrofa C. graminicola och underlättat funktionella jämförelser med en icke-patogen mutant 7,12,16,17. Även om utskurna risbladsskidor som inokulerats med M. oryzae enligt uppgift kan uppvisa symtom som inte motsvarar dem som observerats i hela risplantor36, är tidpunkten och uppkomsten av kolonisering, vävnadskollaps och lesionsutveckling i majsskidor liknande den i hela blad12,14. En andra fördel med mantelanalysen är att den visar större synkronicitet över replikationer och experimentell reproducerbarhet av svampkolonisering12,18. Medan inokulering av hela växter kan resultera i oregelbundna nivåer av svamppenetration18, ger de mer kontrollerade förhållandena för mantelinokuleringarna mer synkronicitet och möjliggör mer exakt undersökning och kvantifiering av interaktioner. Denna ökade synkronicitet underlättade användningen av manteln i transkriptomanalyser32,33. Dessutom möjliggjorde mantelprotokollet den nödvändiga hastigheten för provberedning för transkriptomanalys: trimning, sköljning och screening av varje hylsa tog inte mer än 2 minuter innan de snabbfrystes för RNA-extraktion32,33.
Kritiska steg för framgångsrik avbildning av infektioner med levande celler inkluderar: 1) Slidor bör användas omedelbart efter skärning för experiment. Utskurna inokulerade skidor bör inte behållas i mer än 6 dagar: om svampkolonisationen är kraftig kommer de att brytas ned snabbare12; 2) Var noga med att välja slidor som är av samma utvecklingsålder för att säkerställa mer reproducerbara resultat; 3) Använd en färsk sporsuspension från odlingar som har uppnått maximal sporbildning. 4) Använd vassa rakblad för effektivare trimning för att producera optiskt klara prover; 5) Minimera överdriven och onödig manipulation av prover eftersom denna process kan påverka levande strukturer och bildkvalitet negativt; 6) Kontrollera fuktkamrarna dagligen för att säkerställa att filterpapperet är tillräckligt fuktigt; och 7) När du avbildar samples på ett konfokalmikroskop, håll insamlingsinställningarna fasta under experimentet för att undvika att införa intensitetsförändringar eller bias när du jämför fluorescerande signaler över samples. Fluorescerande proteiner kan fotoblekas om laserintensiteten och varaktigheten är för hög, och de kan ge svagare signaler om vävnadssnitt förvaras under en förseglad täckglas under lång tid. Preliminära experiment, inklusive alla lämpliga kontroller, bör utföras för att standardisera och optimera förhållanden, material och tidslinjer för de mest reproducerbara resultaten.
Felsökning
Handtrimning är otillräcklig för att producera optiskt klara höljen
Det är möjligt att rakbladet har blivit slött. Om så är fallet, kassera den på rätt sätt och byt till ett nytt enkeleggat rakblad. Använd måttligt tryck och håll bladet i en vinkel på 90° mot manteln. Skrapa provet försiktigt, men konsekvent, tills en platt och genomskinlig sektion observeras. Det är tillrådligt att kontrollera hylsorna under ett sammansatt mikroskop innan du går vidare till det konfokala laserskanningsmikroskopet.
Inokulerat majshölje är extremt ömtåligt
Detta inträffar när svampen har koloniserat det mesta av växtvävnaden. Följaktligen bryts vävnaden ned och kollapsar. När du förbereder prover som redan är i det nekrotrofa stadiet, tryck försiktigt sektionen mot ett mikroskopglas, applicera en droppe sterilt DI-vatten och skrapa sample en till två gånger med ett rent täckglas.
Låg sporgroning och penetration in vivo
Detta kan bero på ett stort antal sporer som hämmar groning eller penetration. Se till att inokulumkoncentrationen är justerad till 5 x 105 sporer/ml. Om problemet kvarstår, justera koncentrationen till 5 x 104 sporer/ml. Som kontroll för in vivo-experimentet placeras 50 μl av samma sporsuspension på en ny PDA-platta och sprids jämnt. Kontrollera sporernas livskraft och grobarhet dagligen.
Asynkrona svamputvecklingsstadier över manteln
Se till att majsplantorna befinner sig i samma tillväxtstadium och att mantlarna har tagits från samma nod. Se också till att sporerna är livskraftiga och att svampkulturerna är i det optimala stadiet (t.ex. inte längre än 2 veckor gamla kulturer för C. graminicola) för inokulatberedning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen och inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar USDA-NIFA för deras ekonomiska stöd (anslagsnummer 2018-67013-28489 och 2020-70410-32901). Alla åsikter, resultat, slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta manuskript är enbart författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna hos USA:s jordbruksdepartement. Vi tackar Science Without Borders gästande student från Brasilien, Mayara de Silva, för bilderna som visas i figur 6A och i figur 7D. Vi tackar också institutionen för växtpatologi vid University of Kentucky för att ha gett tillgång till Olympus konfokalmikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. Plant pathological methods: fungi and bacteria. , Burgess Publishing Co. (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
