Summary
Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato che utilizza guaine fogliari di mais staccate per studi citologici, fisiologici e molecolari riproducibili delle interazioni del mais con i patogeni fungini delle piante. Le guaine fogliari facilitano l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellulari tra la pianta vivente e il fungo nei tessuti non fissati.
Abstract
Abbiamo ottimizzato un protocollo per inoculare guaine fogliari di mais con funghi patogeni fogliari emibiotrofi e necrotrofi. Il metodo è modificato da quello originariamente applicato alle guaine delle foglie di riso e consente l'osservazione microscopica diretta della crescita e dello sviluppo dei funghi nelle cellule vegetali viventi. Le guaine fogliari raccolte da piantine di mais con due colletti fogliari completamente emersi vengono inoculate con gocce da 20 μL di 5 x 105 spore/mL di sospensioni di spore fungine e incubate in camere di umidità a 23 °C sotto luce fluorescente continua. Dopo 24-72 ore, il tessuto in eccesso viene rimosso con una lama di rasoio per lasciare un singolo strato di cellule epidermiche, un campione otticamente trasparente che può essere visualizzato direttamente senza la necessità di fissazione chimica o pulizia. Le cellule vegetali e fungine rimangono in vita per tutta la durata dell'esperimento e le interazioni possono essere visualizzate in tempo reale. Le guaine possono essere colorate o sottoposte a plasmolisi per studiare la citologia dello sviluppo e la vitalità delle cellule ospiti e patogene durante l'infezione e la colonizzazione. I ceppi fungini trasformati per esprimere proteine fluorescenti possono essere inoculati o co-inoculati sulle guaine per una maggiore risoluzione e per facilitare la valutazione di interazioni competitive o sinergiche. I ceppi fungini che esprimono proteine di fusione fluorescenti possono essere utilizzati per tracciare e quantificare la produzione e il targeting di queste singole proteine nelle piante. I tessuti della guaina inoculati possono essere estratti per caratterizzare acidi nucleici, proteine o metaboliti. L'uso di questi saggi di guaina ha notevolmente fatto progredire gli studi dettagliati dei meccanismi di patogenicità fungina nel mais e anche degli effettori proteici fungini e dei metaboliti secondari che contribuiscono alla patogenicità.
Introduction
Le analisi spaziali e temporali a livello cellulare sono fondamentali per comprendere la fisiologia e la citologia delle interazioni fungo-pianta. I tessuti fogliari che sono stati fissati chimicamente 1,2,3 o eliminati e colorati4, così come le membrane artificiali 5, sono stati utilizzati in passato per studiare la citologia dello sviluppo dei patogeni fogliari e le interazioni pianta-fungo. Tuttavia, lo studio degli eventi di infezione nei tessuti viventi dell'ospite in tempo reale senza fissazione o chiarificazione è impegnativo a causa di problemi tecnici relativi alla preparazione di campioni otticamente trasparenti per l'imaging.
Alla fine degli anni '40 è stato sviluppato un protocollo di inoculazione con guaina fogliare staccata per l'indagine microscopica in campo chiaro della resistenza delle cellule epidermiche di riso viventi al fungo dell'esplosione del riso Magnaporthe oryza6. Più recentemente, osservazioni molecolari, fisiologiche e citologiche dettagliate della colonizzazione dell'ospite da parte delle specie Colletotrichum e Magnaporthe sono state notevolmente facilitate dalla combinazione di versioni modificate di questo metodo di guaina fogliare con trasformanti fungini che esprimono proteine fluorescenti e protocolli di imaging di cellule vive ad alte prestazioni, tra cui l'epifluorescenza e la microscopia confocale 7,8,9,10.11,12,13.
Questo documento descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato utilizzando guaine fogliari di mais staccate per l'osservazione dei processi di infezione da parte di patogeni fungini fogliari emibiotrofi e necrotrofi. Lo abbiamo utilizzato in particolare per studiare Colletotrichum graminicola (C. graminicola), l'agente causale della peronospora delle foglie antracnosi e del marciume del gambo, e della Stenocarpella maydis, che causa la peronospora delle foglie di Diplodia e il marciume del gambo. Tuttavia, il metodo dovrebbe essere applicabile ad altri patogeni fungini fogliari emibiotrofi e necrotrofi. Le risposte citologiche e fisiologiche durante gli eventi di infezione e colonizzazione in queste guaine fogliari asportate sono simili a quelle delle lame fogliari intere12,14,15. Inoltre, la colonizzazione emibiotrofica delle cellule epidermiche della guaina da parte di C. graminicola è simile alla colonizzazione delle cellule del midollo del gambo16,17. Le guaine distaccate mostrano una maggiore sincronicità e riproducibilità sperimentale della penetrazione e della colonizzazione fungina rispetto alle lame fogliari o ai tessuti del midollo del gambo14,16,17,18. La maggior parte delle varietà di mais può essere utilizzata per questo protocollo. Tuttavia, gli inbred o gli ibridi con eccessivi pigmenti viola nelle guaine sono meno adatti poiché i pigmenti interferiscono con l'imaging. Il mais dolce Golden Jubilee è stato particolarmente utile per i nostri studi perché i semi non trattati sono disponibili in commercio, le piante sono altamente suscettibili a molte malattie fogliari e crescono bene in serra. Le prime epidemie di marciume del gambo dell'antracnosi negli Stati Uniti hanno provocato la perdita totale dei raccolti di mais dolce in Indiana negli anni '7019,20. Questo metodo di inoculazione della guaina fogliare può essere applicato per osservare e quantificare direttamente la crescita e lo sviluppo fungino nelle cellule vegetali viventi rispetto a quelle uccise localmente, per dimostrare le reazioni di resistenza nelle risposte compatibili/incompatibili all'infezione fungina e per testare le interazioni tra ceppi fungini sulla stessa guaina in tempo reale.
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Protocol
NOTA: il flusso di lavoro per il metodo è illustrato nella Figura 1.
Figura 1: Fasi del protocollo di inoculo ottimizzato utilizzando guaine fogliari di mais staccate. La preparazione della sospensione di spore, l'inoculazione della guaina fogliare e la preparazione del campione per la microscopia su cellule vive sono evidenziate rispettivamente nelle caselle verde (A), viola (B) e arancione (C). Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Materiale vegetale e fungino
- Crescita delle piante
- Coltivare piantine di mais (vedi Tabella dei materiali) in serra (14 h luce/27 °C e 10 h buio/22 °C) in contenitori SC10 (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare un terreno di coltura composto da tre parti di terriccio commerciale (vedi Tabella dei materiali) e due parti di terriccio sterilizzato a vapore.
- Innaffia le piantine per 2 minuti con un sistema di irrigazione dall'alto una volta al giorno, al mattino.
- Raccogli le piantine allo stadio V2 tagliandole a livello del terreno. Lo stadio di crescita V2 viene raggiunto quando le piantine sono alte da 5 a 10 cm e hanno due foglie a collare visibili21.
- Avvolgere le piante con un tovagliolo di carta umido e metterle in un sacchetto di plastica per il trasporto in laboratorio per ulteriori lavorazioni.
- Colture fungine
- Riattivare le colture di silice fungina immagazzinate in condizioni asettiche22cospargendo circa 50 granuli di silice infestata su un terreno di agar appropriato. Per evitare cambiamenti morfologici e perdita di patogenicità, la sottocoltura ceppa non più di 3 volte dopo la riattivazione. L'agar destrosio di patate (PDA; vedi Tabella dei materiali) è usato abitualmente per la coltura di C. graminicola, mentre l'agar di farina d'avena (OA; vedi Tabella dei materiali) è usato per S. maydis.
- Per preparare il PDA per la coltura di ceppi fungini, sospendere 19,5 g di PDA disidratato preparato in commercio in 500 mL di acqua deionizzata (DI). Per produrre OA, far bollire 36 g di OA disidratato preparato commercialmente in acqua deionizzata per 15-30 minuti, filtrare attraverso tre strati di garza e portare il filtrato a 500 ml con acqua deionizzata. Mezzi di sterilizzazione in autoclave.
- Aumentare il terreno fuso e raffreddato con un antibiotico appropriato (ad es. igromicina B, geneticina) quando si lavora con ceppi trasformanti. Le concentrazioni finali di igromicina o geneticina in 500 mL di terreno sono rispettivamente di 250 μg/mL e 100 μg/mL.
- Incubare le colture in condizioni ottimali fino allo sviluppo di un micelio sporulante. Colletotrichum graminicola e S. maydis crescono bene a 23 °C con luce fluorescente continua e livelli di umidità ambientale. La sporulazione avviene entro 7 giorni dall'inoculazione (dai) per S. maydis o 14 dai per C. graminicola.
2. Inoculazioni della guaina fogliare
- Gruppo unità filtro in lana di vetro
- Utilizzare forbici o cesoie per impieghi gravosi per tagliare il tappo e a circa 0,5 mm dal fondo conico di una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL (vedere la tabella dei materiali).
- Posizionare un pezzo di lana di vetro (circa 0,5 cm x 0,5 cm; vedere la tabella dei materiali) all'interno del tubo tagliato per coprire il foro centrale, come illustrato nella Figura 2.
- Indossare guanti durante il taglio della lana di vetro, poiché il vetro borosilicato può causare irritazione.
- Preparazione delle rastrelliere di supporto della guaina fogliare
- Tagliare una piastra PCR a 96 pozzetti senza bordatura (vedere la Tabella dei materiali) in sei rack di supporto a due colonne (8 x 2 pozzetti) come illustrato nella Figura 3A.
- Capovolgere i rack a due colonne in modo che i fondi conici dei pozzetti siano rivolti verso l'alto e le parti superiori piatte rivolte verso il basso (Figura 3B).
- Mettere ogni supporto in una piastra di Petri di vetro contenente carta da filtro inumidita e coprirla con il coperchio (vedi Tabella dei materiali). Questa unità funziona come una piccola camera di umidità per le guaine.
- Preparazione dell'inoculo
- Per ciascun ceppo fungino, posizionare un'unità filtrante in lana di vetro assemblata in una provetta sterile intatta da 1,5 mL per microcentrifuga, come illustrato nella Figura 2. Quest'ultimo funge da provetta di raccolta.
- Etichettare i tubi.
- Raccogliere i conidi dalle colture sporulanti inondando prima ogni piastra con 3-4 ml di acqua deionizzata sterile. In alcuni casi può essere necessaria più acqua per produrre uno strato di liquido sulla superficie della colonia. Gli agenti bagnanti non sono necessari in questo sistema.
- Staccare le spore dall'agar utilizzando un pestello sterile a punta conica (vedi Tabella dei materiali) per raschiare uniformemente l'intera piastra.
- Applicare 1 mL di sospensione di spore su un'unità filtrante in lana di vetro in modo asettico e lasciare che le spore fluiscano per gravità nella provetta di raccolta.
- Centrifugare le provette di raccolta contenenti le sospensioni di spore filtrate a 3.500 x g per 5 min. Le spore devono essere pellettate sul fondo della provetta della microcentrifuga.
NOTA: La centrifugazione delle spore di C. graminicola a velocità più elevate di quelle qui raccomandate comporta una significativa perdita di vitalità. - Versare il liquido in un contenitore autoclavabile, aggiungere 1 ml di acqua deionizzata sterile e agitare delicatamente per risospendere le spore pellettate. Centrifugare come al punto 2.3.6.
- Lavare le spore 3 volte per rimuovere qualsiasi matrice conidiale che possa contenere autoinibitori che potrebbero ridurre la germinazione o la penetrazione.
- Dopo il terzo lavaggio, aggiungere 300-500 μL di acqua deionizzata sterile per risospendere le spore per la quantificazione.
- Utilizzare un emocitometro al microscopio composto con un ingrandimento di 100x per determinare la concentrazione di spore. La colorazione delle spore non è necessaria prima del conteggio.
- Preparare una sospensione 5 x 105 spore/mL con acqua deionizzata sterile.
NOTA: La sospensione di spore di C. graminicola può essere mantenuta a temperatura ambiente per non più di 4 ore prima di una rapida perdita di vitalità. La refrigerazione dei conidi non aumenta la vitalità.
- Inoculazioni di guaine
- Verificare le pratiche e le procedure di biosicurezza pertinenti prima di inoculare le piante con ceppi fungini.
- Rimuovi la guaina dalla prima foglia vera delle piantine V2 facendo scorrere una miniatura lungo il margine sovrapposto della guaina e allentala delicatamente dal germoglio. Allentare la guaina da entrambi i lati del tiro prima di provare a rimuoverlo.
- Tagliare le guaine fogliari recuperate in segmenti di 3-5 cm. Non è necessario disinfettare le guaine in superficie prima dell'inoculazione.
- Srotolare ogni segmento molto delicatamente per esporre lo strato epidermico interno (assiale).
- Durante la preparazione delle guaine per l'inoculazione, tenere le guaine asportate rimanenti avvolte con un tovagliolo di carta umido per evitare l'essiccazione.
- Posizionare 20 μL della sospensione di spore fungine sulla superficie interna al centro del pezzo di guaina, direttamente sopra la nervatura centrale, come illustrato nella Figura 4.
- Posizionare le guaine fogliari inoculate orizzontalmente, con la nervatura centrale posta in basso, nel supporto all'interno di una piastra di Petri di vetro contenente una carta da filtro inumidita come illustrato nella Figura 5.
- Ogni rack può contenere fino a sette guaine. Inoculare almeno cinque guaine per ceppo per compensare la perdita di repliche che può verificarsi durante la preparazione o l'incubazione del campione.
- Metti le piccole camere di umidità in una scatola trasparente rivestita con carta di germinazione inumidita (vedi Tabella dei materiali).
- Copri la scatola con il coperchio. Incubare la scatola a 23 °C con illuminazione continua per il tempo previsto, che dipende dal fungo e dagli stadi di sviluppo del fungo che verranno osservati. Un riassunto dell'andamento temporale delle guaine di granturco inoculate con C. graminicola è riportato nella tabella 1.
- Controlla ogni giorno la presenza di segni/sintomi di malattia sulle guaine e mantieni umide sia la germinazione che la carta da filtro. Le guaine fogliari possono essere conservate fino a 6 giorni senza evidente morte o degradazione delle cellule vegetali in assenza di inoculazione.
Figura 2: Preparazione dell'unità filtrante in lana di vetro. (A) Una pallina di lana di vetro di 0,5 cm x 0,5 cm viene posizionata all'interno della provetta per microcentrifuga 1 a cui è stato rimosso il fondo conico. (B-C) Il tubo filtrante viene quindi inserito nel tubo di microcentrifuga 2 per generare un'unità filtrante assemblata per la preparazione della sospensione di spore. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Metodo di taglio di una piastra PCR a 96 pozzetti senza bordatura. (A) Piastra PCR tagliata in sei rack di supporto, 8 x 2 pozzetti. Un esempio di supporto a guaina singola è raffigurato in (B). Le guaine fogliari sono disposte orizzontalmente sul supporto. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Metodo di inoculazione della guaina. Singola goccia di inoculo applicata direttamente sulla superficie adassiale della sezione della guaina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Metodo di incubazione della guaina. Guaine fogliari inoculate poste orizzontalmente in una rastrelliera di supporto all'interno di una piastra di Petri di vetro contenente carta da filtro inumidita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Microscopia a cellule vive
- Preparazione del campione per microscopia
- Sciacquare delicatamente i pezzi della guaina con acqua deionizzata sterile per rimuovere eventuali spore non aderenti o crescita fungina superficiale.
- Posizionare la guaina su un vetrino da microscopio pulito (vedere Tabella dei materiali) con la superficie adassiale (interna) del pezzo di guaina rivolta verso il basso e la superficie abassiale (esterna) rivolta verso l'alto.
- Utilizzare una nuova lama di rasoio a filo singolo (vedere la tabella dei materiali) per tagliare circa 1 cm dalle estremità della guaina e rimuovere la maggior parte del tessuto della lamina su entrambi i lati della nervatura centrale.
- Tenere la lama del rasoio con un angolo di 90° rispetto alla guaina per radere il tessuto dalla costola mediana abassiale ed esporre lo strato epidermico sulla superficie adassiale sopra il punto inoculato. Cerca di mantenere uno spessore uniforme. Una volta rasate le guaine fogliari, non è consigliabile un'ulteriore potatura in quanto ciò potrebbe danneggiare il campione.
- Assicurarsi che le sezioni rasate non superino le dimensioni di 1 cm x 1 cm. Evitare di premere al centro della guaina durante questo processo. Quando si lavora con guaine inoculate con diverse sospensioni di spore, disinfettare i guanti e cambiare la lama del rasoio tra un campione e l'altro.
- Tenere a portata di mano un vetrino da microscopio pulito. Sollevare la sezione della guaina da un bordo e trasferirla con cura su una nuova slitta. La superficie inoculata (assiale) della guaina deve essere più in alto, più vicina alla lente dell'obiettivo. Montare le sezioni delicatamente per evitare danni alle strutture fungine.
- Applicare 60 μL di acqua deionizzata sterile sulla sezione e aggiungere un vetrino coprioggetti di 24 mm x 60 mm (vedere la tabella dei materiali). Fallo lentamente per evitare bolle d'aria.
- Quando si è pronti per la microscopia, sigillare il vetrino coprioggetto con uno smalto trasparente (vedere la tabella dei materiali) posizionando una piccola goccia su ciascun bordo e quindi collegando le gocce con un pennello per smalto per ottenere una sigillatura perfetta.
NOTA: Questo protocollo di guaina può essere utilizzato con colorazioni citologiche, ad es. 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), rosso neutro o blu tripano, o per l'osservazione della plasmolisi cellulare per valutare la vitalità delle cellule vegetali. Per la colorazione della guaina o i saggi di plasmolisi cellulare, non sigillare il vetrino coprioggetto. - Per i saggi di plasmolisi, aggiungere una soluzione ipertonica (0,75 M di saccarosio o 1 M di cloruro di sodio) su un bordo del vetrino coprioggetto e utilizzare una carta velina piegata priva di lanugine per aspirare la soluzione attraverso il campione fino all'altro bordo del vetrino coprioggetto. Per la colorazione, utilizzare un metodo simile per applicare la soluzione antimacchia.
- Microscopia a campo largo
- Una volta che le guaine fogliari sono montate sui vetrini del microscopio, ispezionarle per la colonizzazione fungina utilizzando un microscopio ottico a campo largo con un ingrandimento di 400x.
- Per osservare le strutture fungine in dettaglio, utilizzare un obiettivo a immersione in acqua anziché l'olio per una migliore qualità dell'immagine dei campioni. L'aberrazione sferica dovuta a una mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione può causare la degradazione dell'immagine. Gli obiettivi per l'acqua sono disponibili sia per i microscopi ottici a campo largo che per i microscopi confocali.
- Per determinare la quantità relativa di colonizzazione per guaina, contare il numero di cellule di mais invase da ciascun sito di penetrazione fungina utilizzando un microscopio ottico a campo largo con un ingrandimento di 100x. Questa quantificazione è una fase di screening appropriata prima di qualsiasi analisi statistica che confronti i ceppi, i trattamenti e/o le fasi di sviluppo.
- Microscopia confocale a scansione laser
- Per osservare le proteine fluorescenti nei tessuti di mais durante lo sviluppo di ceppi fungini transgenici, regolare i parametri di base di acquisizione delle immagini. Identificare le migliori impostazioni di eccitazione/emissione in base al marcatore fluorescente selezionato.
NOTA: Un obiettivo d'acqua 60x è preferibile quando si analizzano fusioni fluorescenti costruite con proteine secrete. I moderni microscopi confocali sono dotati di obiettivi a immersione in acqua altamente corretti per evitare artefatti e aberrazioni di forma. - Se si intende l'imaging di proteine fluorescenti su cellule vive, utilizzare ceppi fungini non trasformati come controlli per l'autofluorescenza. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione delle immagini per acquisire la dinamica dell'ospite fungino su un microscopio confocale invertito e per la proteina fluorescente mCherry. Impostare la potenza del laser fino al 5%, 450-600 alta tensione (HV) a seconda del livello di espressione, guadagno 1,375 X, offset 3%, un fattore di zoom ottico di 1 per l'analisi di un massimo di cinque celle di mais per sezione e un fattore di zoom ottico di 2-5 per le singole ife.
NOTA: Le immagini confocali Z-stack ad alta risoluzione forniscono dati tridimensionali e una migliore visione delle interazioni in tempo reale tra l'ospite e l'agente patogeno. - Per quantificare le intensità di fluorescenza corrispondenti alle proteine di fusione secrete, utilizzare un software di analisi delle immagini del produttore del confocale o un programma di elaborazione delle immagini come ImageJ, che può essere scaricato gratuitamente online. Consultare un manuale per i dettagli su come quantificare i segnali fluorescenti di conseguenza.
- Per osservare le proteine fluorescenti nei tessuti di mais durante lo sviluppo di ceppi fungini transgenici, regolare i parametri di base di acquisizione delle immagini. Identificare le migliori impostazioni di eccitazione/emissione in base al marcatore fluorescente selezionato.
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Representative Results
Gli esempi seguenti descrivono i risultati rappresentativi in seguito all'uso del metodo di inoculazione della guaina fogliare di mais. Questi esempi dimostrano la facilità, la velocità e la precisione con cui l'osservazione e il confronto delle interazioni mais-funghi possono essere realizzati in tempo reale con questo saggio ottimizzato. L'imaging di cellule vive consente anche l'estrazione di informazioni quantitative, fornendo uno strumento utile per studi molecolari, citologici e fisiologici comparativi. Ulteriori dettagli possono essere trovati nelle pubblicazioni originali citate per ciascuna domanda accolta.
Esempio di dati 1: Uso della colorazione e della plasmolisi in guaine fogliari inoculate per la valutazione dello stato fungino e il rilevamento delle risposte delle piante all'infezione fungina
Le guaine fogliari di mais sono state utilizzate per visualizzare e confrontare i processi di infezione di Colletotrichum graminicola e Stenocarpella maydis in cellule ospiti viventi con microscopia in campo chiaro, consentendo descrizioni dettagliate dei modelli di colonizzazione e dei corsi temporali (risultati non pubblicati; Figura 6).
Questi studi hanno rivelato che S. maydis invade rapidamente le cellule epidermiche direttamente attraverso gonfiori ifali indifferenziati, a differenza di C. graminicola che produce appressoria melanizzata. Una volta all'interno delle cellule epidermiche, entrambi i patogeni procedono da cellula a cellula passando attraverso pareti cellulari apparentemente intatte (Figura 6A,B).
Le guaine possono essere colorate con blu di tripano o DAPI per valutare più facilmente la natura e l'estensione della colonizzazione delle ife fungine (Figura 6). La colorazione blu di tripano rivela che C. graminicola inizialmente invade attraverso spesse ife primarie che si muovono tra le cellule attraverso connessioni molto strette. Successivamente, il fungo passa a uno stadio necrotrofico, producendo ife secondarie più sottili al centro della colonia (Figura 6 C-E)12,14,16,17.
Figura 6: Guaine fogliari di mais inoculate non colorate o colorate con microscopia a campo chiaro o a epifluorescenza. (A) Ifa intracellulare 48 ore dopo l'inoculazione (hpi ) con Stenocarpella maydis. L'infezione si verifica attraverso punte ifali leggermente gonfie (freccia). (B) Ifa intracellulari 48 hpi con Colletotrichum graminicola. L'infezione avviene attraverso l'appressoria melanizzata (frecce). (C) Ifate di C. graminicola, colorate con blu tripano, che progrediscono da cellula a cellula al bordo della colonia in avanzamento tramite connessioni strette (freccia), 72 hpi. (D) Vista ravvicinata dell'ifa colorata con blu tripano di C. graminicola a 72 hpi, che passa attraverso la parete cellulare del mais attraverso una stretta connessione (freccia). (E) Ifate di C. graminicola, macchiate di blu tripano, nel centro della colonia a 72 hpi. Le ife secondarie più strette possono essere viste emergere dalle ife primarie più spesse (frecce). (F) Ifate di C. graminicola 72 hpi, al margine della colonia in avanzamento su una guaina fogliare colorata con DAPI. I nuclei fungini e vegetali colorati diventano fluorescenti sotto la luce UV. Barre graduate in ogni pannello pari a 50 μm. Micrografie ottenute utilizzando una fotocamera digitale monocromatica accoppiata ad un microscopio ad epifluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le guaine possono essere colorate con rosso neutro e/o sottoposte a plasmolisi per studiare la citologia dello sviluppo e la vitalità delle cellule di mais durante l'infezione e la colonizzazione da parte di funghi patogeni (Figura 7).
Colletotrichum graminicola è un fungo emibiotrofico che invade le cellule di mais viventi con ife primarie spesse che sono separate dal citoplasma ospite da una membrana (Figura 7A-C)12,14,16,17. La Stenocarpella maydis, d'altra parte, è un fungo necrotrofico che produce una fitotossina23 e uccide le cellule epidermiche (che diventano granulose e non riescono a plasmolizzare) prima di invaderle (Figura 7D).
La difesa del mais contro C. graminicola e altri patogeni fogliari comporta l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), in particolareperossido di idrogeno (H 2 O2 ́)12,15. Per studiare la chimica ossidativa delle interazioni pianta-patogeno, la 3,3′-diamminobenzidina (DAB) può essere utilizzata per la colorazione cellulare24. Il DAB viene ossidato daH 2 O2 , producendo un precipitato marrone scuro visibile nelle guaine fogliari del mais (Figura 7 E,F)12,24. La produzione del pigmento è un indicatore di un'esplosione ossidativa correlata a una risposta di resistenza dell'ospite.
Figura 7: Guaine fogliari di mais inoculate colorate e/o plasmolizzate con imaging al microscopio in campo chiaro. (A) Guaina fogliare inoculata con C. graminicola 24 hpi e sottoposta a plasmolisi e colorazione con rosso neutro. Le cellule di mais viventi sotto l'appressoria (frecce) plasmolizzano e colorano, dimostrando che l'agente patogeno non uccide le cellule prima dell'invasione. (B) Guaina fogliare 48 hpi con C. graminicola, sottoposta a plasmolisi e colorazione con rosso neutro. Le cellule di mais colonizzate da ife primarie (freccia) sono ancora vive, stabilendo che C. graminicola invade le cellule come biotrofi. (C) Guaina fogliare 48 hpi con C. graminicola, che mostra ife che si muovono da cellula a cellula al bordo avanzato della colonia. Le guaine sono state plasmolizzate ma non colorate. Le cellule non colonizzate che sono adiacenti al bordo della colonia (frecce) continuano a plasmolizzare. (D) Guaina fogliare 24 hpi con S. maydis, prima della penetrazione. Le cellule sotto la spora germinata (freccia) appaiono granulose e non riescono a plasmolizzare, indicando che S. maydis le uccide prima della penetrazione e che si comporta come un necrotrofo. (E) Guaina fogliare di granturco resistente consanguinea Mp305 24 hpi con C. graminicola e colorata con DAB. La colorazione scura indica una forte risposta ossidativa della singola cellula al centro dell'immagine, mentre aloni di pigmento marrone possono essere visti intorno alla maggior parte delle singole appressorie e la granulazione può essere osservata nelle cellule nella parte superiore della foto. (F) Una vista più ravvicinata degli aloni di pigmento marrone accumulati intorno all'appressoria e della deposizione di pigmento nelle pareti cellulari del mais vicine (frecce). Barre graduate in ogni pannello pari a 50 μm, ad eccezione di (F) che è di 20 μm. Micrografie ottenute utilizzando una fotocamera digitale monocromatica accoppiata ad un microscopio ad epifluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Esempio di dati 2: Imaging di cellule vive con funghi che esprimono proteine fluorescenti
Le ife fungine che esprimono proteine fluorescenti citoplasmatiche possono essere visualizzate ad alta risoluzione in cellule vive della guaina senza la necessità di colorazioni utilizzando un microscopio a epifluorescenza o confocale (Figura 8).
Le proteine fluorescenti possono essere indirizzate a vari organelli fungini, ad esempio i mitocondri, i nuclei o il sistema endomembrana, al fine di tracciare le loro posizioni e attività nelle cellule fungine viventi nelle piante (Figura 8C)25,26,27,28 (risultati non pubblicati). Le proteine fluorescenti possono anche essere guidate da diversi promotori fungini per fungere da reporter per varie funzioni: ad esempio, la RFP guidata dalla proteina di risposta allo stress della secrezione di chaperone BiP è mostrata (Figura 8D)29 (risultati non pubblicati). L'uso di guaine fogliari consente la visualizzazione di proteine di fusione fluorescenti marcate individualmente che vengono accumulate e secrete dalle ife fungine mentre colonizzano le cellule ospiti 8,9 (Figura 8E). Sono disponibili anche linee di mais transgeniche che esprimono proteine fluorescenti mirate a vari compartimenti cellulari, ad esempio nuclei o membrana plasmatica30,31 e possono essere utilizzate per inoculazioni per valutare gli effetti dell'infezione sulle strutture cellulari del mais, ad esempio i nuclei. L'uso di queste linee di mais transgenico ha dimostrato che i nuclei nelle cellule di mais non invase migrano tipicamente verso la parete cellulare più vicina alle cellule che sono già colonizzate da C. graminicola (risultati non pubblicati; Figura 8F).
Figura 8: Imaging in epifluorescenza (A, B) o confocale (C, D, E, F) di Colletotrichum graminicola che esprime proteine fluorescenti. (A) Guaina fogliare plasmolizzata non colorata 48 hpi con un ceppo di C. graminicola che esprime citoplasmaticamente mRFP sotto il controllo del promotore di ToxA34. In queste guaine fogliari si nota anche una significativa autofluorescenza. (B) Guaina fogliare non colorata 48 hpi con un ceppo di C. graminicola che esprime SGFP citoplasmaticamente sotto il controllo del promotore di ToxA. (C)Colletotrichum graminicola che esprime SGFP mirato al sistema endomembrana con un'ancora HDEL35. (D) Guaina fogliare non colorata 24 hpi con C. graminicola trasformata con mRFP sotto il controllo del promotore per l'omologo di C. graminicola dello chaperone BiP. La fluorescenza rossa nell'ifa primaria è un indicatore dell'attivazione di BiP in risposta allo stress della secrezione. (E) Accumulo di arabinofuranosidasi::mCherry fusion protein nell'ifa primaria di C. graminicola WT che attraversa la parete cellulare della guaina fogliare del mais a 44 hpi. (F) Guaina fogliare di una linea di mais transgenico che esprime YFP mirata ai nuclei vegetali30,31, 48 hpi con un ceppo di C. graminicola che esprime citoplasmaticamente mRFP sotto il controllo del promotore di ToxA. Le barre della scala in ogni pannello sono pari a 20 μm, ad eccezione del pannello A dove è uguale a 50 μm. Le micrografie sono state ottenute utilizzando una fotocamera digitale monocromatica accoppiata con un microscopio a epifluorescenza. Le immagini in (C-F) sono state catturate con un microscopio confocale a scansione laser. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Dati di esempio 3: Uso di guaine fogliari di mais per esaminare la citologia dettagliata delle risposte e delle interazioni compatibili/incompatibili tra ceppi fungini
Un ceppo mutante non patogeno di C. graminicola (cpr1 MT) è stato confrontato con il ceppo wild-type (WT) nelle guaine fogliari di mais (Figura 9A,B)12.
L'imaging su cellule vive dei ceppi marcati con proteine fluorescenti citoplasmatiche ha dimostrato che il mutante era specificamente compromesso nel movimento da cellula a cellula all'interno delle guaine fogliari di mais. Il protocollo della guaina ha permesso una quantificazione precisa che ha rivelato che la MT cpr1 è stata confinata alla prima cellula colonizzata il 95% delle volte (Figura 9C)12. Ciò era in netto contrasto con il WT, in cui meno del 5% delle infezioni rimaneva all'interno della prima cellula colonizzata nello stesso lasso di tempo12. È interessante notare che la MT cpr1 è stata in grado di crescere saprofiticamente oltre la prima cellula inizialmente infettata in guaine localmente congelate, come il ceppo WT (Figura 9D). Ciò ha indicato che l'incapacità della MT cpr1 di colonizzare era specificamente correlata ad una risposta attiva della cellula vivente di mais.
Il saggio di inoculazione della guaina fogliare è stato utilizzato per testare le interazioni tra la MT cpr1 che esprime GFP e i ceppi WT che esprimono RFP co-inoculandoli sulla stessa guaina fogliare12. Quando i ceppi sono stati inoculati vicini tra loro (a non più di 8 cellule di mais l'uno dall'altro), il cpr1 MT è stato in grado di crescere normalmente come un biotrofo da cellula a cellula (Figura 9E,F). I saggi di plasmolisi hanno confermato che il fungo cpr1 MT è entrato nelle cellule viventi12. Tutte queste osservazioni dettagliate sono state rese possibili dai saggi di guaina e hanno implicato l'esistenza di un fattore diffusibile che induce la compatibilità prodotta dal ceppo WT di C. graminicola ma assente nel cpr1 MT12.
Figura 9: Interazioni compatibili e incompatibili che coinvolgono i ceppi WT e cpr1 MT di Colletotrichum graminicola. L'uso di diverse proteine fluorescenti ha permesso di distinguere i due ceppi quando co-inoculati su guaine fogliari di mais12. (A) Il ceppo WT C. graminicola che esprime mRFP citoplasmatica in guaine fogliari di mais a 48 hpi. (B) Il ceppo C. graminicola cpr1 MT che esprime SGFP in guaine fogliari di mais a 72 hpi. La MT cpr1 solo raramente (<5% delle volte) colonizza oltre la prima cellula infetta, anche fino a 6 giorni dopo l'inoculazione. (C) Una vista più ravvicinata del ceppo MT cpr1 di C. graminicola che esprime SGFP a 72 dpi. In questo caso, è riuscito ad attraversare la parete cellulare nella cellula successiva, ma poi ha smesso di svilupparsi. (D) Il ceppo MT cpr1 MT di C. graminicola che esprime SGFP, 48 hpi nei tessuti della guaina uccisi. Il ceppo cpr1 MT colonizza rapidamente le cellule della guaina di mais non vivente, in modo simile al WT. (E) Quando i ceppi WT-mRFP di C. graminicola e cpr1 MT-GFP C. graminicola sono co-inoculati vicini su guaine di foglie di mais (48 hpi), il ceppo cpr1 MT-GFP riacquista la capacità di progredire normalmente attraverso le cellule viventi della guaina di mais, come biotrofio. La crescita biotrofica all'interno delle cellule viventi è stata confermata dai saggi di plasmolisi. (F) Una vista più ravvicinata del ceppo MT cpr1 di C. graminicola che esprime SGFP, che cresce da cellula a cellula quando inoculato adiacente al WT (a non più di 8 cellule di mais di distanza). Le barre della scala sono uguali a 50 μm (A, B ed E) o 20 μm (C, D e F). Le micrografie sono state ottenute utilizzando una fotocamera digitale monocromatica accoppiata con un microscopio a epifluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le guaine inoculate sono state utilizzate anche per produrre tessuti per l'estrazione dell'RNA per l'analisi dell'attività trascrizionale32,33. Le guaine erano ideali per questo scopo, poiché potevano essere ispezionate prima dell'estrazione per monitorare il processo di infezione, garantendo così l'uniformità del campione su più repliche. Questi studi hanno permesso l'identificazione di ondate di geni differenzialmente espressi tra gli stadi di transizione dello stile di vita di Colletotrichum 32,33.
Dati di esempio 4: Risultati di esperimenti non ottimali
L'imaging insoddisfacente delle cellule vive può essere il risultato di un taglio insufficiente delle guaine fogliari, che porta alla sovrapposizione di strati di cellule epidermiche e a campioni otticamente opachi (Figura 10).
Figura 10: Risultato sperimentale non ottimale a causa di una potatura insufficiente delle guaine fogliari. A) Esempio di strati multipli di cellule epidermiche che interferiscono con l'esame dello sviluppo funginoin vivo. (B) Esempio di sovrapposizione di strati cellulari che influenzano l'imaging di cellule vive. Barre graduate pari a 20 μm. Le micrografie sono state ottenute utilizzando una fotocamera digitale monocromatica accoppiata con un microscopio a epifluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Un altro potenziale risultato non ottimale dell'esperimento è una concentrazione di inoculo non aggiustata che può portare a un numero basso (Figura 11A) o elevato di spore: quest'ultimo può comportare una ridotta germinazione o penetrazione appressoriosa (Figura 11B). Quest'ultimo può anche ostacolare la quantificazione delle cellule di mais colonizzate in ciascun sito di penetrazione fungina.
Figura 11: Risultato dell'esperimento non ottimale a causa di una concentrazione di inoculo regolata in modo improprio. Bassa concentrazione di sospensione di spore di C. graminicola inoculate su guaine con conseguente basso numero di siti di penetrazione fungina. B. L'elevata concentrazione di inoculo di C. graminicola sulle guaine fogliari causa appressoria multipla in stretta vicinanza e ridotta penetrazione della cellula ospite. Barre graduate pari a 20 μm. Le micrografie sono state ottenute utilizzando una fotocamera digitale monocromatica accoppiata con un microscopio a epifluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tempo di osservazione microscopica (hpi) | Stadio di sviluppo di C. graminicola inoculato su guaine fogliari di mais |
| 12 | Appressoria |
| 24 | Ifate primarie |
| 36 | Ifate secondarie |
| 48 | Ifate secondarie |
| 60 | Acervuli |
| 72 | Acervuli |
| 108 | Acervuli |
Tabella 1: Decorso temporale dell'infezione da Colletotrichum graminicola : Riepilogo del decorso temporale delle guaine fogliari di mais inoculate con il ceppo M1.001 di C. graminicola sulla base delle tappe fondamentali dello sviluppo fungino durante la transizione dello stile di vita. Le osservazioni microscopiche sono state eseguite ogni 12 ore.
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Discussion
Il metodo di inoculazione della guaina fogliare ottimizzato qui descritto è modificato da un protocollo originale che è stato sviluppato ed è stato applicato alle guaine fogliari di riso 6,8,36. Consente osservazioni dirette e dettagliate della crescita e dello sviluppo fungino nelle cellule vegetali viventi con microscopia a campo largo o confocale. Il protocollo è adatto per la caratterizzazione, il confronto e la quantificazione di una varietà di fenomeni microscopici durante la colonizzazione del mais, tra cui lo sviluppo fungino e le risposte dell'ospite durante le interazioni compatibili e incompatibili; produzione e secrezione di specifiche proteine fungine in planta; citologia e biochimica dei fattori di patogenicità comuni o nuovi prodotti durante l'interazione mais-fungino. Abbiamo utilizzato questo metodo con patogeni emibiotrofi e necrotrofi del mais. Non abbiamo tentato inoculazioni con patogeni biotrofici (ad esempio, funghi della ruggine) ma le guaine, poiché rimangono vive, sarebbero utili anche per quell'applicazione. Abbiamo applicato questo metodo anche alle guaine di sorgo per indagini sulla citologia della resistenza specifica dell'ospite e della cultivar 7,37. Per le guaine di sorgo, l'unica modifica al protocollo è stata quella di riempire l'intera guaina con sospensione di spore, piuttosto che applicare una singola goccia al centro. Ciò si è reso necessario a causa del diametro ridotto delle guaine di sorgo.
L'uso di questi saggi di guaina ha notevolmente migliorato i nostri studi dettagliati sui meccanismi di colonizzazione dell'ospite e sulle molecole fungine che sono fondamentali per la patogenicità. Ad esempio, l'applicazione del metodo ha dimostrato il riconoscimento di C. sublineola da parte del mais e di C. graminicola da parte del sorgo da parte di un non-ospite, comprese le risposte di resistenza ipersensibile in entrambi i casi7. Le guaine delle foglie di mais sono state utilizzate anche per testare le interazioni tra ceppi fungini a distanza sulla stessa guaina. In questo caso, la co-inoculazione di un ceppo WT patogeno e di un ceppo non patogeno di cpr1 MT insieme su guaine viventi ha dimostrato l'induzione della suscettibilità delle cellule di mais da parte del ceppo WT e ha fornito prove di un fattore diffusibile coinvolto nella patogenicità12. Le guaine hanno permesso la differenziazione dei due ceppi che esprimono diverse proteine fluorescenti, e la quantificazione e il confronto statistico del processo di colonizzazione per i ceppi inoculati da soli o insieme.
Questo test della guaina fogliare di mais presenta diversi vantaggi rispetto alle inoculazioni di piante intere per l'imaging di cellule vive. In primo luogo, il protocollo fornisce un imaging superiore, senza necessità di cancellazione o fissazione, degli agenti patogeni che interagiscono con le cellule ospiti viventi in tempo reale. Ad esempio, gli studi che utilizzano guaine fogliari di mais hanno permesso di rilevare un netto passaggio dalla biotrofia alla necrotrofia in C. graminicola emibiotrofica e hanno facilitato i confronti funzionali con un mutante non patogeno 7,12,16,17. Sebbene le guaine di foglie di riso asportate inoculate con M. oryzae possano presentare sintomi che non corrispondono a quelli osservati nelle piante di riso intere36, la tempistica e la comparsa della colonizzazione, del collasso dei tessuti e dello sviluppo delle lesioni nelle guaine di mais sono simili a quelle delle foglie intere12,14. Un secondo vantaggio del saggio della guaina è che mostra una maggiore sincronicità tra le repliche e la riproducibilità sperimentale della colonizzazione fungina12,18. Mentre l'inoculo dell'intera pianta può portare a livelli irregolari di penetrazione fungina18, le condizioni più controllate delle inoculazioni della guaina forniscono una maggiore sincronicità e consentono un'indagine e una quantificazione più precise delle interazioni. Questa maggiore sincronicità ha facilitato l'uso delle guaine nelle analisi del trascrittoma32,33. Inoltre, il protocollo della guaina ha consentito la necessaria velocità di preparazione del campione per l'analisi del trascrittoma: il taglio, il risciacquo e lo screening di ciascuna guaina non hanno richiesto più di 2 minuti prima di essere congelati per l'estrazione dell'RNA32,33.
I passaggi critici per il successo dell'imaging dell'infezione su cellule vive includono: 1) Le guaine devono essere utilizzate immediatamente dopo il taglio per gli esperimenti. Le guaine inoculate asportate non devono essere conservate per più di 6 giorni: se la colonizzazione fungina è pesante, si degraderanno più rapidamente12; 2) Attenzione a scegliere guaine della stessa età evolutiva per garantire risultati più riproducibili; 3) Utilizzare una sospensione di spore fresche provenienti da colture che hanno raggiunto la massima sporulazione; 4) Utilizzare lame di rasoio affilate per una rifilatura più efficiente per produrre campioni otticamente chiari; 5) Ridurre al minimo l'eccessiva e inutile manipolazione dei campioni in quanto questo processo può avere un impatto negativo sulle strutture dal vivo e sulla qualità dell'immagine; 6) Controllare quotidianamente le camere di umidità per assicurarsi che la carta da filtro sia sufficientemente umida; e 7) Quando si esegue l'imaging dei campioni su un microscopio confocale, mantenere le impostazioni di acquisizione fisse durante l'esperimento per evitare di introdurre cambiamenti di intensità o distorsioni quando si confrontano i segnali fluorescenti tra i campioni. Le proteine fluorescenti possono fotosbiancare se l'intensità e la durata del laser sono troppo elevate e possono dare segnali più deboli se le sezioni di tessuto vengono tenute a lungo sotto un vetrino coprioggetti sigillato. Gli esperimenti preliminari, compresi tutti i controlli appropriati, dovrebbero essere eseguiti per standardizzare e ottimizzare le condizioni, i materiali e le tempistiche per ottenere i risultati più riproducibili.
Risoluzione dei problemi
La rifilatura manuale non è sufficiente per produrre guaine otticamente trasparenti
È possibile che la lama del rasoio sia diventata opaca. In tal caso, smaltirlo correttamente e passare a una nuova lametta da barba a filo singolo. Utilizzare una pressione moderata e mantenere la lama ad un angolo di 90° rispetto al fodero. Raschiare il campione delicatamente, ma in modo coerente, fino all'osservazione di una sezione piatta e traslucida. Si consiglia di controllare le guaine al microscopio composto prima di procedere al microscopio confocale a scansione laser.
La guaina di mais inoculata è estremamente fragile
Ciò si verifica quando il fungo ha colonizzato la maggior parte del tessuto vegetale. Di conseguenza, il tessuto viene degradato e collassa. Quando si preparano campioni che sono già in fase necrotrofica, premere delicatamente la sezione contro un vetrino da microscopio, applicare una goccia di acqua sterile deionizzata e raschiare il campione una-due volte con un vetrino coprioggetti pulito.
Bassa germinazione e penetrazione delle spore in vivo
Ciò può essere dovuto a un numero elevato di spore che inibiscono la germinazione o la penetrazione. Assicurarsi che la concentrazione dell'inoculo sia regolata su 5 x 105 spore/mL. Se il problema persiste, regolare la concentrazione a 5 x 104 spore/mL. Come controllo per l'esperimento in vivo , posizionare 50 μL della stessa sospensione di spore su una nuova piastra PDA e distribuirla uniformemente. Controllare quotidianamente la vitalità e la germinazione delle spore.
Fasi di sviluppo fungino asincrono attraverso le guaine
Assicurati che le piante di mais siano allo stesso stadio di crescita e che le sezioni della guaina siano state ottenute dallo stesso nodo. Inoltre, assicurarsi che le spore siano vitali e che le colture fungine siano nella fase ottimale (ad esempio, non più di 2 settimane di colture per C. graminicola) per la preparazione dell'inoculo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti e nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano l'USDA-NIFA per il loro sostegno finanziario (numeri di sovvenzione 2018-67013-28489 e 2020-70410-32901). Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo manoscritto sono esclusivamente quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. Ringraziamo la studentessa brasiliana di Science Without Borders, Mayara de Silva, per le immagini che appaiono nella Figura 6A e nella Figura 7D. Ringraziamo anche il Dipartimento di Patologia Vegetale dell'Università del Kentucky per aver fornito l'accesso ai microscopi confocali Olympus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
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