Summary
Ce manuscrit détaille un protocole d’inoculation optimisé qui utilise des gaines de feuilles de maïs détachées pour des études cytologiques, physiologiques et moléculaires reproductibles des interactions du maïs avec les agents pathogènes fongiques des plantes. Les gaines foliaires facilitent l’observation en temps réel des interactions cellulaires entre la plante vivante et le champignon dans les tissus non fixés.
Abstract
Nous avons optimisé un protocole d’inoculation des gaines foliaires du maïs avec des champignons pathogènes foliaires hémibiotrophes et nécrotrophes. La méthode est modifiée par rapport à celle appliquée à l’origine aux gaines des feuilles de riz et permet une observation microscopique directe de la croissance et du développement fongiques dans les cellules végétales vivantes. Les gaines foliaires prélevées sur des semis de maïs dont le collet est entièrement levé sont inoculées avec 20 μL de suspensions de spores fongiques de 5 x 105 spores/mL et incubées dans des chambres humides à 23 °C sous une lumière fluorescente continue. Après 24 à 72 h, l’excès de tissu est retiré avec une lame de rasoir pour laisser une seule couche de cellules épidermiques, un échantillon optiquement clair qui peut être imagé directement sans qu’il soit nécessaire de fixer ou de nettoyer chimiquement. Les cellules végétales et fongiques restent vivantes pendant toute la durée de l’expérience et les interactions peuvent être visualisées en temps réel. Les gaines peuvent être colorées ou soumises à une plasmolyse pour étudier la cytologie du développement et la viabilité des cellules hôtes et pathogènes au cours de l’infection et de la colonisation. Les souches fongiques transformées pour exprimer des protéines fluorescentes peuvent être inoculées ou co-inoculées sur les gaines pour une résolution accrue et pour faciliter l’évaluation des interactions compétitives ou synergiques. Les souches fongiques exprimant des protéines de fusion fluorescentes peuvent être utilisées pour suivre et quantifier la production et le ciblage de ces protéines individuelles in planta. Les tissus de gaine inoculés peuvent être extraits pour caractériser les acides nucléiques, les protéines ou les métabolites. L’utilisation de ces essais de gaine a considérablement fait progresser les études détaillées des mécanismes de pathogénicité fongique chez le maïs, ainsi que des effecteurs protéiques fongiques et des métabolites secondaires contribuant à la pathogénicité.
Introduction
Les analyses spatiales et temporelles au niveau cellulaire sont essentielles pour comprendre la physiologie et la cytologie des interactions fongiques-plantes. Les tissus foliaires qui ont été fixés chimiquement 1,2,3 ou nettoyés et colorés4, ainsi que les membranes artificielles5, ont été utilisés dans le passé pour étudier la cytologie du développement des agents pathogènes foliaires et les interactions plantes-champignons. Cependant, l’étude des événements infectieux dans les tissus de l’hôte vivant en temps réel sans fixation ni nettoyage est difficile en raison de problèmes techniques liés à la préparation d’échantillons optiquement transparents pour l’imagerie.
À la fin des années 1940, un protocole d’inoculation de gaine foliaire détachée a été mis au point pour l’étude microscopique en fond clair de la résistance des cellules épidermiques vivantes du riz au champignon Magnaporthe oryza6. Plus récemment, des observations moléculaires, physiologiques et cytologiques détaillées de la colonisation de l’hôte par les espèces Colletotrichum et Magnaporthe ont été grandement facilitées par la combinaison de versions modifiées de cette méthode de gaine foliaire avec des transformants fongiques exprimant des protéines fluorescentes, et des protocoles d’imagerie de cellules vivantes à haute performance, y compris l’épifluorescence et la microscopie confocale 7,8,9,10,11,12,13.
Cet article détaille un protocole d’inoculation optimisé utilisant des gaines de feuilles de maïs détachées pour l’observation des processus d’infection par des agents pathogènes fongiques foliaires hémibiotrophes et nécrotrophes. Nous l’avons spécifiquement utilisé pour étudier Colletotrichum graminicola (C. graminicola), l’agent causal de la brûlure des feuilles anthracnose et de la pourriture de la tige, et Stenocarpella maydis, qui cause la brûlure des feuilles et la pourriture de la tige de Diplodia. Cependant, la méthode devrait être applicable à d’autres pathogènes fongiques foliaires hémibiotrophes et nécrotrophes. Les réponses cytologiques et physiologiques lors d’événements d’infection et de colonisation dans ces gaines foliaires excisées sont similaires à celles des limbes entiers12,14,15. De plus, la colonisation hémibiotrophe des cellules épidermiques de la gaine par C. graminicola est similaire à la colonisation des cellules de la moelle pédonculaire16,17. Les gaines détachées présentent une plus grande synchronicité et une plus grande reproductibilité expérimentale de la pénétration et de la colonisation fongiques que les limbes des feuilles ou les tissus de la moelle des tiges14,16,17,18. La plupart des variétés de maïs peuvent être utilisées pour ce protocole. Cependant, les consanguins ou les hybrides avec des pigments violets excessifs dans les gaines sont moins appropriés car les pigments interfèrent avec l’imagerie. Le maïs sucré du jubilé d’or a été particulièrement utile pour nos études, car les semences non traitées sont disponibles dans le commerce, les plantes sont très sensibles à de nombreuses maladies foliaires et elles poussent bien en serre. Les premières épidémies de pourriture de la tige par l’anthracnose aux États-Unis ont entraîné la perte totale des récoltes de maïs sucré dans l’Indiana dans les années1970 19,20. Cette méthode d’inoculation de la gaine foliaire peut être appliquée pour observer et quantifier directement la croissance et le développement fongiques dans les cellules végétales vivantes par rapport aux cellules végétales tuées localement, pour démontrer les réactions de résistance dans les réponses compatibles/incompatibles à l’infection fongique et pour tester les interactions entre les souches fongiques sur la même gaine en temps réel.
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Protocol
REMARQUE : Le flux de travail de la méthode est illustré à la figure 1.
Figure 1 : Étapes du protocole d’inoculation optimisé à l’aide de gaines de feuilles de maïs détachées. La préparation de la suspension de spores, l’inoculation de la gaine foliaire et la préparation d’échantillons pour la microscopie de cellules vivantes sont surlignées dans des cases vertes (A), violettes (B) et oranges (C), respectivement. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. Matériel végétal et fongique
- Croissance des plantes
- Cultivez les plants de maïs (voir tableau des matériaux) en serre (14 h lumière/27 °C et 10 h obscurité/22 °C) dans des conteneurs SC10 (voir tableau des matériaux). Utilisez un milieu de culture composé de trois parties de terreau commercial (voir le tableau des matériaux) et de deux parties de terre végétale stérilisée à la vapeur.
- Arrosez les semis pendant 2 min avec un système d’irrigation par aspersion une fois par jour, le matin.
- Récoltez les semis au stade V2 en les coupant au niveau du sol. Le stade de croissance V2 est atteint lorsque les plantules mesurent de 5 à 10 cm de haut et ont deux feuilles à collette visibles21.
- Enveloppez les plantes avec une serviette en papier humide et placez-les dans un sac en plastique pour les transporter au laboratoire pour un traitement ultérieur.
- Cultures fongiques
- Réactiver les cultures mères de silice fongique entreposées dans des conditions aseptiques22en saupoudrant environ 50 granules de silice infestée sur un milieu gélosé approprié. Pour éviter les changements morphologiques et la perte de pathogénicité, les souches de sous-culture ne dépassent pas 3 fois après la réactivation. La gélose au dextrose de pomme de terre (PDA ; voir le tableau des matériaux) est couramment utilisée pour la culture de C. graminicola, tandis que la gélose à l’avoine (OA ; voir le tableau des matériaux) est utilisée pour S. maydis.
- Pour préparer la PDA à la culture de souches fongiques, suspendre 19,5 g de PDA déshydraté préparé commercialement dans 500 mL d’eau déminéralisée (DI). Pour faire de l’arthrose, faites bouillir 36 g d’arthrose déshydratée préparée dans du commerce dans de l’eau déminéralisée pendant 15 à 30 minutes, filtrez à travers trois couches d’étamine et portez le filtrat à 500 ml avec de l’eau déminéralisée. Milieu autoclave à stériliser.
- Complétez le milieu fondu et refroidi avec un antibiotique approprié (p. ex., hygromycine B, génétique) lorsque vous travaillez avec des souches transformantes. Les concentrations finales d’hygromycine ou de génétique dans 500 mL de milieu sont respectivement de 250 μg/mL et de 100 μg/mL.
- Incuber les cultures dans des conditions optimales jusqu’à ce qu’un mycélium sporulant se soit développé. Colletotrichum graminicola et S. maydis poussent bien à 23 °C avec une lumière fluorescente continue et des niveaux d’humidité ambiante. La sporulation a lieu 7 jours après l’inoculation (dai) pour S. maydis ou 14 jours après l’inoculation pour C. graminicola.
2. Inoculations de la gaine foliaire
- Assemblage de l’unité de filtration en laine de verre
- À l’aide de ciseaux ou de cisailles robustes, coupez le capuchon à environ 0,5 mm du fond conique d’un tube de microcentrifugation de 1,5 ml (voir le tableau des matériaux).
- Placez un morceau de laine de verre (environ 0,5 cm x 0,5 cm ; voir le tableau des matériaux) à l’intérieur du tube coupé pour couvrir le trou central, comme illustré à la figure 2.
- Portez des gants lorsque vous coupez de la laine de verre, car le verre borosilicaté peut provoquer des irritations.
- Préparation des supports de gaine de vantail
- Découpez une plaque PCR à 96 puits sans jupe (voir le tableau des matériaux) en six racks de support à deux colonnes (8 x 2 puits), comme illustré à la figure 3A.
- Retournez les grilles à deux colonnes de manière à ce que les fonds coniques des puits soient orientés vers le haut et les sommets plats vers le bas (Figure 3B).
- Placez chaque support dans une plaque de Pétri en verre contenant du papier filtre humidifié et couvrez-la avec le couvercle (voir le tableau des matériaux). Cette unité fonctionne comme une petite chambre d’humidité pour les gaines.
- Préparation de l’inoculum
- Pour chaque souche fongique, placer une unité de filtration en laine de verre assemblée dans un tube de microcentrifugation stérile intact de 1,5 mL, comme illustré à la figure 2. Ce dernier fonctionne comme un tube de collecte.
- Étiquetez les tubes.
- Récoltez les conidies des cultures sporulées en inondant d’abord chaque plaque de 3 à 4 ml d’eau DI stérile. Dans certains cas, il peut être nécessaire d’avoir plus d’eau pour produire une couche de liquide à la surface de la colonie. Les agents mouillants ne sont pas nécessaires dans ce système.
- Détachez les spores de la gélose à l’aide d’un pilon stérile à pointe conique (voir le tableau des matériaux) pour racler uniformément toute la plaque.
- Appliquer 1 mL de suspension de spores sur une unité de filtration en laine de verre de manière aseptique et laisser les spores s’écouler dans le tube collecteur par gravité.
- Centrifuger les tubes de prélèvement contenant les suspensions de spores filtrées à 3 500 x g pendant 5 min. Les spores doivent être granulées au fond du tube de la microcentrifugeuse.
REMARQUE : Centrifuger les spores de C. graminicola à des vitesses plus élevées que celles recommandées ici entraîne une perte importante de viabilité. - Versez le liquide dans un récipient autoclavable, ajoutez 1 mL d’eau dépérissable stérile et agitez doucement pour remettre en suspension les spores granulées. Centrifugeuse comme à l’étape 2.3.6.
- Lavez les spores 3 fois pour éliminer toute matrice conidiale qui pourrait contenir des auto-inhibiteurs susceptibles de réduire la germination ou la pénétration.
- Après le troisième lavage, ajouter 300 à 500 μL d’eau stérile d’injection intraveineuse pour remettre les spores en suspension à des fins de quantification.
- Utilisez un hémocytomètre sous un microscope composé à un grossissement de 100x pour déterminer la concentration de spores. Il n’est pas nécessaire de colorer les spores avant de les compter.
- Préparer une suspension de 5 x 105 spores/mL avec de l’eau stérile.
REMARQUE : La suspension de spores de C. graminicola ne peut être conservée à température ambiante pendant 4 h maximum avant une perte rapide de viabilité. La réfrigération des conidies n’augmente pas la viabilité.
- Inoculations de gaine
- Vérifiez les pratiques et les procédures de biosécurité pertinentes avant d’inoculer des souches fongiques aux plantes.
- Retirez la gaine de la première vraie feuille des semis V2 en passant un ongle de pouce le long de la marge qui se chevauche de la gaine et détachez-la doucement de la pousse. Desserrez la gaine des deux côtés de la pousse avant d’essayer de la retirer.
- Coupez les gaines foliaires récupérées en segments de 3 à 5 cm. Il n’est pas nécessaire de désinfecter les gaines en surface avant l’inoculation.
- Déroulez chaque segment très doucement pour exposer la couche épidermique interne (adaxiale).
- Lors de la préparation des gaines pour l’inoculation, gardez les gaines excisées restantes enveloppées d’un essuie-tout humide pour éviter la dessiccation.
- Placez 20 μL de la suspension de spores fongiques sur la surface interne au centre de la gaine, directement au-dessus de la nervure médiane, comme illustré à la figure 4.
- Placez les gaines foliaires inoculées horizontalement, avec la nervure médiane placée en bas, dans le support à l’intérieur d’une boîte de Pétri en verre contenant un papier filtre humidifié, comme illustré à la figure 5.
- Chaque rack peut contenir jusqu’à sept gaines. Inoculer au moins cinq gaines par souche pour compenser la perte de répétitions qui peut se produire lors de la préparation ou de l’incubation de l’échantillon.
- Placez les petites chambres d’humidité dans une boîte de rangement transparente recouverte de papier de germination humidifié (voir le tableau des matériaux).
- Couvrez la boîte avec le couvercle. Incuber la boîte à 23 °C avec un éclairage continu pour l’évolution temporelle prévue, qui dépend du champignon et des stades de développement fongique qui seront observés. Le tableau 1 résume l’évolution temporelle des gaines de maïs inoculées avec C. graminicola.
- Vérifiez tous les jours s’il y a des signes ou des symptômes de maladie sur les gaines et gardez les papiers de germination et les papiers filtres humides. Les gaines foliaires peuvent être conservées jusqu’à 6 jours sans mort ou dégradation évidente des cellules végétales en l’absence d’inoculation.
Figure 2 : Préparation de l’unité de filtration en laine de verre. (A) Une boule de laine de verre de 0,5 cm x 0,5 cm est placée à l’intérieur du tube de microcentrifugation 1 dont le fond conique a été retiré. (B-C) Le tube filtrant est ensuite placé dans le tube de microcentrifugation 2 pour générer une unité de filtration assemblée pour la préparation de la suspension des spores. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Méthode de découpe d’une plaque PCR à 96 puits sans jupe. (A) Plaque PCR découpée en six racks de support, 8 x 2 puits. Un exemple d’un support de gaine unique est illustré en (B). Les gaines foliaires sont posées horizontalement sur le support. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Méthode d’inoculation de la gaine. Une seule goutte d’inoculum appliquée directement sur la surface adaxiale de la section de gaine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Méthode d’incubation de la gaine. Gaines foliaires inoculées placées horizontalement dans un support à l’intérieur d’une boîte de Pétri en verre contenant du papier filtre humidifié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Microscopie de cellules vivantes
- Préparation d’échantillons pour la microscopie
- Rincez délicatement les pièces de la gaine avec de l’eau détritue stérile pour éliminer les spores non détectées ou les excroissances fongiques superficielles.
- Placez la gaine sur une lame de microscope en verre propre (voir le tableau des matériaux) avec la surface adaxiale (intérieure) de la gaine vers le bas et la surface abaxiale (extérieure) vers le haut.
- Utilisez une nouvelle lame de rasoir à un seul tranchant (voir le tableau des matériaux) pour couper environ 1 cm des extrémités de la gaine et enlever la majeure partie du tissu du limbe de chaque côté de la nervure médiane.
- Tenez la lame de rasoir à un angle de 90° par rapport à la gaine pour raser le tissu de la nervure médiane abaxiale et exposer la couche épidermique sur la surface adaxiale au-dessus de la tache inoculée. Essayez de maintenir une épaisseur uniforme. Une fois que les gaines foliaires sont rasées, il n’est pas recommandé de les tailler davantage car cela pourrait endommager l’échantillon.
- Assurez-vous que les sections rasées ne mesurent pas plus de 1 cm x 1 cm. Évitez d’appuyer sur le centre de la gaine pendant ce processus. Lorsque vous travaillez avec des gaines inoculées avec différentes suspensions de spores, désinfectez les gants et changez la lame de rasoir entre les échantillons.
- Gardez une lame de microscope en verre propre à portée de main. Soulevez la section de la gaine d’un bord et transférez-la soigneusement sur une nouvelle lame. La surface inoculée (adaxiale) de la gaine doit être la plus haute, la plus proche de la lentille de l’objectif. Montez les sections en douceur pour éviter d’endommager les structures fongiques.
- Appliquer 60 μL d’eau stérile sur la section et ajouter une lamelle en verre de 24 mm x 60 mm (voir le tableau des matériaux). Faites-le lentement pour éviter les bulles d’air.
- Lorsque vous êtes prêt pour la microscopie, scellez la lamelle avec du vernis à ongles transparent (voir le tableau des matériaux) en plaçant une petite goutte sur chaque bord, puis en reliant les gouttes ensemble avec un pinceau à vernis à ongles pour obtenir un joint homogène.
REMARQUE : Ce protocole de gaine peut être utilisé avec des colorants cytologiques, par exemple, le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), le rouge neutre ou le bleu trypan, ou pour l’observation de la plasmolyse cellulaire afin d’évaluer la viabilité des cellules végétales. Pour les essais de coloration de gaine ou de plasmolyse cellulaire, ne pas sceller la lamelle. - Pour les essais de plasmolyse, ajoutez une solution hypertonique (saccharose 0,75 M ou chlorure de sodium 1 M) sur un bord de la lamelle et utilisez un papier de soie non pelucheux plié pour aspirer la solution à travers l’échantillon jusqu’à l’autre bord de la lamelle. Pour la coloration, utilisez une méthode similaire pour appliquer la solution de teinture.
- Microscopie à champ large
- Une fois que les gaines foliaires sont montées sur des lames de microscope, inspectez-les pour détecter toute colonisation fongique à l’aide d’un microscope optique à grand champ à grossissement de 400x.
- Pour observer en détail les structures fongiques, utilisez un objectif à immersion dans l’eau plutôt que de l’huile pour une meilleure qualité d’image des échantillons. L’aberration sphérique due à un décalage de l’indice de réfraction peut entraîner une dégradation de l’image. Des objectifs à eau sont disponibles pour les microscopes optiques à grand champ ainsi que pour les microscopes confocaux.
- Pour déterminer la quantité relative de colonisation par gaine, comptez le nombre de cellules de maïs envahies à partir de chaque site de pénétration fongique à l’aide d’un microscope optique à grand champ à un grossissement de 100x. Cette quantification est une étape de dépistage appropriée avant toute analyse statistique comparant les souches, les traitements et/ou les stades de développement.
- Microscopie confocale à balayage laser
- Pour observer les protéines fluorescentes dans les tissus de maïs au cours du développement de souches fongiques transgéniques, ajustez les paramètres de base de l’acquisition d’images. Identifiez les meilleurs paramètres d’excitation/d’émission en fonction du marqueur fluorescent sélectionné.
REMARQUE : Un objectif d’eau 60x est préférable lors de l’analyse de fusions fluorescentes construites avec des protéines sécrétées. Les microscopes confocaux modernes ont des objectifs d’immersion dans l’eau hautement corrigés pour éviter les artefacts et les aberrations de forme. - Si l’imagerie de cellules vivantes de protéines fluorescentes est prévue, utiliser des souches fongiques non transformées comme témoins de l’autofluorescence. Utilisez les paramètres d’acquisition d’images suivants pour capturer la dynamique champignon-hôte sur un microscope confocal inversé et pour la protéine fluorescente mCherry. Réglez la puissance du laser jusqu’à 5 %, 450-600 haute tension (HV) selon le niveau d’expression, un gain de 1,375 X, un décalage de 3 %, un facteur de zoom optique de 1 pour l’analyse de jusqu’à cinq cellules de maïs par section et un facteur de zoom optique de 2 à 5 pour les hyphes individuels.
REMARQUE : Les images confococaux haute résolution de la pile Z fournissent des données tridimensionnelles et une meilleure vue des interactions en temps réel entre l’hôte et l’agent pathogène. - Pour quantifier les intensités de fluorescence correspondant aux protéines de fusion sécrétées, utilisez un logiciel d’analyse d’images du fabricant de confocaux ou un programme de traitement d’images tel que ImageJ, qui peut être téléchargé gratuitement en ligne. Consultez un manuel pour plus de détails sur la façon de quantifier les signaux fluorescents en conséquence.
- Pour observer les protéines fluorescentes dans les tissus de maïs au cours du développement de souches fongiques transgéniques, ajustez les paramètres de base de l’acquisition d’images. Identifiez les meilleurs paramètres d’excitation/d’émission en fonction du marqueur fluorescent sélectionné.
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Representative Results
Les exemples ci-dessous décrivent des résultats représentatifs de l’utilisation de la méthode d’inoculation de la gaine des feuilles de maïs. Ces exemples démontrent la facilité, la rapidité et la précision avec lesquelles l’observation et la comparaison des interactions maïs-champignon peuvent être réalisées en temps réel avec ce test optimisé. L’imagerie de cellules vivantes permet également d’extraire des informations quantitatives, ce qui constitue un outil utile pour les études moléculaires, cytologiques et physiologiques comparatives. De plus amples détails peuvent être trouvés dans les publications originales citées pour chaque demande retenue.
Exemple de données 1 : Utilisation de la coloration et de la plasmolyse dans les gaines foliaires inoculées pour l’évaluation de l’état fongique et la détection des réponses des plantes à l’infection fongique
Des gaines foliaires de maïs ont été utilisées pour visualiser et comparer les processus d’infection de Colletotrichum graminicola et de Stenocarpella maydis dans des cellules hôtes vivantes à l’aide de la microscopie à fond clair, ce qui a permis de décrire en détail les modèles de colonisation et les évolutions temporelles (résultats non publiés ; Graphique 6).
Ces études ont révélé que S. maydis envahit rapidement les cellules de l’épiderme directement via des renflements hyphes indifférenciés, contrairement à C. graminicola qui produit de l’appressoria mélanisée. Une fois à l’intérieur des cellules épidermiques, les deux agents pathogènes passent d’une cellule à l’autre en passant à travers des parois cellulaires apparemment intactes (Figure 6A,B).
Les gaines peuvent être colorées au bleu trypan ou au DAPI afin d’évaluer plus facilement la nature et l’étendue des hyphes fongiques colonisateurs (figure 6). La coloration au bleu trypan révèle que C. graminicola envahit d’abord par l’intermédiaire d’épais hyphes primaires qui se déplacent entre les cellules par des connexions très étroites. Plus tard, le champignon passe à un stade nécrotrophe, produisant des hyphes secondaires plus minces au centre de la colonie (Figure 6 C-E)12,14,16,17.
Figure 6 : Gaines de feuilles de maïs inoculées non colorées ou colorées imagées par microscopie à fond clair ou à épifluorescence. (A) Hyphaes intracellulaires 48 h après l’inoculation (hpi) avec Stenocarpella maydis. L’infection se produit par des pointes hyphes légèrement gonflées (flèche). (B) Hyphaes intracellulaires 48 hpi avec Colletotrichum graminicola. L’infection se produit par l’appressoria mélanisée (flèches). (C) Hyphae de C. graminicola, colorés en bleu trypan, progressant de cellule en cellule au bord de la colonie par des connexions étroites (flèche), 72 hpi. (D) Vue rapprochée de l’hyphe coloré en bleu trypan de C. graminicola à 72 hpi, traversant la paroi cellulaire du maïs par une connexion étroite (flèche). (E) Hyphae de C. graminicola, coloré de bleu trypan, au centre de la colonie 72 hpi. Des hyphes secondaires plus étroits peuvent être vus émergeant des hyphes primaires plus épais (flèches). (F) Hyphae de C. graminicola 72 hpi, à l’extrémité avancée de la colonie, sur une gaine foliaire colorée au DAPI. Les noyaux fongiques et végétaux colorés deviennent fluorescents sous la lumière UV. Barres d’échelle dans chaque panneau égales à 50 μm. Micrographies obtenues à l’aide d’une caméra numérique monochromatique couplée à un microscope à épifluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les gaines peuvent être colorées en rouge neutre et/ou soumises à une plasmolyse pour étudier la cytologie du développement et la viabilité des cellules de maïs lors de l’infection et de la colonisation par des champignons pathogènes (Figure 7).
Colletotrichum graminicola est un champignon hémibiotrophe qui envahit les cellules vivantes du maïs avec des hyphes primaires épais qui sont séparés du cytoplasme de l’hôte par une membrane (Figure 7A-C)12,14,16,17. Stenocarpella maydis, quant à lui, est un champignon nécrotrophe qui produit une phytotoxine23 et tue les cellules épidermiques (qui se granulent et ne parviennent pas à se plasmolyser) avant de les envahir (Figure 7D).
La défense du maïs contre C. graminicola et d’autres agents pathogènes foliaires implique l’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), en particulier le peroxyde d’hydrogène (H 2 O2)12,15. Pour étudier la chimie oxydative des interactions plantes-pathogènes, la 3,3′-diaminobenzidine (DAB) peut être utilisée pour la coloration cellulaire24. Le DAB est oxydé par H 2 O2, produisant un précipité brun foncé visible dans les gaines foliaires du maïs (Figure 7 E,F)12,24. La production du pigment est un indicateur d’une explosion oxydative liée à une réponse de résistance de l’hôte.
Figure 7 : Gaines foliaires de maïs inoculées colorées et/ou plasmolysées, imagées par microscopie à fond clair. (A) Gaine foliaire inoculée avec C. graminicola 24 hpi et soumise à une plasmolyse et à une coloration en rouge neutre. Les cellules vivantes du maïs sous l’appressoria (flèches) se plasmolysent et se colorent, ce qui démontre que l’agent pathogène ne tue pas les cellules avant l’invasion. (B) Gaine foliaire de 48 hpi avec C. graminicola, soumise à la plasmolyse et à la coloration en rouge neutre. Les cellules de maïs qui sont colonisées par des hyphes primaires (flèche) sont toujours vivantes, ce qui établit que C. graminicola envahit les cellules en tant que biotrophe. (C) Gaine foliaire de 48 hpi avec C. graminicola, montrant des hyphes se déplaçant de cellule en cellule à la limite avancée de la colonie. Les gaines ont été plasmolysées mais pas colorées. Les cellules non colonisées qui sont adjacentes au bord de la colonie (flèches) continuent de se plasmolyser. (D) Gaine foliaire de 24 hpi avec S. maydis, avant la pénétration. Les cellules situées sous la spore germée (flèche) semblent granulées et ne parviennent pas à se plasmolyser, ce qui indique que le S. maydis les tue avant la pénétration et qu’il se comporte comme un nécrotrophe. (E) Gaine foliaire de maïs résistant consanguin Mp305 24 hpi avec C. graminicola et colorée au DAB. La coloration foncée indique une forte réponse oxydative de la cellule unique au centre de l’image, tandis que des halos de pigment brun peuvent être vus entourant la plupart des appresseurs individuels, et une granulation peut être observée dans les cellules en haut de la photo. (F) Vue rapprochée des halos de pigment brun accumulés autour de l’appressoria, et du dépôt de pigment dans les parois cellulaires du maïs à proximité (flèches). Barres d’échelle dans chaque panneau égales à 50 μm, à l’exception de (F) qui est de 20 μm. Micrographies obtenues à l’aide d’une caméra numérique monochromatique couplée à un microscope à épifluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Exemple de données 2 : Imagerie de cellules vivantes avec des champignons exprimant des protéines fluorescentes
Les hyphes fongiques exprimant des protéines fluorescentes cytoplasmiques peuvent être visualisés à haute résolution dans des cellules vivantes de la gaine sans qu’il soit nécessaire de les colorer à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou confocal (Figure 8).
Les protéines fluorescentes peuvent être ciblées sur divers organites fongiques, par exemple les mitochondries, les noyaux ou le système endomembranaire, afin de suivre leur emplacement et leurs activités dans les cellules fongiques vivantes in planta (Figure 8C)25,26,27,28 (résultats non publiés). Les protéines fluorescentes peuvent également être pilotées par différents promoteurs fongiques pour servir de rapporteurs pour diverses fonctions : par exemple, la RFP pilotée par la protéine de réponse au stress de sécrétion chaperonne BiP est illustrée (Figure 8D)29 (résultats non publiés). L’utilisation de gaines foliaires permet de visualiser les protéines de fusion fluorescentes marquées individuellement qui sont accumulées et sécrétées par les hyphes fongiques lorsqu’elles colonisent les cellules hôtes 8,9 (Figure 8E). Des lignées de maïs transgéniques exprimant des protéines fluorescentes ciblant divers compartiments cellulaires, par exemple des noyaux ou des membranes plasmiques, sont également disponibles30,31 et peuvent être utilisées pour les inoculations afin d’évaluer les effets de l’infection sur les structures cellulaires du maïs, par exemple les noyaux. L’utilisation de ces lignées de maïs transgéniques a démontré que les noyaux des cellules de maïs non envahies migrent généralement vers la paroi cellulaire la plus proche des cellules déjà colonisées par C. graminicola (résultats non publiés ; Graphique 8F).
Figure 8 : Imagerie épifluorescence (A, B) ou confocale (C, D, E, F) de Colletotrichum graminicola exprimant des protéines fluorescentes. (A) Gaine foliaire non colorée, plasmolysée, de 48 hpi avec une souche de C. graminicola exprimant cytoplasmiquement la mRFP sous le contrôle du promoteur ToxA34. Une autofluorescence importante est également remarquée dans ces gaines foliaires. (B) Gaine foliaire non colorée de 48 hpi avec une souche de C. graminicola exprimant cytoplasmiquement le SGFP sous le contrôle du promoteur ToxA. (C)Colletotrichum graminicola exprimant le SGFP ciblé sur le système endomembranaire avec une ancre HDEL35. (D) Gaine foliaire non colorée de 24 hpi avec C. graminicola transformée avec mRFP sous le contrôle du promoteur de l’homologue de C. graminicola du chaperon BiP. La fluorescence rouge dans l’hyphe primaire est un indicateur de l’activation de BiP en réponse au stress de sécrétion. (E) Accumulation de la protéine de fusion arabinofuranosidase ::mCherry dans l’hyphe primaire WT de C. graminicola qui traverse la paroi cellulaire de la gaine foliaire du maïs à 44 hpi. (F) Gaine foliaire d’une lignée de maïs transgénique exprimant YFP ciblant les noyaux végétaux30,31, 48 hpi avec une souche de C. graminicola exprimant cytoplasmiquement la mRFP sous le contrôle du promoteur ToxA. Les barres d’échelle de chaque panneau sont égales à 20 μm, sauf pour le panneau A où elles sont égales à 50 μm. Les micrographies ont été obtenues à l’aide d’une caméra numérique monochromatique couplée à un microscope à épifluorescence. Les images en (C-F) ont été capturées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Exemple de données 3 : Utilisation de gaines foliaires de maïs pour examiner la cytologie détaillée des réponses et des interactions compatibles/incompatibles entre les souches fongiques
Une souche mutante non pathogène de C. graminicola (cpr1 MT) a été comparée à la souche de type sauvage (WT) dans les gaines foliaires du maïs (Figure 9A,B)12.
L’imagerie des cellules vivantes des souches marquées avec des protéines fluorescentes cytoplasmiques a démontré que le mutant était spécifiquement altéré dans son mouvement d’une cellule à l’autre à l’intérieur des gaines des feuilles de maïs. Le protocole de gaine a permis une quantification précise qui a révélé que la MT cpr1 était confinée à la première cellule colonisée dans 95 % des cas (Figure 9C)12. Cela contrastait fortement avec le WT, dans lequel moins de 5 % des infections sont restées dans la première cellule colonisée au cours de la même période12. Il est intéressant de noter que la MT cpr1 a pu se développer de manière saprophyte au-delà de la première cellule initialement infectée dans des gaines tuées localement par congélation, comme la souche WT (Figure 9D). Cela indiquait que l’incapacité de la MT cpr1 à coloniser était spécifiquement liée à une réponse active de la cellule vivante du maïs.
Le test d’inoculation de la gaine foliaire a été utilisé pour tester les interactions entre les souches de cpr1 MT exprimant la GFP et de WT exprimant la RFP en les co-inoculant sur la même gaine foliaire12. Lorsque les souches ont été inoculées à proximité les unes des autres (pas plus de 8 cellules de maïs espacées), le cpr1 MT a pu se développer normalement en tant que biotrophe d’une cellule à l’autre (Figure 9E,F). Les tests de plasmolyse ont confirmé que le champignon cpr1 MT pénétrait dans les cellules vivantes12. Toutes ces observations détaillées ont été rendues possibles par les essais de gaine et ont impliqué l’existence d’un facteur diffusible qui induit la compatibilité produite par la souche WT de C. graminicola mais absente de la cpr1 MT12.
Figure 9 : Interactions compatibles et incompatibles entre les souches WT et cpr1 MT de Colletotrichum graminicola. L’utilisation de différentes protéines fluorescentes a permis de distinguer les deux souches lorsqu’elles étaient co-inoculées sur des gaines foliaires de maïs12. (A) La souche WT C. graminicola exprimant la mRFP cytoplasmique dans les gaines foliaires du maïs à 48 hpi. (B) La souche C. graminicola cpr1 MT exprimant le SGFP dans les gaines foliaires du maïs à 72 hpi. La MT cpr1 ne colonise que rarement (<5 % du temps) au-delà de la première cellule infectée, même jusqu’à 6 jours après l’inoculation. (C) Vue rapprochée de la souche MT cpr1 de C. graminicola exprimant le SGFP à 72 dpi. Dans ce cas, il a réussi à traverser la paroi cellulaire dans la cellule suivante, mais il a ensuite cessé de se développer. (D) La souche C. graminicola cpr1 MT exprimant le SGFP, 48 hpi dans les tissus de gaine tués. La souche cpr1 MT colonise rapidement les cellules non vivantes de la gaine du maïs, comme la souche WT. (E) Lorsque les souches WT-mRFP C. graminicola et cpr1 MT-GFP C. graminicola sont co-inoculées à proximité l’une de l’autre sur les gaines foliaires du maïs (48 hpi), la souche cpr1 MT-GFP retrouve la capacité de progresser normalement à travers les cellules vivantes de la gaine du maïs, en tant que biotrophe. La croissance biotrophique à l’intérieur des cellules vivantes a été confirmée par des tests de plasmolyse. (F) Vue rapprochée de la souche C. graminicola cpr1 MT exprimant le SGFP, se développant d’une cellule à l’autre lorsqu’elle est inoculée à côté de la WT (pas plus de 8 cellules de maïs espacées). Les barres d’échelle sont égales à 50 μm (A, B et E) ou à 20 μm (C, D et F). Les micrographies ont été obtenues à l’aide d’une caméra numérique monochromatique couplée à un microscope à épifluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Des gaines inoculées ont également été utilisées pour produire des tissus destinés à l’extraction de l’ARN pour l’analyse de l’activité transcriptionnelle32,33. Les gaines étaient idéales à cet effet car elles pouvaient être inspectées avant l’extraction pour surveiller le processus d’infection, assurant ainsi l’uniformité de l’échantillon entre plusieurs réplications. Ces études ont permis d’identifier des vagues de gènes exprimés de manière différentielle entre les stades de transition du mode de vie de Colletotrichum 32,33.
Exemple de données 4 : Résultats d’expériences sous-optimales
Une imagerie insatisfaisante des cellules vivantes peut être le résultat d’une taille insuffisante des gaines foliaires, ce qui entraîne le chevauchement des couches de cellules épidermiques et l’opacité optique des échantillons (figure 10).
Figure 10 : Résultats expérimentaux sous-optimaux en raison d’une taille insuffisante des gaines foliaires ( A) Exemple de multiples couches de cellules épidermiques interférant avec l’examen du développement fongique invivo. (B) Exemple de superposition de couches cellulaires affectant l’imagerie de cellules vivantes. Barres d’échelle égales à 20 μm. Les micrographies ont été obtenues à l’aide d’une caméra numérique monochromatique couplée à un microscope à épifluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Un autre résultat sous-optimal potentiel de l’expérience est une concentration d’inoculum non ajustée qui peut entraîner un nombre faible (figure 11A) ou élevé de spores : ce dernier peut entraîner une réduction de la germination ou de la pénétration appressoriale (figure 11B). Ce dernier peut également entraver la quantification des cellules de maïs colonisées à chaque site de pénétration fongique.
Figure 11 : Résultats sous-optimaux de l’expérience en raison d’une concentration d’inoculum mal ajustée. Faible concentration de spores de C. graminicola en suspension inoculées sur les gaines, ce qui entraîne un faible nombre de sites de pénétration fongique. D. D. Concentration élevée de C. graminicola inoculum sur les gaines foliaires provoquant de multiples appressories à proximité et une pénétration réduite des cellules hôtes. Barres d’échelle égales à 20 μm. Les micrographies ont été obtenues à l’aide d’une caméra numérique monochromatique couplée à un microscope à épifluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Temps d’observation microscopique (hpi) | Stade de développement de C. graminicola inoculé sur gaines foliaires de maïs |
| 12 | L’appressoria |
| 24 | Hyphes primaires |
| 36 | Hyphes secondaires |
| 48 | Hyphes secondaires |
| 60 | Acervuli |
| 72 | Acervuli |
| 108 | Acervuli |
Tableau 1 : Évolution temporelle de l’infection à Colletotrichum graminicola : Résumé de l’évolution temporelle des gaines foliaires de maïs inoculées avec la souche M1.001 de C. graminicola sur la base des étapes de développement fongique tout au long de la transition du mode de vie. Des observations microscopiques ont été effectuées toutes les 12 h.
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Discussion
La méthode optimisée d’inoculation de la gaine foliaire décrite ici est modifiée à partir d’un protocole original qui a été développé et appliqué aux gaines foliaires du riz 6,8,36. Il permet des observations directes et détaillées de la croissance et du développement fongiques dans les cellules végétales vivantes par microscopie à grand champ ou confocale. Le protocole est adapté à la caractérisation, à la comparaison et à la quantification d’une variété de phénomènes microscopiques au cours de la colonisation du maïs, y compris le développement fongique et les réponses de l’hôte lors d’interactions compatibles et incompatibles ; la production et la sécrétion de protéines fongiques spécifiques in planta ; et la cytologie et la biochimie des facteurs de pathogénicité courants ou nouveaux produits au cours de l’interaction maïs-champignon. Nous avons utilisé cette méthode avec des agents pathogènes hémibiotrophes et nécrotrophes du maïs. Nous n’avons pas tenté d’inoculer des agents pathogènes biotrophes (p. ex., des champignons de la rouille), mais les gaines, puisqu’elles restent vivantes, seraient également utiles pour cette application. Nous avons également appliqué cette méthode aux gaines de sorgho pour l’étude de la cytologie de la résistance spécifique à l’hôte et au cultivar 7,37. Pour les gaines de sorgho, le seul ajustement au protocole a été de remplir toute la gaine avec de la suspension de spores, plutôt que d’appliquer une seule goutte au centre. Cela était nécessaire en raison du diamètre plus petit des gaines de sorgho.
L’utilisation de ces tests de gaine a considérablement fait progresser nos études détaillées sur les mécanismes de colonisation de l’hôte et les molécules fongiques qui sont essentielles à la pathogénicité. Par exemple, l’application de la méthode a démontré la reconnaissance non hôte de C. sublineola par le maïs et de C. graminicola par le sorgho, y compris des réponses de résistance hypersensibles dans les deux cas7. Des gaines foliaires de maïs ont également été utilisées pour tester les interactions entre des souches fongiques à distance sur la même gaine. Dans ce cas, la co-inoculation d’une souche MT pathogène et d’une souche non pathogène cpr1 MT sur des gaines vivantes a démontré l’induction de la sensibilité des cellules de maïs par la souche WT et a fourni la preuve de l’existence d’un facteur diffusible impliqué dans la pathogénicité12. Les gaines ont permis de différencier les deux souches exprimant des protéines fluorescentes différentes, ainsi que de quantifier et de comparer statistiquement le processus de colonisation des souches inoculées seules ou ensemble.
Ce test de gaine foliaire de maïs présente plusieurs avantages par rapport aux inoculations de plantes entières pour l’imagerie de cellules vivantes. Tout d’abord, le protocole fournit une imagerie supérieure, sans qu’il soit nécessaire de l’éliminer ou de la fixer, des agents pathogènes interagissant avec des cellules hôtes vivantes en temps réel. Par exemple, des études utilisant des gaines foliaires de maïs ont permis de détecter un passage distinct de la biotrophie à la nécrotrophie chez C. graminicola hémibiotrophe et ont facilité les comparaisons fonctionnelles avec un mutant non pathogène 7,12,16,17. Bien que les gaines foliaires de riz excisées inoculées avec M. oryzae puissent présenter des symptômes qui ne correspondent pas à ceux observés chez les plants de riz entier36, le moment et l’apparence de la colonisation, de l’effondrement des tissus et du développement des lésions dans les gaines de maïs sont similaires à ceux des feuilles entières12,14. Un deuxième avantage de l’essai de gaine est qu’il montre une plus grande synchronicité entre les réplications et une reproductibilité expérimentale de la colonisation fongique12,18. Alors que l’inoculation de la plante entière peut entraîner des niveaux irréguliers de pénétration fongique18, les conditions plus contrôlées des inoculations de la gaine offrent une plus grande synchronicité et permettent une étude et une quantification plus précises des interactions. Cette synchronicité accrue a facilité l’utilisation des gaines dans les analyses de transcriptome32,33. De plus, le protocole de gaine a permis la vitesse nécessaire à la préparation des échantillons pour l’analyse du transcriptome : le rognage, le rinçage et le criblage de chaque gaine n’ont pas pris plus de 2 minutes avant qu’elles ne soient surgelées pour l’extraction de l’ARN32,33.
Les étapes critiques pour une imagerie réussie de l’infection sur des cellules vivantes sont les suivantes : 1) Les gaines doivent être utilisées immédiatement après la coupe pour les expériences. Les gaines inoculées excisées ne doivent pas être conservées plus de 6 jours : si la colonisation fongique est importante, elles se dégraderont plus rapidement12 ; 2) Veiller à choisir des gaines qui sont du même âge de développement pour assurer des résultats plus reproductibles ; 3) Utiliser une suspension de spores fraîches provenant de cultures qui ont atteint une sporulation maximale ; 4) Utilisez des lames de rasoir tranchantes pour une coupe plus efficace afin de produire des échantillons optiquement clairs ; 5) Minimisez les manipulations excessives et inutiles des échantillons, car ce processus peut avoir un impact négatif sur les structures en direct et la qualité de l’image ; 6) Vérifiez quotidiennement les chambres d’humidité pour vous assurer que le papier filtre est suffisamment humide ; et 7) Lors de l’imagerie d’échantillons sur un microscope confocal, gardez les paramètres d’acquisition fixes pendant l’expérience pour éviter d’introduire des changements d’intensité ou des biais lors de la comparaison des signaux fluorescents entre les échantillons. Les protéines fluorescentes peuvent photoblanchir si l’intensité et la durée du laser sont trop élevées, et elles peuvent donner des signaux plus faibles si des sections de tissu sont conservées sous une lamelle scellée pendant une longue période. Des expériences préliminaires, y compris tous les contrôles appropriés, doivent être effectuées pour normaliser et optimiser les conditions, les matériaux et les délais afin d’obtenir les résultats les plus reproductibles.
Dépannage
Le rognage à la main est insuffisant pour produire des gaines optiquement transparentes
Il est possible que la lame de rasoir soit devenue émoussée. Si c’est le cas, jetez-le correctement et passez à une nouvelle lame de rasoir à un seul tranchant. Utilisez une pression modérée et maintenez la lame à un angle de 90° par rapport à la gaine. Grattez l’échantillon doucement, mais régulièrement, jusqu’à l’observation d’une section plane et translucide. Il est conseillé de vérifier les gaines sous un microscope composé avant de passer au microscope confocal à balayage laser.
La gaine de maïs inoculée est extrêmement fragile
Cela se produit lorsque le champignon a colonisé la majeure partie du tissu végétal. Par conséquent, le tissu se dégrade et s’effondre. Lors de la préparation d’échantillons qui sont déjà au stade nécrotrophe, appuyez doucement la section contre une lame de microscope, appliquez une goutte d’eau stérile et grattez l’échantillon une à deux fois avec une lamelle propre.
Faible germination et pénétration des spores in vivo
Cela peut être dû à un nombre élevé de spores inhibant la germination ou la pénétration. Assurez-vous que la concentration d’inoculum est ajustée à 5 x 105 spores/mL. Si le problème persiste, ajustez la concentration à 5 x 104 spores/mL. En guise de contrôle pour l’expérience in vivo , placez 50 μL de la même suspension de spores sur une plaque PDA fraîche et étalez-la uniformément. Vérifiez quotidiennement la viabilité et la germination des spores.
Stades de développement fongique asynchrones à travers les gaines
Assurez-vous que les plants de maïs sont au même stade de croissance et que les sections de gaine ont été obtenues à partir du même nœud. De plus, assurez-vous que les spores sont viables et que les cultures fongiques sont au stade optimal (p. ex., pas plus de 2 semaines pour les cultures de C. graminicola) pour la préparation de l’inoculum.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents et qu’ils n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient l’USDA-NIFA pour son soutien financier (numéros de subvention 2018-67013-28489 et 2020-70410-32901). Les opinions, constatations, conclusions ou recommandations exprimées dans ce manuscrit sont uniquement celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue du ministère de l’Agriculture des États-Unis. Nous remercions Mayara de Silva, étudiante invitée de Science Sans Frontières au Brésil, pour les images qui apparaissent dans les figures 6A et 7D. Nous remercions également le département de pathologie végétale de l’Université du Kentucky pour avoir fourni l’accès aux microscopes confocaux Olympus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
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