Summary
Dette manuskriptet beskriver en optimalisert inokulasjonsprotokoll som bruker frittliggende maisbladskjeder for reproduserbare cytologiske, fysiologiske og molekylære studier av maisinteraksjoner med soppplantepatogener. Bladkappene letter sanntidsobservasjon av cellulære interaksjoner mellom levende plante og sopp i ufikserte vev.
Abstract
Vi har optimalisert en protokoll for å inokulere maisbladskjede med hemibiotrofiske og nekrotrofe bladpatogene sopp. Metoden er modifisert fra en som opprinnelig ble brukt på risbladskjeder og tillater direkte mikroskopisk observasjon av soppvekst og utvikling i levende planteceller. Bladskjede samlet fra maisplanter med to fullt oppståtte bladkrager inokuleres med 20 μL dråper på 5 x 105 sporer/ml soppsporesuspensjoner og inkuberes i fuktighetskamre ved 23 °C under kontinuerlig fluorescerende lys. Etter 24-72 timer fjernes overflødig vev med et barberblad for å etterlate et enkelt lag epidermale celler, en optisk klar prøve som kan avbildes direkte uten at det er nødvendig med kjemisk fiksering eller rydding. Plante- og soppceller forblir i live i løpet av forsøket, og interaksjoner kan visualiseres i sanntid. Skjeder kan farges eller underkastes plasmolyse for å studere utviklingscytologi og levedyktighet av verts- og patogenceller under infeksjon og kolonisering. Svampestammer transformert til å uttrykke fluorescerende proteiner kan inokuleres eller co-inokuleres på kappene for økt oppløsning og for å lette evalueringen av konkurrerende eller synergistiske interaksjoner. Svampestammer som uttrykker fluorescerende fusjonsproteiner kan brukes til å spore og kvantifisere produksjonen og målrettingen av disse individuelle proteinene i planta. Inokulert skjede vev kan ekstraheres for å karakterisere nukleinsyrer, proteiner eller metabolitter. Bruken av disse kappeanalysene har i stor grad avansert de detaljerte studiene av mekanismene for sopppatogenitet i mais og også av soppproteineffektorer og sekundære metabolitter som bidrar til patogenitet.
Introduction
Romlige og tidsmessige analyser på cellenivå er avgjørende for å forstå fysiologien og cytologien til sopp-plante-interaksjoner. Bladvev som har blitt kjemisk fiksert 1,2,3 eller ryddet og farget4, samt kunstige membraner5, har tidligere blitt brukt til å undersøke cytologien av bladpatogenutvikling og plante-soppinteraksjoner. Imidlertid er undersøkelse av infeksjonshendelser i levende vertsvev i sanntid uten fiksering eller clearing utfordrende på grunn av tekniske problemer knyttet til fremstilling av optisk gjennomsiktige prøver for avbildning.
En frittliggende bladkappeinokulasjonsprotokoll ble utviklet på slutten av 1940-tallet for lysfeltmikroskopisk undersøkelse av resistens fra levende risepidermale celler mot risblastsvampen Magnaporthe oryza6. Mer nylig har detaljerte molekylære, fysiologiske og cytologiske observasjoner av vertskolonisering av Colletotrichum og Magnaporthe-artene blitt sterkt tilrettelagt ved å kombinere modifiserte versjoner av denne bladkappemetoden med sopptransformanter som uttrykker fluorescerende proteiner, og høyytelses levende celleavbildningsprotokoller, inkludert epifluorescens og konfokal mikroskopi 7,8,9,10,11,12,13.
Dette papiret beskriver en optimalisert inokulasjonsprotokoll ved bruk av frittliggende maisbladskjeder for observasjon av infeksjonsprosesser av hemibiotrofiske og nekrotrofiske bladsvamppatogener. Vi har spesielt brukt den til å studere Colletotrichum graminicola (C. graminicola), årsaksmidlet til antracnosebladblight og stengelråte, og Stenocarpella maydis, som forårsaker Diplodia bladblight og stengelråte. Metoden bør imidlertid kunne anvendes på andre hemibiotrofiske og nekrotrofe bladsvamppatogener. Cytologiske og fysiologiske responser under infeksjons- og koloniseringshendelser i disse utskårne bladkappene ligner de i hele bladbladene12,14,15. Videre er hemibiotrofisk kolonisering av skjede epidermale celler av C. graminicola lik kolonisering av stengelceller16,17. Frittliggende skjeder viser større synkronitet og eksperimentell reproduserbarhet av sopppenetrasjon og kolonisering enn bladblad eller stengelvev14,16,17,18. De fleste maisvarianter kan brukes til denne protokollen. Imidlertid er innavlede eller hybrider med overdreven lilla pigmenter i mantlene mindre egnet siden pigmentene forstyrrer avbildning. Golden Jubilee søt mais har vært spesielt nyttig for våre studier fordi ubehandlede frø er kommersielt tilgjengelige, plantene er svært utsatt for mange bladsykdommer, og de vokser godt i drivhuset. De første epidemiene av antracnose stengelråte i USA resulterte i totalt tap av søte maisavlinger i Indiana på1970-tallet 19,20. Denne bladkappeinokulasjonsmetoden kan brukes til direkte å observere og kvantifisere soppvekst og utvikling i levende vs. lokalt drepte planteceller, for å demonstrere resistensreaksjoner i kompatible / inkompatible responser på soppinfeksjon, og for å teste interaksjoner mellom soppstammer på samme skjede i sanntid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Arbeidsflyten for metoden er vist i figur 1.
Figur 1: Trinn i den optimaliserte inokulasjonsprotokollen ved bruk av frittliggende maisbladskjeder. Spore suspensjon forberedelse, bladkappe inokulasjon, og prøvepreparering for levende celle mikroskopi er uthevet i grønne (A), lilla (B), og oransje (C) bokser, henholdsvis. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Plante- og soppmateriale
- Plantevekst
- Dyrk maisplanter (se Materialtabell) i drivhuset (14 t lys/27 °C og 10 t mørkt/22 °C) i SC10-beholdere (se Materialtabell). Bruk et vekstmedium bestående av tre deler kommersiell pottejord (se materialfortegnelse) og to deler dampsterilisert matjord.
- Vannplanter i 2 min med et overhead vanningsanlegg en gang hver dag, om morgenen.
- Høst frøplanter på V2-trinnet ved å kutte dem på jordnivå. V2-vekststadiet nås når plantene er 5 til 10 cm høye og har to synlige krageblader21.
- Pakk plantene med et fuktig papirhåndkle og legg dem i en plastpose for transport til laboratoriet for videre behandling.
- Soppkulturer
- Reaktiver lagrede soppsivningskulturer av silika under aseptiske forhold22ved å strø ca. 50 granulater av den infiserte silika på et egnet agarmedium. For å unngå morfologiske endringer og tap av patogenitet, stammer subkultur ikke mer enn 3x etter reaktivering. Potetdruesukkeragar (PDA; se materialfortegnelse) brukes rutinemessig til dyrking av C. graminicola mens havregrynagar (OA; se materialfortegnelse) brukes til S. maydis.
- For å forberede PDA for dyrking av soppbestander, suspender 19,5 g kommersielt tilberedt dehydrert PDA i 500 ml deionisert (DI) vann. For å lage OA, kok 36 g kommersielt tilberedt dehydrert OA i DI-vann i 15-30 minutter, filtrer gjennom tre lag osteklær og bring filtratet til 500 ml med DI-vann. Autoklavmedier som skal steriliseres.
- Forsterk det smeltede, avkjølte mediet med et passende antibiotikum (f.eks. hygromycin B, geneticin) når du arbeider med transformantstammer. De endelige konsentrasjonene av hygromycin eller geneticin i 500 ml medier er henholdsvis 250 μg/ml og 100 μg/ml.
- Inkuber kulturer under optimale forhold til et sporulerende mycelium har utviklet seg. Colletotrichum graminicola og S. maydis vokser godt ved 23 °C med kontinuerlig fluorescerende lys og luftfuktighet. Sporulering skjer innen 7 dager etter inokulering (dai) for S. maydis eller 14 dai for C. graminicola.
2. Vaksinasjoner av bladskjede
- Montering av filterenhet i glassull
- Bruk kraftig saks eller saks til å klippe av hetten og ca. 0,5 mm fra den koniske bunnen av et 1,5 ml mikrosentrifugerør (se materialfortegnelsen).
- Plasser et stykke glassull (ca. 0,5 cm x 0,5 cm; se materialfortegnelse) inne i kuttrøret for å dekke senterhullet, som vist i figur 2.
- Bruk hansker mens du kutter glassull, da borosilikatglass kan forårsake irritasjon.
- Klargjøring av støttestativer for løvkappe
- Klipp en ikke-skjørt 96-brønns PCR-plate (se materialfortegnelsen) i seks støttestativer med to kolonner (8 x 2 brønner) som vist i figur 3A.
- Vend stativene med to kolonner slik at de koniske bunnene på brønnene vender opp og de flate toppene med forsiden ned (figur 3B).
- Legg hver støtte i en petrisklate av glass som inneholder fuktet filterpapir og dekk det med lokket (se Materialfortegnelse). Denne enheten fungerer som et lite fuktighetskammer for mantene.
- Inokulum forberedelse
- For hver soppstamme, plasser en montert glassullfilterenhet i et intakt sterilt mikrosentrifugerør på 1,5 ml som vist i figur 2. Sistnevnte fungerer som et oppsamlingsrør.
- Merk rørene.
- Høst konidier fra sporulerende kulturer ved først å oversvømme hver plate med 3-4 ml sterilt DI-vann. Mer vann kan i noen tilfeller være nødvendig for å produsere et lag av væske på kolonioverflaten. Fuktemidler er ikke nødvendig i dette systemet.
- Løsne sporene fra agaren ved å bruke en steril kjeglespiss (se materialfortegnelse) for å skrape jevnt over hele platen.
- Påfør 1 ml sporeopphenget på en filterenhet av glassull aseptisk, og la sporene strømme gjennom oppsamlingsrøret ved hjelp av tyngdekraften.
- Sentrifuger oppsamlingsrørene som inneholder de filtrerte sporesuspensjonene ved 3 500 x g i 5 minutter. Sporene skal pelleteres i bunnen av mikrosentrifugerøret.
MERK: Sentrifugering av C. graminicola sporer ved høyere hastigheter enn anbefalt her resulterer i et betydelig tap av levedyktighet. - Hell av væsken i en autoklaverbar beholder, tilsett 1 ml sterilt DI-vann og berør forsiktig for å resuspendere de pelleterte sporene. Sentrifuge som i trinn 2.3.6.
- Vask sporer 3x for å fjerne eventuell conidial matrise som kan inneholde autohemmere som kan redusere spiring eller penetrasjon.
- Etter den tredje vasken, tilsett 300-500 μL sterilt DI-vann for å resuspendere sporer for kvantifisering.
- Bruk et hemocytometer under et sammensatt mikroskop ved 100x forstørrelse for å bestemme sporekonsentrasjonen. Sporfarging er ikke nødvendig før telling.
- Klargjør en 5 x 105 sporer/ml suspensjon med sterilt DI-vann.
MERK: C. graminicola sporesuspensjon kan ikke oppbevares ved romtemperatur lenger enn 4 timer før rask tap av levedyktighet. Kjøling av konidier øker ikke levedyktigheten.
- Skjede inokulasjoner
- Sjekk relevante biosikkerhetsrutiner og prosedyrer før inokulering av planter med soppstammer.
- Fjern skjeden fra det første sanne bladet av V2-frøplanter ved å kjøre et miniatyrbilde langs den overlappende kanten av skjeden, og løsne den forsiktig fra skuddet. Løsne sliren fra begge sider av skuddet før du prøver å fjerne den.
- Klipp de gjenvunnede bladkappene i 3-5 cm segmenter. Det er ikke nødvendig å overflatedesinfisere mantlene før inokulering.
- Rull ut hvert segment veldig forsiktig for å eksponere det indre (adaksiale) epidermale laget.
- Mens du forbereder skjede for inokulering, må du holde de resterende utskårne kappene innpakket med et fuktig papirhåndkle for å unngå uttørking.
- Plasser 20 μL av soppsporeopphenget på den indre overflaten i midten av kappestykket, rett over midtribben, som vist i figur 4.
- Plasser de inokulerte bladkappene horisontalt, med midribben plassert nederst, i støtten inne i en petrisklate i glass som inneholder et fuktet filterpapir som vist i figur 5.
- Hvert stativ rommer opptil syv mantler. Inokuler minst fem skjeder per stamme for å kompensere for tap av replikater som kan oppstå under prøvepreparering eller inkubasjon.
- Plasser de små fuktighetskamrene i en klar oppbevaringsboks foret med fuktet spirepapir (se materialfortegnelse).
- Dekk esken med lokket. Inkuber boksen ved 23 °C med kontinuerlig belysning for det tiltenkte tidsforløpet, som avhenger av soppen og sopputviklingsstadiene som vil bli observert. En oppsummering av tidsforløpet for maiskjede inokulert med C. graminicola er gitt i tabell 1.
- Sjekk hver dag for tegn/symptomer på sykdom på skjede og hold både spiring og filterpapir fuktig. Bladskjede kan oppbevares i opptil 6 dager uten åpenbar plantecelledød eller nedbrytning i fravær av inokulering.
Figur 2: Fremstilling av filterenhet av glassull. (A) En 0,5 cm x 0,5 cm glassullkule plasseres inne i mikrosentrifugerør 1 som har fjernet den koniske bunnen. (B-C) Filterrøret plasseres deretter i mikrosentrifugerør 2 for å generere en montert filterenhet for sporeopphengsforberedelse. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Metode for kutting av en ikke-skjørt 96-brønns PCR-plate. (A) PCR-plate kuttet i seks støttestativer, 8 x 2 brønner. Et eksempel på en enkelt kappestøtte er avbildet i (B). Bladskjede legges horisontalt på støtten. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Slireinokulasjonsmetode. Enkelt dråpe inokulum direkte påført den adaksiale overflaten av kappeseksjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Inkubasjonsmetode for kappe. Inokulerte bladskjeder plassert horisontalt i et støttestativ inne i en petrisklate i glass som inneholder fuktet filterpapir. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Levende celle mikroskopi
- Prøvepreparering for mikroskopi
- Skyll kappebitene forsiktig med sterilt DI-vann for å fjerne eventuelle ufestede sporer eller overfladisk soppvekst.
- Plasser hylsen på et lysbilde med rent glassmikroskop (se Materialfortegnelse) med den adaksiale (innsiden) overflaten av kappestykket vendt ned og den abaxiale (utvendige) overflaten øverst.
- Bruk et nytt barberblad med én kant (se Materialfortegnelse) til å trimme ca. 1 cm av slireendene og fjerne det meste av laminavevet på hver side av midtribben.
- Hold barberbladet i en vinkel på 90° i forhold til skjeden for å barbere vev fra den abaksiale midribben og eksponere det epidermale laget på den adaksiale overflaten over det inokulerte stedet. Prøv å opprettholde en jevn tykkelse. Når bladkappene er barbert, anbefales ikke ytterligere trimming, da dette kan skade prøven.
- Forsikre deg om at de barberte seksjonene ikke er mer enn 1 cm x 1 cm i størrelse. Unngå å trykke på midten av skjeden under denne prosessen. Når du arbeider med skjeder inokulert med forskjellige sporeoppheng, desinfiser hansker og bytt barberbladet mellom prøvene.
- Hold et rent glassmikroskopglass klart. Løft kappeseksjonen fra den ene kanten og overfør den forsiktig til et nytt lysbilde. Den inokulerte (adaksiale) overflaten av kappen skal være øverst, nærmest objektivlinsen. Monter seksjoner forsiktig for å unngå skade på soppstrukturer.
- Påfør 60 μL sterilt DI-vann på seksjonen og tilsett et 24 mm x 60 mm glassdeksel (se materialfortegnelse). Gjør dette sakte for å unngå luftbobler.
- Når du er klar for mikroskopi, forsegl dekselet med klar neglelakk (se materialfortegnelse) ved å plassere en liten dråpe på hver kant og deretter koble dråpene sammen med en neglelakkbørste for å lage en sømløs forsegling.
MERK: Denne kappeprotokollen kan brukes med cytologiske flekker, for eksempel 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), nøytral rød eller trypanblå, eller for observasjon av celleplasmolyse for å evaluere plantecellenes levedyktighet. For kappefarging eller celleplasmolyseanalyser, må du ikke forsegle dekselet. - For plasmolyseanalyser, tilsett en hypertonisk løsning (0,75 M sukrose eller 1 M natriumklorid) til den ene kanten av dekselet og bruk et brettet lofritt silkepapir for å trekke løsningen over prøven til den andre kanten av dekselet. For farging, bruk en lignende metode for å påføre flekkløsningen.
- Widefield mikroskopi
- Når bladkappene er montert på mikroskoplysbilder, inspiser dem for soppkolonisering ved hjelp av et bredfeltslysmikroskop ved 400x forstørrelse.
- For å observere soppstrukturer i detalj, bruk et vannnedsenkningsmål i stedet for olje for bedre bildekvalitet på prøvene. Sfærisk aberrasjon på grunn av manglende samsvar mellom brytningsindekser kan forårsake bildeforringelse. Vannmål er tilgjengelige for widefield lysmikroskoper samt konfokale mikroskoper.
- For å bestemme den relative mengden kolonisering per skjede, telle antall maisceller invadert fra hvert sopppenetrasjonssted ved hjelp av et bredfeltsmikroskop ved 100x forstørrelse. Denne kvantifiseringen er et passende screeningtrinn før statistiske analyser som sammenligner stammer, behandlinger og / eller utviklingsstadier.
- Konfokal laserskanningsmikroskopi
- For å observere fluorescerende proteiner i maisvev under utvikling av transgene soppstammer, juster de grunnleggende bildeinnsamlingsparametrene. Identifiser de beste eksitasjons-/utslippsinnstillingene basert på den valgte fluorescerende markøren.
MERK: Et 60x vannmål er å foretrekke ved analyse av fluorescerende fusjoner konstruert med utskilte proteiner. Moderne konfokale mikroskoper har høyt korrigerte vannnedsenkingsmål for å unngå gjenstander og formavvik. - Hvis levende celleavbildning av fluorescerende proteiner er ment, bruk utransformerte soppstammer som kontroller for autofluorescens. Bruk følgende bildeinnsamlingsparametere for å fange sopp-vertsdynamikk på et invertert konfokalmikroskop og for mCherry fluorescerende protein. Still lasereffekten opp til 5%, 450-600 høyspenning (HV) avhengig av uttrykksnivået, 1.375 X forsterkning, 3% forskyvning, en optisk zoomfaktor på 1 for analyse av opptil fem maisceller per seksjon og optisk zoomfaktor på 2-5 for individuelle hyfer.
MERK: Høyoppløselige Z-stack konfokale bilder gir tredimensjonale data og en bedre visning av sanntidsinteraksjoner mellom verten og patogenet. - For kvantifisering av fluorescensintensiteter som tilsvarer utskillede fusjonsproteiner, bruk bildeanalyseprogramvare fra konfokalprodusenten eller et bildebehandlingsprogram som ImageJ, som fritt kan lastes ned online. Rådfør deg med en håndbok for detaljer om hvordan du kvantifiserer fluorescerende signaler tilsvarende.
- For å observere fluorescerende proteiner i maisvev under utvikling av transgene soppstammer, juster de grunnleggende bildeinnsamlingsparametrene. Identifiser de beste eksitasjons-/utslippsinnstillingene basert på den valgte fluorescerende markøren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksemplene nedenfor beskriver representative utfall etter bruk av maisbladkappeinokulasjonsmetoden. Disse eksemplene demonstrerer enkelheten, hastigheten og presisjonen som observasjon og sammenligning av mais-sopp-interaksjoner kan oppnås i sanntid med denne optimaliserte analysen. Levende celleavbildning tillater også utvinning av kvantitativ informasjon, noe som gir et nyttig verktøy for komparative molekylære, cytologiske og fysiologiske studier. Ytterligere detaljer kan bli funnet i de originale publikasjonene som er sitert for hver vellykket søknad.
Eksempeldata 1: Bruk av farging og plasmolyse i inokulerte bladskjeder for evaluering av soppstatus og påvisning av planterespons på soppinfeksjon
Maisbladskjede har blitt brukt til å visualisere og sammenligne infeksjonsprosessene til Colletotrichum graminicola og Stenocarpella maydis i levende vertsceller med lysfeltmikroskopi, noe som gir detaljerte beskrivelser av koloniseringsmønstre og tidsforløp (upubliserte resultater; Figur 6).
Disse studiene viste at S. maydis raskt invaderer epidermale celler direkte via udifferensierte hyphal hevelser, i motsetning til C. graminicola som produserer melanisert appressoria. Når de er inne i epidermale celler, fortsetter begge patogenene fra celle til celle ved å passere gjennom tilsynelatende intakte cellevegger (figur 6A, B).
Skjede kan farges med trypanblå eller DAPI for å evaluere arten og omfanget av koloniserende sopphyfer lettere (figur 6). Trypanblå farging avslører at C. graminicola i utgangspunktet invaderer via tykke primære hyfer som beveger seg mellom celler gjennom svært smale forbindelser. Senere bytter soppen til et nekrotrofisk stadium, og produserer tynnere sekundære hyfer i sentrum av kolonien (figur 6 C-E) 12,14,16,17.
Figur 6: Ufargede eller fargede inokulerte maisbladskjeder avbildet med lysfelt eller epifluorescensmikroskopi. (A) Intracellulære hyfer 48 timer etter inokulasjon (hpi ) med Stenocarpella maydis. Smitte skjer via lett hovne bindespisser (pil). (B) Intracellulære hyfer 48 hpi med Colletotrichum graminicola. Infeksjon skjer via melanisert appressoria (piler). (C) Hyfer av C. graminicola, farget med trypanblått, utvikler celle-til-celle ved den fremrykkende kolonikanten via smale forbindelser (pil), 72 hpi. (D) Nærmere visning av trypanblåfarget hypha av C. graminicola ved 72 hpi, som passerer gjennom maiscelleveggen via en smal forbindelse (pil). (E) Hyfer av C. graminicola, farget med trypanblått, i kolonisenteret 72 hpi. Smalere sekundære hyfer kan sees som kommer fra de tykkere primære hyfene (pilene). (F) Hyfer av C. graminicola 72 hpi, ved den fremrykkende kolonikanten på en bladkappe farget med DAPI. De fargede sopp- og plantekjernene fluorescerer under UV-lys. Skalastenger i hvert panel tilsvarer 50 μm. Mikrografer oppnådd ved hjelp av et monokromatisk digitalkamera kombinert med et epifluorescensmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Slirer kan farges med nøytral rødfarge og/eller plasmolyse for å studere maiscellenes utviklingscytologi og levedyktighet under infeksjon og kolonisering av patogene sopp (figur 7).
Colletotrichum graminicola er en hemibiotrofisk sopp som invaderer levende maisceller med tykke primære hyfer som er skilt fra vertscytoplasmaet med en membran (figur 7A-C)12,14,16,17. Stenocarpella maydis, derimot, er en nekrotrofisk sopp som produserer et fytotoksin23 og dreper epidermale celler (som blir granulerte og ikke klarer å plasmolysere) før den invaderer dem (figur 7D).
Maisforsvar mot C. graminicola og andre bladpatogener innebærer akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS), spesielt hydrogenperoksid (H2O2)12,15. For å undersøke oksidativ kjemi av plantepatogeninteraksjoner, kan 3,3'-diaminobenzidin (DAB) brukes til cellefarging24. DAB oksideres av H 2 O2og gir et mørkebrunt bunnfall som er synlig i maisbladkappene (figur 7 E,F) 12,24. Produksjon av pigmentet er en indikator på en oksidativ burst relatert til en vertsmotstandsrespons.
Figur 7: Farget og/eller plasmolysert inokulert maisbladskjede avbildet med lysfeltmikroskopi. (A) Bladkappe inokulert med C. graminicola 24 hpi og utsatt for plasmolyse og farging med nøytral rød. Levende maisceller under appressoria (piler) plasmolyserer og flekker, noe som viser at patogenet ikke dreper cellene før invasjon. (B) Bladkappe 48 hpi med C. graminicola, utsatt for plasmolyse og farging med nøytral rød. Maisceller som er kolonisert av primære hyfer (pil) er fortsatt i live, og fastslår at C. graminicola invaderer celler som en biotrof. (C) Bladkappe 48 hpi med C. graminicola, som viser hyfer som beveger seg celle til celle ved den fremrykkende kanten av kolonien. Skjeder har blitt plasmolyzed, men ikke farget. Ukoloniserte celler som ligger ved siden av kolonikanten (piler) fortsetter å plasmolyse. (D) Bladkappe 24 hpi med S. maydis, før penetrasjon. Cellene under den spirede sporen (pilen) virker granulerte og klarer ikke å plasmolyze, noe som indikerer at S. maydis dreper dem før penetrasjon og at den oppfører seg som en nekrotrof. (E) Bladkappe av resistent mais innavlet Mp305 24 hpi med C. graminicola og farget med DAB. Mørk farging indikerer en sterk oksidativ respons av enkeltcellen i midten av bildet, mens haloer av brunt pigment kan ses rundt det meste av den enkelte appressoria, og granulering kan observeres i cellene øverst på bildet. (F) En nærmere visning av haloer av brunt pigment akkumulert rundt appressoria, og avsetning av pigment i maiscelleveggene i nærheten (piler). Skalastenger i hvert panel er lik 50 μm, bortsett fra (F) som er 20 μm. Mikrografer oppnådd ved hjelp av et monokromatisk digitalkamera kombinert med et epifluorescensmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Eksempeldata 2: Levende celleavbildning med sopp som uttrykker fluorescerende proteiner
Sopphyfer som uttrykker cytoplasmatiske fluorescerende proteiner kan visualiseres med høy oppløsning i levende kappeceller uten behov for flekker ved hjelp av epifluorescens eller konfokalmikroskop (figur 8).
Fluorescerende proteiner kan målrettes mot forskjellige sopporganeller, for eksempel mitokondriene, kjernene eller endomembransystemet, for å spore deres plasseringer og aktiviteter i levende soppceller i planta (figur 8C) 25,26,27,28 (upubliserte resultater). Fluorescerende proteiner kan også drives av forskjellige sopppromotorer for å tjene som reportere for ulike funksjoner: for eksempel er RFP drevet av BiP-chaperone-sekresjonsstressresponsproteinet vist (figur 8D) 29 (upubliserte resultater). Bruken av bladskjede muliggjør visualisering av individuelt merkede fluorescerende fusjonsproteiner som akkumuleres og utskilles av sopphyfer når de koloniserer vertsceller 8,9 (figur 8E). Transgene maislinjer som uttrykker fluorescerende proteiner rettet mot forskjellige cellulære rom, for eksempel kjerner eller plasmamembraner, er også tilgjengelige30,31, og kan brukes til inokulasjoner for å evaluere effekten av infeksjon på maiscellulære strukturer, for eksempel kjerner. Bruk av disse transgene maislinjene viste at kjerner i ikke-invaderte maisceller vanligvis migrerer til celleveggen som er nærmest celler som allerede er kolonisert av C. graminicola (upubliserte resultater; Figur 8F).
Figur 8: Epifluorescens (A, B) eller konfokal (C, D, E, F) avbildning av Colletotrichum graminicola som uttrykker fluorescerende proteiner. (A) Ufarget, plasmolysert bladkappe 48 hpi med en C. graminicola stamme som uttrykker mRFP cytoplasmatisk under kontroll av ToxA promotoren34. Signifikant autofluorescens er også lagt merke til i disse bladskjeder. (B) Ufarget bladkappe 48 hpi med en C. graminicola stamme som uttrykker SGFP cytoplasmatisk under kontroll av ToxA-promotoren. (C)Colletotrichum graminicola som uttrykker SGFP rettet mot endomembransystemet med et HDEL-anker35. (D) Ufarget bladkappe 24 hpi med C. graminicola transformert med mRFP under kontroll av promotoren for C. graminicola homologen til BiP-chaperone. Den røde fluorescensen i den primære hyfaen er en indikator på BiP-aktivering som respons på sekresjonsstress. (E) Akkumulering av arabinofuranosidase::mKirsebærfusjonsprotein i C. graminicola WT primær hypha som krysser maisbladkappens cellevegg ved 44 hpi. (F) Bladkappe av en transgen maislinje som uttrykker YFP målrettet mot plantekjernene30,31, 48 hpi med en stamme av C. graminicola som uttrykker mRFP cytoplasmatisk under kontroll av ToxA-promotoren. Skalastenger i hvert panel er lik 20 μm, bortsett fra panel A hvor det er lik 50 μm. Mikrografer ble oppnådd ved hjelp av et monokromatisk digitalkamera kombinert med et epifluorescensmikroskop. Bildene i (C-F) ble tatt med et laserskanning konfokalmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Eksempeldata 3: Bruk av maisbladskjede for å undersøke detaljert cytologi av kompatible/inkompatible responser og interaksjoner mellom soppstammer
En ikke-patogen C. graminicola mutert stamme (cpr1 MT) ble sammenlignet med villtype (WT) stammen i maisbladskjede (figur 9A,B)12.
Levende celleavbildning av stammene merket med cytoplasmatiske fluorescerende proteiner viste at mutanten var spesifikt svekket i bevegelse fra celle til celle i maisbladskjedene. Kappeprotokollen muliggjorde presis kvantifisering som viste at cpr1 MT var begrenset til den første koloniserte cellen 95 % av tiden (figur 9C)12. Dette var i sterk kontrast til WT, hvor mindre enn 5% av infeksjonene forble innenfor den første koloniserte cellen i samme tidsramme12. Interessant nok var cpr1 MT i stand til å vokse saprofytisk utover den første opprinnelig infiserte cellen i lokalt frysedrepte skjeder, som WT-stammen (figur 9D). Dette indikerte at manglende evne til cpr1 MT til å kolonisere var spesifikt relatert til en aktiv respons fra den levende maiscellen.
Bladkappeinokulasjonsanalysen ble brukt til å teste interaksjoner mellom GFP-uttrykkende cpr1 MT og RFP-uttrykkende WT-stammer ved å co-inokulere dem på samme bladkappe12. Når stammene ble inokulert tett sammen (ikke mer enn 8 maisceller fra hverandre), var cpr1 MT i stand til å vokse normalt som en biotrof fra celle til celle (figur 9E, F). Plasmolyseanalyser bekreftet at cpr1 MT-sopp kom inn i levende celler12. Alle disse detaljerte observasjonene ble gjort mulig av kappeanalysene og antydet eksistensen av en diffusibel faktor som induserer kompatibilitet produsert av WT-stammen av C. graminicola , men mangler i cpr1 MT12.
Figur 9: Kompatible og inkompatible interaksjoner som involverer WT og cpr1 MT-stammer av Colletotrichum graminicola. Bruk av forskjellige fluorescerende proteiner gjorde det mulig å skille mellom de to stammene når de ble co-inokulert på maisbladskjede12. (A) WT C. graminicola-stammen som uttrykker cytoplasmatisk mRFP i maisbladskjede ved 48 hpi. (B) C. graminicola cpr1 MT-stammen som uttrykker SGFP i maisbladskjede ved 72 hpi. CPR1 MT koloniserer bare sjelden (<5% av tiden) utover den første infiserte cellen, selv opptil 6 dager etter inokulering. (C) En nærmere visning av C. graminicola cpr1 MT-stammen som uttrykker SGFP ved 72 dpi. I dette tilfellet klarte det å krysse celleveggen inn i neste celle, men da sluttet den å utvikle seg. (D) C. graminicola cpr1 MT-stammen som uttrykker SGFP, 48 hpi i drepte kappevev. Cpr1 MT-stammen koloniserer ikke-levende maiskjede raskt, lik WT. (E) Når WT-mRFP C. graminicola og cpr1 MT-GFP C. graminicola stammer er co-inokulert tett sammen på maisbladskjede (48 hpi), gjenvinner cpr1 MT-GFP-stammen evnen til å utvikle seg gjennom levende maiskjede celler normalt, som en biotrof. Biotrofisk vekst inne i de levende cellene ble bekreftet ved plasmolyseanalyser. (F) En nærmere visning av C. graminicola cpr1 MT-stammen som uttrykker SGFP, vokser fra celle til celle når den inokuleres ved siden av WT (ikke mer enn 8 maisceller fra hverandre). Skalastenger er lik 50 μm (A, B og E) eller 20 μm (C, D og F). Mikrografer ble oppnådd ved hjelp av et monokromatisk digitalkamera kombinert med et epifluorescensmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Inokulerte skjeder har også blitt brukt til å produsere vev for RNA-ekstraksjon for transkripsjonsaktivitetsanalyse32,33. Kappene var ideelle for dette formålet siden de kunne inspiseres før ekstraksjon for å overvåke infeksjonsprosessen, og dermed sikre prøveensartethet på tvers av flere replikasjoner. Disse studiene tillot identifisering av bølger av differensielt uttrykte gener mellom Colletotrichum livsstilsovergangsstadier32,33.
Eksempeldata 4: Resultater av suboptimale eksperimenter
Utilfredsstillende levende celleavbildning kan skyldes utilstrekkelig trimming av bladkapper, noe som fører til overlappende epidermale cellelag og optisk ugjennomsiktige prøver (figur 10).
Figur 10: Suboptimalt eksperimentelt resultat på grunn av utilstrekkelig trimming av bladskjeder.( A) Eksempel på flere epidermale cellelag som forstyrrer undersøkelsen av sopputvikling in vivo. (B) Eksempel på overlappende cellelag som påvirker levende celleavbildning. Skalastenger lik 20 μm. Mikrografer ble oppnådd ved hjelp av et monokromatisk digitalkamera kombinert med et epifluorescensmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Et annet potensielt suboptimalt eksperimentresultat er en ujustert inokulumkonsentrasjon som kan resultere i lavt (figur 11A) eller høyt antall sporer: sistnevnte kan resultere i redusert spiring eller appressorial penetrasjon (figur 11B). Sistnevnte kan også hemme kvantifiseringen av maisceller kolonisert på hvert sopppenetrasjonssted.
Figur 11: Suboptimalt eksperimentresultat på grunn av feil justert inokulumkonsentrasjon. A. Lav C. graminicola spore suspensjonskonsentrasjon inokulert på skjeder, noe som resulterer i lavt antall sopppenetrasjonssteder. B. Høy C. graminicola inokulumkonsentrasjon på bladskjede forårsaker multiple appressoria i umiddelbar nærhet, og redusert vertscellepenetrasjon. Skalastenger lik 20 μm. Mikrografer ble oppnådd ved hjelp av et monokromatisk digitalkamera kombinert med et epifluorescensmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tidspunkt for mikroskopisk observasjon (hpi) | Utviklingsstadium av C. graminicola inokulert på maisbladskjede |
| 12 | Appressoria |
| 24 | Primære hyfer |
| 36 | Sekundære hyfer |
| 48 | Sekundære hyfer |
| 60 | Acervuli |
| 72 | Acervuli |
| 108 | Acervuli |
Tabell 1: Colletotrichum graminicola infeksjon tidsforløp: Sammendrag av tidsforløpet av maisbladskjeder inokulert med C. graminicola stamme M1.001 basert på milepæler for sopputvikling gjennom livsstilsovergang. Mikroskopiske observasjoner ble utført hver 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den optimaliserte inokulasjonsmetoden for bladkappe beskrevet her er modifisert fra en original protokoll som ble utviklet for og har blitt brukt på risbladskjeder 6,8,36. Det tillater direkte, detaljerte observasjoner av soppvekst og utvikling i levende planteceller med enten bredfelts- eller konfokalmikroskopi. Protokollen er egnet for karakterisering, sammenligning og kvantifisering av en rekke mikroskopiske fenomener under maiskolonisering, inkludert sopputvikling og vertsresponser under kompatible versus inkompatible interaksjoner; produksjon og sekresjon av spesifikke soppproteiner i planta; og cytologi og biokjemi av vanlige eller nye patogenisitetsfaktorer produsert under mais-sopp-interaksjonen. Vi har brukt denne metoden med hemibiotrofiske og nekrotrofe patogener av mais. Vi har ikke forsøkt inokulasjoner med biotrofe patogener (f.eks. Rustsvamp), men skjederne, siden de forblir i live, vil også være nyttige for den applikasjonen. Vi har også brukt denne metoden på durraskjede for undersøkelser av cytologi av verts- og kultivarspesifikk resistens 7,37. For durraskjede var den eneste justeringen av protokollen å fylle hele sliren med sporeoppheng, i stedet for å påføre en enkelt dråpe i midten. Dette var nødvendig på grunn av den mindre diameteren på durrgapappene.
Bruken av disse skjede analysene har i stor grad avansert våre detaljerte studier på mekanismene for vertskolonisering og soppmolekyler som er kritiske for patogenisitet. For eksempel viste anvendelse av metoden ikke-vert gjenkjenning av C. sublineola av mais, og av C. graminicola av sorghum, inkludert overfølsomme resistensresponser i begge tilfeller7. Maisbladskjede ble også brukt til å teste interaksjoner mellom soppstammer på avstand på samme skjede. I dette tilfellet viste samtidig inokulering av en patogen WT og ikke-patogen cpr1 MT-stamme sammen på levende skjeder induksjon av følsomhet av maisceller ved WT-stammen og ga bevis for en diffusibel faktor involvert i patogenisitet12. Kappene tillot differensiering av de to stammene som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner, og kvantifisering og statistiske sammenligninger av koloniseringsprosessen for stammene inokulert enten alene eller sammen.
Denne maisbladkappeanalysen har flere fordeler i forhold til hele planteinokulasjoner for levende celleavbildning. For det første gir protokollen overlegen avbildning, uten behov for rydding eller fiksering, av patogener som interagerer med levende vertsceller i sanntid. For eksempel gjorde studier ved bruk av maisbladskjeder det mulig å oppdage en tydelig overgang fra biotrofi til nekrotrofi i hemibiotrofisk C. graminicola og tilrettelagt funksjonelle sammenligninger med en ikke-patogen mutant 7,12,16,17. Selv om utskårne risbladskjeder inokulert med M. oryzae angivelig kan presentere symptomer som ikke samsvarer med de som er observert i hele risplanter36, er tidspunktet og utseendet på kolonisering, vevskollaps og lesjonsutvikling i maiskjede lik den i hele blader12,14. En annen fordel med kappeanalysen er at den viser større synkronitet på tvers av replikasjoner og eksperimentell reproduserbarhet av soppkolonisering12,18. Mens hele planteinokulasjonen kan resultere i uregelmessige nivåer av sopppenetrasjon18, gir de mer kontrollerte forholdene til skjedeinokulasjonene mer synkronitet og tillater mer presis undersøkelse og kvantifisering av interaksjoner. Denne økte synkroniteten gjorde det lettere å bruke mantlene i transkriptomanalyser32,33. Videre muliggjorde kappeprotokollen den nødvendige hastigheten på prøvepreparering for transkriptomanalyse: trimming, skylling og screening av hver kappe tok ikke mer enn 2 minutter før de ble flashfrosset for RNA-ekstraksjon32,33.
Kritiske trinn for vellykket levende celleavbildning av infeksjon inkluderer: 1) Skjede bør brukes umiddelbart etter kutting for eksperimenter. Utskårne inokulerte skjeder bør ikke beholdes i mer enn 6 dager: hvis soppkolonisering er tung, vil de nedbrytes raskere12; 2) Vær forsiktig med å velge skjeder som er av samme utviklingsalder for å sikre mer reproduserbare resultater; 3) Bruk en frisk sporesuspensjon fra kulturer som har oppnådd maksimal sporulering; 4) Bruk skarpe barberblader for mer effektiv trimming for å produsere optisk klare prøver; 5) Minimer overdreven og unødvendig manipulering av prøver, da denne prosessen kan påvirke strømførende strukturer og bildekvalitet negativt; 6) Kontroller fuktighetskamrene daglig for å sikre at filterpapiret er tilstrekkelig fuktig; og 7) Når du avbilder prøver på et konfokalmikroskop, må du holde innsamlingsinnstillingene faste under forsøket for å unngå å introdusere intensitetsendringer eller skjevhet når du sammenligner fluorescerende signaler på tvers av prøver. Fluorescerende proteiner kan fotoblekemiddel hvis laserintensiteten og varigheten er for høy, og de kan gi svakere signaler hvis vevsseksjoner holdes under et forseglet deksel i lang tid. Foreløpige eksperimenter, inkludert alle egnede kontroller, bør utføres for å standardisere og optimalisere forhold, materialer og tidslinjer for de mest reproduserbare resultatene.
Feilsøking
Håndtrimming er utilstrekkelig til å produsere optisk klare mantler
Det er mulig at barberbladet har blitt kjedelig. Hvis dette er tilfelle, kast det ordentlig og bytt til et nytt barberblad med én kant. Bruk moderat trykk og hold bladet i en vinkel på 90° i forhold til kappen. Skrap prøven forsiktig, men konsekvent, til observasjon av en flat og gjennomsiktig seksjon. Det anbefales å sjekke mantler under et sammensatt mikroskop før du går videre til det konfokale laserskanningsmikroskopet.
Inokulert maiskjede er ekstremt skjøre
Dette skjer når soppen har kolonisert det meste av plantevevet. Følgelig blir vevet nedbrutt og kollapser. Når du forbereder prøver som allerede er i nekrotrofisk stadium, trykk forsiktig på seksjonen mot et mikroskoplysbilde, påfør en dråpe sterilt DI-vann og skrap prøven en til to ganger med et rent deksel.
Lav spore spiring og penetrasjon in vivo
Dette kan skyldes et høyt antall sporer som hemmer spiring eller penetrasjon. Sørg for at inokulumkonsentrasjonen justeres til 5 x 105 sporer/ml. Hvis problemet vedvarer, juster konsentrasjonen til 5 x 104 sporer/ml. Som en kontroll for in vivo-eksperimentet , plasser 50 μL av den samme sporesuspensjonen på en ny PDA-plate og fordel den jevnt. Kontroller sporenes levedyktighet og spiring daglig.
Asynkrone sopputviklingsstadier over skjeder
Pass på at maisplanter er i samme vekststadium og at kappeseksjoner ble hentet fra samme knute. Sørg også for at sporer er levedyktige og soppkulturer er på det optimale stadiet (f.eks. ikke lenger enn 2 uker gamle kulturer for C. graminicola) for inokulumpreparasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser og ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker USDA-NIFA for deres økonomiske støtte (tilskuddsnummer 2018-67013-28489 og 2020-70410-32901). Eventuelle meninger, funn, konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette manuskriptet er utelukkende forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til det amerikanske landbruksdepartementet. Vi takker besøkende student fra Brasil, Mayara de Silva, for bildene som vises i figur 6A og i figur 7D. Vi anerkjenner også Institutt for plantepatologi ved University of Kentucky for å gi tilgang til Olympus konfokale mikroskoper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. Plant pathological methods: fungi and bacteria. , Burgess Publishing Co. (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
