Summary
В данной рукописи подробно описан оптимизированный протокол инокуляции, в котором для воспроизводимых цитологических, физиологических и молекулярных исследований взаимодействия кукурузы с грибковыми патогенами растений используются отдельные оболочки листьев кукурузы. Влагалища листьев облегчают наблюдение в режиме реального времени за клеточными взаимодействиями между живым растением и грибом в нефиксированных тканях.
Abstract
Оптимизирован протокол инокуляции влагалищ листьев кукурузы гемибиотрофными и некротрофными листовыми патогенными грибами. Этот метод является модификацией по сравнению с методом, первоначально примененным к влагалищу рисовых листьев, и позволяет проводить прямые микроскопические наблюдения за ростом и развитием грибов в живых клетках растений. Влагалища листьев, собранные с проростков кукурузы с двумя полностью раскрывшимися листовыми шейками, инокулируют 20 мкл капель суспензий спор грибов 5 x 105 спор /мл и инкубируют во влажных камерах при температуре 23 °C при непрерывном флуоресцентном свете. Через 24-72 ч лишняя ткань удаляется лезвием бритвы, оставляя один слой клеток эпидермиса, оптически чистый образец, который можно визуализировать непосредственно без необходимости химической фиксации или очистки. Клетки растений и грибов остаются живыми в течение всего эксперимента, а взаимодействия могут быть визуализированы в режиме реального времени. Оболочки могут быть окрашены или подвергнуты плазмолизу для изучения цитологии развития и жизнеспособности клеток хозяина и патогена во время инфекции и колонизации. Штаммы грибов, трансформируемые для экспрессии флуоресцентных белков, могут быть инокулированы или коинокулированы на оболочки для повышения разрешения и облегчения оценки конкурентных или синергетических взаимодействий. Штаммы грибов, экспрессирующие флуоресцентные белки слияния, могут быть использованы для отслеживания и количественной оценки производства и нацеливания этих отдельных белков в planta. Инокулированные ткани оболочки могут быть извлечены для определения характеристик нуклеиновых кислот, белков или метаболитов. Использование этих оболочечных анализов значительно продвинуло вперед детальные исследования механизмов патогенности грибов в кукурузе, а также эффекторов грибных белков и вторичных метаболитов, способствующих патогенности.
Introduction
Пространственный и временной анализ на клеточном уровне имеет решающее значение для понимания физиологии и цитологии взаимодействий грибов и растений. Листовые ткани, которые были химически закреплены 1,2,3 или очищены и окрашены4, а также искусственные мембраны5 использовались в прошлом для изучения цитологии развития листовых патогенов и взаимодействия растений с грибами. Тем не менее, исследование инфекционных событий в тканях живого хозяина в режиме реального времени без фиксации или очистки является сложной задачей из-за технических проблем, связанных с подготовкой оптически прозрачных образцов для визуализации.
В конце 1940-х годов был разработан протокол инокуляции оболочек листьев для ярко-полевого микроскопического исследования резистентности живых клеток эпидермиса риса к рисовому бластному грибу Magnaporthe oryza6. В последнее время детальные молекулярные, физиологические и цитологические наблюдения за колонизацией хозяина видами Colletotrichum и Magnaporthe были значительно облегчены благодаря сочетанию модифицированных версий этого метода с грибными трансформантами, экспрессирующими флуоресцентные белки, и высокоэффективными протоколами визуализации живых клеток, включая эпифлуоресценцию и конфокальную микроскопию7,8,9,10.11,12,13.
В данной работе подробно описан оптимизированный протокол инокуляции с использованием отслоившихся влагалищ листьев кукурузы для наблюдения за процессами заражения гемибиотрофными и некротрофными листовыми грибковыми патогенами. Мы специально использовали его для изучения Colletotrichum graminicola (C. graminicola), возбудителя антракноза листьев и стеблевой гнили, и Stenocarpella maydis, которая вызывает фитофтороз листьев Diplodia и стеблевую гниль. Однако метод должен быть применим и к другим гемибиотрофным и некротрофным листовым грибковым патогенам. Цитологические и физиологические реакции во время инфекций и колонизации в этих иссеченных листовых влагалях аналогичны таковым в целых листовых пластинках12,14,15. Кроме того, гемибиотрофная колонизация клеток эпидермиса оболочки C. graminicola сходна с колонизацией клеток сердцевины стебля16,17. Отслоенные влагалища демонстрируют большую синхронность и экспериментальную воспроизводимость проникновения и колонизации грибов, чем листовые пластинки или ткани сердцевины стебля14,16,17,18. Для этого протокола можно использовать большинство сортов кукурузы. Тем не менее, инбредные или гибриды с избыточным количеством фиолетовых пигментов в влагалях менее подходят, поскольку пигменты мешают визуализации. Сладкая кукуруза «Золотой юбилей» была особенно полезна для наших исследований, потому что необработанные семена коммерчески доступны, растения очень восприимчивы ко многим листовым заболеваниям и хорошо растут в теплице. Первые эпидемии антракнозной стеблевой гнили в США привели к полной потере урожая сахарной кукурузы в Индиане в 1970-х годах19,20. Этот метод инокуляции влагалища листа может быть применен для непосредственного наблюдения и количественной оценки роста и развития грибков в живых и локально убитых растительных клетках, для демонстрации реакций резистентности в совместимых/несовместимых ответах на грибковую инфекцию, а также для тестирования взаимодействия между штаммами грибов на одной и той же оболочке в режиме реального времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс для метода показан на рисунке 1.
Рисунок 1: Этапы оптимизированного протокола инокуляции с использованием отсоединенных влагалищ листьев кукурузы. Приготовление споровой суспензии, инокуляция влагалища листа и подготовка образца для микроскопии живых клеток выделены зеленым (A), фиолетовым (B) и оранжевым (C) прямоугольниками соответственно. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
1. Растительный и грибковый материал
- Рост растений
- Выращивайте рассаду кукурузы (см. Таблицу материалов) в теплице (14 часов света/27 °C и 10 часов темноты/22 °C) в контейнерах SC10 (см. Таблицу материалов). Используйте питательную среду, состоящую из трех частей коммерческой горшечной почвы (см. Таблицу материалов) и двух частей стерилизованного паром верхнего слоя почвы.
- Поливайте рассаду на 2 мин с помощью системы верхнего орошения один раз в день, утром.
- Заготавливают саженцы на стадии V2, обрезая их на уровне почвы. Стадия роста V2 достигается, когда сеянцы достигают 5-10 см в высоту и имеют два видимых воротничковых листа21.
- Оберните растения влажным бумажным полотенцем и поместите в полиэтиленовый пакет для транспортировки в лабораторию для дальнейшей обработки.
- Грибковые культуры
- Реактивируют хранящиеся культуры грибкового кремнезема в асептических условиях22, посыпая примерно 50 гранулами зараженного кремнезема на соответствующую агаровую среду. Во избежание морфологических изменений и потери патогенности штаммы субкультуры после реактивации проводят не более 3 раз. Картофельный декстрозный агар (PDA; см. Таблицу материалов) обычно используется для культивирования C. graminicola, в то время как овсяный агар (OA; см. Таблицу материалов) используется для S. maydis.
- Для приготовления КПК для культивирования грибковых подвоев суспендируют 19,5 г промышленно приготовленного обезвоженного КПК в 500 мл деионизированной (ДИ) воды. Для получения ОА 36 г промышленно приготовленного обезвоженного ОА кипятят в деионизированной воде в течение 15-30 мин, процеживают через три слоя марли и доводят фильтрат до 500 мл децентрализованной водой. Автоклавная среда для стерилизации.
- При работе со штаммами-трансформантами дополняйте расплавленную охлажденную среду подходящим антибиотиком (например, гигромицином В, генетиком). Конечные концентрации гигромицина или генетицина в 500 мл среды составляют 250 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно.
- Инкубируют культуры в оптимальных условиях до тех пор, пока не разовьется спорулирующий мицелий. Colletotrichum graminicola и S. maydis хорошо растут при температуре 23 °C при постоянном флуоресцентном освещении и уровне влажности окружающей среды. Спороношение происходит через 7 дней после инокуляции (dai) для S. maydis или 14 dai для C. graminicola.
2. Прививки влагалища листа
- Монтаж фильтрующего блока из стекловаты
- С помощью сверхпрочных ножниц или ножниц отрежьте колпачок и примерно 0,5 мм от конического дна пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл (см. Таблицу материалов).
- Поместите кусок стекловаты (примерно 0,5 см x 0,5 см; см. Таблицу материалов) внутрь отрезанной трубки, чтобы закрыть центральное отверстие, как показано на рисунке 2.
- При резке стекловаты надевайте перчатки, так как боросиликатное стекло может вызвать раздражение.
- Подготовка опорных стоек оболочки листа
- Разрежьте 96-луночную ПЦР-пластину без юбки (см. таблицу материалов) на шесть двухколонных (8 x 2 лунки) опорных стоек, как показано на рисунке 3A.
- Переверните стойки с двумя колоннами так, чтобы конические дно колодцев были обращены вверх, а плоские верхушки — вниз (Рисунок 3B).
- Поместите каждую опору в стеклянную чашку Петри, содержащую увлажненную фильтровальную бумагу, и накройте ее крышкой (см. Таблицу материалов). Этот блок функционирует как небольшая камера влажности для ножен.
- Подготовка посевного материала
- Для каждого штамма гриба поместите один собранный фильтрующий блок из стекловаты в неповрежденную стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, как показано на рисунке 2. Последний функционирует как сборная трубка.
- Промаркируйте трубки.
- Собирают конидии со спорулирующих культур, предварительно заливая каждую тарелку 3-4 мл стерильной деионизированной воды. В некоторых случаях может потребоваться больше воды для образования слоя жидкости на поверхности колонии. Смачивающие агенты в этой системе не требуются.
- Удалите споры из агара с помощью стерильного пестика с коническим кончиком (см. Таблицу материалов), чтобы равномерно соскрести по всей пластине.
- Нанесите 1 мл споровой суспензии на фильтр из стекловаты асептически и дайте спорам протечь в сборную трубку под действием силы тяжести.
- Центрифугируют пробирки для сбора отфильтрованных споровых суспензий при 3 500 x g в течение 5 мин. Споры должны быть гранулированы на дне пробирки микроцентрифуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование спор C. graminicola на более высоких скоростях, чем рекомендуется здесь, приводит к значительной потере жизнеспособности. - Перелейте жидкость в автоклавируемый контейнер, добавьте 1 мл стерильной деионизированной воды и осторожно перемешайте, чтобы ресуспендировать гранулированные споры. Центрифугу, как показано на шаге 2.3.6.
- Промойте споры 3 раза, чтобы удалить любой конидиальный матрикс, который может содержать аутоингибиторы, которые могут снизить прорастание или проникновение.
- После третьей промывки добавьте 300-500 мкл стерильной деионизированной воды, чтобы повторно суспендировать споры для количественного определения.
- Используйте гемоцитометр под составным микроскопом при 100-кратном увеличении для определения концентрации спор. Окрашивание спор перед подсчетом не требуется.
- Приготовьте суспензию 5 x 10 по5 спор/мл со стерильной деионизированной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензию спор C. graminicola можно хранить при комнатной температуре не более 4 ч до быстрой потери жизнеспособности. Охлаждение конидий не повышает жизнеспособность.
- Прививки влагалища
- Ознакомьтесь с соответствующими методами и процедурами биобезопасности перед инокуляцией растений штаммами грибов.
- Удалите влагалище с первого настоящего листа проростков V2, проведя ногтем большого пальца по перекрывающемуся краю влагалища, и аккуратно отсоедините его от побега. Ослабьте влагалище с обеих сторон побега, прежде чем пытаться его снять.
- Восстановленные влагалища листьев разрезать на отрезки по 3-5 см. Дезинфицировать поверхности влагалища перед прививкой не нужно.
- Очень осторожно разверните каждый сегмент, чтобы обнажить внутренний (адаксиальный) эпидермальный слой.
- Подготавливая влагалища к инокуляции, держите оставшиеся иссеченные влагалища обернутыми влажным бумажным полотенцем, чтобы избежать высыхания.
- Поместите 20 мкл суспензии спор гриба на внутреннюю поверхность в центре оболочки, непосредственно над средней жилкой, как показано на рисунке 4.
- Поместите инокулированные влагалища листьев горизонтально, поместив среднюю жилку внизу, в опору внутри стеклянной пластины Петри, содержащей увлажненную фильтровальную бумагу, как показано на рисунке 5.
- Каждая стойка вмещает до семи ножен. Инокулируйте не менее пяти оболочек для каждого штамма, чтобы компенсировать потерю репликатов, которая может произойти во время подготовки образца или инкубации.
- Поместите небольшие камеры влажности в прозрачный ящик для хранения, застеленный увлажненной бумагой для проращивания (см. Таблицу материалов).
- Накройте коробку крышкой. Инкубируйте ящик при температуре 23 °C при непрерывном освещении в течение предполагаемого периода времени, который зависит от грибка и от стадий развития грибка, которые будут наблюдаться. Краткая информация о динамике времени для влагалищ кукурузы, инокулированных C. graminicola, представлена в таблице 1.
- Каждый день проверяйте наличие признаков/симптомов заболевания на влагалищах и поддерживайте влажностью как всхожесть, так и фильтровальную бумагу. Влагалища листьев могут сохраняться до 6 дней без явной гибели или деградации растительных клеток при отсутствии инокуляции.
Рисунок 2: Подготовка стекловатного фильтрующего блока. (A) Шарик из стекловаты размером 0,5 см x 0,5 см помещается в микроцентрифужную пробирку 1 со снятым коническим дном. (В-В) Затем фильтрующая трубка помещается в микроцентрифужную трубку 2 для создания собранного фильтрующего блока для приготовления споровой суспензии. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Способ разрезания 96-луночного ПЦР-планшета без юбки. (A) ПЦР-пластина, разрезанная на шесть опорных стоек, 8 x 2 лунки. Пример одинарной опоры оболочки изображен на рисунке (В). Влагалища листьев укладываются горизонтально на опору. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Способ инокуляции влагалища. Одна капля посевного материала наносится непосредственно на адаксиальную поверхность участка оболочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Метод инкубации влагалища. Влагалища инокулированных листьев помещают горизонтально в опорную стойку внутри стеклянной пластины Петри, содержащей смоченную фильтровальную бумагу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
3. Микроскопия живых клеток
- Подготовка образцов для микроскопии
- Аккуратно промойте кусочки оболочки стерильной деионизированной водой, чтобы удалить неприлипшие споры или поверхностный грибковый рост.
- Поместите оболочку на чистое предметное стекло микроскопа (см. Таблицу материалов) так, чтобы адаксиальная (внутренняя) поверхность оболочки была обращена вниз, а абаксиальная (внешняя) поверхность — сверху.
- Используйте новое лезвие бритвы с одной лезвием (см. Таблицу материалов), чтобы отрезать примерно 1 см от концов ножен и удалить большую часть ткани пластинки по обе стороны от средней жилки.
- Держите лезвие бритвы под углом 90° относительно ножен, чтобы сбрить ткань с абаксиальной средней жилки и обнажить эпидермальный слой на адаксиальной поверхности над привитым пятном. Старайтесь выдерживать равномерную толщину. После того, как влагалища листьев сбриты, дальнейшая обрезка не рекомендуется, так как это может повредить образец.
- Следите за тем, чтобы размер сбритых прядей не превышал 1 см х 1 см. Избегайте надавливания на центр ножен во время этого процесса. При работе с оболочками, инокулированными различными споровыми суспензиями, дезинфицируйте перчатки и меняйте лезвие бритвы между образцами.
- Держите наготове чистое стеклянное предметное стекло микроскопа. Поднимите секцию ножен с одного края и осторожно перенесите ее на новый салазки. Инокулированная (адаксиальная) поверхность оболочки должна быть самой верхней, ближайшей к линзе объектива. Монтируйте секции аккуратно, чтобы не повредить грибковые конструкции.
- Нанесите 60 мкл стерильной деионизированной воды на срез и добавьте стеклянный покровный лист размером 24 мм x 60 мм (см. Таблицу материалов). Делайте это медленно, чтобы избежать пузырьков воздуха.
- Когда все будет готово к микроскопии, запечатайте покровное стекло прозрачным лаком для ногтей (см. Таблицу материалов), поместив небольшую каплю на каждый край, а затем соединив капли вместе кистью для лака для ногтей, чтобы получить бесшовное уплотнение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оболочки может быть использован с цитологическими красителями, например, 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), нейтральным красным или трипановым синим, или для наблюдения за клеточным плазмолизом для оценки жизнеспособности растительных клеток. Для окрашивания оболочки или анализа клеточного плазмолиза не запечатывайте покровное стекло. - Для плазмолизного анализа добавляют гипертонический раствор (0,75 М сахарозы или 1 М натрия хлорида) к одному краю покровного стекла и используют сложенную безворсовую папиросную бумагу, чтобы провести раствор по образцу к другому краю покровного стекла. Для окрашивания используйте аналогичный способ нанесения раствора для морилки.
- Широкопольная микроскопия
- После того, как влагалища листьев будут установлены на предметные стекла микроскопа, осмотрите их на предмет грибковой колонизации с помощью широкопольного светового микроскопа с 400-кратным увеличением.
- Для детального изучения грибковых структур используйте объектив для погружения в воду, а не масло для лучшего качества изображения образцов. Сферическая аберрация, вызванная несоответствием показателя преломления, может привести к ухудшению качества изображения. Водные объективы доступны как для широкопольных, так и для конфокальных микроскопов.
- Чтобы определить относительную степень колонизации на оболочке, подсчитайте количество клеток кукурузы, захваченных из каждого места проникновения гриба, используя широкопольный световой микроскоп при 100-кратном увеличении. Эта количественная оценка является подходящим этапом скрининга перед любым статистическим анализом, сравнивающим штаммы, методы лечения и/или стадии развития.
- Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
- Для наблюдения флуоресцентных белков в тканях кукурузы при развитии трансгенных штаммов грибов необходимо настроить основные параметры получения изображения. Определите наилучшие настройки возбуждения/излучения на основе выбранного флуоресцентного маркера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив с 60-кратным увеличением количества воды является предпочтительным при анализе флуоресцентных слияний, построенных с секретируемыми белками. Современные конфокальные микроскопы имеют высоко скорректированные объективы для погружения в воду, чтобы избежать артефактов и аберраций формы. - Если предполагается визуализация флуоресцентных белков живыми клетками, используйте нетрансформированные штаммы грибов в качестве контроля автофлуоресценции. Используйте следующие параметры получения изображения для регистрации динамики гриба-хозяина на инвертированном конфокальном микроскопе и для флуоресцентного белка mCherry. Установите мощность лазера до 5%, высокое напряжение (HV) 450-600 в зависимости от уровня экспрессии, усиление 1,375 X, смещение 3%, коэффициент оптического масштабирования 1 для анализа до пяти клеток кукурузы на секцию и коэффициент оптического увеличения 2-5 для отдельных гиф.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальные изображения Z-стека высокого разрешения предоставляют трехмерные данные и лучшее представление о взаимодействиях между хозяином и патогеном в режиме реального времени. - Для количественной оценки интенсивности флуоресценции, соответствующей секретируемым слияниям белков, используйте программное обеспечение для анализа изображений от производителя конфокальных изображений или программу обработки изображений, такую как ImageJ, которую можно бесплатно загрузить в Интернете. Обратитесь к руководству для получения подробной информации о том, как соответствующим образом количественно оценить флуоресцентные сигналы.
- Для наблюдения флуоресцентных белков в тканях кукурузы при развитии трансгенных штаммов грибов необходимо настроить основные параметры получения изображения. Определите наилучшие настройки возбуждения/излучения на основе выбранного флуоресцентного маркера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В приведенных ниже примерах описаны репрезентативные результаты при использовании метода инокуляции влагалища листьев кукурузы. Эти примеры демонстрируют легкость, скорость и точность, с которой наблюдение и сравнение взаимодействий кукурузы и грибов могут быть выполнены в режиме реального времени с помощью этого оптимизированного анализа. Визуализация живых клеток также позволяет извлекать количественную информацию, предоставляя полезный инструмент для сравнительных молекулярных, цитологических и физиологических исследований. Более подробную информацию можно найти в оригинальных публикациях, цитируемых по каждой успешной заявке.
Пример данных 1: Использование окрашивания и плазмолиза в инокулированных влагалищах листьев для оценки грибкового статуса и выявления реакции растений на грибковую инфекцию
Влагалища листьев кукурузы были использованы для визуализации и сравнения процессов заражения Colletotrichum graminicola и Stenocarpella maydis в живых клетках хозяина с помощью ярко-полевой микроскопии, что позволило детально описать закономерности колонизации и временные ходы (неопубликованные результаты; Рисунок 6).
Эти исследования показали, что S. maydis быстро проникает в клетки эпидермиса непосредственно через недифференцированные гифальные отеки, в отличие от C. graminicola , которая продуцирует меланизированную аппрессорию. Попадая внутрь клеток эпидермиса, оба патогена переходят от клетки к клетке, проходя через явно неповрежденные клеточные стенки (рис. 6A, B).
Влагалища могут быть окрашены трипановым синим или DAPI, чтобы легче оценить природу и степень колонизации гиф грибов (рис. 6). Окрашивание трипановым синим показывает, что C. graminicola первоначально проникает через толстые первичные гифы, которые перемещаются между клетками через очень узкие соединения. Позже гриб переходит в некротрофную стадию, образуя более тонкие вторичные гифы в центре колонии (рис. 6 C-E)12,14,16,17.
Рисунок 6: Неокрашенные или окрашенные инокулированные влагалища листьев кукурузы, полученные с помощью яркой полевой или эпифлуоресцентной микроскопии. (A ) Внутриклеточные гифы через 48 ч после инокуляции (hpi) Stenocarpella maydis. Заражение происходит через слегка набухшие кончики гифов (стрелка). (B) Внутриклеточные гифы 48 hpi с Colletotrichum graminicola. Заражение происходит через меланизированные аппрессории (стрелки). (C) Гифы C. graminicola, окрашенные трипановым синим, прогрессирующие от клетки к клетке по наступающему краю колонии через узкие соединения (стрелка), 72 hpi. (D) Более близкий вид гифы C. graminicola , окрашенной трипановым синим, при 72 hpi, проходящей через клеточную стенку кукурузы через узкое соединение (стрелка). (E) Гифы C. graminicola, окрашенные трипановым синим, в центре колонии 72 hpi. Можно увидеть более узкие вторичные гифы, выходящие из более толстых первичных гиф (стрелки). (F) Гифы C. graminicola 72 hpi, у края наступающей колонии на влагалище листа, окрашенное DAPI. Окрашенные ядра грибов и растений флуоресцируют под ультрафиолетовым светом. Масштабные линейки в каждой панели равны 50 мкм. Микрофотографии получены с помощью монохроматической цифровой камеры в сочетании с эпифлуоресцентным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Оболочки могут быть окрашены нейтральным красным цветом и/или подвергнуты плазмолизу для изучения цитологии развития и жизнеспособности клеток кукурузы при заражении и колонизации патогенными грибами (рис. 7).
Colletotrichum graminicola - это гемибиотрофный гриб, который поражает живые клетки кукурузы толстыми первичными гифами, отделенными от цитоплазмы хозяина мембраной (рис. 7A-C)12,14,16,17. Stenocarpella maydis, с другой стороны, является некротрофным грибком, который продуцирует фитотоксин23 и убивает клетки эпидермиса (которые становятся гранулированными и не могут плазмолизироваться) до того, как он проникнет в них (рис. 7D).
Защита кукурузы от C. graminicola и других листовых патогенов включает накопление активных форм кислорода (АФК), в частности перекиси водорода (H2O2)12,15. Для исследования окислительной химии взаимодействий растений и патогенов 3,3′-диаминобензидин (DAB) может быть использован для окрашивания клеток24. DAB окисляется H2 O2 с образованием темно-коричневого осадка, который виден в влагалищах листьев кукурузы (рис. 7 E,F)12,24. Выработка пигмента является индикатором окислительного взрыва, связанного с реакцией на резистентность хозяина.
Рисунок 7: Окрашенные и/или плазмолизированные инокулированные влагалища листьев кукурузы, полученные с помощью ярко-полевой микроскопии. (A) Влагалище листа, инокулированное C. graminicola 24 hpi и подвергнутое плазмолизу и окрашиванию нейтральным красным цветом. Живые клетки кукурузы под аппрессориями (стрелками) плазмолизируются и окрашиваются, демонстрируя, что патоген не убивает клетки до инвазии. (B) Влагалище листа 48 hpi с C. graminicola, подвергнутое плазмолизу и окрашиванию нейтральным красным цветом. Клетки кукурузы, колонизированные первичными гифами (стрелками), все еще живы, что свидетельствует о том, что C. graminicola проникает в клетки в качестве биотрофа. (C) Влагалище листа 48 hpi с C. graminicola, демонстрирующее гифы, движущиеся от клетки к клетке у переднего края колонии. Оболочки плазмолизированы, но не окрашены. Неколонизированные клетки, которые примыкают к краю колонии (стрелкам), продолжают плазмолизировать. (D) Влагалище листа 24 hpi с S. maydis, до проникновения. Клетки под проросшей спорой (стрелкой) выглядят гранулированными и не могут плазмолизироваться, что указывает на то, что S. maydis убивает их до проникновения и ведет себя как некротроф. (E) Влагалище листьев резистентной кукурузы, инбредной Mp305 24 hpi с C. graminicola и окрашенной DAB. Темное окрашивание указывает на сильную окислительную реакцию одиночной клетки в центре изображения, в то время как ореолы коричневого пигмента можно увидеть вокруг большей части отдельных аппрессорий, а грануляцию можно наблюдать в клетках в верхней части фотографии. (F) Более пристальный взгляд на ореолы коричневого пигмента, скопившиеся вокруг аппрессориев, и отложение пигмента в клеточных стенках кукурузы поблизости (стрелки). Масштабные линейки на каждой панели равны 50 мкм, за исключением (F), который составляет 20 мкм. Микрофотографии получены с помощью монохроматической цифровой камеры в сочетании с эпифлуоресцентным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Пример данных 2: Визуализация живых клеток с грибами, экспрессирующими флуоресцентные белки
Гифы грибов, экспрессирующие цитоплазматические флуоресцентные белки, могут быть визуализированы с высоким разрешением в живых клетках оболочки без необходимости окрашивания с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа (рис. 8).
Флуоресцентные белки могут быть нацелены на различные грибковые органеллы, например, митохондрии, ядра или эндомембранную систему, чтобы отслеживать их расположение и активность в живых клетках грибов в плантах (рис. 8C)25,26,27,28 (неопубликованные результаты). Флуоресцентные белки также могут управляться различными промоторами грибов, чтобы служить репортерами для различных функций: например, показан RFP, управляемый белком стресс-реакции шаперона BiP (рис. 8D)29 (неопубликованные результаты). Использование влагалища листа позволяет визуализировать индивидуально помеченные флуоресцентные слияния, которые накапливаются и секретируются гифами грибов по мере колонизации клеток хозяина 8,9 (рис. 8E). Трансгенные линии кукурузы, экспрессирующие флуоресцентные белки, нацеленные на различные клеточные компартменты, например, ядра или плазматическую мембрану, также доступны30,31 и могут быть использованы для инокуляций для оценки влияния инфекции на клеточные структуры кукурузы, например, ядра. Использование этих трансгенных линий кукурузы продемонстрировало, что ядра в неинвазированных клетках кукурузы, как правило, мигрируют к клеточной стенке, ближайшей к клеткам, которые уже колонизированы C. graminicola (неопубликованные результаты; Рисунок 8F).
Рисунок 8: Эпифлуоресцентная (A, B) или конфокальная (C, D, E, F) визуализация Colletotrichum graminicola, экспрессирующих флуоресцентные белки. (A) Неокрашенная, плазмолизированная влагалище листа 48 hpi со штаммом C. graminicola, цитоплазматически экспрессирующим mRFP под контролем промотора ToxA34. В этих влагалищах листьев также отмечается значительная автофлуоресценция. (B) Неокрашенное влагалище листа 48 hpi со штаммом C. graminicola, цитоплазматически экспрессирующим SGFP под контролем промотора ToxA. (C) Colletotrichum graminicola, экспрессирующий SGFP, нацеленный на эндомембранную систему с помощью якоря HDEL35. (D) Неокрашенное влагалище листа 24 hpi с C. graminicola, трансформированным с помощью mRFP под контролем промотора для гомолога C. graminicola шаперона BiP. Красная флуоресценция в первичной гифе является индикатором активации BiP в ответ на стресс секреции. (E) Накопление белка слияния арабинофуранозидазы::mCherry в первичной гифе C. graminicola WT, которая пересекает клеточную стенку оболочки листа кукурузы при 44 hpi. (F) Влагалище листа трансгенной линии кукурузы, экспрессирующей YFP, нацеленное на ядра растений30, 31, 48 hpi со штаммом C. graminicola, экспрессирующим mRFP цитоплазматически под контролем промотора ToxA. Масштабные линейки на каждой панели равны 20 мкм, за исключением панели A, где она равна 50 мкм. Микрофотографии получали с помощью монохроматической цифровой камеры в сочетании с эпифлуоресцентным микроскопом. Изображения в (C-F) были получены с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Пример данных 3: Использование влагалищ листьев кукурузы для изучения детальной цитологии совместимых/несовместимых ответов и взаимодействий между штаммами грибов
Непатогенный мутантный штамм C. graminicola (cpr1 MT) сравнивали со штаммом дикого типа (WT) в влагалищах листьев кукурузы (рис. 9A,B)12.
Визуализация живых клеток штаммов, меченных цитоплазматическими флуоресцентными белками, показала, что мутант был специфически нарушен при перемещении от клетки к клетке в оболочках листьев кукурузы. Протокол оболочки позволил провести точную количественную оценку, которая показала, что cpr1 MT был ограничен первой колонизированной клеткой в 95% случаев (рис. 9C)12. Это резко контрастировало с WT, при котором менее 5% инфекций оставались в первой колонизированной клетке в тотже период времени. Интересно, что cpr1 MT был способен сапрофитно расти за пределы первой первоначально инфицированной клетки в локально замерзших оболочках, таких как штамм WT (рис. 9D). Это указывало на то, что неспособность cpr1 MT к колонизации была конкретно связана с активным ответом живой клетки кукурузы.
Анализ инокуляции влагалища листа использовали для проверки взаимодействия между GFP-экспрессирующими cpr1 MT и RFP-экспрессирующими WT штаммами путем их совместного посева на одну и ту же влагалищелиста 12. Когда штаммы были инокулированы близко друг к другу (не более 8 клеток кукурузы друг от друга), cpr1 MT мог нормально расти как биотроф от клетки к клетке (рис. 9E, F). Плазмолизные анализы подтвердили, что грибок cpr1 MT проник в живые клетки12. Все эти детальные наблюдения стали возможными благодаря анализу оболочки и подразумевали существование диффузионного фактора, который индуцирует совместимость, продуцируемую WT-штаммом C. graminicola, но отсутствует в cpr1 MT12.
Рисунок 9: Совместимые и несовместимые взаимодействия с участием WT и cpr1 MT штаммов Colletotrichum graminicola. Использование различных флуоресцентных белков позволило различить эти два штамма при совместном посеве на влагалища листьев кукурузы12. (A) Штамм WT C. graminicola, экспрессирующий цитоплазматический mRFP в влагалях листьев кукурузы при 48 hpi. (B) Штамм C. graminicola cpr1 MT, экспрессирующий SGFP в влагалях листьев кукурузы при 72 hpi. CPR1 MT лишь в редких случаях (<5% времени) колонизируется после первой инфицированной клетки, даже в течение 6 дней после инокуляции. (C) Более пристальный взгляд на штамм C. graminicola cpr1 MT, экспрессирующий SGFP при 72 dpi. В этом случае ему удалось пересечь клеточную стенку в соседнюю клетку, но затем он перестал развиваться. (D) Штамм C. graminicola cpr1 MT, экспрессирующий SGFP, 48 hpi в убитых тканях оболочки. Штамм cpr1 MT быстро колонизирует неживые клетки оболочки кукурузы, подобно WT. (E) Когда штаммы WT-mRFP C. graminicola и cpr1 MT-GFP C. graminicola совместно инокулируются близко друг к другу на влагалища листьев кукурузы (48 hpi), штамм cpr1 MT-GFP восстанавливает способность нормально продвигаться через живые клетки оболочки кукурузы в качестве биотрофа. Биотрофный рост внутри живых клеток был подтвержден плазмолизным анализом. (F) Более пристальный взгляд на штамм C. graminicola cpr1 MT, экспрессирующий SGFP, растущий от клетки к клетке при инокуляции рядом с WT (не более 8 клеток кукурузы друг от друга). Масштабные линейки равны 50 мкм (A, B и E) или 20 мкм (C, D и F). Микрофотографии получали с помощью монохроматической цифровой камеры в сочетании с эпифлуоресцентным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Инокулированные оболочки также использовались для получения тканей для экстракции РНК для анализа транскрипционной активности32,33. Оболочки идеально подходили для этой цели, поскольку их можно было осматривать перед экстракцией, чтобы контролировать процесс заражения, что обеспечивает однородность образца при многократной репликации. Эти исследования позволили идентифицировать волны дифференциально экспрессируемых генов между стадиями перехода образа жизни Colletotrichum 32,33.
Пример данных 4: Результаты субоптимальных экспериментов
Неудовлетворительная визуализация живых клеток может быть результатом недостаточной обрезки влагалищ листьев, что приводит к перекрытию слоев эпидермальных клеток и оптически непрозрачным образцам (рис. 10).
Рисунок 10: Неоптимальный исход эксперимента из-за недостаточной обрезки влагалищ листьев.( А) Пример множественных слоев клеток эпидермиса, препятствующих исследованию развития грибов invivo. (B) Пример наложения клеточных слоев, влияющих на визуализацию живых клеток. Масштабные линейки равны 20 мкм. Микрофотографии получали с помощью монохроматической цифровой камеры в сочетании с эпифлуоресцентным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Другим потенциальным неоптимальным результатом эксперимента является нескорректированная концентрация инокулята, которая может привести к низкому (рис. 11А) или высокому количеству спор: последнее может привести к снижению всхожести или аппрессориального проникновения (рис. 11Б). Последнее также может затруднить количественное определение клеток кукурузы, колонизированных в каждом месте проникновения грибов.
Рисунок 11: Неоптимальный исход эксперимента из-за неправильно отрегулированной концентрации посевного материала. Ответ. Низкая концентрация суспензии спор C. graminicola на влагалищах, что приводит к низкому количеству мест проникновения грибов. В. Высокая концентрация инокулята C. graminicola на влагалях листьев, вызывающая множественные аппрессории в непосредственной близости и снижающая проникновение клеток хозяина. Масштабные линейки равны 20 мкм. Микрофотографии получали с помощью монохроматической цифровой камеры в сочетании с эпифлуоресцентным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Время микроскопического наблюдения (hpi) | Стадия развития C. graminicola, инокулированного на влагалища листьев кукурузы |
| 12 | Аппрессория |
| 24 | Первичные гифы |
| 36 | Вторичные гифы |
| 48 | Вторичные гифы |
| 60 | Ацервули |
| 72 | Ацервули |
| 108 | Ацервули |
Таблица 1: Хронометраж инфекции Colletotrichum graminicola : Краткая информация о динамике влагалищ листьев кукурузы, инокулированных штаммом C. graminicola M1.001, на основе этапов развития грибков на протяжении всего периода изменения образа жизни. Микроскопические наблюдения проводили каждые 12 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оптимизированный метод инокуляции влагалища листа, описанный здесь, является модификацией оригинального протокола, который был разработан и применен для влагалищ листьев риса 6,8,36. Он позволяет проводить прямые, детальные наблюдения за ростом и развитием грибов в живых клетках растений с помощью широкопольной или конфокальной микроскопии. Протокол подходит для характеризации, сравнения и количественной оценки различных микроскопических явлений во время колонизации кукурузы, включая развитие грибов и реакцию хозяина во время совместимых и несовместимых взаимодействий; выработка и секреция специфических грибковых белков в плантах; цитология и биохимия распространенных или новых факторов патогенности, образующихся при взаимодействии кукурузы и грибов. Мы использовали этот метод с гемибиотрофными и некротрофными возбудителями кукурузы. Мы не пытались прививать биотрофные патогены (например, ржавчинные грибы), но оболочки, поскольку они остаются живыми, также были бы полезны для этого применения. Мы также применили этот метод к влагалищу сорго для исследования цитологии устойчивости хозяина и сортоспецифической устойчивости 7,37. Для влагалищ сорго единственное изменение в протоколе заключалось в том, чтобы заполнить всю оболочку споровой суспензией, а не наносить одну каплю в центр. Это было необходимо из-за меньшего диаметра влагалищ сорго.
Использование этих анализов оболочки значительно продвинуло наши детальные исследования механизмов колонизации хозяина и молекул грибов, которые имеют решающее значение для патогенности. Например, применение метода продемонстрировало внехозяйское распознавание C. sublineola кукурузой и C. graminicola сорго, включая гиперчувствительные реакции резистентности в обоих случаях7. Влагалища листьев кукурузы также использовались для тестирования взаимодействия между штаммами грибов на расстоянии на одной и той же оболочке. В данном случае совместная инокуляция патогенного штамма WT и непатогенного штамма cpr1 MT вместе на живые оболочки продемонстрировала индукцию восприимчивости клеток кукурузы штаммом WT и предоставила доказательства диффузионного фактора, участвующего в патогенности12. Оболочки позволили дифференцировать два штамма, экспрессирующих разные флуоресцентные белки, а также количественно и статистически сравнить процесс колонизации штаммов, инокулированных по отдельности или вместе.
Этот анализ влагалища листьев кукурузы имеет ряд преимуществ по сравнению с инокуляциями цельных растений для визуализации живых клеток. Во-первых, протокол обеспечивает превосходную визуализацию, без необходимости очистки или фиксации, патогенов, взаимодействующих с живыми клетками хозяина в режиме реального времени. Например, исследования с использованием влагалищ листьев кукурузы позволили обнаружить отчетливый переход от биотрофии к некротрофии у гемибиотрофной C. graminicola и облегчили функциональное сравнение с непатогенным мутантом 7,12,16,17. Несмотря на то, что иссеченные влагалища рисовых листьев, инокулированные M. oryzae, по имеющимся данным, могут проявлять симптомы, которые не соответствуют тем, которые наблюдаются у целых растений риса36, время и внешний вид колонизации, разрушения тканей и развития повреждений в влагалях кукурузы аналогичны таковым у цельных листьев12,14. Второе преимущество анализа оболочки заключается в том, что он показывает большую синхронность между репликациями и экспериментальную воспроизводимость колонизации грибов12,18. В то время как инокуляция всего растения может привести к неравномерным уровням проникновения грибков18, более строго контролируемые условия инокуляции оболочки обеспечивают большую синхронность и позволяют более точно исследовать и количественно оценивать взаимодействия. Эта повышенная синхронность облегчила использование оболочек в транскриптомном анализе32,33. Кроме того, протокол оболочки обеспечивал необходимую скорость подготовки образцов для анализа транскриптома: обрезка, промывка и скрининг каждой оболочки занимали не более 2 мин, прежде чем они были мгновенно заморожены для экстракции РНК32,33.
Важнейшие шаги для успешной визуализации инфекции живыми клетками включают: 1) Оболочки следует использовать сразу после разреза для экспериментов. Иссеченные инокулированные влагалища не должны сохраняться более 6 дней: если грибковая колонизация будет сильной, они будут разрушаться быстрее12; 2) Будьте осторожны при выборе ножен того же возраста развития, чтобы обеспечить более воспроизводимые результаты; 3) Использовать свежую споровую суспензию из культур, достигших максимального спороношения; 4) Используйте острые бритвенные лезвия для более эффективной обрезки для получения оптически чистых образцов; 5) Сведите к минимуму чрезмерные и ненужные манипуляции с образцами, так как этот процесс может негативно повлиять на живые структуры и качество изображения; 6) Ежедневно проверяйте камеры влажности, чтобы убедиться, что фильтровальная бумага достаточно влажная; и 7) При визуализации образцов на конфокальном микроскопе сохраняйте фиксированные настройки регистрации во время эксперимента, чтобы избежать изменений интенсивности или смещения при сравнении флуоресцентных сигналов в разных образцах. Флуоресцентные белки могут фотоотбеливаться, если интенсивность и продолжительность лазера слишком высоки, и они могут давать более слабые сигналы, если срезы ткани хранятся под герметичным покровным стеклом в течение длительного времени. Предварительные эксперименты, включая все соответствующие контрольные мероприятия, должны быть проведены для стандартизации и оптимизации условий, материалов и сроков для получения наиболее воспроизводимых результатов.
Устранение неполадок
Ручная обрезка недостаточна для изготовления оптически прозрачных ножен
Не исключено, что лезвие бритвы затупилось. В этом случае утилизируйте его надлежащим образом и перейдите на новое лезвие бритвы с одной лезвием. Используйте умеренное давление и держите лезвие под углом 90° к ножнам. Соскребите образец аккуратно, но последовательно, пока не увидите плоский и полупрозрачный срез. Желательно проверить оболочки под составным микроскопом, прежде чем переходить к конфокальному лазерному сканирующему микроскопу.
Инокулированная кукурузная оболочка чрезвычайно хрупкая
Это происходит, когда грибок колонизировал большую часть тканей растения. Следовательно, ткань деградирует и разрушается. При подготовке образцов, которые уже находятся в стадии некротрофии, осторожно прижмите срез к предметному стеклу микроскопа, нанесите каплю стерильной деионизированной воды и соскребите образец один-два раза чистым покровным стеклом.
Низкая всхожесть и проникновение спор in vivo
Это может быть связано с большим количеством спор, препятствующих прорастанию или проникновению. Убедитесь, что концентрация посевного материала доведена до 5 x10,5 спор/мл. Если проблема не устранена, отрегулируйте концентрацию до 5 x 104 спор/мл. В качестве контроля для эксперимента in vivo поместите 50 мкл той же споровой суспензии на свежую пластину КПК и равномерно распределите ее. Ежедневно проверяйте жизнеспособность и всхожесть спор.
Асинхронные стадии развития грибка в оболочке
Убедитесь, что растения кукурузы находятся на одной стадии роста и срезы влагалища были получены из одного и того же узла. Кроме того, убедитесь, что споры жизнеспособны, а грибковые культуры находятся на оптимальной стадии (например, не более 2-недельных культур для C. graminicola) для подготовки инокулята.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов и им нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят USDA-NIFA за финансовую поддержку (номера грантов 2018-67013-28489 и 2020-70410-32901). Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этой рукописи, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают точку зрения Министерства сельского хозяйства США. Мы благодарим студентку программы «Наука без границ» из Бразилии Майяру де Сильва за изображения, представленные на рисунке 6A и на рисунке 7D. Мы также выражаем признательность кафедре патологии растений Университета Кентукки за предоставление доступа к конфокальным микроскопам Olympus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. Plant pathological methods: fungi and bacteria. , Burgess Publishing Co. (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
