Summary
En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.
Abstract
Hemos optimizado un protocolo para inocular vainas foliares de maíz con hongos patógenos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. El método es una modificación de uno aplicado originalmente a las vainas de las hojas de arroz y permite la observación microscópica directa del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas. Las vainas foliares recolectadas de plántulas de maíz con dos collares foliares completamente emergidos se inoculan con 20 μL de suspensiones de esporas fúngicas de 5 x 105 esporas/mL y se incuban en cámaras de humedad a 23 °C bajo luz fluorescente continua. Después de 24-72 h, el exceso de tejido se elimina con una cuchilla de afeitar para dejar una sola capa de células epidérmicas, una muestra ópticamente clara que se puede obtener directamente sin necesidad de fijación química o aclaramiento. Las células vegetales y fúngicas permanecen vivas durante la duración del experimento y las interacciones se pueden visualizar en tiempo real. Las vainas pueden teñirse o someterse a plasmólisis para estudiar la citología del desarrollo y la viabilidad de las células huésped y patógena durante la infección y la colonización. Las cepas fúngicas transformadas para expresar proteínas fluorescentes pueden ser inoculadas o co-inoculadas en las vainas para aumentar la resolución y facilitar la evaluación de interacciones competitivas o sinérgicas. Las cepas fúngicas que expresan proteínas de fusión fluorescentes se pueden utilizar para rastrear y cuantificar la producción y el objetivo de estas proteínas individuales en la planta. Los tejidos de la vaina inoculados se pueden extraer para caracterizar ácidos nucleicos, proteínas o metabolitos. El uso de estos ensayos de vaina ha hecho avanzar en gran medida los estudios detallados de los mecanismos de patogenicidad fúngica en el maíz y también de los efectores proteicos fúngicos y los metabolitos secundarios que contribuyen a la patogenicidad.
Introduction
Los análisis espaciales y temporales a nivel celular son fundamentales para comprender la fisiología y la citología de las interacciones entre hongos y plantas. Los tejidos foliares que han sido fijados químicamente 1,2,3 o aclarados y teñidos4, así como las membranas artificiales5, se han utilizado en el pasado para investigar la citología del desarrollo de patógenos foliares y las interacciones planta-hongo. Sin embargo, la investigación de eventos de infección en tejidos vivos del huésped en tiempo real sin fijación o aclaramiento es un desafío debido a problemas técnicos relacionados con la preparación de muestras ópticamente transparentes para la obtención de imágenes.
A finales de la década de 1940 se desarrolló un protocolo de inoculación de la vaina de la hoja separada para la investigación microscópica de campo claro de la resistencia de las células epidérmicas vivas del arroz al hongo del brusone del arroz Magnaporthe oryza6. Más recientemente, las observaciones moleculares, fisiológicas y citológicas detalladas de la colonización del huésped por las especies Colletotrichum y Magnaporthe se han facilitado en gran medida mediante la combinación de versiones modificadas de este método de vaina foliar con transformadores fúngicos que expresan proteínas fluorescentes y protocolos de imágenes de células vivas de alto rendimiento, incluida la epifluorescencia y la microscopía confocal 7,8,9,10.11,12,13.
En este trabajo se detalla un protocolo de inoculación optimizado utilizando vainas foliares de maíz separadas para la observación de procesos de infección por patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. Lo hemos utilizado específicamente para estudiar Colletotrichum graminicola (C. graminicola), el agente causal del tizón de la hoja y la pudrición del tallo de la antracnosis, y Stenocarpella maydis, que causa el tizón de la hoja y la pudrición del tallo por Diplodia. Sin embargo, el método debe ser aplicable a otros patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. Las respuestas citológicas y fisiológicas durante los eventos de infección y colonización en estas vainas foliares extirpadas son similares a las de las láminas foliares enteras12,14,15. Además, la colonización hemibiotrófica de las células epidérmicas de la vaina por C. graminicola es similar a la colonización de las células de la médula del tallo16,17. Las vainas desprendidas muestran mayor sincronicidad y reproducibilidad experimental de la penetración y colonización fúngica que las láminas foliares o los tejidos de la médula del tallo14,16,17,18. La mayoría de las variedades de maíz se pueden utilizar para este protocolo. Sin embargo, los endogámicos o híbridos con exceso de pigmentos púrpuras en las vainas son menos adecuados, ya que los pigmentos interfieren con las imágenes. El maíz dulce del Jubileo de Oro ha sido particularmente útil para nuestros estudios porque las semillas no tratadas están disponibles comercialmente, las plantas son altamente susceptibles a muchas enfermedades foliares y crecen bien en el invernadero. Las primeras epidemias de pudrición del tallo por antracnosis en los Estados Unidos provocaron la pérdida total de las cosechas de maíz dulce en Indiana en la década de 197019,20. Este método de inoculación de la vaina foliar se puede aplicar para observar y cuantificar directamente el crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas frente a células vegetales muertas localmente, para demostrar reacciones de resistencia en respuestas compatibles/incompatibles a la infección fúngica y para probar las interacciones entre cepas fúngicas en la misma vaina en tiempo real.
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Protocol
NOTA: El flujo de trabajo del método se muestra en la Figura 1.
Figura 1: Pasos del protocolo de inoculación optimizado utilizando vainas de hojas de maíz desprendidas. La preparación de la suspensión de esporas, la inoculación de la vaina foliar y la preparación de la muestra para la microscopía de células vivas se resaltan en los cuadros verde (A), púrpura (B) y naranja (C), respectivamente. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Material vegetal y fúngico
- Crecimiento de las plantas
- Cultive plántulas de maíz (ver Tabla de Materiales) en invernadero (14 h de luz/27 °C y 10 h de oscuridad/22 °C) en recipientes SC10 (ver Tabla de Materiales). Use un medio de cultivo que consista en tres partes de tierra para macetas comerciales (consulte la Tabla de materiales) y dos partes de tierra vegetal esterilizada con vapor.
- Riegue las plántulas durante 2 minutos con un sistema de riego por aspersión una vez al día, por la mañana.
- Coseche las plántulas en la etapa V2 cortándolas a nivel del suelo. La etapa de crecimiento V2 se alcanza cuando las plántulas miden de 5 a 10 cm de altura y tienen dos hojas visibles con collar21.
- Envuelva las plantas con una toalla de papel húmeda y colóquelas en una bolsa de plástico para transportarlas al laboratorio para su posterior procesamiento.
- Cultivos fúngicos
- Reactivar los cultivos madre de sílice fúngica almacenados en condiciones asépticas22rociando aproximadamente 50 gránulos de la sílice infestada en un medio de agar apropiado. Para evitar cambios morfológicos y pérdida de patogenicidad, las cepas del subcultivo no superan las 3 veces después de la reactivación. El agar papa dextrosa (PDA; ver Tabla de Materiales) se usa rutinariamente para cultivar C. graminicola, mientras que el agar avena (OA; ver Tabla de Materiales) se usa para S. maydis.
- Para preparar PDA para el cultivo de poblaciones de hongos, suspenda 19,5 g de PDA deshidratado preparado comercialmente en 500 mL de agua desionizada (DI). Para hacer artrosis, hierva 36 g de artrosis deshidratada preparada comercialmente en agua desionizada durante 15-30 minutos, filtre a través de tres capas de gasa y lleve el filtrado a 500 ml con agua desionizada. Medios de autoclave para esterilizar.
- Aumente el medio fundido y enfriado con un antibiótico apropiado (p. ej., higromicina B, genética) cuando trabaje con cepas transformantes. Las concentraciones finales de higromicina o genética en 500 mL de medio son 250 μg/mL y 100 μg/mL, respectivamente.
- Incubar los cultivos en condiciones óptimas hasta que se haya desarrollado un micelio esporulante. Colletotrichum graminicola y S. maydis crecen bien a 23 °C con luz fluorescente continua y niveles de humedad ambiental. La esporulación ocurre a los 7 días después de la inoculación (dai) para S. maydis o 14 dai para C. graminicola.
2. Inoculación de la vaina foliar
- Conjunto de la unidad de filtro de lana de vidrio
- Utilice tijeras o tijeras de alta resistencia para cortar la tapa y aproximadamente a 0,5 mm del fondo cónico de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (consulte la tabla de materiales).
- Coloque un pedazo de lana de vidrio (aproximadamente 0.5 cm x 0.5 cm; ver Tabla de Materiales) dentro del tubo cortado para cubrir el orificio central, como se muestra en la Figura 2.
- Use guantes mientras corta lana de vidrio, ya que el vidrio de borosilicato puede causar irritación.
- Preparación de los bastidores de soporte de la vaina de las hojas.
- Corte una placa de PCR de 96 pocillos sin faldón (consulte la Tabla de materiales) en seis bastidores de soporte de dos columnas (8 x 2 pocillos) como se muestra en la Figura 3A.
- Voltee las rejillas de dos columnas de modo que los fondos cónicos de los pocillos miren hacia arriba y los superiores planos miren hacia abajo (Figura 3B).
- Coloque cada soporte en una placa de Petri de vidrio que contenga papel de filtro humedecido y cúbralo con la tapa (consulte la Tabla de materiales). Esta unidad funciona como una pequeña cámara de humedad para las vainas.
- Preparación del inóculo
- Para cada cepa fúngica, coloque una unidad de filtro de lana de vidrio ensamblada en un tubo de microcentrífuga estéril intacto de 1,5 ml como se muestra en la Figura 2. Este último funciona como un tubo de recolección.
- Etiqueta los tubos.
- Coseche los conidios de los cultivos esporulados inundando primero cada placa con 3-4 ml de agua desionizada estéril. En algunos casos, puede ser necesaria más agua para producir una capa de líquido en la superficie de la colonia. Los agentes humectantes no son necesarios en este sistema.
- Afloje las esporas del agar usando un mortero estéril de punta cónica (consulte la Tabla de materiales) para raspar uniformemente en toda la placa.
- Aplique 1 ml de la suspensión de esporas a una unidad de filtro de lana de vidrio de forma aséptica y deje que las esporas fluyan por gravedad hacia el tubo de recolección.
- Centrifugar los tubos de recolección que contienen las suspensiones de esporas filtradas a 3.500 x g durante 5 min. Las esporas deben peletizarse en el fondo del tubo de microcentrífuga.
NOTA: La centrifugación de esporas de C. graminicola a velocidades superiores a las recomendadas aquí da como resultado una pérdida significativa de viabilidad. - Vierta el líquido en un recipiente esterilizable en autoclave, agregue 1 ml de agua desionizada estéril y agite suavemente para resuspender las esporas granuladas. Centrífuga como en el paso 2.3.6.
- Lave las esporas 3 veces para eliminar cualquier matriz conidial que pueda contener inhibidores automáticos que puedan reducir la germinación o la penetración.
- Después del tercer lavado, agregue 300-500 μL de agua desionizada estéril para resuspender las esporas para su cuantificación.
- Utilice un hemocitómetro bajo un microscopio compuesto con un aumento de 100x para determinar la concentración de esporas. No es necesario teñir las esporas antes de contar.
- Prepare una suspensión de 5 x 105 esporas/ml con agua desionizada estéril.
NOTA: La suspensión de esporas de C. graminicola puede mantenerse a temperatura ambiente durante no más de 4 horas antes de una rápida pérdida de viabilidad. Refrigerar los conidios no aumenta la viabilidad.
- Inoculaciones de vaina
- Verifique las prácticas y procedimientos de bioseguridad pertinentes antes de inocular las plantas con cepas fúngicas.
- Retire la vaina de la primera hoja verdadera de las plántulas V2 pasando una uña del pulgar a lo largo del margen superpuesto de la vaina y aflójela suavemente del brote. Afloje la funda de ambos lados del brote antes de intentar quitarla.
- Corta las vainas de las hojas recuperadas en segmentos de 3-5 cm. No es necesario desinfectar las vainas antes de la inoculación.
- Desenrolle cada segmento muy suavemente para exponer la capa epidérmica interna (adaxial).
- Mientras prepara las vainas para la inoculación, mantenga las vainas restantes extirpadas envueltas con una toalla de papel húmeda para evitar la desecación.
- Coloque 20 μL de la suspensión de esporas de hongos en la superficie interna en el centro de la pieza de la vaina, directamente encima de la nervadura central, como se muestra en la Figura 4.
- Coloque las vainas de las hojas inoculadas horizontalmente, con la nervadura central colocada en la parte inferior, en el soporte dentro de una placa de Petri de vidrio que contenga un papel de filtro humedecido como se muestra en la Figura 5.
- Cada estante tiene capacidad para siete fundas. Inocular al menos cinco vainas por cepa para compensar la pérdida de réplicas que pueda producirse durante la preparación de la muestra o la incubación.
- Coloque las pequeñas cámaras de humedad en una caja de almacenamiento transparente forrada con papel de germinación humedecido (consulte la Tabla de materiales).
- Cubre la caja con la tapa. Incubar la caja a 23 °C con iluminación continua durante el tiempo previsto, que depende del hongo y de las etapas de desarrollo del hongo que se observarán. En la Tabla 1 se presenta un resumen de la evolución temporal de las vainas de maíz inoculadas con C. graminicola.
- Revise todos los días si hay signos / síntomas de enfermedad en las vainas y mantenga húmedos tanto la germinación como los papeles de filtro. Las vainas de las hojas pueden retenerse hasta 6 días sin que se produzca una muerte o degradación evidente de las células vegetales en ausencia de inoculación.
Figura 2: Preparación de la unidad de filtro de lana de vidrio. (A) Se coloca una bola de lana de vidrio de 0,5 cm x 0,5 cm dentro del tubo de microcentrífuga 1 al que se le quita el fondo cónico. (B-C) A continuación, el tubo de filtro se coloca en el tubo de microcentrífuga 2 para generar una unidad de filtro ensamblada para la preparación de la suspensión de esporas. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Método de corte de una placa de PCR de 96 pocillos sin faldón. (A) Placa de PCR cortada en seis bastidores de soporte, 8 x 2 pocillos. Un ejemplo de un solo soporte de vaina se muestra en (B). Las vainas de las hojas se colocan horizontalmente sobre el soporte. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Método de inoculación de la vaina. Una sola gota de inóculo aplicada directamente a la superficie adaxial de la sección de la vaina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Método de incubación de la vaina. Vainas de hojas inoculadas colocadas horizontalmente en una rejilla de soporte dentro de una placa de Petri de vidrio que contiene papel de filtro humedecido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Microscopía de células vivas
- Preparación de muestras para microscopía
- Enjuague suavemente las piezas de la vaina con agua desionizada estéril para eliminar las esporas no adheridas o el crecimiento de hongos superficiales.
- Coloque la vaina en un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio (ver Tabla de Materiales) con la superficie adaxial (interior) de la pieza de la vaina hacia abajo y la superficie abaxial (exterior) hacia arriba.
- Utilice una nueva hoja de afeitar de un solo filo (consulte la Tabla de materiales) para recortar aproximadamente 1 cm de los extremos de la vaina y eliminar la mayor parte del tejido de la lámina a ambos lados de la nervadura central.
- Sostenga la hoja de afeitar en un ángulo de 90° con respecto a la vaina para afeitar el tejido de la nervadura central abaxial y exponer la capa epidérmica en la superficie adaxial por encima del punto inoculado. Trate de mantener un grosor uniforme. Una vez afeitadas las vainas de las hojas, no se recomienda recortar más, ya que esto puede dañar la muestra.
- Asegúrese de que las secciones afeitadas no tengan más de 1 cm x 1 cm de tamaño. Evite presionar el centro de la funda durante este proceso. Cuando trabaje con vainas inoculadas con diferentes suspensiones de esporas, desinfecte los guantes y cambie la hoja de afeitar entre muestras.
- Tenga listo un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio. Levante la sección de la funda desde un borde y transfiérala con cuidado a una nueva guía. La superficie inoculada (adaxial) de la vaina debe estar más arriba, más cerca de la lente del objetivo. Monte las secciones suavemente para evitar daños en las estructuras fúngicas.
- Aplique 60 μL de agua desionizada estéril a la sección y agregue un cubreobjetos de vidrio de 24 mm x 60 mm (ver Tabla de Materiales). Hazlo lentamente para evitar burbujas de aire.
- Cuando esté listo para la microscopía, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente (consulte la Tabla de materiales) colocando una pequeña gota en cada borde y luego conectando las gotas con un cepillo de esmalte de uñas para hacer un sellado perfecto.
NOTA: Este protocolo de vaina se puede utilizar con tinciones citológicas, por ejemplo, 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), rojo neutro o azul de tripano, o para la observación de la plasmólisis celular para evaluar la viabilidad de las células vegetales. Para la tinción de la vaina o los ensayos de plasmólisis celular, no selle el cubreobjetos. - Para los ensayos de plasmólisis, agregue una solución hipertónica (0,75 M de sacarosa o 1 M de cloruro de sodio) a un borde del cubreobjetos y use un papel de seda doblado sin pelusa para extraer la solución a través de la muestra hasta el otro borde del cubreobjetos. Para teñir, use un método similar para aplicar la solución de tinción.
- Microscopía de campo amplio
- Una vez que las vainas de las hojas estén montadas en portaobjetos de microscopio, inspecciónelas en busca de colonización fúngica utilizando un microscopio óptico de campo amplio con un aumento de 400x.
- Para observar las estructuras fúngicas en detalle, utilice un objetivo de inmersión en agua en lugar de aceite para obtener una mejor calidad de imagen de las muestras. La aberración esférica debida a un desajuste del índice de refracción puede causar degradación de la imagen. Los objetivos de agua están disponibles para microscopios ópticos de campo amplio, así como para microscopios confocal.
- Para determinar la cantidad relativa de colonización por vaina, cuente el número de células de maíz invadidas desde cada sitio de penetración fúngica utilizando un microscopio óptico de campo amplio con un aumento de 100x. Esta cuantificación es un paso de cribado adecuado antes de cualquier análisis estadístico que compare cepas, tratamientos y/o etapas de desarrollo.
- Microscopía de barrido láser confocal
- Para observar las proteínas fluorescentes en los tejidos de maíz durante el desarrollo de cepas fúngicas transgénicas, ajuste los parámetros básicos de adquisición de imágenes. Identifique los mejores ajustes de excitación/emisión en función del marcador fluorescente seleccionado.
NOTA: Es preferible un objetivo de agua de 60x cuando se analizan fusiones fluorescentes construidas con proteínas secretadas. Los microscopios confocales modernos tienen objetivos de inmersión en agua altamente corregidos para evitar artefactos y aberraciones de forma. - Si se pretende obtener imágenes de células vivas de proteínas fluorescentes, utilice cepas fúngicas no transformadas como controles de autofluorescencia. Utilice los siguientes parámetros de adquisición de imágenes para capturar la dinámica fúngico-huésped en un microscopio confocal invertido y para la proteína fluorescente mCherry. Ajuste la potencia del láser hasta el 5%, 450-600 de alto voltaje (HV) según el nivel de expresión, ganancia de 1.375X, desplazamiento del 3%, un factor de zoom óptico de 1 para el análisis de hasta cinco células de maíz por sección y un factor de zoom óptico de 2-5 para hifas individuales.
NOTA: Las imágenes confocales Z-stack de alta resolución proporcionan datos tridimensionales y una mejor visión de las interacciones en tiempo real entre el huésped y el patógeno. - Para la cuantificación de las intensidades de fluorescencia correspondientes a las proteínas de fusión secretadas, utilice un software de análisis de imágenes del fabricante confocal o un programa de procesamiento de imágenes como ImageJ, que se puede descargar gratuitamente en línea. Consulte un manual para obtener detalles sobre cómo cuantificar las señales fluorescentes en consecuencia.
- Para observar las proteínas fluorescentes en los tejidos de maíz durante el desarrollo de cepas fúngicas transgénicas, ajuste los parámetros básicos de adquisición de imágenes. Identifique los mejores ajustes de excitación/emisión en función del marcador fluorescente seleccionado.
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Representative Results
En los ejemplos siguientes se describen resultados representativos tras el uso del método de inoculación de la vaina foliar de maíz. Estos ejemplos demuestran la facilidad, velocidad y precisión con la que se puede observar y comparar las interacciones maíz-hongo en tiempo real con este ensayo optimizado. Las imágenes de células vivas también permiten la extracción de información cuantitativa, proporcionando una herramienta útil para estudios moleculares, citológicos y fisiológicos comparativos. Se pueden encontrar más detalles en las publicaciones originales citadas para cada solicitud aceptada.
Datos de ejemplo 1: Uso de tinción y plasmólisis en vainas foliares inoculadas para la evaluación del estado fúngico y la detección de las respuestas de las plantas a la infección fúngica
Las vainas foliares de maíz se han utilizado para visualizar y comparar los procesos de infección de Colletotrichum graminicola y Stenocarpella maydis en células hospederas vivas con microscopía de campo claro, lo que permite descripciones detalladas de los patrones de colonización y los cursos temporales (resultados no publicados; Figura 6).
Estos estudios revelaron que S. maydis invade rápidamente las células epidérmicas directamente a través de hinchazones de hifas indiferenciadas, a diferencia de C. graminicola que produce apresorios melanizados. Una vez dentro de las células epidérmicas, ambos patógenos pasan de célula a célula pasando a través de paredes celulares aparentemente intactas (Figura 6A,B).
Las vainas se pueden teñir con azul de tripano o DAPI para evaluar más fácilmente la naturaleza y el alcance de las hifas fúngicas colonizadoras (Figura 6). La tinción con azul de tripano revela que C. graminicola invade inicialmente a través de hifas primarias gruesas que se mueven entre las células a través de conexiones muy estrechas. Posteriormente, el hongo pasa a una etapa necrótrofa, produciendo hifas secundarias más delgadas en el centro de la colonia (Figura 6 C-E)12,14,16,17.
Figura 6: Vainas foliares de maíz inoculadas sin teñir o teñidas con microscopía de campo claro o epifluorescencia. (A) Hifas intracelulares 48 h post-inoculación (hpi ) con Stenocarpella maydis. La infección se produce a través de las puntas de las hifas ligeramente hinchadas (flecha). (B) Hifas intracelulares de 48 hpi con Colletotrichum graminicola. La infección se produce a través de apresores melanizados (flechas). (C) Hifas de C. graminicola, teñidas con azul de tripán, progresando de célula a célula en el borde de la colonia a través de conexiones estrechas (flecha), 72 hpi. (D) Vista más cercana de la hifa teñida de azul tripano de C. graminicola a 72 hpi, que pasa a través de la pared celular del maíz a través de una conexión estrecha (flecha). (E) Hifas de C. graminicola, teñidas con azul tripano, en el centro de la colonia 72 hpi. Se pueden ver hifas secundarias más estrechas que emergen de las hifas primarias más gruesas (flechas). (F) Hifas de C. graminicola 72 hpi, en el borde de la colonia que avanza sobre una vaina foliar teñida con DAPI. Los núcleos de hongos y plantas teñidos emiten fluorescencia bajo la luz ultravioleta. Barras de escala en cada panel iguales a 50 μm. Micrografías obtenidas con una cámara digital monocromática acoplada a un microscopio de epifluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las vainas pueden teñirse con rojo neutro y/o someterse a plasmólisis para estudiar la citología del desarrollo y la viabilidad de las células de maíz durante la infección y colonización por hongos patógenos (Figura 7).
Colletotrichum graminicola es un hongo hemibiotrófico que invade las células vivas de maíz con hifas primarias gruesas que están separadas del citoplasma del huésped por una membrana (Figura 7A-C)12,14,16,17. Stenocarpella maydis, por otro lado, es un hongo necrótrofo que produce una fitotoxina23 y mata las células epidérmicas (que se granulan y no logran plasmolizarse) antes de invadirlas (Figura 7D).
La defensa del maíz contra C. graminicola y otros patógenos foliares implica la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), particularmente peróxido de hidrógeno (H2O2)12,15. Para investigar la química oxidativa de las interacciones planta-patógeno, se puede utilizar la 3,3′-diaminobencidina (DAB) para la tinción celular24. El DAB es oxidado por H 2 O2, produciendo un precipitado de color marrón oscuro que es visible en las vainas de las hojas de maíz (Figura 7 E,F)12,24. La producción del pigmento es un indicador de un estallido oxidativo relacionado con una respuesta de resistencia del huésped.
Figura 7: Vainas foliares de maíz inoculadas teñidas y/o plasmolizadas con microscopía de campo claro. (A) Vaina foliar inoculada con C. graminicola 24 hpi y sometida a plasmólisis y tinción con rojo neutro. Las células vivas de maíz debajo de los apresores (flechas) se plasmolizan y tiñen, lo que demuestra que el patógeno no mata las células antes de la invasión. (B) Vaina foliar de 48 hpi con C. graminicola, sometida a plasmólisis y tinción con rojo neutro. Las células de maíz que son colonizadas por hifas primarias (flecha) siguen vivas, lo que establece que C. graminicola invade las células como un biótrofo. (C) Vaina foliar de 48 hpi con C. graminicola, mostrando hifas moviéndose de célula a célula en el borde de avance de la colonia. Las vainas han sido plasmolizadas pero no teñidas. Las células no colonizadas que están adyacentes al borde de la colonia (flechas) continúan plasmolisándose. (D) Vaina foliar 24 hpi con S. maydis, antes de la penetración. Las células debajo de la espora germinada (flecha) aparecen granuladas y no logran plasmolizarse, lo que indica que S. maydis las mata antes de la penetración y que se comporta como un necrótrofo. (E) Vaina foliar de maíz resistente endogámico Mp305 de 24 hpi con C. graminicola y teñida con DAB. La tinción oscura indica una fuerte respuesta oxidativa de la célula individual en el centro de la imagen, mientras que se pueden ver halos de pigmento marrón que rodean la mayor parte de los apresores individuales, y se puede observar granulación en las células en la parte superior de la foto. (F) Una vista más cercana de los halos de pigmento marrón acumulados alrededor de los apresores, y la deposición de pigmento en las paredes celulares de maíz cercanas (flechas). Las barras de escala en cada panel son iguales a 50 μm, excepto (F) que es de 20 μm. Micrografías obtenidas con una cámara digital monocromática acoplada a un microscopio de epifluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ejemplo de datos 2: Imágenes de células vivas con hongos que expresan proteínas fluorescentes
Las hifas fúngicas que expresan proteínas fluorescentes citoplasmáticas se pueden visualizar a alta resolución en células vivas de la vaina sin necesidad de tinciones mediante el uso de un microscopio de epifluorescencia o confocal (Figura 8).
Las proteínas fluorescentes pueden dirigirse a varios orgánulos fúngicos, por ejemplo, las mitocondrias, los núcleos o el sistema de endomembranas, con el fin de rastrear sus ubicaciones y actividades en las células fúngicas vivas de la planta (Figura 8C)25,26,27,28 (resultados no publicados). Las proteínas fluorescentes también pueden ser impulsadas por diferentes promotores fúngicos para que sirvan como reporteros para diversas funciones: por ejemplo, se muestra la RFP impulsada por la proteína de respuesta al estrés de secreción de chaperona BiP (Figura 8D)29 (resultados no publicados). El uso de vainas foliares permite la visualización de proteínas de fusión fluorescentes marcadas individualmente que son acumuladas y secretadas por hifas fúngicas a medida que colonizan las células huésped 8,9 (Figura 8E). También se dispone de líneas de maíz transgénico que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a diversos compartimentos celulares, por ejemplo, núcleos o membranas plasmáticas30,31, y pueden utilizarse para inoculaciones con el fin de evaluar los efectos de la infección en las estructuras celulares del maíz, por ejemplo, los núcleos. El uso de estas líneas de maíz transgénico demostró que los núcleos de las células de maíz no invadidas suelen migrar a la pared celular más cercana a las células que ya están colonizadas por C. graminicola (resultados no publicados; Figura 8F).
Figura 8: Imágenes de epifluorescencia (A, B) o confocal (C, D, E, F) de Colletotrichum graminicola que expresan proteínas fluorescentes. (A) Vaina foliar plasmolizada sin teñir de 48 hpi con una cepa de C. graminicola que expresa mRFP citoplasmáticamente bajo el control del promotor ToxA34. También se observa una autofluorescencia significativa en estas vainas foliares. (B) Vaina foliar sin teñir de 48 hpi con una cepa de C. graminicola que expresa SGFP citoplasmáticamente bajo el control del promotor ToxA. (C)Colletotrichum graminicola que expresa SGFP dirigida al sistema de endomembranas con un anclaje HDEL35. (D) Vaina foliar no teñida de 24 hpi con C. graminicola transformada con mRFP bajo el control del promotor para el homólogo de C. graminicola de la chaperona BiP. La fluorescencia roja en la hifa primaria es un indicador de la activación de BiP en respuesta al estrés de secreción. (E) Acumulación de arabinofuranosidasa::mProteína de fusión de cereza en la hifa primaria de C. graminicola WT que atraviesa la pared celular de la vaina de la hoja de maíz a 44 hpi. (F) Vaina foliar de una línea de maíz transgénico que expresa YFP dirigida a los núcleos de la planta30,31, 48 hpi con una cepa de C. graminicola que expresa mRFP citoplasmáticamente bajo el control del promotor ToxA. Las barras de escala en cada panel son iguales a 20 μm, excepto en el panel A, donde es igual a 50 μm. Las micrografías se obtuvieron utilizando una cámara digital monocromática acoplada a un microscopio de epifluorescencia. Las imágenes en (C-F) se capturaron con un microscopio confocal de barrido láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Datos de ejemplo 3: Uso de vainas foliares de maíz para examinar la citología detallada de las respuestas e interacciones compatibles/incompatibles entre cepas fúngicas
Se comparó una cepa mutante no patógena de C. graminicola (cpr1 MT) con la cepa de tipo silvestre (WT) en vainas de hojas de maíz (Figura 9A,B)12.
Las imágenes de células vivas de las cepas marcadas con proteínas fluorescentes citoplasmáticas demostraron que el mutante estaba específicamente afectado en el movimiento de una célula a otra dentro de las vainas de las hojas de maíz. El protocolo de vaina permitió una cuantificación precisa que reveló que la MT cpr1 estaba confinada a la primera célula colonizada el 95% de las veces (Figura 9C)12. Esto contrastó marcadamente con el WT, en el que menos del 5% de las infecciones permanecieron dentro de la primera célula colonizada en el mismo períodode tiempo 12. Curiosamente, la MT cpr1 fue capaz de crecer saprófitamente más allá de la primera célula inicialmente infectada en vainas localmente muertas por congelación, como la cepa WT (Figura 9D). Esto indicó que la incapacidad de la MT cpr1 para colonizar estaba específicamente relacionada con una respuesta activa de la célula viva de maíz.
El ensayo de inoculación de la vaina foliar se utilizó para probar las interacciones entre las cepas de MT cpr1 que expresan GFP y WT que expresan RFP mediante la coinoculación en la misma vaina foliar12. Cuando las cepas se inocularon juntas (no más de 8 células de maíz separadas), la MT cpr1 pudo crecer normalmente como un biótrofo de célula a célula (Figura 9E, F). Los ensayos de plasmólisis confirmaron que el hongo cpr1 MT entró en las células vivas12. Todas estas observaciones detalladas fueron posibles gracias a los ensayos de vaina e implicaron la existencia de un factor difusible que induce la compatibilidad producida por la cepa WT de C. graminicola pero ausente en el cpr1 MT12.
Figura 9: Interacciones compatibles e incompatibles que involucran cepas WT y cpr1 MT de Colletotrichum graminicola. El uso de diferentes proteínas fluorescentes permitió distinguir las dos cepas cuando se inocularon conjuntamente en vainas foliares de maíz12. (A) La cepa WT C. graminicola que expresa mRFP citoplasmática en vainas foliares de maíz a 48 hpi. (B) La cepa C. graminicola cpr1 MT que expresa SGFP en vainas foliares de maíz a 72 hpi. La MT cpr1 solo en raras ocasiones (<5% de las veces) coloniza más allá de la primera célula infectada, incluso hasta 6 días después de la inoculación. (C) Una vista más cercana de la cepa cpr1 MT de C. graminicola que expresa SGFP a 72 dpi. En este caso, logró cruzar la pared celular hacia la siguiente célula, pero luego dejó de desarrollarse. (D) La cepa cpr1 MT de C. graminicola que expresa SGFP, 48 hpi en tejidos de vaina muertos. La cepa cpr1 MT coloniza rápidamente las células no vivas de la vaina de maíz, de manera similar a la WT. (E) Cuando las cepas WT-mRFP de C. graminicola y cpr1 MT-GFP C. graminicola se inoculan juntas en vainas foliares de maíz (48 hpi), la cepa cpr1 MT-GFP recupera la capacidad de progresar a través de las células vivas de la vaina de maíz normalmente, como un biotrofo. El crecimiento biotrófico dentro de las células vivas se confirmó mediante ensayos de plasmólisis. (F) Una vista más cercana de la cepa MT de C. graminicola cpr1 que expresa SGFP, creciendo de célula a célula cuando se inocula adyacente al WT (no más de 8 celdas de maíz separadas). Las barras de escala son iguales a 50 μm (A, B y E) o 20 μm (C, D y F). Las micrografías se obtuvieron utilizando una cámara digital monocromática acoplada a un microscopio de epifluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las vainas inoculadas también se han utilizado para producir tejidos para la extracción de ARN para el análisis de la actividad transcripcional32,33. Las vainas eran ideales para este propósito, ya que podían inspeccionarse antes de la extracción para monitorear el proceso de infección, asegurando así la uniformidad de la muestra en múltiples repeticiones. Estos estudios permitieron la identificación de ondas de genes expresados diferencialmente entre las etapas de transición del estilo de vida de Colletotrichum 32,33.
Datos de ejemplo 4: Resultados de experimentos subóptimos
Las imágenes insatisfactorias de células vivas pueden ser el resultado de un recorte insuficiente de las vainas de las hojas, lo que lleva a capas de células epidérmicas superpuestas y muestras ópticamente opacas (Figura 10).
Figura 10: Resultado experimental subóptimo debido a un recorte insuficiente de las vainas de las hojas. A) Ejemplo de múltiples capas de células epidérmicas que interfieren con el examen del desarrollo fúngicoin vivo. (B) Ejemplo de capas celulares superpuestas que afectan a la obtención de imágenes de células vivas. Barras de escala iguales a 20 μm. Las micrografías se obtuvieron utilizando una cámara digital monocromática acoplada a un microscopio de epifluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Otro posible resultado subóptimo del experimento es una concentración de inóculo no ajustada que puede dar lugar a un número bajo (Figura 11A) o alto de esporas: esto último puede dar lugar a una reducción de la germinación o a una penetración apresiva (Figura 11B). Esto último también puede dificultar la cuantificación de las células de maíz colonizadas en cada sitio de penetración del hongo.
Figura 11: Resultado subóptimo del experimento debido a una concentración de inóculo mal ajustada. Baja concentración de suspensión de esporas de C. graminicola inoculada en vainas, lo que resulta en un bajo número de sitios de penetración de hongos. B. Alta concentración de inóculo de C. graminicola en las vainas foliares causando múltiples apresorios en las proximidades y reducción de la penetración de las células huésped. Barras de escala iguales a 20 μm. Las micrografías se obtuvieron utilizando una cámara digital monocromática acoplada a un microscopio de epifluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tiempo de observación microscópica (hpi) | Etapa de desarrollo de C. graminicola inoculada en vainas foliares de maíz |
| 12 | Apresorios |
| 24 | Hifas primarias |
| 36 | Hifas secundarias |
| 48 | Hifas secundarias |
| 60 | Acervuli |
| 72 | Acervuli |
| 108 | Acervuli |
Tabla 1: Evolución temporal de la infección por Colletotrichum graminicola : Resumen de la evolución temporal de las vainas foliares de maíz inoculadas con la cepa M1.001 de C. graminicola en función de los hitos del desarrollo fúngico a lo largo de la transición al estilo de vida. Las observaciones microscópicas se realizaron cada 12 h.
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Discussion
El método optimizado de inoculación de la vaina foliar descrito aquí es una modificación de un protocolo original que se desarrolló y se ha aplicado a las vainas foliares de arroz 6,8,36. Permite observaciones directas y detalladas del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas con microscopía de campo amplio o confocal. El protocolo es adecuado para la caracterización, comparación y cuantificación de una variedad de fenómenos microscópicos durante la colonización del maíz, incluido el desarrollo fúngico y las respuestas del huésped durante interacciones compatibles versus incompatibles; producción y secreción de proteínas fúngicas específicas en planta; y citología y bioquímica de los factores de patogenicidad comunes o nuevos producidos durante la interacción maíz-hongo. Hemos utilizado este método con patógenos hemibiotróficos y necrotróficos del maíz. No hemos intentado inoculaciones con patógenos biotróficos (por ejemplo, hongos de la roya) pero las vainas, dado que permanecen vivas, también serían útiles para esa aplicación. También hemos aplicado este método a vainas de sorgo para investigaciones de la citología de la resistencia específica del huésped y del cultivar 7,37. En el caso de las vainas de sorgo, el único ajuste al protocolo fue llenar toda la vaina con suspensión de esporas, en lugar de aplicar una sola gota en el centro. Esto fue necesario debido al menor diámetro de las vainas de sorgo.
El uso de estos ensayos de vaina ha hecho avanzar en gran medida nuestros estudios detallados sobre los mecanismos de colonización del huésped y las moléculas fúngicas que son críticas para la patogenicidad. Por ejemplo, la aplicación del método demostró el reconocimiento de C. sublineola por el maíz y de C. graminicola por el sorgo sin hospedador, incluidas las respuestas de resistencia a la hipersensibilidad en ambos casos7. También se utilizaron vainas de hojas de maíz para probar las interacciones entre cepas fúngicas a distancia en la misma vaina. En este caso, la co-inoculación de una cepa patógena de WT y una cepa no patógena de cpr1 MT juntas en vainas vivas demostró la inducción de la susceptibilidad de las células de maíz por la cepa WT y proporcionó evidencia de un factor difusible involucrado en la patogenicidad12. Las vainas permitieron la diferenciación de las dos cepas que expresan diferentes proteínas fluorescentes, y la cuantificación y comparación estadística del proceso de colonización de las cepas inoculadas solas o juntas.
Este ensayo de vaina foliar de maíz tiene varias ventajas sobre las inoculaciones de plantas enteras para la obtención de imágenes de células vivas. En primer lugar, el protocolo proporciona imágenes superiores, sin necesidad de eliminación o fijación, de los patógenos que interactúan con las células huésped vivas en tiempo real. Por ejemplo, los estudios con vainas foliares de maíz permitieron detectar un cambio distinto de biotrofia a necrotrofia en C. graminicola hemibiocófica y facilitaron las comparaciones funcionales con un mutante no patógeno 7,12,16,17. A pesar de que las vainas de hojas de arroz inoculares con M. oryzae pueden presentar síntomas que no se corresponden con los observados en las plantas enteras de arroz36, el momento y la aparición de la colonización, el colapso tisular y el desarrollo de lesiones en las vainas de maíz es similar al de las hojas enteras12,14. Una segunda ventaja del ensayo de vaina es que muestra una mayor sincronicidad entre las repeticiones y la reproducibilidad experimental de la colonización fúngica12,18. Si bien la inoculación de toda la planta puede dar lugar a niveles irregulares de penetración de hongos18, las condiciones más controladas de las inoculaciones de la vaina proporcionan una mayor sincronicidad y permiten una investigación y cuantificación más precisas de las interacciones. Este aumento de la sincronicidad facilitó el uso de las vainas en los análisis del transcriptoma32,33. Además, el protocolo de la vaina permitió la velocidad necesaria de preparación de la muestra para el análisis del transcriptoma: el recorte, el enjuague y el cribado de cada vaina no tardaron más de 2 minutos antes de que se congelaran rápidamente para la extracción de ARN32,33.
Los pasos críticos para obtener imágenes exitosas de la infección con células vivas incluyen: 1) Las vainas deben usarse inmediatamente después del corte para experimentos. Las vainas inoculadas extirpadas no deben conservarse durante más de 6 días: si la colonización fúngica es intensa, se degradarán más rápidamente12; 2) Tenga cuidado de elegir vainas que tengan la misma edad de desarrollo para garantizar resultados más reproducibles; 3) Utilizar una suspensión de esporas frescas de cultivos que hayan alcanzado la máxima esporulación; 4) Utilice hojas de afeitar afiladas para un recorte más eficiente para producir muestras ópticamente claras; 5) Minimice la manipulación excesiva e innecesaria de las muestras, ya que este proceso puede afectar negativamente a las estructuras vivas y a la calidad de la imagen; 6) Revise las cámaras de humedad diariamente para asegurarse de que el papel de filtro esté lo suficientemente húmedo; y 7) Al obtener imágenes de muestras en un microscopio confocal, mantenga fija la configuración de adquisición durante el experimento para evitar introducir cambios de intensidad o sesgo al comparar señales fluorescentes entre muestras. Las proteínas fluorescentes pueden fotoblanquear si la intensidad y la duración del láser son demasiado altas, y pueden dar señales más débiles si las secciones de tejido se mantienen bajo un cubreobjetos sellado durante mucho tiempo. Se deben realizar experimentos preliminares, incluidos todos los controles apropiados, para estandarizar y optimizar las condiciones, los materiales y los plazos para obtener los resultados más reproducibles.
Solución de problemas
El recorte manual es insuficiente para producir vainas ópticamente transparentes
Es posible que la hoja de afeitar se haya desafilado. Si este es el caso, deséchelo correctamente y cambie a una nueva hoja de afeitar de un solo filo. Ejerza una presión moderada y mantenga la cuchilla en un ángulo de 90° con respecto a la funda. Raspe la muestra suavemente, pero de manera consistente, hasta que observe una sección plana y translúcida. Es aconsejable comprobar las vainas bajo un microscopio compuesto antes de proceder al microscopio de barrido láser confocal.
La vaina de maíz inoculada es extremadamente frágil
Esto ocurre cuando el hongo ha colonizado la mayor parte del tejido vegetal. En consecuencia, el tejido se degrada y colapsa. Al preparar muestras que ya se encuentran en la etapa necrotrófica, presione suavemente la sección contra un portaobjetos de microscopio, aplique una gota de agua desionizada estéril y raspe la muestra una o dos veces con un cubreobjetos limpio.
Baja germinación y penetración de esporas in vivo
Esto puede deberse a un alto número de esporas que inhiben la germinación o la penetración. Asegúrese de que la concentración de inóculo esté ajustada a 5 x 105 esporas/ml. Si el problema persiste, ajuste la concentración a 5 x 104 esporas/ml. Como control para el experimento in vivo , coloque 50 μL de la misma suspensión de esporas en una placa de PDA nueva y extiéndala uniformemente. Compruebe diariamente la viabilidad y la germinación de las esporas.
Etapas de desarrollo fúngico asincrónico en las vainas
Asegúrese de que las plantas de maíz estén en la misma etapa de crecimiento y que las secciones de la vaina se hayan obtenido del mismo nudo. Además, asegúrese de que las esporas sean viables y que los cultivos de hongos estén en la etapa óptima (por ejemplo, cultivos de no más de 2 semanas de edad para C. graminicola) para la preparación del inóculo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos y nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al USDA-NIFA por su apoyo financiero (números de subvención 2018-67013-28489 y 2020-70410-32901). Todas las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este manuscrito pertenecen exclusivamente a los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. Agradecemos a la estudiante visitante de Ciencia Sin Fronteras de Brasil, Mayara de Silva, por las imágenes que aparecen en la Figura 6A y en la Figura 7D. También reconocemos al Departamento de Patología Vegetal de la Universidad de Kentucky por proporcionar acceso a los microscopios confocales Olympus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
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