Summary
تفصل هذه المخطوطة بروتوكول التلقيح الأمثل الذي يستخدم أغماد أوراق الذرة المنفصلة للدراسات الخلوية والفسيولوجية والجزيئية القابلة للتكرار لتفاعلات الذرة مع مسببات الأمراض النباتية الفطرية. تسهل أغماد الأوراق المراقبة في الوقت الفعلي للتفاعلات الخلوية بين النبات الحي والفطريات في الأنسجة غير الثابتة.
Abstract
لقد قمنا بتحسين بروتوكول لتلقيح أغماد أوراق الذرة بالفطريات المسببة للأمراض الورقية ذاتية التغذية والميتة. تم تعديل الطريقة من طريقة تم تطبيقها في الأصل على أغلفة أوراق الأرز وتسمح بالمراقبة المجهرية المباشرة لنمو الفطريات وتطورها في الخلايا النباتية الحية. يتم تلقيح أغماد الأوراق التي يتم جمعها من شتلات الذرة مع اثنين من أطواق الأوراق الناشئة بالكامل بقطرات 20 ميكرولتر من 5 × 105 جراثيم / مل معلقات جراثيم فطرية وحضنها في غرف الرطوبة عند 23 درجة مئوية تحت ضوء الفلورسنت المستمر. بعد 24-72 ساعة ، تتم إزالة الأنسجة الزائدة بشفرة حلاقة لترك طبقة واحدة من خلايا البشرة ، وهي عينة واضحة بصريا يمكن تصويرها مباشرة دون الحاجة إلى التثبيت الكيميائي أو التطهير. تبقى الخلايا النباتية والفطرية على قيد الحياة طوال مدة التجربة ويمكن تصور التفاعلات في الوقت الفعلي. يمكن تلطيخ الأغماد أو تعريضها لانحلال البلازما لدراسة علم الخلايا النمائي وصلاحية الخلايا المضيفة والممرضة أثناء العدوى والاستعمار. يمكن تلقيح السلالات الفطرية التي تم تحويلها للتعبير عن البروتينات الفلورية أو تلقيحها بشكل مشترك على الأغماد لزيادة الدقة ولتسهيل تقييم التفاعلات التنافسية أو التآزرية. يمكن استخدام السلالات الفطرية التي تعبر عن بروتينات الاندماج الفلورية لتتبع وقياس إنتاج واستهداف هذه البروتينات الفردية في لسان النبات. يمكن استخلاص أنسجة الغلاف الملقحة لتوصيف الأحماض النووية أو البروتينات أو الأيضات. أدى استخدام مقايسات الغمد هذه إلى تقدم كبير في الدراسات التفصيلية لآليات الإمراضية الفطرية في الذرة وكذلك مستجيبات البروتين الفطري والمستقلبات الثانوية التي تساهم في الإمراضية.
Introduction
تعتبر التحليلات المكانية والزمانية على المستوى الخلوي ضرورية لفهم فسيولوجيا وعلم الخلايا للتفاعلات الفطرية النباتية. تم استخدام الأنسجة الورقية التي تم تثبيتها كيميائيا1،2،3أو تطهيرها وتلوينها4 ، وكذلك الأغشية الاصطناعية5 ، في الماضي للتحقيق في علم الخلايا لتطور مسببات الأمراض الورقية والتفاعلات الفطرية النباتية. ومع ذلك ، فإن التحقيق في أحداث العدوى في أنسجة المضيف الحي في الوقت الفعلي دون تثبيت أو إزالة يمثل تحديا بسبب المشكلات الفنية المتعلقة بإعداد عينات شفافة بصريا للتصوير.
تم تطوير بروتوكول تلقيح غمد الأوراق المنفصل في أواخر أربعينيات القرن العشرين للتحقيق المجهري الميداني الساطع لمقاومة خلايا بشرة الأرز الحية لفطر انفجار الأرز Magnaporthe oryza6. في الآونة الأخيرة ، تم تسهيل الملاحظات الجزيئية والفسيولوجية والخلوية التفصيلية لاستعمار المضيف بواسطة أنواع Colletotrichum و Magnaporthe بشكل كبير من خلال الجمع بين الإصدارات المعدلة من طريقة غمد الأوراق هذه مع المحولات الفطرية التي تعبر عن البروتينات الفلورية ، وبروتوكولات تصوير الخلايا الحية عالية الأداء ، بما في ذلك التألق والمجهر متحد البؤر7،8،9،10 ،11,12,13.
يفصل هذا البحث بروتوكول التلقيح الأمثل باستخدام أغلفة أوراق الذرة المنفصلة لمراقبة عمليات العدوى بواسطة مسببات الأمراض الفطرية الورقية والميتة. لقد استخدمناه على وجه التحديد لدراسة Colletotrichum graminicola (C. graminicola) ، العامل المسبب لآفة أوراق أنثراكنوز وتعفن الساق ، و Stenocarpella maydis ، الذي يسبب لفحة أوراق الديبلوديا وتعفن الساق. ومع ذلك ، يجب أن تكون الطريقة قابلة للتطبيق على مسببات الأمراض الفطرية الورقية الأخرى والنخرية. تتشابه الاستجابات الخلوية والفسيولوجية أثناء أحداث العدوى والاستعمار في أغماد الأوراق المستأصلة هذه مع تلك الموجودة في شفرات الأوراق بأكملها12،14،15. علاوة على ذلك ، فإن الاستعمار النصفي لخلايا البشرة الغمد بواسطة C. graminicola يشبه استعمار خلايا لب الساق16,17. تظهر الأغماد المنفصلة تزامنا أكبر واستنساخا تجريبيا لاختراق الفطريات واستعمارها مقارنة بشفرات الأوراق أو أنسجة لب الساق14،16،17،18. يمكن استخدام معظم أصناف الذرة لهذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن السلالات الداخلية أو الهجينة ذات الأصباغ الأرجوانية المفرطة في الأغماد أقل ملاءمة لأن الأصباغ تتداخل مع التصوير. كانت الذرة الحلوة في اليوبيل الذهبي مفيدة بشكل خاص لدراساتنا لأن البذور غير المعالجة متوفرة تجاريا ، والنباتات معرضة بشدة للعديد من الأمراض الورقية ، وتنمو جيدا في الدفيئة. أدت الأوبئة الأولى لتعفن ساق أنثراكنوز في الولايات المتحدة إلى فقدان إجمالي لمحاصيل الذرة الحلوة في ولاية إنديانا في سبعينيات القرن العشرين19,20. يمكن تطبيق طريقة تلقيح غمد الأوراق هذه لمراقبة نمو الفطريات وتطورها بشكل مباشر وقياسها في الخلايا النباتية الحية مقابل الخلايا النباتية المقتولة محليا ، لإظهار تفاعلات المقاومة في الاستجابات المتوافقة / غير المتوافقة للعدوى الفطرية ، واختبار التفاعلات بين السلالات الفطرية على نفس الغمد في الوقت الفعلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يظهر سير العمل الخاص بالأسلوب في الشكل 1.
الشكل 1: خطوات بروتوكول التلقيح الأمثل باستخدام أغلفة أوراق الذرة المنفصلة. يتم تمييز تحضير تعليق البوغ ، وتلقيح غمد الأوراق ، وإعداد العينة للفحص المجهري للخلايا الحية في مربعات خضراء (A) وأرجوانية (B) وبرتقالية (C) ، على التوالي. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. المواد النباتية والفطرية
- نمو النبات
- زراعة شتلات الذرة (انظر جدول المواد) في الدفيئة (14 ساعة ضوء / 27 درجة مئوية و 10 ساعات مظلمة / 22 درجة مئوية) في حاويات SC10 (انظر جدول المواد). استخدم وسط نمو يتكون من ثلاثة أجزاء من تربة تأصيص تجارية (انظر جدول المواد) وجزئين من التربة السطحية المعقمة بالبخار.
- شتلات المياه لمدة 2 دقيقة مع نظام الري العلوي مرة واحدة كل يوم ، في الصباح.
- حصاد الشتلات في مرحلة V2 عن طريق قطعها على مستوى التربة. يتم الوصول إلى مرحلة نمو V2 عندما يبلغ طول الشتلات من 5 إلى 10 سم ولها ورقتان مرئيتان من الياقات21.
- لف النباتات بمنشفة ورقية مبللة وضعها في كيس بلاستيكي لنقلها إلى المختبر لمزيد من المعالجة.
- الثقافات الفطرية
- إعادة تنشيط مزارع مخزون السيليكا الفطرية المخزنة في ظل ظروف معقمة22عن طريق رش ما يقرب من 50 حبيبة من السيليكا المصابة على وسط أجار مناسب. لتجنب التغيرات المورفولوجية وفقدان الإمراضية ، لا تزيد سلالات الثقافة الفرعية عن 3x بعد إعادة التنشيط. يستخدم أجار سكر العنب في البطاطس (PDA ؛ انظر جدول المواد) بشكل روتيني لاستزراع C. graminicola بينما يستخدم أجار الشوفان (OA ؛ انظر جدول المواد) ل S. maydis.
- لتحضير المساعد الرقمي الشخصي لزراعة المخزونات الفطرية ، قم بتعليق 19.5 جم من المساعد الرقمي الشخصي المجفف المحضر تجاريا في 500 مل من الماء منزوع الأيونات (DI). لعمل الزراعة العضوية ، قم بغلي 36 جم من الزراعة العضوية المجففة المحضرة تجاريا في ماء DI لمدة 15-30 دقيقة ، وقم بالتصفية من خلال ثلاث طبقات من القماش القطني ، وجلب الترشيح إلى 500 مل بماء DI. وسائط الأوتوكلاف للتعقيم.
- زيادة الوسائط المنصهرة والمبردة بمضاد حيوي مناسب (على سبيل المثال ، hygromycin B ، geneticin) عند العمل مع سلالات محولة. التركيزات النهائية للهيجروميسين أو الجينيتين في 500 مل من الوسائط هي 250 ميكروغرام / مل و 100 ميكروغرام / مل ، على التوالي.
- احتضان الثقافات في ظل الظروف المثلى حتى تتطور أفطورة sporulating. تنمو Colletotrichum graminicola و S. maydis بشكل جيد عند 23 درجة مئوية مع ضوء الفلورسنت المستمر ومستويات الرطوبة المحيطة. يحدث التبويض لمدة 7 أيام بعد التلقيح (داي) ل S. maydis أو 14 داي ل C. graminicola.
2. تلقيح غمد الأوراق
- تجميع وحدة مرشح الصوف الزجاجي
- استخدم مقصا أو مقصات شديدة التحمل لقطع الغطاء وحوالي 0.5 مم من القاع المخروطي لأنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل (انظر جدول المواد).
- ضع قطعة من الصوف الزجاجي (حوالي 0.5 سم × 0.5 سم ؛ انظر جدول المواد) داخل الأنبوب المقطوع لتغطية الفتحة المركزية ، كما هو موضح في الشكل 2.
- ارتد قفازات أثناء قطع الصوف الزجاجي ، لأن زجاج البورسليكات يمكن أن يسبب تهيجا.
- إعداد رفوف دعم غمد الأوراق
- قم بقطع لوحة PCR غير ذات 96 بئرا (انظر جدول المواد) إلى ستة رفوف دعم ذات عمودين (8 × 2 آبار) كما هو موضح في الشكل 3 أ.
- اقلب الرفوف ذات العمودين بحيث تكون القيعان المخروطية للآبار متجهة لأعلى وتواجه القمم المسطحة لأسفل (الشكل 3 ب).
- ضع كل دعامة في صفيحة بتري زجاجية تحتوي على ورق ترشيح مبلل وقم بتغطيتها بالغطاء (انظر جدول المواد). تعمل هذه الوحدة كغرفة رطوبة صغيرة للأغماد.
- إعداد اللقاح
- لكل سلالة فطرية ، ضع وحدة مرشح واحدة مجمعة من الصوف الزجاجي في أنبوب طرد مركزي معقم سليم سعة 1.5 مل كما هو موضح في الشكل 2. هذا الأخير يعمل كأنبوب جمع.
- قم بتسمية الأنابيب.
- احصد الكونيديا من الثقافات المبوضة عن طريق إغراق كل طبق أولا ب 3-4 مل من ماء DI المعقم. قد يكون من الضروري المزيد من الماء في بعض الحالات لإنتاج طبقة من السائل على سطح المستعمرة. عوامل الترطيب ليست ضرورية في هذا النظام.
- قم بفك الجراثيم من الآجار باستخدام مدقة معقمة مخروطية الطرف (انظر جدول المواد) لكشطها بالتساوي عبر اللوحة بأكملها.
- ضع 1 مل من معلق البوغ على وحدة مرشح من الصوف الزجاجي بشكل معقم واترك الجراثيم تتدفق إلى أنبوب التجميع عن طريق الجاذبية.
- أجهزة الطرد المركزي أنابيب التجميع التي تحتوي على معلقات البوغ المفلترة عند 3500 × جم لمدة 5 دقائق. يجب تكوير الجراثيم في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
ملاحظة: تؤدي جراثيم C. graminicola بالطرد المركزي بسرعات أعلى من الموصى بها هنا إلى فقدان كبير للحياة. - اسكب السائل في وعاء قابل للتعقيم ، وأضف 1 مل من ماء DI المعقم ، وحركه برفق لإعادة تعليق الجراثيم المحببة. أجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.3.6.
- اغسل الجراثيم 3x لإزالة أي مصفوفة مخروطية قد تحتوي على مثبطات ذاتية قد تقلل من الإنبات أو الاختراق.
- بعد الغسيل الثالث ، أضف 300-500 ميكرولتر من ماء DI المعقم لإعادة تعليق الجراثيم للقياس الكمي.
- استخدم مقياس الدم تحت المجهر المركب عند تكبير 100x لتحديد تركيز البوغ. بوغ تلطيخ ليست ضرورية قبل العد.
- قم بإعداد معلق 5 × 105 جراثيم / مل بماء DI معقم.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بتعليق بوغ C. graminicola في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 4 ساعات قبل الفقدان السريع للصلاحية. تبريد كونيديا لا يزيد من الجدوى.
- التطعيمات غمد
- تحقق من ممارسات وإجراءات السلامة الأحيائية ذات الصلة قبل تلقيح النباتات بالسلالات الفطرية.
- قم بإزالة الغمد من الورقة الحقيقية الأولى لشتلات V2 عن طريق تشغيل صورة مصغرة على طول الهامش المتداخل للغمد ، وقم بفكها برفق من اللقطة. قم بفك الغمد من جانبي اللقطة قبل محاولة إزالته.
- قطع أغلفة الأوراق المستردة إلى شرائح 3-5 سم. ليس من الضروري تطهير الأغماد قبل التلقيح.
- قم بفك كل جزء برفق شديد لكشف طبقة البشرة الداخلية (المحورية).
- أثناء تحضير الأغماد للتلقيح ، احتفظ بالأغماد المستأصلة المتبقية ملفوفة بمنشفة ورقية مبللة لتجنب الجفاف.
- ضع 20 ميكرولتر من معلق البوغ الفطري على السطح الداخلي في مركز قطعة الغمد، فوق الضلع الأوسط مباشرة، كما هو موضح في الشكل 4.
- ضع أغلفة الأوراق الملقحة أفقيا ، مع وضع الضلع الأوسط في الأسفل ، في الدعامة داخل صفيحة بتري زجاجية تحتوي على ورق ترشيح مبلل كما هو موضح في الشكل 5.
- كل رف يحمل ما يصل إلى سبعة أغماد. تلقيح ما لا يقل عن خمسة أغماد لكل سلالة للتعويض عن فقدان النسخ المتماثلة التي قد تحدث أثناء تحضير العينة أو الحضانة.
- ضع غرف الرطوبة الصغيرة في صندوق تخزين شفاف مبطن بورق إنبات مبلل (انظر جدول المواد).
- غطي الصندوق بالغطاء. احتضان الصندوق عند 23 درجة مئوية مع إضاءة مستمرة للدورة الزمنية المقصودة ، والتي تعتمد على الفطريات وعلى مراحل تطور الفطريات التي سيتم ملاحظتها. ويرد في الجدول 1 ملخص للدورة الزمنية لأغماد الذرة الملقحة ب C. graminicola.
- تحقق كل يوم من علامات / أعراض المرض على الأغماد وحافظ على رطوبة كل من أوراق الإنبات والترشيح. يمكن الاحتفاظ بأغلفة الأوراق لمدة تصل إلى 6 أيام دون موت واضح للخلايا النباتية أو تدهورها في حالة عدم وجود تلقيح.
الشكل 2: تحضير وحدة مرشح الصوف الزجاجي. (أ) توضع كرة من الصوف الزجاجي مقاس 0.5 سم × 0.5 سم داخل أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1 الذي تمت إزالة قاعه المخروطي. (ب-ج) ثم يتم وضع أنبوب المرشح في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 2 لإنشاء وحدة مرشح مجمعة لإعداد تعليق البوغ. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: طريقة قطع لوحة PCR غير ذات 96 بئرا. (أ) لوحة PCR مقطعة إلى ستة رفوف دعم ، 8 × 2 آبار. مثال على دعامة غمد واحدة موضح في (ب). يتم وضع أغماد الأوراق أفقيا على الدعم. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: طريقة تلقيح الغمد. قطرة واحدة من اللقاح تطبق مباشرة على السطح المحوري لقسم الغمد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: طريقة حضانة الغمد. أغماد الأوراق الملقحة موضوعة أفقيا في رف دعم داخل صفيحة بتري زجاجية تحتوي على ورق ترشيح مبلل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. مجهر الخلية الحية
- تحضير العينة للفحص المجهري
- اشطف قطع الغمد برفق بماء DI المعقم لإزالة أي جراثيم غير ملتصقة أو نمو فطري سطحي.
- ضع الغمد على شريحة مجهر زجاجية نظيفة (انظر جدول المواد) بحيث يكون السطح المحوري (الداخلي) لقطعة الغمد متجها لأسفل والسطح المحوري (الخارجي) في الأعلى.
- استخدم شفرة حلاقة جديدة أحادية الحافة (انظر جدول المواد) لتقليم حوالي 1 سم من أطراف الغمد وإزالة معظم أنسجة الصفيحة على جانبي الضلع الأوسط.
- أمسك شفرة الحلاقة بزاوية 90 درجة بالنسبة للغمد لحلق الأنسجة من الضلع الأوسط المحوري وكشف طبقة البشرة على السطح المحوري فوق البقعة الملقحة. حاول الحفاظ على سمك موحد. بمجرد حلق أغلفة الأوراق ، لا ينصح بمزيد من التشذيب لأن ذلك قد يتلف العينة.
- تأكد من أن حجم المقاطع المحلوقة لا يزيد عن 1 سم × 1 سم. تجنب الضغط على مركز الغمد أثناء هذه العملية. عند العمل مع الأغماد الملقحة بمعلقات بوغ مختلفة ، قم بتطهير القفازات وتغيير شفرة الحلاقة بين العينات.
- حافظ على شريحة مجهر زجاجي نظيف جاهزة. ارفع قسم الغلاف من حافة واحدة وانقله بعناية إلى شريحة جديدة. يجب أن يكون السطح الملقح (المحوري) للغمد أعلى ، أقرب إلى العدسة الموضوعية. قم بتركيب المقاطع برفق لتجنب تلف الهياكل الفطرية.
- ضع 60 ميكرولتر من ماء DI المعقم على القسم وأضف غطاء زجاجي مقاس 24 مم × 60 مم (انظر جدول المواد). افعل ذلك ببطء لتجنب فقاعات الهواء.
- عندما تكون جاهزا للفحص المجهري ، أغلق الغطاء بطلاء أظافر شفاف (انظر جدول المواد) عن طريق وضع قطرة صغيرة على كل حافة ثم توصيل القطرات معا بفرشاة طلاء الأظافر لعمل ختم سلس.
ملاحظة: يمكن استخدام بروتوكول الغمد هذا مع البقع الخلوية ، على سبيل المثال ، 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، أو الأحمر المحايد ، أو التريبان الأزرق ، أو لمراقبة انحلال البلازما الخلوي لتقييم صلاحية الخلايا النباتية. لتلطيخ الغمد أو مقايسات انحلال البلازما الخلوي ، لا تغلق الغطاء. - بالنسبة لمقايسات انحلال البلازما ، أضف محلولا مفرط التوتر (0.75 M سكروز أو 1 M كلوريد الصوديوم) إلى حافة واحدة من غطاء الغطاء واستخدم مناديل ورقية مطوية خالية من النسالة لسحب المحلول عبر العينة إلى الحافة الأخرى من غطاء الغطاء. للتلطيخ ، استخدم طريقة مماثلة لتطبيق محلول البقع.
- الفحص المجهري واسع المجال
- بمجرد تركيب أغلفة الأوراق على شرائح المجهر ، افحصها بحثا عن الاستعمار الفطري باستخدام مجهر ضوئي واسع المجال بتكبير 400x.
- لمراقبة الهياكل الفطرية بالتفصيل ، استخدم هدف الغمر في الماء بدلا من الزيت للحصول على جودة صورة أفضل للعينات. قد يؤدي الانحراف الكروي الناتج عن عدم تطابق معامل الانكسار إلى تدهور الصورة. أهداف المياه متاحة للمجاهر الضوئية واسعة المجال وكذلك المجاهر متحدة البؤر.
- لتحديد الكمية النسبية للاستعمار لكل غمد ، احسب عدد خلايا الذرة التي تم غزوها من كل موقع اختراق فطري باستخدام مجهر ضوئي واسع المجال عند تكبير 100x. هذا القياس الكمي هو خطوة فحص مناسبة قبل أي تحليلات إحصائية تقارن السلالات والعلاجات و / أو مراحل النمو.
- مجهر المسح بالليزر متحد البؤر
- لمراقبة البروتينات الفلورية في أنسجة الذرة أثناء تطور السلالات الفطرية المعدلة وراثيا ، اضبط المعلمات الأساسية لاكتساب الصورة. حدد أفضل إعدادات الإثارة/الانبعاث بناء على علامة الفلورسنت المحددة.
ملاحظة: يفضل استخدام هدف مائي 60 ضعفا عند تحليل عمليات الاندماج الفلورية التي تم إنشاؤها باستخدام البروتينات المفرزة. تحتوي المجاهر الحديثة متحدة البؤر على أهداف غمر الماء المصححة للغاية لتجنب القطع الأثرية وانحرافات الشكل. - إذا كان تصوير الخلايا الحية للبروتينات الفلورية مقصودا ، فاستخدم السلالات الفطرية غير المحولة كعناصر تحكم للتألق الذاتي. استخدم معلمات الحصول على الصور التالية لالتقاط ديناميكيات المضيف الفطري على مجهر متحد البؤر مقلوب ولبروتين الفلورسنت mCherry . اضبط طاقة الليزر حتى 5٪ ، 450-600 جهد عالي (HV) اعتمادا على مستوى التعبير ، كسب 1.375 X ، إزاحة 3٪ ، عامل تكبير بصري 1 لتحليل ما يصل إلى خمس خلايا ذرة لكل قسم ، وعامل تكبير بصري من 2-5 للخيوط الفردية.
ملاحظة: توفر الصور البؤرية عالية الدقة Z-stack بيانات ثلاثية الأبعاد ورؤية أفضل للتفاعلات في الوقت الفعلي بين المضيف والممرض. - لتحديد شدة التألق المقابلة لبروتينات الاندماج المفرزة ، استخدم برنامج تحليل الصور من الشركة المصنعة متحدة البؤر أو برنامج معالجة الصور مثل ImageJ ، والذي يمكن تنزيله مجانا عبر الإنترنت. راجع دليلا للحصول على تفاصيل حول كيفية تحديد إشارات الفلورسنت وفقا لذلك.
- لمراقبة البروتينات الفلورية في أنسجة الذرة أثناء تطور السلالات الفطرية المعدلة وراثيا ، اضبط المعلمات الأساسية لاكتساب الصورة. حدد أفضل إعدادات الإثارة/الانبعاث بناء على علامة الفلورسنت المحددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصف الأمثلة أدناه النتائج التمثيلية بعد استخدام طريقة تلقيح غمد أوراق الذرة. توضح هذه الأمثلة السهولة والسرعة والدقة التي يمكن من خلالها تحقيق الملاحظة والمقارنة بين تفاعلات الذرة والفطريات في الوقت الفعلي باستخدام هذا الفحص الأمثل. يسمح تصوير الخلايا الحية أيضا باستخراج المعلومات الكمية ، مما يوفر أداة مفيدة للدراسات الجزيئية والخلوية والفسيولوجية المقارنة. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل في المنشورات الأصلية المذكورة لكل طلب ناجح.
مثال على البيانات 1: استخدام التلوين وانحلال البلازما في أغماد الأوراق الملقحة لتقييم الحالة الفطرية والكشف عن استجابات النبات للعدوى الفطرية
وقد استخدمت أغماد أوراق الذرة لتصور ومقارنة عمليات العدوى ببكتيريا Colletotrichum graminicola و Stenocarpella maydis في الخلايا المضيفة الحية باستخدام المجهر الميداني الساطع، مما يسمح بوصف مفصل لأنماط الاستعمار والدورات الزمنية (النتائج غير المنشورة؛ والنتائج غير المنشورة). الشكل 6).
كشفت هذه الدراسات أن S. maydis يغزو خلايا البشرة بسرعة مباشرة عن طريق تورمات hyphal غير متمايزة ، على عكس C. graminicola التي تنتج appressoria الميلانينية. بمجرد دخول خلايا البشرة ، ينتقل كلا ممرضي الأمراض من خلية إلى أخرى عن طريق المرور عبر جدران الخلايا السليمة على ما يبدو (الشكل 6 أ ، ب).
يمكن تلطيخ الأغماد باللون الأزرق المثقب أو DAPI لتقييم طبيعة ومدى استعمار الخيوط الفطرية بسهولة أكبر (الشكل 6). يكشف تلطيخ تريبان الأزرق أن C. graminicola يغزو في البداية عبر خيوط أولية سميكة تنتقل بين الخلايا عبر وصلات ضيقة جدا. في وقت لاحق ، يتحول الفطر إلى مرحلة نخرية التغذية ، مما ينتج عنه خيوط ثانوية أرق في وسط المستعمرة (الشكل 6 C-E) 12،14،16،17.
الشكل 6: أغماد أوراق الذرة الملقحة غير الملطخة أو الملطخة المصورة بالمجهر الساطع أو التألق. (أ) الخيوط داخل الخلايا بعد 48 ساعة من التلقيح (hpi ) مع Stenocarpella maydis. تحدث العدوى عن طريق أطراف hyphal منتفخة قليلا (السهم). ب: الواصلة داخل الخلايا 48 hpi مع Colletotrichum graminicola. تحدث العدوى عن طريق الضغط الميلاني (الأسهم). (ج ) خيوط C. graminicola ، ملطخة بأزرق التريبان ، تتقدم من خلية إلى خلية عند حافة المستعمرة المتقدمة عبر وصلات ضيقة (سهم) ، 72 hpi. (د) رؤية أقرب للخيوط المطبوغة باللون الأزرق المثقب ل C. graminicola عند 72 hpi ، مرورا بجدار خلية الذرة عبر وصلة ضيقة (سهم). (ه) خيوط C. graminicola ، ملطخة بالتريبان الأزرق ، في مركز المستعمرة 72 hpi. يمكن رؤية خيوط ثانوية أضيق تخرج من الخيوط الأولية الأكثر سمكا (الأسهم). (F) خيوط C. graminicola 72 hpi ، عند حافة المستعمرة المتقدمة على غمد ورقة ملطخة ب DAPI. تتألق النوى الفطرية والنباتية الملطخة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قضبان المقياس في كل لوحة تساوي 50 ميكرومتر. الصور المجهرية التي تم الحصول عليها باستخدام كاميرا رقمية أحادية اللون مقترنة بمجهر epifluorescence. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمكن تلطيخ الأغماد باللون الأحمر المحايد و / أو تعريضها لانحلال البلازما لدراسة علم الخلايا التنموي وصلاحية خلايا الذرة أثناء العدوى والاستعمار بواسطة الفطريات المسببة للأمراض (الشكل 7).
Colletotrichum graminicola هو فطر نصف التغذية يغزو خلايا الذرة الحية ذات الخيوط الأولية السميكة التي يتم فصلها عن السيتوبلازم المضيف بواسطة غشاء (الشكل 7A-C)12،14،16،17. Stenocarpella maydis ، من ناحية أخرى ، هو فطر ينتج توكسيننباتي 23 ويقتل خلايا البشرة (التي تصبح حبيبية وتفشل في تحلل البلازما) قبل أن تغزوها (الشكل 7 د).
يتضمن دفاع الذرة ضد C. graminicola ومسببات الأمراض الورقية الأخرى تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وخاصة بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O2)12,15. للتحقيق في الكيمياء المؤكسدة للتفاعلات بين مسببات الأمراض النباتية ، يمكن استخدام 3،3-ديامينوبنزيدين (DAB) لتلطيخ الخلايا24. يتأكسد DAB بواسطة H 2O2 ، مما ينتج عنه راسب بني غامق مرئي في أغلفة أوراق الذرة (الشكل 7 E ، F) 12,24. إنتاج الصباغ هو مؤشر على انفجار مؤكسد مرتبط باستجابة مقاومة المضيف.
الشكل 7: أغماد أوراق الذرة الملقحة الملقحة و/أو المحللة بالبلازما المصورة بالمجهر الميداني الساطع. (أ) غمد الأوراق الملقح ب C. graminicola 24 hpi ويتعرض لانحلال البلازما وتلطيخ باللون الأحمر المحايد. خلايا الذرة الحية تحت appressoria (السهام) البلازما وتلطيخ ، مما يدل على أن العامل الممرض لا يقتل الخلايا قبل الغزو. (ب) غمد الورقة 48 hpi مع C. graminicola ، يتعرض لانحلال البلازما وتلطيخ باللون الأحمر المحايد. لا تزال خلايا الذرة التي تستعمرها خيوط أولية (سهم) على قيد الحياة ، مما يثبت أن C. graminicola يغزو الخلايا كتغذية حيوية. (ج) غمد الورقة 48 hpi مع C. graminicola ، يظهر خيوط تتحرك من خلية إلى خلية عند الحافة المتقدمة للمستعمرة. تم تحلل الأغماد ولكن لم يتم تلطيخها. تستمر الخلايا غير المستعمرة المجاورة لحافة المستعمرة (الأسهم) في التحلل البلازما. (د) غمد الورقة 24 hpi مع S. maydis ، قبل الاختراق. تظهر الخلايا الموجودة أسفل البوغ النابتة (السهم) محببة وتفشل في التحلل ، مما يشير إلى أن S. maydis يقتلها قبل الاختراق وأنه يتصرف على أنه نخر التغذية. (ه) غمد ورقة الذرة المقاومة الفطرية Mp305 24 hpi مع C. graminicola وملطخة ب DAB. يشير التلوين الداكن إلى استجابة مؤكسدة قوية للخلية المفردة في وسط الصورة ، بينما يمكن رؤية هالات من الصباغ البني تحيط بمعظم الضغط الفردي ، ويمكن ملاحظة التحبيب في الخلايا الموجودة أعلى الصورة. (F) رؤية أقرب لهالات الصباغ البني المتراكمة حول appressoria ، وترسب الصبغة في جدران خلايا الذرة القريبة (الأسهم). قضبان المقياس في كل لوحة تساوي 50 ميكرومتر ، باستثناء (F) التي تبلغ 20 ميكرومتر. الصور المجهرية التي تم الحصول عليها باستخدام كاميرا رقمية أحادية اللون مقترنة بمجهر epifluorescence. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مثال على البيانات 2: تصوير الخلايا الحية بالفطريات التي تعبر عن البروتينات الفلورية
يمكن تصور خيوط فطرية تعبر عن بروتينات الفلورسنت السيتوبلازمية بدقة عالية في خلايا الغلاف الحية دون الحاجة إلى أي بقع باستخدام ميكروسكوب فوق فلوري أو مجهر متحد البؤر (الشكل 8).
يمكن استهداف البروتينات الفلورية لمختلف العضيات الفطرية ، على سبيل المثال ، الميتوكوندريا أو النوى أو نظام الغشاء الداخلي ، من أجل تتبع مواقعها وأنشطتها في الخلايا الفطرية الحية في النبات (الشكل 8C)25،26،27،28 (نتائج غير منشورة). يمكن أيضا تشغيل البروتينات الفلورية بواسطة محفزات فطرية مختلفة للعمل كمراسلين لوظائف مختلفة: على سبيل المثال ، يتم عرض RFP المدفوع ببروتين استجابة إجهاد إفراز BiP chaperone (الشكل 8D)29 (نتائج غير منشورة). يتيح استخدام أغلفة الأوراق تصور بروتينات الاندماج الفلورية الموسومة بشكل فردي والتي تتراكم وتفرزها خيوط فطرية لأنها تستعمر الخلايا المضيفة 8,9 (الشكل 8E). تتوفر أيضا خطوط الذرة المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية التي تستهدف مختلف المقصورات الخلوية ، على سبيل المثال ، النوى أو غشاء البلازما ،30،31 ، ويمكن استخدامها للتلقيح لتقييم آثار العدوى على الهياكل الخلوية للذرة مثل النوى. أظهر استخدام خطوط الذرة المعدلة وراثيا هذه أن النوى في خلايا الذرة غير الغازية تهاجر عادة إلى جدار الخلية الأقرب إلى الخلايا التي استعمرتها بالفعل C. graminicola (نتائج غير منشورة; الشكل 8F).
الشكل 8: تصوير التألق (أ ، ب) أو التصوير البؤري (C ، D ، E ، F) ل Colletotrichum graminicola الذي يعبر عن البروتينات الفلورية. (أ) غمد أوراق غير ملطخ ومتحلل بالبلازما 48 hpi مع سلالة C. graminicola التي تعبر عن mRFP السيتوبلازم تحت سيطرة مروج ToxA34. ويلاحظ أيضا تألق ذاتي كبير في أغماد الأوراق هذه. (ب) غمد الأوراق غير الملوث 48 hpi مع سلالة C. graminicola التي تعبر عن SGFP السيتوبلازميا تحت سيطرة مروج ToxA. (ج) Colletotrichum graminicola معبرا عن SGFP يستهدف نظام الغشاء الداخلي مع مرساة HDEL35. (د) غمد الأوراق غير الملوث 24 hpi مع تحويل C. graminicola مع mRFP تحت سيطرة المروج لمتماثل C. graminicola لمرافق BiP. التألق الأحمر في الخيوط الأولية هو مؤشر على تنشيط BiP استجابة لإجهاد الإفراز. (ه) تراكم أرابينوفورانوسيداز::mCherry Fusion protein في الخيوط الأولية C. graminicola WT التي تعبر جدار خلية غمد أوراق الذرة عند 44 hpi. (F) غمد ورقة لخط ذرة معدل وراثيا يعبر عن YFP يستهدف نوى النبات30،31 ، 48 hpi مع سلالة من C. graminicola تعبر عن mRFP السيتوبلازميا تحت سيطرة مروج ToxA. أشرطة المقياس في كل لوحة تساوي 20 ميكرومتر ، باستثناء اللوحة A حيث تساوي 50 ميكرومتر. تم الحصول على الصور المجهرية باستخدام كاميرا رقمية أحادية اللون مقترنة بمجهر فوق التألق. تم التقاط الصور في (C-F) باستخدام مجهر المسح البؤري بالليزر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مثال على البيانات 3: استخدام أغماد أوراق الذرة لفحص علم الخلايا التفصيلي للاستجابات والتفاعلات المتوافقة / غير المتوافقة بين السلالات الفطرية
تمت مقارنة سلالة C. graminicola الطافرة غير المسببة للأمراض (cpr1 MT) مع سلالة النوع البري (WT) في أغلفة أوراق الذرة (الشكل 9A ، B) 12.
أظهر تصوير الخلايا الحية للسلالات الموسومة ببروتينات الفلورسنت السيتوبلازمية أن الطافر كان ضعيفا على وجه التحديد في الحركة من خلية إلى أخرى داخل أغماد أوراق الذرة. مكن بروتوكول الغمد من القياس الكمي الدقيق الذي كشف أن cpr1 MT كان محصورا في الخلية المستعمرة الأولى بنسبة 95٪ من الوقت (الشكل 9C) 12. كان هذا في تناقض ملحوظ مع WT ، حيث بقي أقل من 5٪ من الإصابات داخل الخلية المستعمرة الأولى في نفس الإطار الزمني12. ومن المثير للاهتمام ، أن cpr1 MT كان قادرا على النمو بشكل وقائي خارج الخلية الأولى المصابة في البداية في الأغماد المقتولة بالتجميد محليا ، مثل سلالة WT (الشكل 9D). وهذا يشير إلى أن عدم قدرة cpr1 MT على الاستعمار كان مرتبطا على وجه التحديد بالاستجابة النشطة لخلية الذرة الحية.
تم استخدام مقايسة تلقيح غمد الأوراق لاختبار التفاعلات بين سلالات GPR 1 MT المعبرة عن GFP وسلالات WT المعبرة عن RFP عن طريق تلقيحها على نفس غمد الورقة12. عندما تم تلقيح السلالات بالقرب من بعضها البعض (لا يزيد عن 8 خلايا ذرة) ، كان cpr1 MT قادرا على النمو بشكل طبيعي كتغذية حيوية من خلية إلى أخرى (الشكل 9E ، F). أكدت مقايسات انحلال البلازما أن فطر cpr1 MT دخل الخلايا الحية12. كل هذه الملاحظات التفصيلية أصبحت ممكنة من خلال مقايسات الغمد وضمنا وجود عامل قابل للانتشار يحفز التوافق الناتج عن سلالة WT من C. graminicola ولكنه يفتقر إلى cpr1 MT12.
الشكل 9: التفاعلات المتوافقة وغير المتوافقة التي تتضمن سلالات WT و cpr1 MT من Colletotrichum graminicola. سمح استخدام بروتينات فلورية مختلفة بتمييز السلالتين عند تلقيحهما على أغماد أوراق الذرة12. (أ) سلالة WT C. graminicola التي تعبر عن mRFP السيتوبلازمي في أغلفة أوراق الذرة عند 48 hpi. (ب) سلالة C. graminicola cpr1 MT التي تعبر عن SGFP في أغلفة أوراق الذرة عند 72 hpi. نادرا ما يستعمر cpr1 MT (<5٪ من الوقت) خارج الخلية المصابة الأولى ، حتى بعد 6 أيام من التلقيح. (ج) رؤية أقرب لسلالة C. graminicola cpr1 MT التي تعبر عن SGFP عند 72 نقطة في البوصة. في هذه الحالة ، تمكنت من عبور جدار الخلية إلى الخلية التالية ، لكنها توقفت عن التطور. (د) سلالة C. graminicola cpr1 MT التي تعبر عن SGFP ، 48 hpi في أنسجة الغمد المقتولة. تستعمر سلالة cpr1 MT خلايا غمد الذرة غير الحية بسرعة ، على غرار WT. (ه) عندما يتم تلقيح سلالات WT-mRFP C. graminicola و cpr1 MT-GFP C. GRAMINICOLA بالقرب من بعضها البعض على أغماد أوراق الذرة (48 hpi) ، تستعيد سلالة cpr1 MT-GFP القدرة على التقدم من خلال خلايا غمد الذرة الحية بشكل طبيعي ، كتغذية حيوية. تم تأكيد النمو الحيوي داخل الخلايا الحية عن طريق مقايسات انحلال البلازما. (F) نظرة أقرب لسلالة C. graminicola cpr1 MT التي تعبر عن SGFP ، والتي تنمو من خلية إلى أخرى عند تلقيحها بجوار WT (لا تزيد عن 8 خلايا ذرة). أشرطة المقياس تساوي 50 ميكرومتر (A و B و E) أو 20 ميكرومتر (C و D و F). تم الحصول على الصور المجهرية باستخدام كاميرا رقمية أحادية اللون مقترنة بمجهر فوق التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كما تم استخدام الأغماد الملقحة لإنتاج أنسجة لاستخراج الحمض النووي الريبي لتحليل نشاط النسخ32,33. كانت الأغماد مثالية لهذا الغرض حيث يمكن فحصها قبل الاستخراج لمراقبة عملية العدوى ، وبالتالي ضمان توحيد العينة عبر عمليات النسخ المتماثلة المتعددة. سمحت هذه الدراسات بتحديد موجات الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بين مراحل انتقال نمط حياة Colletotrichum 32,33.
مثال على البيانات 4: نتائج التجارب دون المستوى الأمثل
قد يكون تصوير الخلايا الحية غير المرضي نتيجة لعدم كفاية تقليم أغماد الأوراق ، مما يؤدي إلى تداخل طبقات خلايا البشرة وعينات معتمة بصريا (الشكل 10).
الشكل 10: نتائج تجريبية دون المستوى الأمثل بسبب عدم كفاية تقليم أغلفة الأوراق. أ) مثال على طبقات خلايا البشرة المتعددة التي تتداخل مع فحص تطور الفطريات فيالجسم الحي. ب: مثال على طبقات الخلايا المتداخلة التي تؤثر على تصوير الخلايا الحية. قضبان مقياس تساوي 20 ميكرومتر. تم الحصول على الصور المجهرية باستخدام كاميرا رقمية أحادية اللون مقترنة بمجهر فوق التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نتيجة تجربة أخرى محتملة دون المستوى الأمثل هي تركيز اللقاح غير المعدل الذي قد يؤدي إلى انخفاض (الشكل 11 أ) أو ارتفاع أعداد الجراثيم: قد يؤدي الأخير إلى انخفاض الإنبات أو الاختراق القمعي (الشكل 11 ب). هذا الأخير يمكن أن يعيق أيضا القياس الكمي لخلايا الذرة المستعمرة في كل موقع اختراق فطري.
الشكل 11: نتائج التجربة دون المستوى الأمثل بسبب تركيز اللقاح المعدل بشكل غير صحيح . أ. انخفاض تركيز معلق بوغ C. graminicola الملقح على الأغماد مما أدى إلى انخفاض عدد مواقع اختراق الفطريات. ب. ارتفاع تركيز لقاح C. graminicola على أغماد الأوراق مما تسبب في ضغط متعدد على مقربة ، وتقليل تغلغل الخلايا المضيفة. قضبان مقياس تساوي 20 ميكرومتر. تم الحصول على الصور المجهرية باستخدام كاميرا رقمية أحادية اللون مقترنة بمجهر فوق التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وقت المراقبة المجهرية (hpi) | المرحلة التنموية لتلقيح C. graminicola على أغماد أوراق الذرة |
| 12 | أببريسوريا |
| 24 | خيوط أولية |
| 36 | خيوط ثانوية |
| 48 | خيوط ثانوية |
| 60 | أسيرفولي |
| 72 | أسيرفولي |
| 108 | أسيرفولي |
الجدول 1: الدورة الزمنية لعدوى Colletotrichum graminicola : ملخص الدورة الزمنية لأغلفة أوراق الذرة الملقحة بسلالة C. graminicola M1.001 بناء على معالم تطور الفطريات طوال فترة انتقال نمط الحياة. تم إجراء الملاحظات المجهرية كل 12 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تعديل طريقة تلقيح غمد الأوراق المحسنة الموصوفة هنا من بروتوكول أصلي تم تطويره وتم تطبيقه على أغلفة أوراق الأرز6،8،36. يسمح بملاحظات مباشرة ومفصلة لنمو الفطريات وتطورها في الخلايا النباتية الحية إما بالمجهر واسع المجال أو متحد البؤر. البروتوكول مناسب لتوصيف ومقارنة وقياس مجموعة متنوعة من الظواهر المجهرية أثناء استعمار الذرة ، بما في ذلك تطور الفطريات واستجابات المضيف أثناء التفاعلات المتوافقة مقابل التفاعلات غير المتوافقة. إنتاج وإفراز بروتينات فطرية محددة في الموز ؛ وعلم الخلايا والكيمياء الحيوية لعوامل الإمراض الشائعة أو الجديدة الناتجة أثناء تفاعل الذرة والفطريات. لقد استخدمنا هذه الطريقة مع مسببات الأمراض المنفية والميتة للذرة. لم نحاول التطعيم بمسببات الأمراض الحيوية (مثل فطريات الصدأ) ولكن الأغماد ، لأنها لا تزال حية ، ستكون مفيدة أيضا لهذا التطبيق. لقد طبقنا هذه الطريقة أيضا على أغلفة الذرة الرفيعة للتحقيق في علم الخلايا للمقاومة الخاصة بالمضيف والصنف 7,37. بالنسبة لأغلفة الذرة الرفيعة ، كان التعديل الوحيد للبروتوكول هو ملء الغمد بأكمله بتعليق البوغ ، بدلا من وضع قطرة واحدة في المنتصف. كان هذا ضروريا بسبب القطر الأصغر لأغلفة الذرة الرفيعة.
أدى استخدام مقايسات الغمد هذه إلى تقدم كبير في دراساتنا التفصيلية حول آليات استعمار المضيف والجزيئات الفطرية التي تعتبر ضرورية للإمراضية. فعلى سبيل المثال، أظهر تطبيق الطريقة التعرف غير المضيف على C. sublineola بواسطة الذرة، وعلى C. graminicola بواسطة الذرة الرفيعة، بما في ذلك استجابات المقاومة شديدة الحساسية في كلتا الحالتين7. كما تم استخدام أغماد أوراق الذرة لاختبار التفاعلات بين السلالات الفطرية على مسافة على نفس الغمد. في هذه الحالة ، أظهر التلقيح المشترك لسلالة WT المسببة للأمراض وسلالة cpr1 MT غير المسببة للأمراض معا على الأغماد الحية تحريض حساسية خلايا الذرة بواسطة سلالة WT وقدم دليلا على وجود عامل منتشر متورط في الإمراضية12. سمحت الأغماد بتمايز السلالتين اللتين تعبران عن بروتينات فلورية مختلفة ، والقياس الكمي والمقارنات الإحصائية لعملية الاستعمار للسلالات الملقحة إما بمفردها أو معا.
يتميز اختبار غمد أوراق الذرة هذا بالعديد من المزايا مقارنة بتلقيحات النبات بالكامل لتصوير الخلايا الحية. أولا ، يوفر البروتوكول تصويرا فائقا ، دون الحاجة إلى إزالة أو تثبيت ، لمسببات الأمراض التي تتفاعل مع الخلايا المضيفة الحية في الوقت الفعلي. على سبيل المثال ، مكنت الدراسات التي استخدمت أغماد أوراق الذرة من اكتشاف تحول متميز من التغذية الحيوية إلى التغذية النخرية في C. graminicola نصف التغذية وسهلت المقارنات الوظيفية مع طفرة غير مسببة للأمراض7،12،16،17. على الرغم من أن أغماد أوراق الأرز المستأصلة الملقحة ب M. oryzae يمكن أن تظهر أعراضا لا تتوافق مع تلك التي لوحظت في نباتات الأرز الكاملة36 ، فإن توقيت وظهور الاستعمار وانهيار الأنسجة وتطور الآفة في أغلفة الذرة مشابه لتلك الموجودة في الأوراق الكاملة12,14. الميزة الثانية لفحص الغمد هي أنه يظهر تزامنا أكبر عبر النسخ المتماثلة والتكاثر التجريبي للاستعمار الفطري12,18. في حين أن تلقيح النبات الكامل يمكن أن يؤدي إلى مستويات غير منتظمة من اختراق الفطريات18 ، فإن الظروف الأكثر تحكما في تلقيح الغمد توفر مزيدا من التزامن وتسمح بإجراء تحقيق أكثر دقة وتحديد كمية للتفاعلات. سهل هذا التزامن المتزايد استخدام الأغماد في تحليلات النسخ32,33. علاوة على ذلك ، مكن بروتوكول الغمد من السرعة اللازمة لإعداد العينة لتحليل النسخ: لم يستغرق التشذيب والشطف والفحص كل غمد أكثر من 2 دقيقة قبل أن يتم تجميدها لاستخراج الحمض النووي الريبي32,33.
تتضمن الخطوات الحاسمة لتصوير الخلايا الحية الناجح للعدوى ما يلي: 1) يجب استخدام الأغماد مباشرة بعد القطع لإجراء التجارب. لا ينبغي الاحتفاظ بالأغماد الملقحة المستأصلة لأكثر من 6 أيام: إذا كان الاستعمار الفطري ثقيلا ، فسوف يتحلل بسرعةأكبر 12 ؛ 2) احرص على اختيار الأغماد التي هي من نفس العمر التنموي لضمان المزيد من النتائج القابلة للتكرار ؛ 3) استخدم معلقا جديدا للجراثيم من الثقافات التي حققت أقصى قدر من التبويض ؛ 4) استخدم شفرات حلاقة حادة لتشذيب أكثر كفاءة لإنتاج عينات واضحة بصريا ؛ 5) تقليل التلاعب المفرط وغير الضروري للعينات لأن هذه العملية يمكن أن تؤثر سلبا على الهياكل الحية وجودة الصورة ؛ 6) افحص غرف الرطوبة يوميا للتأكد من أن ورق الترشيح رطب بدرجة كافية ؛ و 7) عند تصوير العينات على مجهر متحد البؤر ، حافظ على إعدادات الاكتساب ثابتة أثناء التجربة لتجنب إدخال تغييرات في الشدة أو التحيز عند مقارنة إشارات الفلورسنت عبر العينات. قد تبيض البروتينات الفلورية ضوئيا إذا كانت كثافة الليزر ومدته عالية جدا ، وقد تعطي إشارات أضعف إذا تم الاحتفاظ بأقسام الأنسجة تحت غطاء مغلق لفترة طويلة. يجب إجراء التجارب الأولية ، بما في ذلك جميع الضوابط المناسبة ، لتوحيد وتحسين الظروف والمواد والجداول الزمنية للحصول على النتائج الأكثر قابلية للتكرار.
استكشاف الاخطاء
التشذيب اليدوي غير كاف لإنتاج أغلفة واضحة بصريا
من الممكن أن تكون شفرة الحلاقة مملة. إذا كانت هذه هي الحالة ، فتخلص منها بشكل صحيح وانتقل إلى شفرة حلاقة جديدة أحادية الحافة. استخدم ضغطا معتدلا وحافظ على الشفرة بزاوية 90 درجة على الغمد. اكشط العينة برفق ، ولكن باستمرار ، حتى ملاحظة قسم مسطح وشفاف. ينصح بفحص الأغماد تحت المجهر المركب قبل الانتقال إلى مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.
غمد الذرة الملقح هش للغاية
يحدث هذا عندما يستعمر الفطر معظم الأنسجة النباتية. وبالتالي ، فإن الأنسجة تتحلل وتنهار. عند تحضير العينات الموجودة بالفعل في المرحلة الميتة ، اضغط برفق على القسم مقابل شريحة المجهر ، ضع قطرة من ماء DI المعقم ، وكشط العينة مرة أو مرتين باستخدام غطاء نظيف.
إنبات بوغ منخفض واختراق في الجسم الحي
قد يكون هذا بسبب ارتفاع عدد الجراثيم التي تمنع الإنبات أو الاختراق. تأكد من ضبط تركيز اللقاح على 5 × 105 جراثيم / مل. إذا استمرت المشكلة ، اضبط التركيز على 5 × 104 جراثيم / مل. كعنصر تحكم للتجربة في الجسم الحي ، ضع 50 ميكرولتر من نفس معلق البوغ على لوحة PDA جديدة وانشرها بالتساوي. تحقق من صلاحية البوغ والإنبات يوميا.
مراحل تطور الفطريات غير المتزامنة عبر الأغماد
تأكد من أن نباتات الذرة في نفس مرحلة النمو وأنه تم الحصول على أقسام غمد من نفس العقدة. أيضا ، تأكد من أن الجراثيم قابلة للحياة وأن الثقافات الفطرية في المرحلة المثلى (على سبيل المثال ، لا تزيد عن 2 أسابيع من الثقافات القديمة ل C. graminicola) لإعداد اللقاح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة وليس لديهما ما يفصحان عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون USDA-NIFA على دعمهم المالي (أرقام المنح 2018-67013-28489 و 2020-70410-32901). أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات معبر عنها في هذه المخطوطة هي آراء المؤلفين فقط ولا تعكس بالضرورة آراء وزارة الزراعة الأمريكية. نشكر الطالبة الزائرة من البرازيل ، ميارا دي سيلفا ، على الصور التي تظهر في الشكل 6A وفي الشكل 7D. كما نعترف بقسم أمراض النبات في جامعة كنتاكي لتوفير الوصول إلى مجاهر أوليمبوس متحدة البؤر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. Plant pathological methods: fungi and bacteria. , Burgess Publishing Co. (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
