Summary
Dit manuscript beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol dat gebruik maakt van losse maïsbladomhulsels voor reproduceerbare cytologische, fysiologische en moleculaire studies van maïsinteracties met schimmelpathogenen van planten. De bladomhulsels vergemakkelijken real-time observatie van cellulaire interacties tussen de levende plant en de schimmel in niet-gefixeerde weefsels.
Abstract
We hebben een protocol geoptimaliseerd om maïsbladscheden te inoculeren met hemibiotrofe en necrotrofe bladpathogene schimmels. De methode is aangepast ten opzichte van een methode die oorspronkelijk werd toegepast op rijstbladomhulsels en maakt directe microscopische observatie van schimmelgroei en -ontwikkeling in levende plantencellen mogelijk. Bladomhulsels die worden verzameld uit maïszaailingen met twee volledig uitgekomen bladkragen worden geënt met druppels van 20 μl van 5 x 105 sporen/ml schimmelsporensuspensies en geïncubeerd in vochtigheidskamers bij 23 °C onder continu fluorescerend licht. Na 24-72 uur wordt overtollig weefsel verwijderd met een scheermesje om een enkele laag epidermale cellen achter te laten, een optisch helder monster dat direct kan worden afgebeeld zonder de noodzaak van chemische fixatie of opruiming. Planten- en schimmelcellen blijven in leven voor de duur van het experiment en interacties kunnen in realtime worden gevisualiseerd. Omhulsels kunnen worden gekleurd of onderworpen aan plasmolyse om de ontwikkelingscytologie en levensvatbaarheid van gastheer- en pathogene cellen tijdens infectie en kolonisatie te bestuderen. Schimmelstammen die zijn getransformeerd om fluorescerende eiwitten tot expressie te brengen, kunnen op de omhulsels worden geënt of gecoöculeerd voor een betere resolutie en om de evaluatie van competitieve of synergetische interacties te vergemakkelijken. Schimmelstammen die fluorescerende fusie-eiwitten tot expressie brengen, kunnen worden gebruikt om de productie en targeting van deze individuele eiwitten in planta te volgen en te kwantificeren. Geënte schedeweefsels kunnen worden geëxtraheerd om nucleïnezuren, eiwitten of metabolieten te karakteriseren. Het gebruik van deze schedetesten heeft de gedetailleerde studies van de mechanismen van schimmelpathogeniteit in maïs en ook van schimmeleiwiteffectoren en secundaire metabolieten die bijdragen aan pathogeniteit aanzienlijk verbeterd.
Introduction
Ruimtelijke en temporele analyses op cellulair niveau zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de fysiologie en cytologie van schimmel-plantinteracties. Bladweefsels die chemisch zijn gefixeerd 1,2,3 of zijn opgeruimd en gekleurd4, evenals kunstmatige membranen 5, zijn in het verleden gebruikt om de cytologie van de ontwikkeling van bladpathogenen en plant-schimmelinteracties te onderzoeken. Onderzoek naar infectiegebeurtenissen in levende gastheerweefsels in real-time zonder fixatie of opruiming is echter een uitdaging vanwege technische problemen met betrekking tot de voorbereiding van optisch transparante monsters voor beeldvorming.
Aan het eind van de jaren 1940 werd een losstaand inoculatieprotocol voor bladschede ontwikkeld voor microscopisch onderzoek naar de resistentie van levende epidermale rijstcellen tegen de rijstblastschimmel Magnaporthe oryza6. Meer recentelijk zijn gedetailleerde moleculaire, fysiologische en cytologische waarnemingen van gastheerkolonisatie door Colletotrichum- en Magnaporte-soorten aanzienlijk vergemakkelijkt door gemodificeerde versies van deze bladschedemethode te combineren met schimmeltransformaties die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, en hoogwaardige beeldvormingsprotocollen voor levende cellen, waaronder epifluorescentie en confocale microscopie 7,8,9,10,11,12,13.
Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol met behulp van losse maïsbladomhulsels voor observatie van infectieprocessen door hemibiotrofe en necrotrofe bladschimmelpathogenen. We hebben het specifiek gebruikt om Colletotrichum graminicola (C. graminicola) te bestuderen, de veroorzaker van anthracnose-bladziekte en stengelrot, en Stenocarpella maydis, die Diplodia-bladziekte en stengelrot veroorzaakt. De methode moet echter wel toepasbaar zijn op andere hemibiotrofe en necrotrofe bladschimmelpathogenen. Cytologische en fysiologische reacties tijdens infectie en kolonisatie in deze uitgesneden bladscheden zijn vergelijkbaar met die in hele bladbladen12,14,15. Bovendien is hemibiotrofe kolonisatie van schede-epidermale cellen door C. graminicola vergelijkbaar met kolonisatie van stengelmerg16,17. Losse omhulsels vertonen een grotere synchroniciteit en experimentele reproduceerbaarheid van schimmelpenetratie en kolonisatie dan bladbladen of stengelmerg weefsels14,16,17,18. De meeste maïsrassen kunnen voor dit protocol worden gebruikt. Inteelt of hybriden met overmatige paarse pigmenten in de omhulsels zijn echter minder geschikt omdat de pigmenten de beeldvorming verstoren. Golden Jubilee-suikermaïs is bijzonder nuttig geweest voor onze studies omdat onbehandelde zaden in de handel verkrijgbaar zijn, de planten zeer vatbaar zijn voor veel bladziekten en ze goed groeien in de kas. De eerste epidemieën van anthracnosestengelrot in de Verenigde Staten resulteerden in het totale verlies van suikermaïsoogsten in Indiana in de jaren1970 19,20. Deze inoculatiemethode voor bladschede kan worden toegepast om schimmelgroei en -ontwikkeling in levende versus lokaal gedode plantencellen direct te observeren en te kwantificeren, om resistentiereacties aan te tonen in compatibele/onverenigbare reacties op schimmelinfecties, en om interacties tussen schimmelstammen op dezelfde schede in realtime te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De workflow voor de methode wordt weergegeven in afbeelding 1.
Figuur 1: Stappen in het geoptimaliseerde inoculatieprotocol met behulp van losse maïsbladscheden. De voorbereiding van sporensuspensie, de inoculatie van de bladschede en de monstervoorbereiding voor levende celmicroscopie worden gemarkeerd in respectievelijk groene (A), paarse (B) en oranje (C) vakken. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Plantaardig en schimmelmateriaal
- Plantengroei
- Kweek maïszaailingen (zie Materiaaltabel) in de kas (14 uur licht/27 °C en 10 uur donker/22 °C) in SC10-containers (zie Materiaaltabel). Gebruik een groeimedium dat bestaat uit drie delen commerciële potgrond (zie Materiaaltabel) en twee delen met stoom gesteriliseerde bovengrond.
- Geef zaailingen eenmaal per dag, 's ochtends, 2 minuten water met een bovengronds irrigatiesysteem.
- Oogst zaailingen in het V2-stadium door ze op grondniveau af te snijden. De V2-groeifase wordt bereikt wanneer de zaailingen 5 tot 10 cm hoog zijn en twee zichtbare gekraagde bladeren hebben21.
- Wikkel de planten in een vochtige papieren handdoek en doe ze in een plastic zak voor transport naar het laboratorium voor verdere verwerking.
- Schimmel culturen
- Herstel opgeslagen schimmelsilica stockculturen onder aseptische omstandigheden22door ongeveer 50 korrels van het aangetaste silica op een geschikt agarmedium te strooien. Om morfologische veranderingen en verlies van pathogeniteit te voorkomen, verrekt de subcultuur niet meer dan 3x na reactivering. Aardappeldextrose-agar (PDA; zie Materiaaltabel) wordt routinematig gebruikt om C. graminicola te kweken, terwijl havermoutagar (OA; zie Materiaaltabel) wordt gebruikt voor S. maydis.
- Om PDA voor te bereiden voor het kweken van schimmelbestanden, suspendeert u 19,5 g commercieel bereide gedehydrateerde PDA in 500 ml gedeïoniseerd (DI) water. Om OA te maken, kook je 36 g commercieel bereide gedehydrateerde OA gedurende 15-30 minuten in DI-water, filtreer je door drie lagen kaasdoek en breng je het filtraat tot 500 ml met DI-water. Autoclaafmedia om te steriliseren.
- Vul de gesmolten, gekoelde media aan met een geschikt antibioticum (bijv. hygromycine B, geneticine) bij het werken met transformatieve stammen. De uiteindelijke concentraties van hygromycine of geneticine in 500 ml media zijn respectievelijk 250 μg/ml en 100 μg/ml.
- Incubeer culturen onder optimale omstandigheden totdat zich een sporulerend mycelium heeft ontwikkeld. Colletotrichum graminicola en S. maydis groeien goed bij 23 °C met continu fluorescerend licht en luchtvochtigheid. Sporulatie treedt op binnen 7 dagen na inoculatie (dai) voor S. maydis of 14 dai voor C. graminicola.
2. Inentingen op bladschede
- Glaswol filterunit assemblage
- Gebruik een stevige schaar of schaar om de dop en ongeveer 0,5 mm van de conische bodem van een microcentrifugebuis van 1,5 ml af te knippen (zie Materiaaltabel).
- Plaats een stuk glaswol (ongeveer 0,5 cm x 0,5 cm; zie Materiaaltabel) in de gesneden buis om het middelste gat te bedekken, zoals afgebeeld in afbeelding 2.
- Draag handschoenen tijdens het snijden van glaswol, omdat borosilicaatglas irritatie kan veroorzaken.
- Voorbereiding van bladschededragers
- Snijd een niet-gerokte PCR-plaat met 96 putjes (zie de materiaaltabel) in zes steunrekken met twee kolommen (8 x 2 putjes), zoals afgebeeld in figuur 3A.
- Draai de rekken met twee kolommen om zodat de conische bodems van de putten naar boven wijzen en de platte bovenkant naar beneden wijst (Figuur 3B).
- Plaats elke steun in een glazen petrischaal met bevochtigd filtreerpapier en dek deze af met het deksel (zie Materiaaltabel). Deze unit functioneert als een kleine vochtigheidskamer voor de omhulsels.
- Entmateriaal bereiding
- Plaats voor elke schimmelstam een geassembleerde glaswolfiltereenheid in een intacte steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml, zoals afgebeeld in figuur 2. Deze laatste functioneert als opvangbuis.
- Label de buizen.
- Oogst conidia uit sporulerende culturen door eerst elke plaat te overspoelen met 3-4 ml steriel DI-water. In sommige gevallen kan meer water nodig zijn om een vloeistoflaag op het oppervlak van de kolonie te produceren. Bevochtigingsmiddelen zijn in dit systeem niet nodig.
- Maak de sporen los van de agar met behulp van een steriele stamper met conische punt (zie Materiaaltabel) om gelijkmatig over de hele plaat te schrapen.
- Breng 1 ml van de sporensuspensie aseptisch aan op een glaswolfiltereenheid en laat de sporen door de zwaartekracht in de verzamelbuis stromen.
- Centrifugeer de verzamelbuisjes met de gefilterde sporensuspensies bij 3.500 x g gedurende 5 minuten. De sporen moeten op de bodem van de microcentrifugebuis worden gepelleteerd.
OPMERKING: Het centrifugeren van C. graminicola-sporen met hogere snelheden dan hier wordt aanbevolen, resulteert in een aanzienlijk verlies aan levensvatbaarheid. - Giet de vloeistof in een autoclaveerbare container, voeg 1 ml steriel DI-water toe en schud voorzichtig om de gepelleteerde sporen te resuspenderen. Centrifugeer zoals beschreven in stap 2.3.6.
- Was de sporen 3x om de conidiale matrix te verwijderen die autoremmers kan bevatten die de kieming of penetratie kunnen verminderen.
- Voeg na de derde wasbeurt 300-500 μL steriel DI-water toe om de sporen te resuspenderen voor kwantificering.
- Gebruik een hemocytometer onder een samengestelde microscoop met een vergroting van 100x om de sporenconcentratie te bepalen. Sporenkleuring is niet nodig voor het tellen.
- Bereid een suspensie van 5 x 105 sporen/ml met steriel DI-water.
OPMERKING: C. graminicola sporensuspensie kan niet langer dan 4 uur bij kamertemperatuur worden bewaard voordat de levensvatbaarheid snel verloren gaat. Het koelen van conidia verhoogt de levensvatbaarheid niet.
- Inentingen in de schede
- Controleer de relevante bioveiligheidspraktijken en -procedures voordat u planten inentt met schimmelstammen.
- Verwijder de schede van het eerste echte blad van V2-zaailingen door een duimnagel langs de overlappende rand van de schede te laten lopen en maak deze voorzichtig los van de scheut. Maak de schede aan beide zijden van de scheut los voordat u deze probeert te verwijderen.
- Snijd de teruggewonnen bladscheden in partjes van 3-5 cm. Het is niet nodig om de omhulsels vóór inoculatie aan het oppervlak te desinfecteren.
- Rol elk segment heel voorzichtig uit om de binnenste (adaxiale) epidermale laag bloot te leggen.
- Terwijl u de omhulsels voorbereidt op inoculatie, houdt u de resterende uitgesneden omhulsels omwikkeld met adamp keukenpapier om uitdroging te voorkomen.
- Plaats 20 μL van de schimmelsporensuspensie op het binnenoppervlak in het midden van het omhulselstuk, direct boven de hoofdnerf, zoals afgebeeld in figuur 4.
- Plaats de geënte bladscheden horizontaal, met de hoofdnerf aan de onderkant, in de steun in een glazen petriplaat met bevochtigd filtreerpapier, zoals afgebeeld in figuur 5.
- Elk rek biedt plaats aan maximaal zeven omhulsels. Inoculeer ten minste vijf omhulsels per stam om het verlies van replicaten te compenseren dat kan optreden tijdens de voorbereiding of incubatie van het monster.
- Plaats de kleine vochtigheidskamers in een doorzichtige opbergdoos bekleed met bevochtigd kiempapier (zie Materiaaltabel).
- Dek de doos af met het deksel. Incubeer de box bij 23 °C met continue verlichting gedurende het beoogde tijdsverloop, dat afhankelijk is van de schimmel en van de schimmelontwikkelingsstadia die in acht worden genomen. Tabel 1 geeft een overzicht van het tijdsverloop van met C. graminicola geïnoculeerde maïsscheden.
- Controleer elke dag op tekenen/symptomen van ziekte op de schedes en houd zowel kiem- als filtreerpapier vochtig. Bladscheden kunnen tot 6 dagen worden vastgehouden zonder duidelijke celdood of -afbraak van planten als er geen inoculatie is.
Figuur 2: Voorbereiding van de glaswolfiltereenheid. (A) Een bolletje van glaswol van 0,5 cm x 0,5 cm wordt in microcentrifugebuis 1 geplaatst waarvan de conische bodem is verwijderd. (B-C) De filterbuis wordt vervolgens in microcentrifugebuis 2 geplaatst om een geassembleerde filtereenheid te genereren voor de bereiding van sporensuspensie. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Methode voor het snijden van een niet-gerokte PCR-plaat met 96 putjes. (A) PCR-plaat gesneden in zes steunrekken, 8 x 2 putjes. Een voorbeeld van een enkele schedesteun is afgebeeld in (B). Bladscheden worden horizontaal op de steun gelegd. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Methode voor het inoculeren van de schede. Enkele druppel inoculum rechtstreeks aangebracht op het adaxiale oppervlak van het omhulsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Incubatiemethode van de schede. Geënte bladscheden die horizontaal in een steunrek in een glazen petriplaat met bevochtigd filtreerpapier zijn geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Levende celmicroscopie
- Monstervoorbereiding voor microscopie
- Spoel de stukken omhulsel voorzichtig af met steriel DI-water om niet-aangehechte sporen of oppervlakkige schimmelgroei te verwijderen.
- Plaats het omhulsel op een schoon glazen microscoopglaasje (zie Materiaaltabel) met het adaxiale (binnenste) oppervlak van het omhulselstuk naar beneden gericht en het abaxiale (buitenste) oppervlak naar boven.
- Gebruik een nieuw enkelzijdig scheermesje (zie Materiaaltabel) om ongeveer 1 cm van de uiteinden van de schede af te snijden en verwijder het grootste deel van het laminaweefsel aan weerszijden van de hoofdnerf.
- Houd het scheermesje in een hoek van 90° ten opzichte van de schede om weefsel van de abaxiale hoofdnerf te scheren en de epidermale laag op het adaxiale oppervlak boven de geïnoculeerde plek bloot te leggen. Probeer een uniforme dikte aan te houden. Zodra de bladscheden zijn geschoren, wordt verder snoeien niet aanbevolen, omdat dit het monster kan beschadigen.
- Zorg ervoor dat de geschoren delen niet groter zijn dan 1 cm x 1 cm. Druk tijdens dit proces niet op het midden van de schede. Als je werkt met omhulsels die zijn geënt met verschillende sporensuspensies, desinfecteer dan handschoenen en verwissel het scheermesje tussen de monsters.
- Houd een schoon glazen microscoopglaasje bij de hand. Til het omhulselgedeelte van een rand op en breng het voorzichtig over op een nieuwe dia. Het geënte (adaxiale) oppervlak van de schede moet zich naar boven bevinden, het dichtst bij de objectieflens. Monteer secties voorzichtig om schade aan schimmelstructuren te voorkomen.
- Breng 60 μL steriel DI-water aan op de sectie en voeg een glazen dekglaasje van 24 mm x 60 mm toe (zie Materiaaltabel). Doe dit langzaam om luchtbellen te voorkomen.
- Als u klaar bent voor microscopie, sluit u het dekglaasje af met doorzichtige nagellak (zie Materiaaltabel) door een kleine druppel op elke rand te plaatsen en de druppels vervolgens met elkaar te verbinden met een nagellakborsteltje om een naadloze afdichting te maken.
OPMERKING: Dit omhulselprotocol kan worden gebruikt met cytologische kleuringen, bijv. 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), neutraal rood of trypanblauw, of voor observatie van celplasmolyse om de levensvatbaarheid van plantencellen te evalueren. Voor schedekleuring of celplasmolyse-assays mag u het dekglaasje niet verzegelen. - Voeg voor plasmolysetests een hypertone oplossing (0,75 M sucrose of 1 M natriumchloride) toe aan de ene rand van het dekglaasje en gebruik een gevouwen pluisvrij tissuepapier om de oplossing over het monster naar de andere rand van het dekglaasje te trekken. Gebruik voor het kleuren een vergelijkbare methode om de vlekoplossing aan te brengen.
- Breedveldmicroscopie
- Zodra de bladomhulsels op microscoopglaasjes zijn gemonteerd, inspecteert u ze op schimmelkolonisatie met behulp van een breedveldlichtmicroscoop met een vergroting van 400x.
- Om schimmelstructuren in detail te observeren, gebruikt u een onderdompelingsobjectief in water in plaats van olie voor een betere beeldkwaliteit van de monsters. Sferische aberratie als gevolg van een mismatch van de brekingsindex kan beeldverslechtering veroorzaken. Waterobjectieven zijn beschikbaar voor zowel breedveldlichtmicroscopen als confocale microscopen.
- Om de relatieve hoeveelheid kolonisatie per omhulsel te bepalen, telt u het aantal maïscellen dat is binnengedrongen vanaf elke schimmelpenetratieplaats met behulp van een breedveldlichtmicroscoop met een vergroting van 100x. Deze kwantificering is een geschikte screeningsstap voorafgaand aan statistische analyses waarin stammen, behandelingen en/of ontwikkelingsstadia worden vergeleken.
- Confocale laserscanmicroscopie
- Om fluorescerende eiwitten in maïsweefsels te observeren tijdens de ontwikkeling van transgene schimmelstammen, past u de basisparameters voor beeldacquisitie aan. Identificeer de beste excitatie-/emissie-instellingen op basis van de geselecteerde fluorescerende marker.
OPMERKING: Een 60x waterobjectief heeft de voorkeur bij het analyseren van fluorescerende fusies die zijn opgebouwd uit uitgescheiden eiwitten. Moderne confocale microscopen hebben sterk gecorrigeerde onderdompelingsobjectieven in water om artefacten en vormafwijkingen te voorkomen. - Als het de bedoeling is om fluorescerende eiwitten in levende cellen af te beeldvormen, gebruik dan niet-getransformeerde schimmelstammen als controles voor autofluorescentie. Gebruik de volgende beeldacquisitieparameters om de dynamiek van schimmels en gastheren vast te leggen op een omgekeerde confocale microscoop en voor mCherry fluorescerend eiwit. Stel het laservermogen in tot 5%, 450-600 hoogspanning (HV) afhankelijk van het expressieniveau, 1,375 X versterking, 3% offset, een optische zoomfactor van 1 voor de analyse van maximaal vijf maïscellen per sectie en een optische zoomfactor van 2-5 voor individuele hyfen.
OPMERKING: Confocale beelden van de Z-stack met hoge resolutie bieden driedimensionale gegevens en een beter beeld van real-time interacties tussen de gastheer en de ziekteverwekker. - Voor het kwantificeren van fluorescentie-intensiteiten die overeenkomen met uitgescheiden fusie-eiwitten, gebruikt u beeldanalysesoftware van de confocale fabrikant of een beeldverwerkingsprogramma zoals ImageJ, dat gratis online kan worden gedownload. Raadpleeg een handleiding voor meer informatie over het kwantificeren van fluorescentiesignalen.
- Om fluorescerende eiwitten in maïsweefsels te observeren tijdens de ontwikkeling van transgene schimmelstammen, past u de basisparameters voor beeldacquisitie aan. Identificeer de beste excitatie-/emissie-instellingen op basis van de geselecteerde fluorescerende marker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De onderstaande voorbeelden beschrijven representatieve resultaten na het gebruik van de inoculatiemethode met maïsbladschede. Deze voorbeelden demonstreren het gemak, de snelheid en de precisie waarmee observatie en vergelijking van interacties tussen maïs en schimmel in realtime kan worden bereikt met deze geoptimaliseerde test. Beeldvorming van levende cellen maakt ook de extractie van kwantitatieve informatie mogelijk, wat een nuttig hulpmiddel is voor vergelijkende moleculaire, cytologische en fysiologische studies. Nadere bijzonderheden zijn te vinden in de oorspronkelijke publicaties die voor elke succesvolle aanvraag worden geciteerd.
Voorbeeldgegeven 1: Gebruik van kleuring en plasmolyse in geënte bladscheden voor de evaluatie van de schimmelstatus en de detectie van plantreacties op schimmelinfecties
Maïsbladomhulsels zijn gebruikt om de infectieprocessen van Colletotrichum graminicola en Stenocarpella maydis in levende gastheercellen te visualiseren en te vergelijken met helderveldmicroscopie, waardoor gedetailleerde beschrijvingen van kolonisatiepatronen en tijdsverloop mogelijk zijn (ongepubliceerde resultaten; Figuur 6).
Deze studies toonden aan dat S. maydis snel epidermale cellen rechtstreeks binnendringt via ongedifferentieerde hyfale zwellingen, in tegenstelling tot C. graminicola die gemelaniseerde appressoria produceert. Eenmaal in de epidermale cellen gaan beide ziekteverwekkers van cel naar cel door schijnbaar intacte celwanden te passeren (Figuur 6A,B).
Omhulsels kunnen worden gekleurd met trypanblauw of DAPI om de aard en omvang van koloniserende schimmelhyfen gemakkelijker te evalueren (Figuur 6). Trypanblauwe kleuring onthult dat C. graminicola aanvankelijk binnendringt via dikke primaire hyfen die zich tussen cellen verplaatsen via zeer nauwe verbindingen. Later schakelt de schimmel over naar een necrotroof stadium, waarbij dunnere secundaire hyfen in het midden van de kolonie worden geproduceerd (Figuur 6 CE)12,14,16,17.
Figuur 6: Ongekleurde of gekleurd geënte maïsbladscheden afgebeeld met helderveld- of epifluorescentiemicroscopie. (A) Intracellulaire hyfen 48 uur na inoculatie (hpi ) met Stenocarpella maydis. Infectie vindt plaats via licht gezwollen hyfuiteinden (pijl). (B) Intracellulaire hyfen 48 hpi met Colletotrichum graminicola. Infectie vindt plaats via gemelaniseerde appressorie (pijlen). (C) Hyfen van C. graminicola, gekleurd met trypanblauw, van cel tot cel voortschrijdend aan de voortschrijdende kolonierand via smalle verbindingen (pijl), 72 hpi. (D) Close-up van trypanblauw gekleurd dreef van C. graminicola bij 72 hpi, die via een smalle verbinding door de maïscelwand gaat (pijl). (E) Hyfen van C. graminicola, gekleurd met trypanblauw, in het centrum van de kolonie 72 hpi. Smallere secundaire hyfen zijn te zien uit de dikkere primaire hyfen (pijlen). (F) Hyfen van C. graminicola 72 hpi, aan de oprukkende kolonierand op een met DAPI gekleurde bladschede. De gekleurde schimmel- en plantenkernen fluoresceren onder UV-licht. Schaalbalken in elk paneel zijn gelijk aan 50 μm. Microfoto's verkregen met behulp van een monochromatische digitale camera in combinatie met een epifluorescentiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Omhulsels kunnen neutraal rood worden gekleurd en/of worden onderworpen aan plasmolyse om de ontwikkelingscytologie en levensvatbaarheid van maïscellen te bestuderen tijdens infectie en kolonisatie door pathogene schimmels (Figuur 7).
Colletotrichum graminicola is een hemibiotrofe schimmel die levende maïscellen binnendringt met dikke primaire hyfen die door een membraan van het cytoplasma van de gastheer worden gescheiden (Figuur 7A-C)12,14,16,17. Stenocarpella maydis daarentegen is een necrotrofe schimmel die een fytotoxine23 produceert en de epidermale cellen (die gegranuleerd worden en niet plasmolyseren) doodt voordat het ze binnendringt (Figuur 7D).
De afweer van maïs tegen C. graminicola en andere bladpathogenen omvat de accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), met name waterstofperoxide (H 2 O2)12,15. Om de oxidatieve chemie van plant-pathogeen interacties te onderzoeken, kan 3,3′-diaminobenzidine (DAB) worden gebruikt voor celkleuring24. DAB wordt geoxideerd door H2 O2, waardoor een donkerbruin neerslag ontstaat dat zichtbaar is in de maïsbladscheden (figuur 7 E,F)12,24. De productie van het pigment is een indicator van een oxidatieve uitbarsting die verband houdt met een weerstandsreactie van de gastheer.
Figuur 7: Gekleurd en/of geplasmolyseerd geënt maïsbladomhulsel, in beeld gebracht met helderveldmicroscopie. (A) Bladschede geënt met C. graminicola 24 hpi en onderworpen aan plasmolyse en kleuring met neutraal rood. Levende maïscellen onder appressoria (pijlen) plasmolyseren en kleuren, wat aantoont dat de ziekteverwekker de cellen niet doodt voorafgaand aan de invasie. (B) Bladschede 48 hpi met C. graminicola, onderworpen aan plasmolyse en kleuring met neutraal rood. Maïscellen die worden gekoloniseerd door primaire hyfen (pijl) zijn nog in leven, wat aantoont dat C. graminicola cellen binnendringt als een biotroof. (C) Bladschede 48 hpi met C. graminicola, met hyfen die cel-tot-cel bewegen aan de voortschrijdende rand van de kolonie. De omhulsels zijn geplastmolyseerd maar niet gekleurd. Niet-gekoloniseerde cellen die grenzen aan de rand van de kolonie (pijlen) blijven plasmolyse. (D) Bladschede 24 hpi met S. maydis, voorafgaand aan penetratie. De cellen onder de ontkiemde spore (pijl) zien er gegranuleerd uit en kunnen niet plasmolyseren, wat aangeeft dat de S. maydis ze doodt voordat ze binnendringen en dat het zich gedraagt als een necrotroop. (E) Bladschede van resistente mais ingeteeld Mp305 24 hpi met C. graminicola en gekleurd met DAB. Donkere kleuring duidt op een sterke oxidatieve reactie van de enkele cel in het midden van het beeld, terwijl halo's van bruin pigment te zien zijn rond het grootste deel van de individuele appressoria, en granulatie kan worden waargenomen in de cellen bovenaan de foto. (F) Een nadere blik op de halo's van bruin pigment die zich rond appressoria hebben opgehoopt, en de afzetting van pigment in de nabijgelegen maïscelwanden (pijlen). Schaalbalken in elk paneel zijn gelijk aan 50 μm, behalve (F) die 20 μm is. Microfoto's verkregen met behulp van een monochromatische digitale camera in combinatie met een epifluorescentiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Voorbeeldgegevens 2: Beeldvorming van levende cellen met schimmels die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen
Schimmelhyfen die cytoplasmatische fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, kunnen met hoge resolutie worden gevisualiseerd in levende schedecellen zonder dat er kleuringen nodig zijn met behulp van een epifluorescentie- of confocale microscoop (Figuur 8).
Fluorescerende eiwitten kunnen worden gericht op verschillende schimmelorganellen, bijvoorbeeld de mitochondriën, kernen of het endomembraansysteem, om hun locaties en activiteiten in de levende schimmelcellen in planten te volgen (Figuur 8C)25,26,27,28 (niet-gepubliceerde resultaten). Fluorescerende eiwitten kunnen ook worden aangestuurd door verschillende schimmelpromotors om te dienen als verslaggevers voor verschillende functies: RFP aangedreven door het BiP-chaperonne-secretiestressresponseiwit wordt bijvoorbeeld getoond (Figuur 8D)29 (niet-gepubliceerde resultaten). Het gebruik van bladomhulsels maakt de visualisatie mogelijk van individueel gelabelde fluorescerende fusie-eiwitten die worden geaccumuleerd en uitgescheiden door schimmelhyfen terwijl ze gastheercellen koloniseren 8,9 (Figuur 8E). Transgene maïslijnen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen die gericht zijn op verschillende cellulaire compartimenten, bijv. kernen of plasmamembraan, zijn ook beschikbaar30,31, en kunnen worden gebruikt voor inentingen om de effecten van infectie op cellulaire structuren van maïs, bijvoorbeeld kernen, te evalueren. Het gebruik van deze transgene maïslijnen toonde aan dat kernen in niet-binnengedrongen maïscellen doorgaans migreren naar de celwand die het dichtst bij cellen ligt die al gekoloniseerd zijn door C. graminicola (niet-gepubliceerde resultaten; Figuur 8F).
Figuur 8: Epifluorescentie (A, B) of confocale (C, D, E, F) beeldvorming van Colletotrichum graminicola die fluorescerende eiwitten tot expressie brengt. (A) Ongekleurde, geplasmolyseerde bladschede 48 hpi met een C. graminicola-stam die mRFP cytoplasmatisch tot expressie brengt onder controle van de ToxA-promotor34. Aanzienlijke autofluorescentie wordt ook opgemerkt in deze bladscheden. (B) Ongekleurd bladschede 48 hpi met een C. graminicola-stam die SGFP cytoplasmatisch tot expressie brengt onder controle van de ToxA-promotor. (C)Colletotrichum graminicola die SGFP tot expressie brengt, gericht op het endomembraansysteem met een HDEL-anker35. (D) Ongekleurd bladschede 24 hpi met C. graminicola getransformeerd met mRFP onder controle van de promotor voor de C. graminicola homoloog van de BiP-chaperonne. De rode fluorescentie in de primaire hyfen is een indicator van BiP-activering als reactie op secretiestress. (E) Accumulatie van arabinofuranosidase::mKersenfusie-eiwit in de primaire hyfen van C. graminicola WT die de celwand van de maïsbladschede passeert met 44 hpi. (F) Bladschede van een transgene maïslijn die YFP tot expressie brengt, gericht op de plantenkernen30,31, 48 hpi, met een stam van C. graminicola die mRFP cytoplasmatisch tot expressie brengt onder controle van de ToxA-promotor. Schaalbalken in elk paneel zijn gelijk aan 20 μm, behalve voor paneel A waar het gelijk is aan 50 μm. Microfoto's werden verkregen met behulp van een monochromatische digitale camera in combinatie met een epifluorescentiemicroscoop. Beelden in (CF) werden vastgelegd met een confocale microscoop met laserscanning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Voorbeeldgegeven 3: Gebruik van maïsbladomhulsels om de gedetailleerde cytologie van compatibele/incompatibele reacties en interacties tussen schimmelstammen te onderzoeken
Een niet-pathogene C. graminicola-mutante stam (cpr1 MT) werd vergeleken met de wildtype (WT) stam in maïsbladscheden (Figuur 9A,B)12.
Beeldvorming van levende cellen van de stammen die waren gelabeld met cytoplasmatische fluorescerende eiwitten toonde aan dat de mutant specifiek was aangetast in de beweging van cel naar cel in de maïsbladomhulsels. Het schedeprotocol maakte nauwkeurige kwantificering mogelijk waaruit bleek dat de cpr1 MT 95% van de tijd beperkt was tot de eerste gekoloniseerde cel (Figuur 9C)12. Dit stond in schril contrast met de WT, waarin minder dan 5% van de infecties in de eerste gekoloniseerde cel bleef in hetzelfde tijdsbestek12. Interessant is dat de cpr1 MT in staat was om saprofytisch voorbij de eerste aanvankelijk geïnfecteerde cel te groeien in lokaal door bevriezing gedode omhulsels, zoals de WT-stam (Figuur 9D). Dit gaf aan dat het onvermogen van de cpr1 MT om te koloniseren specifiek verband hield met een actieve respons van de levende maïscel.
De inoculatietest van de bladschede werd gebruikt om interacties tussen de GFP-expressieve cpr1 MT- en RFP-expressieve WT-stammen te testen door ze samen te inoculeren op dezelfde bladschede12. Wanneer de stammen dicht bij elkaar werden geïnoculeerd (niet meer dan 8 maïscellen uit elkaar), kon de cpr1 MT normaal groeien als een biotroof van cel tot cel (figuur 9E,F). Plasmolyse-assays bevestigden dat de cpr1 MT-schimmel levende cellen binnendrong12. Al deze gedetailleerde waarnemingen werden mogelijk gemaakt door de schedetesten en impliceerden het bestaan van een diffusibele factor die compatibiliteit induceert die wordt geproduceerd door de WT-stam van C. graminicola, maar ontbreekt in de cpr1 MT12.
Figuur 9: Compatibele en onverenigbare interacties waarbij WT- en cpr1 MT-stammen van Colletotrichum graminicola betrokken zijn. Door gebruik te maken van verschillende fluorescerende eiwitten konden de twee stammen worden onderscheiden wanneer ze samen werden geïnoculeerd op maïsbladscheden12. (A) De WT C. graminicola-stam die cytoplasmatisch mRFP tot expressie brengt in maïsbladomhulsels bij 48 hpi. (B) De C. graminicola cpr1 MT-stam die SGFP tot expressie brengt in maïsbladschede bij 72 hpi. De cpr1 MT koloniseert slechts zelden (<5% van de tijd) voorbij de eerste geïnfecteerde cel, zelfs tot 6 dagen na inoculatie. (C) Een nadere beschouwing van de C. graminicola cpr1 MT-stam die SGFP uitdrukt bij 72 dpi. In dit geval slaagde het erin om de celwand over te steken naar de volgende cel, maar toen stopte het met ontwikkelen. (D) De C. graminicola cpr1 MT-stam die SGFP, 48 hpi tot expressie brengt in gedode schedeweefsels. De cpr1 MT-stam koloniseert niet-levende maïsschedecellen snel, vergelijkbaar met de WT. (E) Wanneer de WT-mRFP C. graminicola- en cpr1 MT-GFP C. graminicola-stammen dicht bij elkaar worden geënt op maïsbladschede (48 hpi), krijgt de cpr1 MT-GFP-stam weer het vermogen om normaal door levende maïsschedecellen te gaan, als een biotroop. Biotrofe groei in de levende cellen werd bevestigd door plasmolyse-assays. (F) Een nadere beschouwing van de C. graminicola cpr1 MT-stam die SGFP tot expressie brengt en van cel tot cel groeit wanneer deze naast het WT wordt geïnoculeerd (niet meer dan 8 maïscellen uit elkaar). Schaalbalken zijn gelijk aan 50 μm (A, B en E) of 20 μm (C, D en F). Microfoto's werden verkregen met behulp van een monochromatische digitale camera in combinatie met een epifluorescentiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Geïnoculeerde omhulsels zijn ook gebruikt om weefsels te produceren voor RNA-extractie voor transcriptionele activiteitsanalyse32,33. De omhulsels waren ideaal voor dit doel, omdat ze vóór extractie konden worden geïnspecteerd om het infectieproces te controleren, waardoor de uniformiteit van het monster over meerdere replicaties werd gegarandeerd. Deze studies maakten het mogelijk om golven van differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren tussen de overgangsstadia van de levensstijl van Colletotrichum 32,33.
Voorbeeldgegeven 4: Resultaten van suboptimale experimenten
Onbevredigende beeldvorming van levende cellen kan het gevolg zijn van onvoldoende trimmen van de bladscheden, wat leidt tot overlappende epidermale cellagen en optisch ondoorzichtige monsters (figuur 10).
Figuur 10: Suboptimaal experimenteel resultaat door onvoldoende snoeien van bladscheden.( A) Voorbeeld van meerdere epidermale cellagen die het onderzoek naar de ontwikkeling van schimmelsi n vivo verstoren. (B) Voorbeeld van overlappende cellagen die de beeldvorming van levende cellen beïnvloeden. Schaalbalken gelijk aan 20 μm. Microfoto's werden verkregen met behulp van een monochromatische digitale camera in combinatie met een epifluorescentiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een andere mogelijke suboptimale uitkomst van het experiment is een niet-gecorrigeerde inoculumconcentratie die kan resulteren in lage (Figuur 11A) of hoge aantallen sporen: dit laatste kan leiden tot verminderde kieming of appressoriale penetratie (Figuur 11B). Dit laatste kan ook de kwantificering belemmeren van maïscellen die op elke schimmelpenetratieplaats zijn gekoloniseerd.
Figuur 11: Suboptimaal resultaat van het experiment als gevolg van een onjuist afgestelde entstofconcentratie. Lage concentratie C. graminicola sporensuspensie geïnoculeerd op omhulsels, wat resulteert in een laag aantal schimmelpenetratieplaatsen. B. Hoge concentratie van het C. graminicola-inoculum op de bladscheden, waardoor meerdere appressoria in de buurt ontstaan en de penetratie van gastheercellen wordt verminderd. Schaalbalken gelijk aan 20 μm. Microfoto's werden verkregen met behulp van een monochromatische digitale camera in combinatie met een epifluorescentiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tijdstip van microscopische waarneming (hpi) | Ontwikkelingsstadium van C. graminicola geënt op maïsbladscheden |
| 12 | Appressoria |
| 24 | Primaire hyfen |
| 36 | Secundaire hyfen |
| 48 | Secundaire hyfen |
| 60 | Acervuli |
| 72 | Acervuli |
| 108 | Acervuli |
Tabel 1: Tijdsverloop van Colletotrichum graminicola-infectie: Samenvatting van het tijdsverloop van maïsbladscheden die zijn geënt met C. graminicola stam M1.001 op basis van mijlpalen in de ontwikkeling van schimmels tijdens de overgang van levensstijl. Microscopische waarnemingen werden elke 12 uur uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De geoptimaliseerde inoculatiemethode voor bladschede die hier wordt beschreven, is aangepast van een origineel protocol dat is ontwikkeld voor en is toegepast op rijstbladomhulsels 6,8,36. Het maakt directe, gedetailleerde observaties mogelijk van schimmelgroei en -ontwikkeling in levende plantencellen met breedveld- of confocale microscopie. Het protocol is geschikt voor karakterisering, vergelijking en kwantificering van een verscheidenheid aan microscopische verschijnselen tijdens maïskolonisatie, waaronder schimmelontwikkeling en gastheerreacties tijdens compatibele versus onverenigbare interacties; productie en afscheiding van specifieke schimmeleiwitten in planta; en cytologie en biochemie van gemeenschappelijke of nieuwe pathogeniteitsfactoren die worden geproduceerd tijdens de interactie tussen maïs en schimmel. We hebben deze methode gebruikt met hemibiotrofe en necrotrofe pathogenen van maïs. We hebben geen pogingen ondernomen om te inoculeren met biotrofe ziekteverwekkers (bijv. roestschimmels), maar de omhulsels, aangezien ze in leven blijven, zouden ook nuttig zijn voor die toepassing. We hebben deze methode ook toegepast op sorghumschedes voor onderzoek naar de cytologie van gastheer- en cultivar-specifieke resistentie 7,37. Voor sorghumschedes was de enige aanpassing aan het protocol om de hele schede te vullen met sporensuspensie, in plaats van een enkele druppel in het midden aan te brengen. Dit was nodig vanwege de kleinere diameter van de sorghumscheden.
Het gebruik van deze schedetesten heeft onze gedetailleerde studies naar de mechanismen van gastheerkolonisatie en schimmelmoleculen die cruciaal zijn voor pathogeniteit aanzienlijk verbeterd. Toepassing van de methode toonde bijvoorbeeld aan dat C. sublineola door maïs en C. graminicola door sorghum niet als gastheer werden herkend, inclusief overgevoelige resistentiereacties in beide gevallen7. Maïsbladscheden werden ook gebruikt om interacties tussen schimmelstammen op afstand op dezelfde schede te testen. In dit geval toonde co-inoculatie van een pathogene WT en niet-pathogene cpr1 MT-stam samen op levende omhulsels de inductie van gevoeligheid van maïscellen door de WT-stam aan en leverde het bewijs voor een diffusibele factor die betrokken is bij pathogeniteit12. De omhulsels maakten differentiatie mogelijk van de twee stammen die verschillende fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, en kwantificering en statistische vergelijkingen van het kolonisatieproces voor de stammen die alleen of samen waren geïnoculeerd.
Deze maïsbladschedetest heeft verschillende voordelen ten opzichte van inoculaties van hele planten voor beeldvorming van levende cellen. Ten eerste biedt het protocol superieure beeldvorming, zonder noodzaak voor opruiming of fixatie, van ziekteverwekkers die in realtime interageren met levende gastheercellen. Studies met maïsbladscheden maakten het bijvoorbeeld mogelijk om een duidelijke omschakeling van biotrofie naar necrotrofie te detecteren in hemibiotrofe C. graminicola en vergemakkelijkten functionele vergelijkingen met een niet-pathogene mutant 7,12,16,17. Hoewel uitgesneden rijstbladomhulsels die zijn geënt met M. oryzae naar verluidt symptomen kunnen vertonen die niet overeenkomen met die waargenomen in hele rijstplanten36, is de timing en het uiterlijk van kolonisatie, weefselinstorting en laesieontwikkeling in maïsomhulsels vergelijkbaar met die in hele bladeren12,14. Een tweede voordeel van de schedetest is dat deze een grotere synchroniciteit vertoont tussen replicaties en experimentele reproduceerbaarheid van schimmelkolonisatie12,18. Hoewel inoculatie van de hele plant kan leiden tot onregelmatige niveaus van schimmelpenetratie18, zorgen de meer gecontroleerde omstandigheden van de ingehuldigingen voor meer synchroniciteit en maken ze nauwkeuriger onderzoek en kwantificering van interacties mogelijk. Deze verhoogde synchroniciteit vergemakkelijkte het gebruik van de omhulsels in transcriptoomanalyses32,33. Bovendien maakte het omhulselprotocol de nodige snelheid van monstervoorbereiding voor transcriptoomanalyse mogelijk: het trimmen, spoelen en screenen van elk omhulsel duurde niet meer dan 2 minuten voordat ze snel werden ingevroren voor RNA-extractie32,33.
Cruciale stappen voor succesvolle beeldvorming van infectie met levende cellen zijn onder meer: 1) Omhulsels moeten onmiddellijk na het snijden worden gebruikt voor experimenten. Uitgesneden geënte omhulsels mogen niet langer dan 6 dagen worden bewaard: als schimmelkolonisatie zwaar is, zullen ze sneller worden afgebroken12; 2) Zorg ervoor dat u omhulsels kiest die dezelfde ontwikkelingsleeftijd hebben om meer reproduceerbare resultaten te garanderen; 3) Gebruik een verse sporensuspensie uit culturen die maximale sporulatie hebben bereikt; 4) Gebruik scherpe scheermesjes voor efficiënter trimmen om optisch heldere monsters te produceren; 5) Minimaliseer buitensporige en onnodige manipulatie van monsters, aangezien dit proces een negatieve invloed kan hebben op live-structuren en beeldkwaliteit; 6) Controleer dagelijks de vochtigheidskamers om er zeker van te zijn dat het filtreerpapier voldoende vochtig is; en 7) Houd bij het afbeelden van monsters op een confocale microscoop de acquisitie-instellingen vast tijdens het experiment om te voorkomen dat intensiteitsveranderingen of vertekening worden geïntroduceerd bij het vergelijken van fluorescerende signalen tussen monsters. Fluorescerende eiwitten kunnen fotobleken als de laserintensiteit en -duur te hoog zijn, en ze kunnen zwakkere signalen afgeven als weefselsecties lange tijd onder een verzegeld dekglaasje worden bewaard. Voorbereidende experimenten, inclusief alle geschikte controles, moeten worden uitgevoerd om omstandigheden, materialen en tijdlijnen te standaardiseren en te optimaliseren voor de meest reproduceerbare resultaten.
Probleemoplossing
Met de hand knippen is onvoldoende om optisch heldere omhulsels te produceren
Het is mogelijk dat het scheermesje bot is geworden. Als dit het geval is, gooi het dan op de juiste manier weg en schakel over op een nieuw enkelzijdig scheermesje. Oefen matige druk uit en houd het mes in een hoek van 90° ten opzichte van de schede. Schraap het monster voorzichtig, maar consequent, totdat u een vlak en doorschijnend gedeelte waarneemt. Het is raadzaam om omhulsels onder een samengestelde microscoop te controleren voordat u overgaat tot de confocale laserscanmicroscoop.
Geënte maïsschede is uiterst kwetsbaar
Dit gebeurt wanneer de schimmel het grootste deel van het plantenweefsel heeft gekoloniseerd. Bijgevolg wordt het weefsel afgebroken en stort het in. Bij het voorbereiden van monsters die zich al in het necrotrofe stadium bevinden, drukt u de sectie voorzichtig tegen een microscoopglaasje, brengt u een druppel steriel DI-water aan en schraapt u het monster een of twee keer met een schoon dekglaasje.
Lage sporenkieming en penetratie in vivo
Dit kan te wijten zijn aan een groot aantal sporen die de kieming of penetratie remmen. Zorg ervoor dat de inoculumconcentratie is aangepast aan 5 x 105 sporen/ml. Als het probleem aanhoudt, pas dan de concentratie aan naar 5 x 104 sporen/ml. Ter controle van het in vivo experiment plaats je 50 μL van dezelfde sporensuspensie op een verse PDA-plaat en verdeel je deze gelijkmatig. Controleer dagelijks de levensvatbaarheid en ontkieming van sporen.
Asynchrone ontwikkelingsstadia van schimmels in omhulsels
Zorg ervoor dat maïsplanten zich in hetzelfde groeistadium bevinden en dat de schedesecties van dezelfde knoop zijn verkregen. Zorg er ook voor dat sporen levensvatbaar zijn en dat schimmelculturen zich in het optimale stadium bevinden (bijv. niet langer dan 2 weken oude culturen voor C. graminicola) voor de bereiding van inoculum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben en niets te onthullen hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken USDA-NIFA voor hun financiële steun (subsidienummers 2018-67013-28489 en 2020-70410-32901). Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen in dit manuscript zijn uitsluitend die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van het Amerikaanse ministerie van landbouw. We danken Science Without Borders-gaststudent uit Brazilië, Mayara de Silva, voor de beelden die in figuur 6A en in figuur 7D te zien zijn. We erkennen ook de afdeling Plantenpathologie van de Universiteit van Kentucky voor het verlenen van toegang tot de confocale microscopen van Olympus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. Plant pathological methods: fungi and bacteria. , Burgess Publishing Co. (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
