Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Inokulationsprotokoll, das abgelöste Maisblatthüllen für reproduzierbare zytologische, physiologische und molekulare Studien von Maisinteraktionen mit pilzlichen Pflanzenpathogenen verwendet. Die Blattscheiden erleichtern die Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen zwischen der lebenden Pflanze und dem Pilz in nicht fixiertem Gewebe.
Abstract
Wir haben ein Protokoll optimiert, um Maisblattscheiden mit hemibiotrophen und nekrotrophen blattpathogenen Pilzen zu impfen. Die Methode ist eine Abwandlung von einer Methode, die ursprünglich auf Reisblattscheiden angewendet wurde, und ermöglicht die direkte mikroskopische Beobachtung des Pilzwachstums und der Pilzentwicklung in lebenden Pflanzenzellen. Blattscheiden, die von Maiskeimlingen mit zwei vollständig geschlüpften Blatthalsen entnommen wurden, werden mit 20 μl-Tropfen von 5 x 105 Sporen/ml Pilzsporensuspensionen beimpft und in Feuchtekammern bei 23 °C unter kontinuierlichem Fluoreszenzlicht inkubiert. Nach 24-72 h wird überschüssiges Gewebe mit einer Rasierklinge entfernt, um eine einzelne Schicht Epidermiszellen zu hinterlassen, eine optisch klare Probe, die direkt abgebildet werden kann, ohne dass eine chemische Fixierung oder Reinigung erforderlich ist. Pflanzen- und Pilzzellen bleiben für die Dauer des Experiments am Leben und Interaktionen können in Echtzeit visualisiert werden. Hüllen können gefärbt oder einer Plasmolyse unterzogen werden, um die Entwicklungszytologie und Lebensfähigkeit von Wirts- und Pathogenzellen während der Infektion und Kolonisierung zu untersuchen. Pilzstämme, die so transformiert wurden, dass sie fluoreszierende Proteine exprimieren, können auf den Hüllen inokuliert oder co-inokuliert werden, um die Auflösung zu erhöhen und die Bewertung kompetitiver oder synergistischer Interaktionen zu erleichtern. Pilzstämme, die fluoreszierende Fusionsproteine exprimieren, können verwendet werden, um die Produktion und das Targeting dieser einzelnen Proteine in planta zu verfolgen und zu quantifizieren. Inokulierte Scheidengewebe können extrahiert werden, um Nukleinsäuren, Proteine oder Metaboliten zu charakterisieren. Der Einsatz dieser Scheidenassays hat die detaillierten Untersuchungen der Mechanismen der pilzlichen Pathogenität in Mais sowie der Effektoren von Pilzproteinen und Sekundärmetaboliten, die zur Pathogenität beitragen, erheblich vorangebracht.
Introduction
Räumliche und zeitliche Analysen auf zellulärer Ebene sind entscheidend für das Verständnis der Physiologie und Zytologie von Pilz-Pflanzen-Interaktionen. Blattgewebe, das chemischfixiert wurde 1,2,3 oder gereinigt und gefärbt 4, sowie künstliche Membranen5 wurden in der Vergangenheit verwendet, um die Zytologie der Blattpathogenentwicklung und der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Pilzen zu untersuchen. Die Untersuchung von Infektionsereignissen in lebenden Wirtsgeweben in Echtzeit ohne Fixierung oder Klärung ist jedoch aufgrund technischer Probleme im Zusammenhang mit der Vorbereitung optisch transparenter Proben für die Bildgebung eine Herausforderung.
In den späten 1940er Jahren wurde ein Inokulationsprotokoll für die Inokulation mit abgelöster Blattscheide entwickelt, um die Resistenz lebender Reisepidermiszellen gegen den Reisblastenpilz Magnaporthe oryza6 hellfeldmikroskopisch zu untersuchen. In jüngerer Zeit wurden detaillierte molekulare, physiologische und zytologische Beobachtungen der Wirtsbesiedlung durch Colletotrichum- und Magnaporthe-Arten durch die Kombination modifizierter Versionen dieser Blattscheidenmethode mit Pilztransformanten, die fluoreszierende Proteine exprimieren, und leistungsstarken Live-Cell-Imaging-Protokollen, einschließlich Epifluoreszenz und konfokaler Mikroskopie, erheblich erleichtert 7,8,9,10.11,12,13.
In dieser Arbeit wird ein optimiertes Inokulationsprotokoll unter Verwendung von abgelösten Maisblattscheiden zur Beobachtung von Infektionsprozessen durch hemibiotrophe und nekrotrophe Blattpilzerreger beschrieben. Wir haben es speziell verwendet, um Colletotrichum graminicola (C. graminicola), den Erreger der Anthraknose-Blattfäule und Stängelfäule, und Stenocarpella maydis, die Diplodia-Blattfäule und Stängelfäule verursacht, zu untersuchen. Die Methode sollte jedoch auch auf andere hemibiotrophe und nekrotrophe Blattpilzpathogene anwendbar sein. Die zytologischen und physiologischen Reaktionen während der Infektions- und Kolonisationsereignisse in diesen herausgeschnittenen Blattscheiden ähneln denen in ganzen Blattspreiten12,14,15. Darüber hinaus ähnelt die hemibiotrophe Besiedlung von Scheidenepidermiszellen durch C. graminicola der Besiedlung von Stängelmarkzellen16,17. Abgelöste Hüllen zeigen eine größere Synchronizität und experimentelle Reproduzierbarkeit der Pilzpenetration und -besiedlung als Blattspreiten oder Stängelmarkgewebe 14,16,17,18. Die meisten Maissorten können für dieses Protokoll verwendet werden. Inzuchten oder Hybriden mit übermäßigen violetten Pigmenten in den Scheiden sind jedoch weniger geeignet, da die Pigmente die Bildgebung stören. Golden Jubilee Zuckermais war für unsere Studien besonders nützlich, da unbehandeltes Saatgut im Handel erhältlich ist, die Pflanzen sehr anfällig für viele Blattkrankheiten sind und im Gewächshaus gut wachsen. Die ersten Epidemien der Anthraknose-Stängelfäule in den Vereinigten Staaten führten in den 1970er Jahren zum Totalverlust der Zuckermaisernte in Indiana19,20. Diese Methode der Blattscheideninokulation kann angewendet werden, um das Pilzwachstum und die Pilzentwicklung in lebenden vs. lokal abgetöteten Pflanzenzellen direkt zu beobachten und zu quantifizieren, um Resistenzreaktionen in kompatiblen/inkompatiblen Reaktionen auf eine Pilzinfektion nachzuweisen und um Interaktionen zwischen Pilzstämmen auf derselben Scheide in Echtzeit zu testen.
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Protocol
HINWEIS: Der Workflow für die Methode ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Schritte des optimierten Impfprotokolls mit abgelösten Maisblatthüllen. Die Herstellung der Sporensuspension, die Inokulation der Blattscheide und die Probenvorbereitung für die Lebendzellmikroskopie sind in grünen (A), violetten (B) bzw. orangefarbenen (C) Kästchen hervorgehoben. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
1. Pflanzen- und Pilzmaterial
- Pflanzenwachstum
- Maissetzlinge (siehe Materialtabelle) im Gewächshaus (14 h hell/27 °C und 10 h dunkel/22 °C) in SC10-Behältern (siehe Materialtabelle) ziehen. Verwenden Sie ein Nährmedium, das aus drei Teilen handelsüblicher Blumenerde (siehe Materialtabelle) und zwei Teilen dampfsterilisierter Muttererde besteht.
- Gießen Sie die Setzlinge einmal täglich morgens 2 Minuten lang mit einem Überkopf-Bewässerungssystem.
- Ernten Sie Sämlinge im V2-Stadium, indem Sie sie auf Bodenebene schneiden. Das V2-Wachstumsstadium wird erreicht, wenn die Sämlinge 5 bis 10 cm hoch sind und zwei sichtbare Kragenblätter haben21.
- Wickeln Sie die Pflanzen mit einem feuchten Papiertuch ein und legen Sie sie in eine Plastiktüte, um sie zur weiteren Verarbeitung ins Labor zu transportieren.
- Pilzkulturen
- Reaktivieren Sie gelagerte Pilz-Kieselsäure-Stammkulturen unter aseptischen Bedingungen22, indem Sie etwa 50 Körnchen der befallenen Kieselsäure auf ein geeignetes Agar-Medium streuen. Um morphologische Veränderungen und den Verlust der Pathogenität zu vermeiden, werden Subkulturstämme nicht mehr als 3x nach der Reaktivierung gezüchtet. Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA; siehe Materialtabelle) wird routinemäßig für die Kultivierung von C. graminicola verwendet, während Haferflocken-Agar (OA; siehe Materialtabelle) für S. maydis verwendet wird.
- Um PDA für die Kultivierung von Pilzbeständen vorzubereiten, suspendieren Sie 19,5 g kommerziell hergestelltes dehydriertes PDA in 500 ml deionisiertem (DI) Wasser. Um OA herzustellen, kochen Sie 36 g kommerziell hergestelltes dehydriertes OA 15-30 Minuten lang in DI-Wasser, filtern Sie durch drei Schichten Mulltuch und bringen Sie das Filtrat mit DI-Wasser auf 500 ml. Zu sterilisierende Medien autoklavieren.
- Ergänzen Sie das geschmolzene, gekühlte Medium mit einem geeigneten Antibiotikum (z. B. Hygromycin B, Geneticin), wenn Sie mit transformativen Stämmen arbeiten. Die Endkonzentrationen von Hygromycin oder Geneticin in 500 ml Medien betragen 250 μg/ml bzw. 100 μg/ml.
- Kulturen unter optimalen Bedingungen inkubieren, bis sich ein sporulierendes Myzel entwickelt hat. Colletotrichum graminicola und S. maydis gedeihen gut bei 23 °C bei kontinuierlichem Fluoreszenzlicht und Luftfeuchtigkeit. Die Sporulation erfolgt 7 Tage nach der Inokulation (dai) bei S. maydis bzw. 14 dai bei C. graminicola.
2. Impfungen der Blattscheide
- Glaswolle-Filtereinheit
- Verwenden Sie eine schwere Schere oder Schere, um die Kappe und etwa 0,5 mm vom konischen Boden eines 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens abzuschneiden (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie ein Stück Glaswolle (ca. 0,5 cm x 0,5 cm; siehe Materialtabelle) in das geschnittene Rohr, um das mittlere Loch abzudecken, wie in Abbildung 2 dargestellt.
- Tragen Sie beim Schneiden von Glaswolle Handschuhe, da Borosilikatglas Reizungen verursachen kann.
- Vorbereitung von Blattscheiden-Stützgestellen
- Schneiden Sie eine 96-Well-PCR-Platte ohne Rand (siehe Materialtabelle) in sechs zweispaltige (8 x 2 Wells) Stützracks, wie in Abbildung 3A dargestellt.
- Drehen Sie die Zweisäulen-Racks um, so dass die konischen Böden der Wells nach oben und die flachen Böden nach unten zeigen (Abbildung 3B).
- Legen Sie jede Stütze in eine Petriplatte aus Glas, die angefeuchtetes Filterpapier enthält, und decken Sie sie mit dem Deckel ab (siehe Materialtabelle). Diese Einheit fungiert als kleine Feuchtigkeitskammer für die Hüllen.
- Inokulum-Präparat
- Legen Sie für jeden Pilzstamm eine zusammengebaute Glaswolle-Filtereinheit in ein intaktes, steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Letzteres fungiert als Sammelröhrchen.
- Beschriften Sie die Röhrchen.
- Entnehmen Sie Konidien aus sporulierenden Kulturen, indem Sie zuerst jede Platte mit 3-4 ml sterilem DI-Wasser fluten. In einigen Fällen kann mehr Wasser erforderlich sein, um eine Flüssigkeitsschicht auf der Kolonieoberfläche zu erzeugen. Netzmittel sind bei diesem System nicht notwendig.
- Lösen Sie die Sporen aus dem Agar, indem Sie einen sterilen Stößel mit konischer Spitze (siehe Materialtabelle) verwenden, um gleichmäßig über die gesamte Platte zu kratzen.
- 1 ml der Sporensuspension aseptisch auf eine Glaswollefiltereinheit geben und die Sporen durch Schwerkraft in das Sammelröhrchen fließen lassen.
- Die Sammelröhrchen mit den filtrierten Sporensuspensionen werden bei 3.500 x g 5 min zentrifugiert. Die Sporen sollten am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens pelletiert werden.
HINWEIS: Das Zentrifugieren von C. graminicola-Sporen mit höheren Geschwindigkeiten als hier empfohlen führt zu einem erheblichen Verlust der Lebensfähigkeit. - Gießen Sie die Flüssigkeit in einen autoklavierbaren Behälter, fügen Sie 1 ml steriles DI-Wasser hinzu und rühren Sie vorsichtig, um die pelletierten Sporen zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie wie in Schritt 2.3.6.
- Waschen Sie die Sporen 3x, um alle Konidialmatrix zu entfernen, die Autoinhibitoren enthalten kann, die die Keimung oder Penetration verringern könnten.
- Nach dem dritten Waschen fügen Sie 300-500 μl steriles DI-Wasser hinzu, um die Sporen für die Quantifizierung zu resuspendieren.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer unter einem zusammengesetzten Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung, um die Sporenkonzentration zu bestimmen. Eine Sporenfärbung ist vor der Zählung nicht notwendig.
- Bereiten Sie eine 5 x 105 Sporen/ml Suspension mit sterilem DI-Wasser vor.
HINWEIS: Die Sporensuspension von C. graminicola kann nicht länger als 4 h bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, bevor sie schnell an Lebensfähigkeit verliert. Das Kühlen von Konidien erhöht nicht die Lebensfähigkeit.
- Scheiden-Impfungen
- Überprüfen Sie die relevanten Biosicherheitspraktiken und -verfahren, bevor Sie Pflanzen mit Pilzstämmen impfen.
- Entferne die Hülle vom ersten echten Blatt der V2-Sämlinge, indem du mit einem Daumennagel am überlappenden Rand der Scheide entlangfährst, und löse sie vorsichtig vom Trieb. Löse die Hülle von beiden Seiten des Sprosses, bevor du versuchst, sie zu entfernen.
- Schneiden Sie die geborgenen Blattscheiden in 3-5 cm große Segmente. Es ist nicht notwendig, die Hüllen vor der Impfung zu desinfizieren.
- Rollen Sie jedes Segment sehr vorsichtig ab, um die innere (adaxiale) Epidermisschicht freizulegen.
- Bereiten Sie die Hüllen für die Impfung vor und wickeln Sie die verbleibenden herausgeschnittenen Hüllen in ein feuchtes Papiertuch, um ein Austrocknen zu vermeiden.
- Geben Sie 20 μl der Pilzsporensuspension auf die Innenfläche in der Mitte des Mantelstücks, direkt über der Mittelrippe, wie in Abbildung 4 dargestellt.
- Legen Sie die inokulierten Blattscheiden waagerecht, mit der Mittelrippe nach unten, in die Halterung innerhalb einer Petriplatte aus Glas, die ein angefeuchtetes Filterpapier enthält, wie in Abbildung 5 dargestellt.
- Jedes Gestell fasst bis zu sieben Hüllen. Impfen Sie mindestens fünf Hüllen pro Stamm, um den Verlust von Replikaten zu kompensieren, der während der Probenvorbereitung oder Inkubation auftreten kann.
- Stellen Sie die kleinen Feuchtigkeitskammern in eine durchsichtige Aufbewahrungsbox, die mit angefeuchtetem Keimpapier ausgelegt ist (siehe Materialtabelle).
- Decken Sie die Schachtel mit dem Deckel ab. Die Box wird bei 23 °C mit kontinuierlicher Beleuchtung für den vorgesehenen Zeitverlauf bebrütet, der vom Pilz und den beobachteten Stadien der Pilzentwicklung abhängt. Eine Zusammenfassung des Zeitverlaufs für Maisschalen, die mit C. graminicola geimpft wurden, ist in Tabelle 1 enthalten.
- Kontrollieren Sie jeden Tag die Hüllen auf Anzeichen/Symptome von Krankheiten und halten Sie sowohl die Keim- als auch die Filterpapiere feucht. Die Blattscheiden können bis zu 6 Tage lang aufbewahrt werden, ohne dass es zu einem offensichtlichen Absterben oder Abbau der Pflanzenzellen kommt, wenn keine Inokulation durchgeführt wird.
Abbildung 2: Vorbereitung der Glaswolle-Filtereinheit. (A) Eine Glaswollekugel von 0,5 cm x 0,5 cm wird in das Mikrozentrifugenröhrchen 1 gelegt, dessen konischer Boden entfernt wurde. (B-C) Das Filterrohr wird dann in das Mikrozentrifugenröhrchen 2 gelegt, um eine zusammengebaute Filtereinheit für die Herstellung der Sporensuspension zu erzeugen. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Methode zum Schneiden einer 96-Well-PCR-Platte ohne Rand. (A) PCR-Platte, geschnitten in sechs Stützracks, 8 x 2 Wells. Ein Beispiel für eine einzelne Mantelstütze ist in (B) dargestellt. Blattscheiden werden waagerecht auf die Auflage gelegt. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Methode der Scheideninokulation. Einzelner Tropfen des Inokulums, der direkt auf die adaxiale Oberfläche des Mantelabschnitts aufgetragen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Inkubationsmethode der Scheide. Inokulierte Blatthüllen, die horizontal in einem Stützgestell in einer Petriplatte aus Glas platziert werden, die angefeuchtetes Filterpapier enthält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Lebendzell-Mikroskopie
- Probenvorbereitung für die Mikroskopie
- Spülen Sie die Scheidenteile vorsichtig mit sterilem DI-Wasser ab, um nicht anhaftende Sporen oder oberflächliches Pilzwachstum zu entfernen.
- Legen Sie die Hülle auf einen sauberen Objektträger aus Glas (siehe Materialtabelle), wobei die adaxiale (innere) Oberfläche des Hülsenstücks nach unten und die abaxiale (äußere) Oberfläche nach oben zeigt.
- Verwende eine neue einschneidige Rasierklinge (siehe Materialtabelle), um etwa 1 cm von den Scheidenenden abzuschneiden und den größten Teil des Laminagewebes auf beiden Seiten der Mittelrippe zu entfernen.
- Halten Sie die Rasierklinge in einem Winkel von 90° zur Scheide, um Gewebe von der abaxialen Mittelrippe zu rasieren und die Epidermisschicht auf der adaxialen Oberfläche über der inokulierten Stelle freizulegen. Versuchen Sie, eine gleichmäßige Dicke beizubehalten. Sobald die Blattscheiden rasiert sind, wird ein weiteres Trimmen nicht empfohlen, da dies die Probe beschädigen kann.
- Achten Sie darauf, dass die rasierten Partien nicht größer als 1 cm x 1 cm sind. Vermeiden Sie es, während dieses Vorgangs auf die Mitte der Hülle zu drücken. Wenn Sie mit Hüllen arbeiten, die mit verschiedenen Sporensuspensionen beimpft wurden, desinfizieren Sie die Handschuhe und wechseln Sie die Rasierklinge zwischen den Proben.
- Halten Sie einen sauberen Objektträger aus Glas bereit. Heben Sie das Mantelteil von einer Kante ab und übertragen Sie es vorsichtig auf einen neuen Objektträger. Die inokulierte (adaxiale) Oberfläche der Hülle sollte sich oben befinden, der Objektivlinse am nächsten. Montieren Sie die Abschnitte vorsichtig, um Schäden an Pilzstrukturen zu vermeiden.
- Tragen Sie 60 μl steriles DI-Wasser auf die Sektion auf und fügen Sie ein 24 mm x 60 mm großes Deckglas hinzu (siehe Materialtabelle). Tun Sie dies langsam, um Luftblasen zu vermeiden.
- Wenn Sie für die Mikroskopie bereit sind, versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack (siehe Materialtabelle), indem Sie einen kleinen Tropfen auf jede Kante geben und die Tropfen dann mit einem Nagellackpinsel verbinden, um eine nahtlose Versiegelung zu erzielen.
HINWEIS: Dieses Mantelprotokoll kann mit zytologischen Färbungen verwendet werden, z. B. 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), neutrales Rot oder Trypanblau, oder zur Beobachtung der Zellplasmolyse, um die Lebensfähigkeit von Pflanzenzellen zu bewerten. Bei Mantelfärbungen oder Zellplasmolyse-Assays darf das Deckglas nicht versiegelt werden. - Für Plasmolyse-Assays wird eine hypertone Lösung (0,75 M Saccharose oder 1 M Natriumchlorid) auf einen Rand des Deckglases gegeben und die Lösung mit einem gefalteten fusselfreien Seidenpapier über die Probe zum anderen Rand des Deckglases gezogen. Verwenden Sie für die Färbung eine ähnliche Methode, um die Färbelösung aufzutragen.
- Weitfeld-Mikroskopie
- Sobald die Blattscheiden auf Objektträgern montiert sind, untersuchen Sie sie mit einem Weitfeld-Lichtmikroskop mit 400-facher Vergrößerung auf Pilzbesiedelung.
- Um Pilzstrukturen im Detail zu beobachten, verwenden Sie ein Wasserimmersionsobjektiv anstelle von Öl, um eine bessere Bildqualität der Proben zu erzielen. Eine sphärische Aberration aufgrund einer Fehlanpassung des Brechungsindex kann zu einer Verschlechterung des Bildes führen. Wasserobjektive sind sowohl für Weitfeld-Lichtmikroskope als auch für konfokale Mikroskope erhältlich.
- Um die relative Menge der Besiedlung pro Hülle zu bestimmen, wird die Anzahl der Maiszellen, die von jeder Pilzeindringstelle eingedrungen sind, mit einem Weitfeld-Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung gezählt. Diese Quantifizierung ist ein geeigneter Screening-Schritt vor statistischen Analysen, bei denen Stämme, Behandlungen und/oder Entwicklungsstadien verglichen werden.
- Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
- Um fluoreszierende Proteine in Maisgewebe während der Entwicklung transgener Pilzstämme zu beobachten, müssen die grundlegenden Bildaufnahmeparameter angepasst werden. Ermitteln Sie die besten Anregungs-/Emissionseinstellungen basierend auf dem ausgewählten Fluoreszenzmarker.
HINWEIS: Ein 60-faches Wasserobjektiv ist vorzuziehen, wenn fluoreszierende Fusionen mit sezernierten Proteinen analysiert werden. Moderne konfokale Mikroskope verfügen über hochkorrigierte Wasserimmersionsobjektive, um Artefakte und Formfehler zu vermeiden. - Wenn die Bildgebung fluoreszierender Proteine in lebenden Zellen beabsichtigt ist, verwenden Sie untransformierte Pilzstämme als Kontrollen für die Autofluoreszenz. Verwenden Sie die folgenden Bildaufnahmeparameter, um die Dynamik von Pilzen und Wirten auf einem inversen konfokalen Mikroskop und für das fluoreszierende mCherry-Protein zu erfassen. Stellen Sie die Laserleistung auf bis zu 5 %, 450-600 Hochspannung (HV) je nach Expressionsniveau, 1,375-fache Verstärkung, 3 % Offset, einen optischen Zoomfaktor von 1 für die Analyse von bis zu fünf Maiszellen pro Abschnitt und einen optischen Zoomfaktor von 2-5 für einzelne Hyphen ein.
HINWEIS: Hochauflösende konfokale Z-Stack-Bilder liefern dreidimensionale Daten und eine bessere Sicht auf Echtzeit-Interaktionen zwischen Wirt und Erreger. - Für die Quantifizierung von Fluoreszenzintensitäten, die den sezernierten Fusionsproteinen entsprechen, verwenden Sie eine Bildanalysesoftware des konfokalen Herstellers oder ein Bildverarbeitungsprogramm wie ImageJ, das kostenlos online heruntergeladen werden kann. In einem Handbuch finden Sie weitere Informationen zur entsprechenden Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen.
- Um fluoreszierende Proteine in Maisgewebe während der Entwicklung transgener Pilzstämme zu beobachten, müssen die grundlegenden Bildaufnahmeparameter angepasst werden. Ermitteln Sie die besten Anregungs-/Emissionseinstellungen basierend auf dem ausgewählten Fluoreszenzmarker.
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Representative Results
Die folgenden Beispiele beschreiben repräsentative Ergebnisse nach der Anwendung der Inokulationsmethode mit Maisblattscheiden. Diese Beispiele zeigen, wie einfach, schnell und präzise die Beobachtung und der Vergleich von Mais-Pilz-Interaktionen mit diesem optimierten Assay in Echtzeit durchgeführt werden können. Die Bildgebung lebender Zellen ermöglicht auch die Extraktion quantitativer Informationen und ist ein nützliches Werkzeug für vergleichende molekulare, zytologische und physiologische Studien. Weitere Details finden Sie in den Originalpublikationen, die zu jeder erfolgreichen Bewerbung zitiert werden.
Beispieldaten 1: Einsatz von Färbung und Plasmolyse in inokulierten Blattscheiden zur Beurteilung des Pilzstatus und zum Nachweis von Pflanzenreaktionen auf Pilzinfektionen
Maisblattscheiden wurden verwendet, um die Infektionsprozesse von Colletotrichum graminicola und Stenocarpella maydis in lebenden Wirtszellen mit Hellfeldmikroskopie sichtbar zu machen und zu vergleichen, was eine detaillierte Beschreibung von Besiedlungsmustern und Zeitverläufen ermöglicht (unveröffentlichte Ergebnisse; Abbildung 6).
Diese Studien zeigten, dass S. maydis schnell über undifferenzierte Hyphenschwellungen direkt in Epidermiszellen eindringt, im Gegensatz zu C. graminicola, das melanisierte Appressorien produziert. Im Inneren der Epidermiszellen wandern beide Erreger von Zelle zu Zelle, indem sie scheinbar intakte Zellwände passieren (Abbildung 6A,B).
Die Hüllen können mit Trypanblau oder DAPI gefärbt werden, um die Art und das Ausmaß der Besiedlung von Pilzhyphen leichter beurteilen zu können (Abbildung 6). Die Färbung von Trypanblau zeigt, dass C. graminicola zunächst über dicke primäre Hyphen eindringt, die sich durch sehr schmale Verbindungen zwischen den Zellen bewegen. Später wechselt der Pilz in ein nekrotrophes Stadium und produziert dünnere sekundäre Hyphen im Zentrum der Kolonie (Abbildung 6 C-E)12,14,16,17.
Abbildung 6: Ungefärbte oder gefärbte inokulierte Maisblattscheiden, aufgenommen mit Hellfeld- oder Epifluoreszenzmikroskopie. (A) Intrazelluläre Hyphen 48 h nach der Inokulation (hpi ) mit Stenocarpella maydis. Die Infektion erfolgt über leicht geschwollene Hyphenspitzen (Pfeil). (B) Intrazelluläre Hyphen 48 hpi mit Colletotrichum graminicola. Die Infektion erfolgt über melanisierte Appressorien (Pfeile). (C) Hyphen von C. graminicola, mit Trypanblau gefärbt, am vorrückenden Kolonierand über schmale Verbindungen von Zelle zu Zelle fortschreitend (Pfeil), 72 hpi. (D) Nahaufnahme einer trypanblau gefärbten Hyphe von C. graminicola bei 72 hpi, die die Maiszellwand über eine schmale Verbindung durchquert (Pfeil). (E) Hyphen von C. graminicola, mit Trypanblau gefärbt, im Koloniezentrum 72 hpi. Schmalere sekundäre Hyphen sind zu sehen, die aus den dickeren primären Hyphen (Pfeile) hervorgehen. (F) Hyphen von C. graminicola 72 hpi, am vorrückenden Kolonierand auf einer mit DAPI gefärbten Blattscheide. Die gefärbten Pilz- und Pflanzenkerne fluoreszieren unter UV-Licht. Maßstabsleisten in jedem Panel entsprechen 50 μm. Mikroskopische Aufnahmen, die mit einer monochromatischen Digitalkamera in Verbindung mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Hüllen können mit neutralem Rot gefärbt und/oder einer Plasmolyse unterzogen werden, um die Zytologie der Entwicklung und Lebensfähigkeit von Maiszellen während der Infektion und Besiedlung durch pathogene Pilze zu untersuchen (Abbildung 7).
Colletotrichum graminicola ist ein hemibiotropher Pilz, der mit dicken primären Hyphen, die durch eine Membran vom Zytoplasma des Wirts getrennt sind, in lebende Maiszellen eindringt (Abbildung 7A-C)12,14,16,17. Stenocarpella maydis hingegen ist ein nekrotropher Pilz, der ein Phytotoxin23 produziert und die Epidermiszellen (die granuliert werden und nicht plasmolysieren) abtötet, bevor er in sie eindringt (Abbildung 7D).
Die Abwehr von Mais gegen C. graminicola und andere Blattpathogene umfasst die Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), insbesondere Wasserstoffperoxid (H2O2)12,15. Um die oxidative Chemie von Pflanzen-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, kann 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) für die Zellfärbung verwendet werden24. DAB wird durchH2O2oxidiert, wobei ein dunkelbrauner Niederschlag entsteht, der in den Maisblattscheiden sichtbar ist (Abbildung 7 E,F)12,24. Die Produktion des Pigments ist ein Indikator für einen oxidativen Ausbruch, der mit einer Resistenzreaktion des Wirts zusammenhängt.
Abbildung 7: Gefärbte und/oder plasmolysierte inokulierte Maisblattscheiden, aufgenommen mit Hellfeldmikroskopie. (A) Blattscheide, die mit C. graminicola 24 hpi inokuliert und einer Plasmolyse und Färbung mit neutralem Rot unterzogen wurde. Lebende Maiszellen unter Appressoria (Pfeile) plasmolysieren und färben sich, was zeigt, dass der Erreger die Zellen vor der Invasion nicht abtötet. (B) Blattscheide 48 hpi mit C. graminicola, plasmolysiert und mit neutralem Rot gefärbt. Maiszellen, die von primären Hyphen (Pfeil) besiedelt sind, sind noch am Leben, was beweist, dass C. graminicola als Biotroph in Zellen eindringt. (C) Blattscheide 48 hpi mit C. graminicola, die zeigt, wie sich die Hyphen am vorrückenden Rand der Kolonie von Zelle zu Zelle bewegen. Die Hüllen wurden plasmolysiert, aber nicht gefärbt. Nicht kolonisierte Zellen, die an den Kolonierand angrenzen (Pfeile), setzen die Plasmolyse fort. (D) Blattscheide 24 hpi mit S. maydis, vor dem Eindringen. Die Zellen unter der gekeimten Spore (Pfeil) erscheinen granuliert und können nicht plasmolysiert werden, was darauf hindeutet, dass S. maydis sie vor dem Eindringen abtötet und dass es sich wie ein Nekrotroph verhält. (E) Blattscheide von resistentem Mais, Inzucht Mp305 24 hpi mit C. graminicola und gefärbt mit DAB. Die dunkle Färbung deutet auf eine starke oxidative Reaktion der einzelnen Zelle in der Mitte des Bildes hin, während Halos aus braunem Pigment zu sehen sind, die den größten Teil der einzelnen Appressorien umgeben, und eine Granulation in den Zellen am oberen Rand des Fotos beobachtet werden kann. (F) Eine genauere Ansicht der Halos aus braunem Pigment, die sich um die Appressorien angesammelt haben, und die Ablagerung von Pigmenten in den Maiszellwänden in der Nähe (Pfeile). Maßstabsbalken in jedem Feld entsprechen 50 μm, mit Ausnahme von (F), das 20 μm beträgt. Mikroskopische Aufnahmen, die mit einer monochromatischen Digitalkamera in Verbindung mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Beispieldaten 2: Lebendzell-Bildgebung mit Pilzen, die fluoreszierende Proteine exprimieren
Pilzhyphen, die zytoplasmatisch fluoreszierende Proteine exprimieren, können mit Hilfe eines Epifluoreszenz- oder konfokalen Mikroskops mit hoher Auflösung in lebenden Scheidenzellen sichtbar gemacht werden, ohne dass irgendwelche Färbungen erforderlich sind (Abbildung 8).
Fluoreszierende Proteine können auf verschiedene Pilzorganellen gerichtet werden, z. B. auf die Mitochondrien, Zellkerne oder das Endomembransystem, um ihre Position und Aktivität in den lebenden Pilzzellen in planta zu verfolgen (Abbildung 8C)25,26,27,28 (unveröffentlichte Ergebnisse). Fluoreszierende Proteine können auch von verschiedenen Pilzpromotoren angetrieben werden, um als Reporter für verschiedene Funktionen zu dienen: Zum Beispiel wird RFP gezeigt, die durch das BiP-Chaperon-Sekretionsstressantwortprotein gesteuert wird (Abbildung 8D)29 (unveröffentlichte Ergebnisse). Die Verwendung von Blattscheiden ermöglicht die Visualisierung von individuell markierten fluoreszierenden Fusionsproteinen, die von Pilzhyphen akkumuliert und abgesondert werden, wenn sie Wirtszellen besiedeln 8,9 (Abbildung 8E). Transgene Maislinien, die fluoreszierende Proteine exprimieren, die auf verschiedene zelluläre Kompartimente, z. B. Zellkerne oder Plasmamembranen, abzielen, sind ebenfalls verfügbar30,31 und können für Inokulationen verwendet werden, um die Auswirkungen einer Infektion auf Maiszellstrukturen, z. B. Zellkerne, zu bewerten. Die Verwendung dieser transgenen Maislinien zeigte, dass Zellkerne in nicht invasiven Maiszellen typischerweise zu der Zellwand wandern, die Zellen am nächsten ist, die bereits von C. graminicola besiedelt sind (unveröffentlichte Ergebnisse; Abbildung 8F).
Abbildung 8: Epifluoreszenz- (A, B) oder konfokale (C, D, E, F) Bildgebung von Colletotrichum graminicola, die fluoreszierende Proteine exprimieren. (A) Ungefärbte, plasmolysierte Blattscheide 48 hpi mit einem C. graminicola-Stamm, der mRFP zytoplasmatisch unter der Kontrolle des ToxA-Promotors34 exprimiert. Eine signifikante Autofluoreszenz wird auch in diesen Blattscheiden festgestellt. (B) Ungefärbte Blattscheide 48 hpi mit einem C. graminicola-Stamm, der SGFP zytoplasmatisch unter der Kontrolle des ToxA-Promotors exprimiert. (C)Colletotrichum graminicola, das SGFP exprimiert, das auf das Endomembransystem mit einem HDEL-Ankergerichtet ist 35. (D) Ungefärbte Blattscheide 24 hpi mit C. graminicola, transformiert mit mRFP unter der Kontrolle des Promotors für das C. graminicola-Homolog des BiP-Chaperons. Die rote Fluoreszenz in der primären Hyphe ist ein Indikator für die BiP-Aktivierung als Reaktion auf Sekretionsstress. (E) Akkumulation des Fusionsproteins Arabinofuranosidase::mCherry in der primären Hyphe von C. graminicola WT, die die Zellwand der Maisblattscheide bei 44 hpi durchquert. (F) Blattscheide einer transgenen Maislinie, die YFP exprimiert, die auf die Pflanzenkerne30, 31, 48 hpi gerichtet ist, mit einem Stamm von C. graminicola, der mRFP zytoplasmatisch unter der Kontrolle des ToxA-Promotors exprimiert. Die Maßstabsbalken in jedem Panel entsprechen 20 μm, mit Ausnahme von Panel A, wo sie 50 μm entspricht. Die Aufnahmen wurden mit einer monochromatischen Digitalkamera in Verbindung mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Die Bilder in (C-F) wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Beispieldaten 3: Verwendung von Maisblattscheiden zur Untersuchung der detaillierten Zytologie von kompatiblen/inkompatiblen Reaktionen und Interaktionen zwischen Pilzstämmen
Ein nicht-pathogener C. graminicola-Mutantenstamm (cpr1 MT) wurde mit dem Wildtyp-Stamm (WT) in Maisblattscheiden verglichen (Abbildung 9A,B)12.
Die Bildgebung der mit zytoplasmatisch fluoreszierenden Proteinen markierten Stämme in lebenden Zellen zeigte, dass die Mutante in der Bewegung von Zelle zu Zelle innerhalb der Maisblattscheiden spezifisch beeinträchtigt war. Das Schleusenprotokoll ermöglichte eine präzise Quantifizierung, die zeigte, dass die cpr1 MT in 95 % der Fälle auf die erste kolonisierte Zelle beschränkt war (Abbildung 9C)12. Dies stand in deutlichem Kontrast zur WT, bei der weniger als 5% der Infektionen im gleichen Zeitraum in der ersten kolonisierten Zelle verblieben12. Interessanterweise war der cpr1 MT in der Lage, saprophytisch über die erste anfänglich infizierte Zelle hinaus in lokal gefriertoten Hüllen zu wachsen, wie der WT-Stamm (Abbildung 9D). Dies deutet darauf hin, dass die Unfähigkeit der cpr1 MT zur Kolonisierung spezifisch mit einer aktiven Reaktion der lebenden Maiszelle zusammenhängt.
Der Blattscheiden-Inokulationsassay wurde verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen den GFP-exprimierenden cpr1-MT- und RFP-exprimierenden WT-Stämmen zu testen, indem sie auf derselben Blattscheide co-inokuliertwurden 12. Wenn die Stämme dicht beieinander inokuliert wurden (nicht mehr als 8 Maiszellen voneinander entfernt), konnte die cpr1 MT normal als biotroph von Zelle zu Zelle wachsen (Abbildung 9E,F). Plasmolyse-Assays bestätigten, dass der cpr1 MT-Pilz in lebende Zellen eingedrungenist 12. All diese detaillierten Beobachtungen wurden durch die Sheath-Assays ermöglicht und implizierten die Existenz eines diffusiblen Faktors, der die Kompatibilität induziert, die durch den WT-Stamm von C. graminicola erzeugt wird, aber im cpr1 MT12 fehlt.
Abbildung 9: Kompatible und inkompatible Interaktionen zwischen WT- und cpr1 MT-Stämmen von Colletotrichum graminicola. Die Verwendung verschiedener fluoreszierender Proteine ermöglichte die Unterscheidung der beiden Stämme bei der Co-Inokulation auf Maisblattscheiden12. (A) Der WT C. graminicola-Stamm, der zytoplasmatisches mRFP in Maisblattscheiden bei 48 hpi exprimiert. (B) Der Stamm C. graminicola cpr1 MT, der SGFP in Maisblattscheiden bei 72 hpi exprimiert. Das cpr1 MT kolonisiert nur selten (<5% der Zeit) über die erste infizierte Zelle hinaus, auch nicht bis zu 6 Tage nach der Inokulation. (C) Eine genauere Betrachtung des C. graminicola cpr1 MT-Stammes, der SGFP bei 72 dpi exprimiert. In diesem Fall gelang es ihm, die Zellwand in die nächste Zelle zu durchqueren, aber dann hörte er auf, sich zu entwickeln. (D) Der C. graminicola cpr1 MT-Stamm, der SGFP, 48 hpi in abgetötetem Scheidengewebe exprimiert. Der Stamm cpr1 MT besiedelt nichtlebende Maisscheidenzellen schnell, ähnlich wie der WT. (E) Wenn die Stämme WT-mRFP C. graminicola und cpr1 MT-GFP C. graminicola dicht beieinander auf Maisblattscheiden (48 hpi) co-inokuliert werden, erlangt der cpr1 MT-GFP-Stamm die Fähigkeit zurück, sich als biotropher Typ normal durch lebende Maisscheidenzellen zu bewegen. Das biotrophe Wachstum in den lebenden Zellen wurde durch Plasmolyse-Assays bestätigt. (F) Eine genauere Betrachtung des Stamms C. graminicola cpr1 MT, der SGFP exprimiert und von Zelle zu Zelle wächst, wenn er neben dem WT inokuliert wird (nicht mehr als 8 Maiszellen voneinander entfernt). Die Maßstabsbalken entsprechen 50 μm (A, B und E) oder 20 μm (C, D und F). Die Aufnahmen wurden mit einer monochromatischen Digitalkamera in Verbindung mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Inokulierte Hüllen wurden auch verwendet, um Gewebe für die RNA-Extraktion für die Analyse der Transkriptionsaktivität herzustellen32,33. Die Hüllen waren ideal für diesen Zweck, da sie vor der Extraktion inspiziert werden konnten, um den Infektionsprozess zu überwachen und so die Einheitlichkeit der Proben über mehrere Replikationen hinweg zu gewährleisten. Diese Studien ermöglichten die Identifizierung von Wellen unterschiedlich exprimierter Gene zwischen Colletotrichum-Übergangsstadien 32,33.
Beispieldaten 4: Ergebnisse suboptimaler Experimente
Eine unbefriedigende Bildgebung lebender Zellen kann auf eine unzureichende Beschneidung der Blattscheiden zurückzuführen sein, was zu überlappenden epidermalen Zellschichten und optisch undurchsichtigen Proben führt (Abbildung 10).
Abbildung 10: Suboptimales Versuchsergebnis durch unzureichendes Trimmen der Blattscheiden.( A) Beispiel für mehrere epidermale Zellschichten, die die Untersuchung der Pilzentwicklung invivo stören. (B) Beispiel für überlappende Zellschichten, die die Bildgebung lebender Zellen beeinflussen. Maßstabsbalken gleich 20 μm. Die Aufnahmen wurden mit einer monochromatischen Digitalkamera in Verbindung mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ein weiteres potenziell suboptimales Versuchsergebnis ist eine unangepasste Inokulumkonzentration, die zu einer niedrigen (Abbildung 11A) oder hohen Anzahl von Sporen führen kann: Letzteres kann zu einer verminderten Keimung oder appressoriellen Penetration führen (Abbildung 11B). Letzteres kann auch die Quantifizierung von Maiszellen erschweren, die an jeder Pilzeindringstelle besiedelt sind.
Abbildung 11: Suboptimales Versuchsergebnis aufgrund einer falsch eingestellten Inokulumkonzentration. Niedrige Konzentration der C. graminicola-Sporensuspension , die auf die Scheiden inokuliert wurde, führte zu einer geringen Anzahl von Pilzpenetrationsstellen. B. Eine hohe Konzentration von C. graminicola Inoculum auf den Blattscheiden verursacht multiple Appressorien in unmittelbarer Nähe und eine verminderte Penetration der Wirtszellen. Maßstabsbalken gleich 20 μm. Die Aufnahmen wurden mit einer monochromatischen Digitalkamera in Verbindung mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zeit der mikroskopischen Beobachtung (hpi) | Entwicklungsstadium von C. graminicola geimpft auf Maisblattscheiden |
| 12 | Appressorien |
| 24 | Primäre Hyphen |
| 36 | Sekundäre Hyphen |
| 48 | Sekundäre Hyphen |
| 60 | Acervuli |
| 72 | Acervuli |
| 108 | Acervuli |
Tabelle 1: Zeitverlauf der Colletotrichum graminicola-Infektion: Zusammenfassung des Zeitverlaufs von Maisblattscheiden, die mit C. graminicola-Stamm M1.001 geimpft wurden, basierend auf Meilensteinen der Pilzentwicklung während der Lebensstilumstellung. Mikroskopische Beobachtungen wurden alle 12 h durchgeführt.
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Discussion
Die hier beschriebene optimierte Blattscheideninokulationsmethode ist modifiziert von einem Originalprotokoll, das für Reisblattscheiden entwickelt wurde und auf Reisblattscheiden angewendet wurde 6,8,36. Es ermöglicht direkte, detaillierte Beobachtungen des Pilzwachstums und der Pilzentwicklung in lebenden Pflanzenzellen entweder mit Weitfeld- oder konfokaler Mikroskopie. Das Protokoll eignet sich für die Charakterisierung, den Vergleich und die Quantifizierung einer Vielzahl von mikroskopischen Phänomenen während der Maisbesiedlung, einschließlich der Pilzentwicklung und der Wirtsreaktionen während kompatibler versus inkompatibler Interaktionen; Produktion und Sekretion spezifischer Pilzproteine in planta; und Zytologie und Biochemie von häufigen oder neuen Pathogenitätsfaktoren, die während der Mais-Pilz-Interaktion produziert werden. Wir haben diese Methode bei hemibiotrophen und nekrotrophen Krankheitserregern von Mais angewendet. Wir haben keine Impfungen mit biotrophen Krankheitserregern (z.B. Rostpilzen) versucht, aber die Hüllen, da sie noch am Leben sind, wären auch für diese Anwendung nützlich. Wir haben diese Methode auch auf Sorghumscheiden angewendet, um die Zytologie der Wirts- und Kultivarresistenz zu untersuchen 7,37. Bei Sorghumscheiden bestand die einzige Anpassung des Protokolls darin, die gesamte Hülle mit einer Sporensuspension zu füllen, anstatt einen einzigen Tropfen in die Mitte aufzutragen. Dies war aufgrund des geringeren Durchmessers der Sorghumhüllen notwendig.
Die Verwendung dieser Scheidenassays hat unsere detaillierten Studien zu den Mechanismen der Wirtsbesiedlung und der Pilzmoleküle, die für die Pathogenität entscheidend sind, erheblich vorangebracht. Die Anwendung der Methode zeigte beispielsweise die Nicht-Wirtserkennung von C. sublineola durch Mais und von C. graminicola durch Sorghum, einschließlich überempfindlicher Resistenzreaktionen in beiden Fällen7. Maisblattscheiden wurden auch verwendet, um Wechselwirkungen zwischen Pilzstämmen aus der Ferne auf derselben Scheide zu testen. In diesem Fall zeigte die Co-Inokulation eines pathogenen WT- und eines nicht-pathogenen cpr1 MT-Stammes auf lebenden Hüllen die Induktion der Suszeptibilität von Maiszellen durch den WT-Stamm und lieferte Hinweise auf einen diffusiblen Faktor, der an der Pathogenität beteiligt ist12. Die Hüllen ermöglichten die Differenzierung der beiden Stämme, die unterschiedliche fluoreszierende Proteine exprimieren, sowie die Quantifizierung und den statistischen Vergleich des Kolonisierungsprozesses für die Stämme, die entweder allein oder zusammen inokuliert wurden.
Dieser Maisblattscheiden-Assay hat mehrere Vorteile gegenüber Ganzpflanzen-Inokulationen für die Bildgebung lebender Zellen. Erstens bietet das Protokoll eine überlegene Bildgebung von Krankheitserregern, die mit lebenden Wirtszellen interagieren, ohne dass eine Klärung oder Fixierung erforderlich ist. So ermöglichten Studien mit Maisblattscheiden den Nachweis eines deutlichen Wechsels von Biotrophie zu Nekrotrophie in hemibiotrophen C. graminicola und ermöglichten funktionelle Vergleiche mit einer nicht-pathogenen Mutante 7,12,16,17. Obwohl herausgeschnittene Reisblattscheiden, die mit M. oryzae geimpft wurden, Berichten zufolge Symptome aufweisen können, die nicht denen entsprechen, die bei ganzen Reispflanzen beobachtet wurden36, ist der Zeitpunkt und das Auftreten der Kolonisierung, des Gewebekollapses und der Läsionsentwicklung in Maisscheiden ähnlich wie bei ganzen Blättern12,14. Ein zweiter Vorteil des Scheidenassays besteht darin, dass er eine größere Synchronizität zwischen den Replikationen und eine experimentelle Reproduzierbarkeit der Pilzbesiedlung zeigt12,18. Während die Inokulation der gesamten Pflanze zu einer unregelmäßigen Penetration der Pilze führen kann18, sorgen die stärker kontrollierten Bedingungen der Scheidenimpfungen für mehr Synchronizität und ermöglichen eine genauere Untersuchung und Quantifizierung der Wechselwirkungen. Diese erhöhte Synchronizität erleichterte die Verwendung der Hüllen in Transkriptomanalysen32,33. Darüber hinaus ermöglichte das Schleusenprotokoll die notwendige Geschwindigkeit der Probenvorbereitung für die Transkriptomanalyse: Das Trimmen, Spülen und Screening jeder Hülle dauerte nicht länger als 2 Minuten, bevor sie für die RNA-Extraktion schockgefroren wurde32,33.
Zu den entscheidenden Schritten für eine erfolgreiche Bildgebung der Infektion durch lebende Zellen gehören: 1) Die Hüllen sollten unmittelbar nach dem Schneiden für Experimente verwendet werden. Herausgeschnittene inokulierte Hüllen sollten nicht länger als 6 Tage aufbewahrt werden: Wenn die Pilzbesiedlung stark ist, werden sie schneller abgebaut12; 2) Achten Sie darauf, Hüllen zu wählen, die das gleiche Entwicklungsalter haben, um reproduzierbarere Ergebnisse zu gewährleisten. 3) Verwenden Sie eine frische Sporensuspension aus Kulturen, die eine maximale Sporulation erreicht haben; 4) Verwenden Sie scharfe Rasierklingen für ein effizienteres Trimmen, um optisch klare Proben zu erzeugen. 5) Minimieren Sie übermäßige und unnötige Manipulationen von Proben, da sich dieser Prozess negativ auf Live-Strukturen und Bildqualität auswirken kann. 6) Überprüfen Sie die Feuchtigkeitskammern täglich, um sicherzustellen, dass das Filterpapier ausreichend feucht ist. und 7) Wenn Sie Proben mit einem konfokalen Mikroskop abbilden, halten Sie die Aufnahmeeinstellungen während des Experiments fest, um Intensitätsänderungen oder Verzerrungen beim Vergleich von Fluoreszenzsignalen zwischen Proben zu vermeiden. Fluoreszierende Proteine können photobleichen, wenn die Laserintensität und -dauer zu hoch sind, und sie können schwächere Signale liefern, wenn Gewebeschnitte über einen längeren Zeitraum unter einem versiegelten Deckglas aufbewahrt werden. Vorläufige Experimente, einschließlich aller geeigneten Kontrollen, sollten durchgeführt werden, um Bedingungen, Materialien und Zeitpläne zu standardisieren und zu optimieren, um möglichst reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Fehlerbehebung
Das Trimmen von Hand reicht nicht aus, um optisch klare Hüllen herzustellen
Es ist möglich, dass die Rasierklinge stumpf geworden ist. Wenn dies der Fall ist, entsorgen Sie es ordnungsgemäß und wechseln Sie zu einer neuen einschneidigen Rasierklinge. Üben Sie mäßigen Druck aus und halten Sie die Klinge in einem Winkel von 90° zur Scheide. Kratzen Sie die Probe vorsichtig, aber gleichmäßig ab, bis Sie einen flachen und durchscheinenden Abschnitt sehen. Es ist ratsam, die Hüllen unter einem zusammengesetzten Mikroskop zu überprüfen, bevor Sie mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fortfahren.
Inokulierte Maisscheide ist extrem zerbrechlich
Dies tritt auf, wenn der Pilz den größten Teil des Pflanzengewebes besiedelt hat. In der Folge wird das Gewebe abgebaut und kollabiert. Wenn Sie Proben vorbereiten, die sich bereits im nekrotrophen Stadium befinden, drücken Sie den Abschnitt vorsichtig gegen einen Objektträger, tragen Sie einen Tropfen steriles DI-Wasser auf und kratzen Sie die Probe ein- bis zweimal mit einem sauberen Deckglas ab.
Geringe Sporenkeimung und -penetration in vivo
Dies kann auf eine hohe Anzahl von Sporen zurückzuführen sein, die die Keimung oder das Eindringen hemmen. Stellen Sie sicher, dass die Inokulumkonzentration auf 5 x 105 Sporen/ml eingestellt ist. Wenn das Problem weiterhin besteht, stellen Sie die Konzentration auf 5 x 104 Sporen/ml ein. Als Kontrolle für das In-vivo-Experiment werden 50 μl der gleichen Sporensuspension auf eine frische PDA-Platte gegeben und gleichmäßig verteilt. Überprüfen Sie täglich die Lebensfähigkeit und Keimung der Sporen.
Asynchrone Pilzentwicklungsstadien über Scheiden hinweg
Stellen Sie sicher, dass sich die Maispflanzen im gleichen Wachstumsstadium befinden und die Scheidenabschnitte aus demselben Knoten stammen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Sporen lebensfähig sind und sich die Pilzkulturen im optimalen Stadium befinden (z. B. nicht länger als 2 Wochen alte Kulturen für C. graminicola) für die Inokulumvorbereitung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben und nichts offenzulegen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken USDA-NIFA für die finanzielle Unterstützung (Fördernummern 2018-67013-28489 und 2020-70410-32901). Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Manuskript zum Ausdruck gebracht werden, sind ausschließlich die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten des US-Landwirtschaftsministeriums wider. Wir danken der brasilianischen Gaststudentin von Science Without Borders, Mayara de Silva, für die Bilder, die in Abbildung 6A und in Abbildung 7D zu sehen sind. Wir danken auch der Abteilung für Pflanzenpathologie an der University of Kentucky für den Zugang zu den konfokalen Mikroskopen von Olympus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
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