Summary
Este manuscrito detalha um protocolo de inoculação otimizado que utiliza bainhas de folhas de milho destacadas para estudos citológicos, fisiológicos e moleculares reprodutíveis de interações do milho com fitopatógenos fúngicos. As bainhas foliares facilitam a observação em tempo real das interações celulares entre a planta viva e o fungo em tecidos não fixos.
Abstract
Otimizamos um protocolo para inocular bainhas foliares de milho com fungos hemibiotróficos e necrotróficos foliares patogênicos. O método é modificado a partir de um originalmente aplicado em bainhas de folhas de arroz e permite a observação microscópica direta do crescimento e desenvolvimento de fungos em células vivas de plantas. Bainhas foliares coletadas de plântulas de milho com dois colares de folhas completamente emergidos são inoculadas com gotas de 20 μL de suspensões de esporos fúngicos de 5 x 105 esporos/mL e incubadas em câmaras de umidade a 23 °C sob luz fluorescente contínua. Após 24-72 h, o excesso de tecido é removido com uma lâmina de barbear para deixar uma única camada de células epidérmicas, uma amostra opticamente clara que pode ser fotografada diretamente sem a necessidade de fixação química ou clareamento. Células de plantas e fungos permanecem vivas durante todo o experimento e as interações podem ser visualizadas em tempo real. As bainhas podem ser coradas ou submetidas à plasmólise para estudar a citologia do desenvolvimento e a viabilidade das células do hospedeiro e do patógeno durante a infecção e colonização. Cepas fúngicas transformadas para expressar proteínas fluorescentes podem ser inoculadas ou co-inoculadas nas bainhas para maior resolução e para facilitar a avaliação de interações competitivas ou sinérgicas. Cepas fúngicas expressando proteínas de fusão fluorescente podem ser usadas para rastrear e quantificar a produção e o direcionamento dessas proteínas individuais em planta. Tecidos da bainha inoculados podem ser extraídos para caracterizar ácidos nucléicos, proteínas ou metabólitos. O uso destes ensaios de bainha tem avançado muito os estudos detalhados dos mecanismos de patogenicidade fúngica em milho e também de efetores de proteínas fúngicas e metabólitos secundários que contribuem para a patogenicidade.
Introduction
Análises espaciais e temporais em nível celular são críticas para o entendimento da fisiologia e citologia das interações fúngico-planta. Tecidos foliares quimicamentefixados1,2,3 ou clareados4, bem como membranas artificiais5, têm sido utilizados no passado para investigar a citologia do desenvolvimento de patógenos foliares e interações planta-fungos. No entanto, a investigação de eventos infecciosos em tecidos vivos do hospedeiro em tempo real, sem fixação ou clareamento, é um desafio devido a questões técnicas relacionadas à preparação de amostras opticamente transparentes para obtenção de imagens.
Um protocolo de inoculação em bainha de folha destacada foi desenvolvido no final da década de 1940 para investigação microscópica de campo brilhante da resistência de células epidérmicas vivas de arroz ao fungo da brusone do arroz Magnaporthe oryza6. Mais recentemente, observações moleculares, fisiológicas e citológicas detalhadas da colonização do hospedeiro por espécies de Colletotrichum e Magnaporthe foram grandemente facilitadas pela combinação de versões modificadas desse método de bainha foliar com transformadores fúngicos expressando proteínas fluorescentes e protocolos de imagem de células vivas de alto desempenho, incluindo epifluorescência e microscopia confocal 7,8,9,10,11,12,13.
Este trabalho detalha um protocolo de inoculação otimizado utilizando bainhas foliares destacadas de milho para observação de processos de infecção por patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos e necrotróficos. Nós o usamos especificamente para estudar Colletotrichum graminicola (C. graminicola), o agente causal da requeima das folhas da antracnose e da podridão do colmo, e Stenocarpella maydis, que causa a queima das folhas de Diplodia e a podridão do colmo. No entanto, o método deve ser aplicável a outros patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos e necrotróficos. As respostas citológicas e fisiológicas durante eventos de infecção e colonização nessas bainhas excisadas são semelhantes àquelas em lâminas foliares inteiras12,14,15. Além disso, a colonização hemibiotrófica das células epidérmicas da bainha por C. graminicola é semelhante à colonização das células da medula do pedúnculo16,17. Bainhas destacadas apresentam maior sincronicidade e reprodutibilidade experimental da penetração e colonização de fungos do que lâminas foliares ou tecidos da medula do pedúnculo14,16,17,18. A maioria das variedades de milho pode ser utilizada para este protocolo. No entanto, endogâmicas ou híbridos com excesso de pigmentos roxos nas bainhas são menos adequados, uma vez que os pigmentos interferem na imagem. O milho doce Golden Jubilee tem sido particularmente útil para nossos estudos porque sementes não tratadas estão disponíveis comercialmente, as plantas são altamente suscetíveis a muitas doenças foliares e crescem bem em casa de vegetação. As primeiras epidemias de podridão do colmo da antracnose nos Estados Unidos resultaram na perda total das lavouras de milho doce em Indiana na década de1970 19,20. Este método de inoculação da bainha foliar pode ser aplicado para observar e quantificar diretamente o crescimento e desenvolvimento fúngico em células vegetais vivas versus mortas localmente, para demonstrar reações de resistência em respostas compatíveis/incompatíveis à infecção fúngica e para testar interações entre cepas fúngicas na mesma bainha em tempo real.
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Protocol
Observação : o fluxo de trabalho para o método é mostrado na Figura 1.
Figura 1: Etapas do protocolo de inoculação otimizado utilizando bainhas de folhas de milho destacadas. O preparo da suspensão de esporos, a inoculação da bainha foliar e o preparo da amostra para microscopia de células vivas são destacados nas caixas verde (A), roxa (B) e laranja (C), respectivamente. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Material vegetal e fúngico
- Crescimento vegetal
- Cultivar mudas de milho (ver Tabela de Materiais) na estufa (14 h claro/27 °C e 10 h escuro/22 °C) em recipientes SC10 (ver Tabela de Materiais). Use um meio de crescimento composto por três partes de solo de vaso comercial (consulte a Tabela de Materiais) e duas partes de solo superficial esterilizado a vapor.
- Regue as mudas por 2 min com um sistema de irrigação aérea uma vez por dia, pela manhã.
- Colher mudas no estádio V2, cortando-as ao nível do solo. O estádio de crescimento V2 é atingido quando as plântulas têm de 5 a 10 cm de altura e duas folhas visíveis com colarinho21.
- Embrulhe as plantas com uma toalha de papel úmida e coloque-as em um saco plástico para transporte ao laboratório para processamento posterior.
- Culturas fúngicas
- Reativar culturas estoque de sílica fúngica armazenadas em condições assépticas22polvilhando aproximadamente 50 grânulos da sílica infestada em meio ágar apropriado. Para evitar alterações morfológicas e perda de patogenicidade, as cepas de subcultivo não mais do que 3x após a reativação. O ágar batata-dextrose (PDA; ver Tabela de Materiais) é rotineiramente usado para cultivar C. graminicola, enquanto o ágar aveia (OA; ver Tabela de Materiais) é usado para S. maydis.
- Para preparar o BDA para a cultura de estoques fúngicos, suspender 19,5 g de PDA desidratado preparado comercialmente em 500 mL de água deionizada (DI). Para fazer OA, ferva 36 g de OA desidratado preparado comercialmente em água DI por 15-30 min, filtre através de três camadas de pano de queijo e leve o filtrado a 500 mL com água DI. Meios de autoclave para esterilização.
- Aumente o meio fundido e resfriado com um antibiótico apropriado (por exemplo, higromicina B, geneticina) ao trabalhar com cepas transformantes. As concentrações finais de higromicina ou geneticina em 500 mL de meio são de 250 μg/mL e 100 μg/mL, respectivamente.
- Incubar culturas em condições ótimas até que um micélio esporulante tenha se desenvolvido. Colletotrichum graminicola e S. maydis crescem bem a 23 °C com luz fluorescente contínua e níveis de umidade ambiente. A esporulação ocorre 7 dias após a inoculação (dai) para S. maydis ou 14 dai para C. graminicola.
2. Inoculações da bainha foliar
- Montagem da unidade de filtro de lã de vidro
- Use tesouras ou tesouras para serviço pesado para cortar a tampa e aproximadamente 0,5 mm do fundo cônico de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (consulte a Tabela de Materiais).
- Coloque um pedaço de lã de vidro (aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm; ver Tabela de Materiais) dentro do tubo cortado para cobrir o orifício central, conforme ilustrado na Figura 2.
- Use luvas ao cortar lã de vidro, pois o vidro borossilicato pode causar irritação.
- Preparação de cremalheiras de apoio de bainha foliar
- Corte uma placa de PCR de 96 poços não contornada (consulte a Tabela de Materiais) em seis racks de suporte de duas colunas (8 x 2 poços), conforme ilustrado na Figura 3A.
- Inverta os racks de duas colunas de modo que os fundos cônicos dos poços fiquem voltados para cima e os topos planos voltados para baixo (Figura 3B).
- Coloque cada suporte em uma placa de Petri de vidro contendo papel de filtro umedecido e cubra com a tampa (consulte Tabela de Materiais). Esta unidade funciona como uma pequena câmara de umidade para as bainhas.
- Preparação do inóculo
- Para cada cepa fúngica, coloque uma unidade de filtro de lã de vidro montada em um tubo de microcentrífuga estéril intacto de 1,5 mL, conforme ilustrado na Figura 2. Este último funciona como um tubo de coleta.
- Rotule os tubos.
- Colher conídios de culturas esporulantes inundando primeiro cada placa com 3-4 mL de água DI estéril. Mais água pode ser necessária em alguns casos para produzir uma camada de líquido na superfície da colônia. Agentes umectantes não são necessários neste sistema.
- Solte os esporos do ágar usando um pilão estéril de ponta cônica (ver Tabela de Materiais) para raspar uniformemente em toda a placa.
- Aplicar 1 ml da suspensão de esporos numa unidade filtrante de lã de vidro de forma asséptica e permitir que os esporos fluam para o tubo de recolha por gravidade.
- Centrifugar os tubos de coleta contendo as suspensões de esporos filtrados a 3.500 x g por 5 min. Os esporos devem ser peletizados no fundo do tubo da microcentrífuga.
NOTA: A centrifugação de esporos de C. graminicola em velocidades mais altas do que as recomendadas aqui resulta em uma perda significativa de viabilidade. - Despeje o líquido em um recipiente autoclavável, adicione 1 mL de água DI estéril e agite suavemente para ressuspender os esporos peletizados. Centrifugar como no passo 2.3.6.
- Lave os esporos 3x para remover qualquer matriz conidial que possa conter autoinibidores que possam reduzir a germinação ou penetração.
- Após a terceira lavagem, adicionar 300-500 μL de água DI estéril para ressuspender os esporos para quantificação.
- Use um hemocitômetro sob um microscópio composto em aumento de 100x para determinar a concentração de esporos. A coloração de esporos não é necessária antes da contagem.
- Preparar uma suspensão de 5 x 105 esporos/mL com água DI estéril.
NOTA: A suspensão de esporos de C. graminicola pode ser mantida à temperatura ambiente por não mais de 4 h antes da rápida perda de viabilidade. A refrigeração dos conídios não aumenta a viabilidade.
- Inoculações de bainha
- Verificar as práticas e procedimentos de biossegurança relevantes antes de inocular plantas com cepas fúngicas.
- Retire a bainha da primeira folha verdadeira de mudas V2 passando uma miniatura ao longo da margem sobreposta da bainha e solte-a suavemente da parte aérea. Solte a bainha de ambos os lados do rebento antes de tentar removê-la.
- Corte as bainhas foliares recuperadas em segmentos de 3-5 cm. Não é necessário desinfetar as bainhas antes da inoculação.
- Desenrolar cada segmento muito suavemente para expor a camada epidérmica interna (adaxial).
- Ao preparar bainhas para inoculação, mantenha as bainhas excisadas restantes embrulhadas com uma toalha de papel úmida para evitar a dessecação.
- Colocar 20 μL da suspensão de esporos fúngicos na superfície interna, no centro da bainha, diretamente acima da nervura central, como mostra a Figura 4.
- Coloque as bainhas foliares inoculadas horizontalmente, com a nervura central colocada na parte inferior, no suporte dentro de uma placa de Petri de vidro contendo um papel de filtro umedecido, conforme ilustrado na Figura 5.
- Cada rack comporta até sete bainhas. Inocular pelo menos cinco bainhas por cepa para compensar a perda de réplicas que possa ocorrer durante a preparação ou incubação da amostra.
- Coloque as pequenas câmaras de humidade numa caixa de armazenamento transparente forrada com papel de germinação humedecido (ver Tabela de Materiais).
- Cubra a caixa com a tampa. Incubar a caixa a 23 °C com iluminação contínua para o curso de tempo pretendido, que depende do fungo e dos estágios de desenvolvimento fúngico que serão observados. Um resumo do curso temporal para bainhas de milho inoculadas com C. graminicola é apresentado na Tabela 1.
- Verifique todos os dias se há sinais/sintomas de doença nas bainhas e mantenha os papéis de germinação e de filtro úmidos. As bainhas foliares podem ser retidas por até 6 dias sem morte ou degradação celular vegetal óbvia na ausência de inoculação.
Figura 2: Preparação da unidade filtrante de lã de vidro. (A) Uma esfera de lã de vidro de 0,5 cm x 0,5 cm é colocada dentro do tubo de microcentrífuga 1 que tem seu fundo cônico removido. (B-C) O tubo do filtro é então colocado no tubo de microcentrífuga 2 para gerar uma unidade de filtro montada para a preparação da suspensão de esporos. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Método de corte de uma placa de PCR de 96 poços não contornada. (A) Placa de PCR cortada em seis racks de apoio, 8 x 2 poços. Um exemplo de um único suporte de bainha é descrito em (B). As bainhas foliares são colocadas horizontalmente sobre o suporte. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Método de inoculação da bainha. Uma gota de inóculo aplicada diretamente na superfície adaxial do corte da bainha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Método de incubação da bainha. Bainhas foliares inoculadas colocadas horizontalmente em uma prateleira de suporte dentro de uma placa de Petri de vidro contendo papel de filtro umedecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Microscopia de células vivas
- Preparação da amostra para microscopia
- Enxágue suavemente as peças da bainha com água DI estéril para remover quaisquer esporos não aderidos ou crescimento fúngico superficial.
- Coloque a bainha em uma lâmina limpa de microscópio de vidro (ver Tabela de Materiais) com a superfície adaxial (interna) da bainha voltada para baixo e a superfície abaxial (externa) mais superior.
- Use uma nova lâmina de barbear de borda única (consulte Tabela de Materiais) para cortar aproximadamente 1 cm das extremidades da bainha e remover a maior parte do tecido da lâmina em ambos os lados da nervura central.
- Segure a lâmina de barbear em um ângulo de 90° em relação à bainha para raspar o tecido da nervura central abaxial e expor a camada epidérmica na superfície adaxial acima do ponto inoculado. Procure manter uma espessura uniforme. Uma vez que as bainhas das folhas são raspadas, não é recomendado um corte adicional, pois isso pode danificar a amostra.
- Certifique-se de que as seções raspadas não tenham mais de 1 cm x 1 cm de tamanho. Evite pressionar o centro da bainha durante este processo. Ao trabalhar com bainhas inoculadas com diferentes suspensões de esporos, desinfete as luvas e troque a lâmina de barbear entre as amostras.
- Mantenha uma lâmina de microscópio de vidro limpa pronta. Levante a seção da bainha de uma borda e transfira-a cuidadosamente para uma nova corrediça. A superfície inoculada (adaxial) da bainha deve ser mais superior, mais próxima da lente objetiva. Monte seções suavemente para evitar danos às estruturas fúngicas.
- Aplicar 60 μL de água DI estéril na secção e adicionar uma lamínula de vidro de 24 mm x 60 mm (ver Tabela de Materiais). Faça isso lentamente para evitar bolhas de ar.
- Quando estiver pronto para a microscopia, sele a lamínula com esmalte transparente (consulte Tabela de Materiais) colocando uma pequena gota em cada borda e, em seguida, conectando as gotas com uma escova de esmalte para fazer uma vedação sem costura.
NOTA: Este protocolo de bainha pode ser usado com colorações citológicas, por exemplo, 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), vermelho neutro ou azul de tripano, ou para observação de plasmólise celular para avaliar a viabilidade de células vegetais. Para ensaios de coloração de bainha ou plasmólise celular, não sele a lamínula. - Para ensaios de plasmólise, adicionar uma solução hipertônica (sacarose 0,75 M ou cloreto de sódio 1 M) a uma borda da lamínula e usar um papel higiênico dobrado sem fiapos para desenhar a solução através da amostra até a outra borda da lamínula. Para a coloração, use um método semelhante para aplicar a solução de mancha.
- Microscopia de campo largo
- Uma vez que as bainhas foliares estejam montadas em lâminas de microscópio, inspecione-as quanto à colonização fúngica usando um microscópio de luz de campo largo com aumento de 400x.
- Para observar as estruturas fúngicas em detalhes, use uma objetiva de imersão em água em vez de óleo para melhor qualidade de imagem das amostras. A aberração esférica devido a uma incompatibilidade de índice de refração pode causar degradação da imagem. As objetivas de água estão disponíveis para microscópios de luz de campo largo, bem como microscópios confocais.
- Para determinar a quantidade relativa de colonização por bainha, conte o número de células de milho invadidas de cada local de penetração fúngica usando um microscópio de luz de campo largo em aumento de 100x. Essa quantificação é uma etapa de triagem apropriada antes de qualquer análise estatística comparando cepas, tratamentos e/ou estágios de desenvolvimento.
- Microscopia confocal de varredura a laser
- Para observar proteínas fluorescentes em tecidos de milho durante o desenvolvimento de cepas fúngicas transgênicas, ajustar os parâmetros básicos de aquisição de imagens. Identifique as melhores configurações de excitação/emissão com base no marcador fluorescente selecionado.
NOTA: Uma objetiva de água de 60x é preferível ao analisar fusões fluorescentes construídas com proteínas secretadas. Os microscópios confocais modernos têm objetivas de imersão em água altamente corrigidas para evitar artefatos e aberrações de forma. - Se a imagem de células vivas de proteínas fluorescentes for pretendida, use cepas fúngicas não transformadas como controles para autofluorescência. Use os seguintes parâmetros de aquisição de imagem para capturar a dinâmica fúngico-hospedeiro em um microscópio confocal invertido e para a proteína fluorescente mCherry. Ajuste a potência do laser até 5%, 450-600 de alta tensão (HV) dependendo do nível de expressão, ganho de 1,375 X, deslocamento de 3%, fator de zoom óptico de 1 para a análise de até cinco células de milho por seção e fator de zoom óptico de 2-5 para hifas individuais.
NOTA: Imagens confocais Z-stack de alta resolução fornecem dados tridimensionais e uma melhor visualização das interações em tempo real entre o hospedeiro e o patógeno. - Para quantificar as intensidades de fluorescência correspondentes às proteínas de fusão secretadas, use um software de análise de imagem do fabricante confocal ou um programa de processamento de imagem como o ImageJ, que pode ser baixado gratuitamente on-line. Consulte um manual para obter detalhes sobre como quantificar sinais fluorescentes de acordo.
- Para observar proteínas fluorescentes em tecidos de milho durante o desenvolvimento de cepas fúngicas transgênicas, ajustar os parâmetros básicos de aquisição de imagens. Identifique as melhores configurações de excitação/emissão com base no marcador fluorescente selecionado.
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Representative Results
Os exemplos a seguir descrevem resultados representativos após o uso do método de inoculação em bainha de milho. Esses exemplos demonstram a facilidade, a velocidade e a precisão com que a observação e a comparação das interações milho-fungo podem ser realizadas em tempo real com este ensaio otimizado. A imagem de células vivas também permite a extração de informações quantitativas, fornecendo uma ferramenta útil para estudos moleculares, citológicos e fisiológicos comparativos. Mais detalhes podem ser encontrados nas publicações originais citadas para cada candidatura bem-sucedida.
Dados de exemplo 1: Uso de coloração e plasmólise em bainhas foliares inoculadas para avaliação do estado fúngico e detecção de respostas de plantas à infecção fúngica
Bainhas foliares de milho têm sido utilizadas para visualizar e comparar os processos de infecção de Colletotrichum graminicola e Stenocarpella maydis em células hospedeiras vivas com microscopia de campo claro, permitindo descrições detalhadas dos padrões de colonização e cursos temporais (resultados não publicados; Gráfico 6).
Esses estudos revelaram que S. maydis invade rapidamente as células epidérmicas diretamente através de edemas hifais indiferenciados, ao contrário de C. graminicola que produz apressórios melanizados. Uma vez dentro das células epidérmicas, ambos os patógenos procedem de célula em célula, passando através de paredes celulares aparentemente intactas (Figura 6A,B).
As bainhas podem ser coradas com azul de tripano ou DAPI para avaliar a natureza e a extensão da colonização mais fácil das hifas fúngicas (Figura 6). A coloração com azul de tripano revela que C. graminicola invade inicialmente através de hifas primárias espessas que se movem entre as células através de conexões muito estreitas. Posteriormente, o fungo muda para um estágio necrotrófico, produzindo hifas secundárias mais finas no centro da colônia (Figura 6 C-E)12,14,16,17.
Figura 6: Bainhas foliares de milho inoculadas não coradas ou coradas com microscopia de campo claro ou epifluorescência. (A) Hifas intracelulares 48 h após a inoculação (hpi ) com Stenocarpella maydis. A infecção ocorre através de pontas hifais levemente inchadas (seta). (B) Hifas intracelulares de 48 hpi com Colletotrichum graminicola. A infecção ocorre por apressórios melanizados (setas). (C) Hifas de C. graminicola, coradas com azul de tripano, progredindo célula a célula na borda da colônia avançada através de conexões estreitas (seta), 72 hpi. (D) Visão mais próxima da hifa corada com azul de tripano de C. graminicola a 72 hpi, passando pela parede celular do milho através de uma conexão estreita (seta). (E) Hifas de C. graminicola, coradas com azul de tripano, no centro colônia 72 hpi. Hifas secundárias mais estreitas podem ser vistas emergindo das hifas primárias mais espessas (setas). (F) Hifas de C. graminicola 72 hpi, na borda da colônia avançada sobre bainha foliar corada com DAPI. Os núcleos fúngicos e vegetais corados fluorescem sob luz UV. Barras de escala em cada painel igual a 50 μm. Micrografias obtidas utilizando câmera digital monocromática acoplada a microscópio de epifluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As bainhas podem ser coradas com vermelho neutro e/ou submetidas à plasmólise para estudar a citologia do desenvolvimento e a viabilidade das células do milho durante a infecção e colonização por fungos patogênicos (Figura 7).
Colletotrichum graminicola é um fungo hemibiotrófico que invade células vivas de milho com hifas primárias espessas que são separadas do citoplasma do hospedeiro por uma membrana (Figura 7A-C)12,14,16,17. Já Stenocarpella maydis é um fungo necrotrófico que produz uma fitotoxina23 e mata as células epidérmicas (que se tornam granuladas e não se plasmólizam) antes de invadi-las (Figura 7D).
A defesa do milho contra C. graminicola e outros patógenos foliares envolve o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs), particularmente peróxido de hidrogênio (H 2 O2)12,15. Para investigar a química oxidativa das interações planta-patógeno, a 3,3′-diaminobenzidina (DAB) pode ser usada para coloração celular24. O DAB é oxidado por H2 O2, produzindo um precipitado marrom escuro visível nas bainhas foliares do milho (Figura 7 E,F)12,24. A produção do pigmento é um indicador de uma explosão oxidativa relacionada a uma resposta de resistência do hospedeiro.
Figura 7: Bainhas foliares de milho inoculadas coradas e/ou plasmolizadas obtidas com microscopia de campo claro. (A) Bainha foliar inoculada com C. graminicola 24 hpi e submetida à plasmólise e coloração com vermelho neutro. Células vivas de milho sob apressórios (setas) plasmolizam e colorem, demonstrando que o patógeno não mata as células antes da invasão. (B) Bainha foliar de 48 hpi com C. graminicola, submetida à plasmólise e corada com vermelho neutro. Células de milho que são colonizadas por hifas primárias (seta) ainda estão vivas, estabelecendo que C. graminicola invade as células como biotrófico. (C) Bainha foliar de 48 hpi com C. graminicola, mostrando hifas movendo-se célula a célula na borda avançada da colônia. As bainhas foram plasmolizadas, mas não coradas. As células não colonizadas adjacentes à borda da colônia (setas) continuam a plasmolizar. (D) Bainha foliar 24 hpi com S. maydis, antes da penetração. As células abaixo do esporo germinado (seta) aparecem granuladas e não se plasmólizam, indicando que o S. maydis as mata antes da penetração e que se comporta como necrotrófico. (E) Bainha foliar de milho resistente endogâmico Mp305 24 hpi com C. graminicola e corado com DAB. A coloração escura indica uma forte resposta oxidativa da célula única no centro da imagem, enquanto halos de pigmento marrom podem ser vistos ao redor da maior parte dos apressórios individuais, e granulação pode ser observada nas células no topo da foto. (F) Uma visão mais próxima dos halos de pigmento marrom acumulados ao redor dos apressórios e deposição de pigmento nas paredes celulares do milho nas proximidades (setas). Barras de escala em cada painel igual a 50 μm, exceto para (F) que é de 20 μm. Micrografias obtidas utilizando câmera digital monocromática acoplada a microscópio de epifluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Dados de exemplo 2: Imagem de células vivas com fungos expressando proteínas fluorescentes
Hifas fúngicas expressando proteínas fluorescentes citoplasmáticas podem ser visualizadas em alta resolução em células vivas da bainha sem a necessidade de colorações usando epifluorescência ou microscópio confocal (Figura 8).
As proteínas fluorescentes podem ser direcionadas para várias organelas fúngicas, por exemplo, mitocôndrias, núcleos ou sistema de endomembrana, a fim de rastrear suas localizações e atividades nas células fúngicas vivas em planta (Figura 8C)25,26,27,28 (resultados não publicados). Proteínas fluorescentes também podem ser conduzidas por diferentes promotores fúngicos para servir como repórteres para várias funções: por exemplo, RFP impulsionado pela proteína de resposta ao estresse de secreção de chaperona BiP é mostrado (Figura 8D)29 (resultados não publicados). O uso de bainhas foliares permite a visualização de proteínas de fusão fluorescente marcadas individualmente que são acumuladas e secretadas pelas hifas fúngicas à medida que colonizam as células hospedeiras 8,9 (Figura 8E). Linhagens transgênicas de milho expressando proteínas fluorescentes direcionadas a vários compartimentos celulares, por exemplo, núcleos ou membrana plasmática, também estão disponíveis30,31 e podem ser usadas para inoculações para avaliar os efeitos da infecção sobre as estruturas celulares do milho, por exemplo, núcleos. O uso dessas linhagens transgênicas de milho demonstrou que núcleos em células de milho não invadidas tipicamente migram para a parede celular mais próxima de células já colonizadas por C. graminicola (resultados não publicados; Figura 8F).
Figura 8: Imagem de epifluorescência (A, B) ou confocal (C, D, E, F) de Colletotrichum graminicola expressando proteínas fluorescentes. (A) Bainha foliar plasmolizada de 48 hpi não corada com uma cepa de C. graminicola expressando citoplasmicamente mRFP sob o controle do promotor ToxA34. Autofluorescência significativa também é notada nessas bainhas foliares. (B) Bainha foliar não corada de 48 hpi com uma cepa de C. graminicola expressando SGFP citoplasmicamente sob o controle do promotor ToxA. (C)Colletotrichum graminicola expressando SGFP direcionado para o sistema endomembrana com âncora HDEL35. (D) Bainha foliar não corada de 24 hpi com C. graminicola transformada com mRFP sob o controle do promotor do homólogo C. graminicola da chaperona BiP. A fluorescência vermelha na hifa primária é um indicador da ativação do BiP em resposta ao estresse da secreção. (E) Acúmulo de arabinofuranosidase::mProteína de fusão cereja na hifa primária de C. graminicola WT que está atravessando a parede celular da bainha foliar do milho a 44 hpi. (F) Bainha foliar de uma linhagem transgênica de milho expressando YFP direcionada aos núcleos da planta30,31, 48 hpi com uma cepa de C. graminicola expressando mRFP citoplasmicamente sob o controle do promotor da ToxA. As barras de escala em cada painel são iguais a 20 μm, exceto no painel A, onde é igual a 50 μm. As micrografias foram obtidas utilizando-se uma câmera digital monocromática acoplada a um microscópio de epifluorescência. As imagens em (C-F) foram capturadas com um microscópio confocal de varredura a laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Dados de exemplo 3: Uso de bainhas foliares de milho para examinar a citologia detalhada de respostas compatíveis/incompatíveis e interações entre cepas fúngicas
Uma linhagem mutante não patogênica de C. graminicola (cpr1 MT) foi comparada à linhagem selvagem (WT) em bainhas foliares de milho (Figura 9A,B)12.
Imagens de células vivas das cepas marcadas com proteínas fluorescentes citoplasmáticas demonstraram que o mutante estava especificamente prejudicado no movimento de célula para célula dentro das bainhas foliares de milho. O protocolo da bainha permitiu uma quantificação precisa que revelou que a cpr1 MT estava confinada à primeira célula colonizada em 95% das vezes (Figura 9C)12. Isso contrastou fortemente com o TP, no qual menos de 5% das infecções permaneceram dentro da primeira célula colonizada no mesmo período de tempo12. Curiosamente, a cpr1 MT foi capaz de crescer saprofilicamente além da primeira célula inicialmente infectada em bainhas localmente congeladas, como a cepa WT (Figura 9D). Isso indicou que a incapacidade da cpr1 MT de colonizar estava especificamente relacionada a uma resposta ativa da célula viva de milho.
O ensaio de inoculação em bainha foliar foi utilizado para testar interações entre as cepas de MT cpr1 que expressam GFP e WT que expressam RFP, coinoculando-as na mesma bainha foliar12. Quando as cepas foram inoculadas próximas umas das outras (não mais do que 8 células de milho separadas), a cpr1 MT foi capaz de crescer normalmente como um biotrófico de célula para célula (Figura 9E,F). Ensaios de plasmólise confirmaram que o fungo cpr1 MT entrou em células vivas12. Todas essas observações detalhadas foram possíveis pelos ensaios de bainha e implicaram a existência de um fator difusível que induz a compatibilidade produzida pela cepa WT de C. graminicola, mas ausente na cpr1 MT12.
Figura 9: Interações compatíveis e incompatíveis envolvendo cepas WT e cpr1 MT de Colletotrichum graminicola. O uso de diferentes proteínas fluorescentes permitiu distinguir as duas linhagens quando co-inoculadas em bainhas foliares de milho12. (A) A cepa WT de C. graminicola expressando mRFP citoplasmático em bainhas foliares de milho a 48 hpi. (B) A cepa C. graminicola cpr1 MT expressando SGFP em bainhas foliares de milho a 72 hpi. A cpr1 MT raramente (<5% das vezes) coloniza além da primeira célula infectada, mesmo até 6 dias após a inoculação. (C) Uma visão mais detalhada da cepa C. graminicola cpr1 MT expressando SGFP a 72 dpi. Neste caso, ele conseguiu atravessar a parede celular para a próxima célula, mas depois parou de se desenvolver. (D) A cepa C. graminicola cpr1 MT expressando SGFP, 48 hpi em tecidos da bainha morta. A cepa cpr1 MT coloniza rapidamente células não vivas da bainha de milho, semelhante à WT. (E) Quando as cepas WT-mRFP C. graminicola e cpr1 MT-GFP C. graminicola são co-inoculadas juntas em bainhas foliares de milho (48 hpi), a cepa cpr1 MT-GFP recupera a capacidade de progredir através de células vivas da bainha de milho normalmente, como um biotrófico. O crescimento biotrófico no interior das células vivas foi confirmado por ensaios de plasmólise. (F) Uma visão mais próxima da cepa de C. graminicola cpr1 MT expressando SGFP, crescendo de célula a célula quando inoculada adjacente ao WT (não mais de 8 células de milho separadas). As barras de escala são iguais a 50 μm (A, B e E) ou 20 μm (C, D e F). As micrografias foram obtidas utilizando-se uma câmera digital monocromática acoplada a um microscópio de epifluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Bainhas inoculadas também têm sido utilizadas na produção de tecidos para extração de RNA para análise da atividade transcricional32,33. As bainhas eram ideais para este fim, uma vez que podiam ser inspecionadas antes da extração para monitorar o processo de infecção, garantindo assim a uniformidade da amostra em múltiplas replicações. Esses estudos permitiram a identificação de ondas de genes diferencialmente expressos entre os estágios de transição do estilo de vida de Colletotrichum 32,33.
Dados de exemplo 4: Resultados de experimentos subótimos
Imagens insatisfatórias de células vivas podem ser resultado do corte insuficiente das bainhas foliares, levando à sobreposição de camadas de células epidérmicas e amostras opticamente opacas (Figura 10).
Figura 10: Resultados experimentais subótimos devido ao corte insuficiente das bainhas foliares.( A) Exemplo de múltiplas camadas de células epidérmicas interferindo no exame do desenvolvimento fúngico in vivo. (B) Exemplo de sobreposição de camadas celulares que afetam imagens de células vivas. Barras de escala iguais a 20 μm. As micrografias foram obtidas utilizando-se uma câmera digital monocromática acoplada a um microscópio de epifluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Outro potencial resultado subótimo do experimento é uma concentração de inóculo não ajustada que pode resultar em baixo (Figura 11A) ou alto número de esporos: este último pode resultar em germinação reduzida ou penetração apressorial (Figura 11B). Este último também pode dificultar a quantificação de células de milho colonizadas em cada sítio de penetração fúngica.
Figura 11: Resultado subótimo do experimento devido à concentração de inóculo ajustada inadequadamente. Não. Baixa concentração de suspensão de esporos de C. graminicola inoculados nas bainhas, resultando em baixo número de sítios de penetração fúngica. Não. Alta concentração de inóculo de C. graminicola nas bainhas foliares, causando múltiplos apressórios próximos e reduzida penetração da célula hospedeira. Barras de escala iguais a 20 μm. As micrografias foram obtidas utilizando-se uma câmera digital monocromática acoplada a um microscópio de epifluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempo de observação microscópica (hpi) | Estádio de desenvolvimento de C. graminicola inoculada em bainhas foliares de milho |
| 12 | Apressório |
| 24 | Hifas primárias |
| 36 | Hifas secundárias |
| 48 | Hifas secundárias |
| 60 | Acervuli |
| 72 | Acervuli |
| 108 | Acervuli |
Tabela 1: Evolução temporal da infecção por Colletotrichum graminicola : Resumo do curso temporal das bainhas foliares de milho inoculadas com C. graminicola cepa M1.001 com base nos marcos do desenvolvimento fúngico ao longo da transição de estilo de vida. Observações microscópicas foram realizadas a cada 12 h.
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Discussion
O método otimizado de inoculação de bainha foliar aqui descrito é modificado de um protocolo original que foi desenvolvido e aplicado em bainhas foliares de arroz 6,8,36. Permite observações diretas e detalhadas do crescimento e desenvolvimento de fungos em células vegetais vivas com microscopia de campo amplo ou confocal. O protocolo é adequado para caracterização, comparação e quantificação de uma variedade de fenômenos microscópicos durante a colonização do milho, incluindo o desenvolvimento fúngico e respostas do hospedeiro durante interações compatíveis versus incompatíveis; produção e secreção de proteínas fúngicas específicas em planta; e citologia e bioquímica de fatores de patogenicidade comuns ou novos produzidos durante a interação milho-fungos. Utilizamos este método com patógenos hemibiotróficos e necrotróficos do milho. Não tentamos inoculações com patógenos biotróficos (por exemplo, fungos da ferrugem), mas as bainhas, uma vez que permanecem vivas, também seriam úteis para essa aplicação. Também aplicamos este método em bainhas de sorgo para investigações da citologia da resistência específica do hospedeiro e cultivar 7,37. Para as bainhas de sorgo, o único ajuste no protocolo foi preencher toda a bainha com suspensão de esporos, em vez de aplicar uma única gota no centro. Isso foi necessário devido ao menor diâmetro das bainhas de sorgo.
O uso desses ensaios de bainha tem avançado muito nossos estudos detalhados sobre os mecanismos de colonização do hospedeiro e moléculas fúngicas críticas para a patogenicidade. Por exemplo, a aplicação do método demonstrou o não reconhecimento do hospedeiro de C. sublineola pelo milho e de C. graminicola pelo sorgo, incluindo respostas de resistência hipersensíveis em ambos os casos7. Bainhas foliares de milho também foram utilizadas para testar interações entre cepas fúngicas à distância na mesma bainha. Neste caso, a co-inoculação de uma cepa patogênica de MT WT e cpr1 não patogênica em bainhas vivas demonstrou a indução de suscetibilidade de células de milho pela linhagem WT e forneceu evidências de um fator difusível envolvido na patogenicidade12. As bainhas permitiram a diferenciação das duas cepas expressando diferentes proteínas fluorescentes e a quantificação e comparação estatística do processo de colonização para as cepas inoculadas isoladamente ou em conjunto.
Este ensaio de bainha foliar de milho tem várias vantagens sobre inoculações de plantas inteiras para imagens de células vivas. Primeiro, o protocolo fornece imagens superiores, sem necessidade de limpeza ou fixação, de patógenos interagindo com células hospedeiras vivas em tempo real. Por exemplo, estudos utilizando bainhas foliares de milho permitiram a detecção de uma mudança distinta de biotrofia para necrotrofia em C. graminicola hemibiotrófica e facilitaram comparações funcionais com um mutante não patogênico 7,12,16,17. Embora bainhas de folhas de arroz excisadas inoculadas com M. oryzae possam apresentar sintomas que não correspondem aos observados em plantas inteiras de arroz36, o momento e o aparecimento da colonização, colapso tecidual e desenvolvimento de lesões em bainhas de milho são semelhantes aos de folhas inteiras12,14. Uma segunda vantagem do ensaio de bainha é que ele apresenta maior sincronicidade entre as replicações e reprodutibilidade experimental da colonização fúngica12,18. Enquanto a inoculação de plantas inteiras pode resultar em níveis irregulares de penetração fúngica18, as condições mais controladas das inoculações de bainha fornecem maior sincronicidade e permitem investigação e quantificação mais precisas das interações. Essa maior sincronicidade facilitou o uso das bainhas na análise do transcriptoma32,33. Além disso, o protocolo da bainha possibilitou a velocidade necessária de preparação da amostra para a análise do transcriptoma: corte, enxágue e triagem de cada bainha não levou mais do que 2 min antes de serem congeladas para extração de RNA32,33.
Etapas críticas para o sucesso da infecção por células vivas incluem: 1) Bainhas devem ser usadas imediatamente após o corte para experimentos. As bainhas inoculadas excisadas não devem ser retidas por mais de 6 dias: se a colonização fúngica for pesada, elas se degradarão mais rapidamente12; 2) Ter o cuidado de escolher bainhas que sejam da mesma idade de desenvolvimento para garantir resultados mais reprodutíveis; 3) Utilizar uma suspensão de esporos frescos de culturas que tenham atingido esporulação máxima; 4) Use lâminas de barbear afiadas para um corte mais eficiente para produzir amostras opticamente claras; 5) Minimizar a manipulação excessiva e desnecessária das amostras, pois esse processo pode impactar negativamente as estruturas vivas e a qualidade da imagem; 6) Verifique as câmaras de umidade diariamente para garantir que o papel de filtro esteja suficientemente úmido; e 7) Ao obter imagens de amostras em microscópio confocal, manter as configurações de aquisição fixas durante o experimento para evitar introduzir mudanças de intensidade ou viés ao comparar sinais fluorescentes entre amostras. As proteínas fluorescentes podem fotoclarear se a intensidade e a duração do laser forem muito altas, e podem dar sinais mais fracos se as seções de tecido forem mantidas sob uma lamínula selada por um longo tempo. Experimentos preliminares, incluindo todos os controles apropriados, devem ser realizados para padronizar e otimizar condições, materiais e cronogramas para os resultados mais reprodutíveis.
Solucionando problemas
O corte manual é insuficiente para produzir bainhas opticamente claras
É possível que a lâmina de barbear tenha se tornado maçante. Se esse for o caso, descarte-o corretamente e mude para uma nova lâmina de barbear de borda única. Use pressão moderada e mantenha a lâmina em um ângulo de 90° em relação à bainha. Raspar a amostra suavemente, mas de forma consistente, até observar uma secção plana e translúcida. É aconselhável verificar as bainhas sob um microscópio composto antes de prosseguir para o microscópio confocal de varredura a laser.
Bainha de milho inoculada é extremamente frágil
Isso ocorre quando o fungo colonizou a maior parte do tecido vegetal. Consequentemente, o tecido é degradado e entra em colapso. Ao preparar amostras que já estão no estágio necrotrófico, pressione suavemente a seção contra uma lâmina de microscópio, aplique uma gota de água DI estéril e raspe a amostra uma a duas vezes com uma lamínula limpa.
Baixa germinação e penetração de esporos in vivo
Isso pode ser devido a um alto número de esporos que inibem a germinação ou penetração. Certifique-se de que a concentração de inóculo está ajustada para 5 x 105 esporos/mL. Se o problema persistir, ajuste a concentração para 5 x 104 esporos/mL. Como controle para o experimento in vivo , colocar 50 μL da mesma suspensão de esporos em uma placa de PDA fresca e espalhe-a uniformemente. Verificar diariamente a viabilidade e germinação dos esporos.
Estágios assíncronos de desenvolvimento fúngico nas bainhas
Certifique-se de que as plantas de milho estão no mesmo estádio de crescimento e as seções da bainha foram obtidas do mesmo nó. Além disso, certifique-se de que os esporos sejam viáveis e que as culturas fúngicas estejam no estágio ideal (por exemplo, não mais do que culturas de 2 semanas de idade para C. graminicola) para a preparação do inóculo.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes e nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao USDA-NIFA por seu apoio financeiro (números de concessão 2018-67013-28489 e 2020-70410-32901). Quaisquer opiniões, achados, conclusões ou recomendações expressas neste manuscrito são exclusivamente dos autores e não refletem necessariamente as opiniões do Departamento de Agricultura dos EUA. Agradecemos à aluna visitante do Ciência sem Fronteiras, Mayara da Silva, pelas imagens que aparecem na Figura 6A e na Figura 7D. Também agradecemos ao Departamento de Fitopatologia da Universidade de Kentucky por fornecer acesso aos microscópios confocais Olympus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
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