Summary
Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.
Abstract
Mısır yaprağı kılıflarını hemibiotrofik ve nekrotrofik yaprak patojenik mantarlarla aşılamak için bir protokolü optimize ettik. Yöntem, orijinal olarak pirinç yaprağı kılıflarına uygulanandan modifiye edilmiştir ve canlı bitki hücrelerinde mantar büyümesi ve gelişiminin doğrudan mikroskobik gözlemine izin verir. İki adet tam yaprak boğazı ile mısır fidelerinden toplanan yaprak kılıfları, 20 μL damla 5 x 105 spor/mL mantar sporu süspansiyonu ile aşılanır ve sürekli floresan ışık altında 23 °C'de nem odalarında inkübe edilir. 24-72 saat sonra, kimyasal fiksasyon veya temizleme gerektirmeden doğrudan görüntülenebilen optik olarak berrak bir numune olan tek bir epidermal hücre tabakası bırakmak için fazla doku bir tıraş bıçağıyla çıkarılır. Bitki ve mantar hücreleri deney süresince canlı kalır ve etkileşimler gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir. Kılıflar, enfeksiyon ve kolonizasyon sırasında konakçı ve patojen hücrelerin gelişimsel sitolojisini ve canlılığını incelemek için boyanabilir veya plazmolize tabi tutulabilir. Floresan proteinleri eksprese etmek için dönüştürülen mantar suşları, daha fazla çözünürlük için ve rekabetçi veya sinerjik etkileşimlerin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için kılıflar üzerine aşılanabilir veya birlikte aşılanabilir. Floresan füzyon proteinlerini eksprese eden mantar suşları, plantadaki bu bireysel proteinlerin üretimini ve hedeflenmesini izlemek ve ölçmek için kullanılabilir. Aşılanmış kılıf dokuları, nükleik asitleri, proteinleri veya metabolitleri karakterize etmek için ekstrakte edilebilir. Bu kılıf tahlillerinin kullanımı, mısırda mantar patojenitesi mekanizmalarının ve ayrıca patojeniteye katkıda bulunan mantar protein efektörlerinin ve ikincil metabolitlerin ayrıntılı çalışmalarını büyük ölçüde ilerletmiştir.
Introduction
Hücresel düzeyde mekansal ve zamansal analizler, mantar-bitki etkileşimlerinin fizyolojisini ve sitolojisini anlamak için kritik öneme sahiptir. Kimyasal olarak sabitlenmiş 1,2,3 veya temizlenmiş ve boyanmış4 yaprak dokuları ve yapay zarlar5, geçmişte yaprak patojen gelişiminin sitolojisini ve bitki-mantar etkileşimlerini araştırmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, canlı konakçı dokulardaki enfeksiyon olaylarının fiksasyon veya temizleme olmadan gerçek zamanlı olarak araştırılması, görüntüleme için optik olarak şeffaf örneklerin hazırlanmasıyla ilgili teknik sorunlar nedeniyle zordur.
1940'ların sonlarında, canlı pirinç epidermal hücrelerinin pirinç patlaması mantarı Magnaporthe oryza6'ya karşı direncinin parlak alan mikroskobik araştırması için müstakil bir yaprak kılıfı aşılama protokolü geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, Colletotrichum ve Magnaporthe türleri tarafından konak kolonizasyonunun ayrıntılı moleküler, fizyolojik ve sitolojik gözlemleri, bu yaprak kılıfı yönteminin modifiye edilmiş versiyonlarının floresan proteinleri eksprese eden mantar dönüştürücüleri ve epifloresan ve konfokal mikroskopi dahil olmak üzere yüksek performanslı canlı hücre görüntüleme protokolleri ile birleştirilmesiyle büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır 7,8,9,10,11,12,13.
Bu makale, hemibiyotrofik ve nekrotrofik yaprak mantar patojenleri tarafından enfeksiyon süreçlerinin gözlemlenmesi için ayrılmış mısır yaprağı kılıfları kullanılarak optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Antraknoz yaprak yanıklığı ve sap çürüklüğünün etken maddesi olan Colletotrichum graminicola (C. graminicola) ve Diplodia yaprak yanıklığına ve sap çürümesine neden olan Stenocarpella maydis'i incelemek için özel olarak kullandık. Bununla birlikte, yöntem diğer hemibiotrofik ve nekrotrofik yaprak mantar patojenlerine uygulanabilir olmalıdır. Bu eksize edilen yaprak kılıflarında enfeksiyon ve kolonizasyon olayları sırasındaki sitolojik ve fizyolojik yanıtlar, tüm yaprak bıçaklarındakilerebenzerdir 12,14,15. Ayrıca, kılıf epidermal hücrelerinin C. graminicola tarafından hemibiyotrofik kolonizasyonu, sap öz hücrelerininkolonizasyonuna benzer 16,17. Müstakil kılıflar, mantar penetrasyonu ve kolonizasyonunun yaprak bıçaklarından veya sap özü dokularından daha fazla eşzamanlılık ve deneysel tekrarlanabilirlik gösterir14,16,17,18. Çoğu mısır çeşidi bu protokol için kullanılabilir. Bununla birlikte, kılıflarda aşırı mor pigmentlere sahip akrabalı veya melezler, pigmentler görüntülemeye müdahale ettiği için daha az uygundur. Golden Jubilee tatlı mısır, çalışmalarımız için özellikle yararlı olmuştur, çünkü işlenmemiş tohumlar ticari olarak temin edilebilir, bitkiler birçok yaprak hastalığına karşı oldukça hassastır ve serada iyi büyürler. Amerika Birleşik Devletleri'ndeki ilk antraknoz sap çürüklüğü salgınları, 1970'lerde Indiana'da tatlı mısır mahsullerinin toplam kaybına neden oldu19,20. Bu yaprak kılıfı aşılama yöntemi, canlı ve yerel olarak öldürülmüş bitki hücrelerinde mantar büyümesini ve gelişimini doğrudan gözlemlemek ve ölçmek, mantar enfeksiyonuna uyumlu/uyumsuz yanıtlarda direnç reaksiyonlarını göstermek ve aynı kılıf üzerindeki mantar suşları arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak test etmek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Yöntemin iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Ayrılmış mısır yaprağı kılıfları kullanılarak optimize edilmiş aşılama protokolündeki adımlar. Spor süspansiyon hazırlama, yaprak kılıfı aşılama ve canlı hücre mikroskobu için numune hazırlama sırasıyla yeşil (A), mor (B) ve turuncu (C) kutularda vurgulanmıştır. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. Bitki ve mantar materyali
- Bitki büyümesi
- Serada (14 saat açık/27 °C ve 10 saat karanlık/22 °C) SC10 kaplarda mısır fideleri (Malzeme Tablosuna bakınız) yetiştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Üç kısım ticari saksı toprağından (Malzeme Tablosuna bakınız) ve iki kısım buharla sterilize edilmiş üst topraktan oluşan bir büyüme ortamı kullanın.
- Fideleri sabahları her gün bir kez üstten sulama sistemi ile 2 dakika sulayın.
- Fideleri toprak seviyesinde keserek V2 aşamasında hasat edin. V2 büyüme aşamasına, fideler 5 ila 10 cm boyunda olduğunda ve iki görünür yakalı yaprağasahip olduğunda ulaşılır 21.
- Bitkileri nemli bir kağıt havluyla sarın ve daha sonraki işlemler için laboratuvara taşınmak üzere plastik bir torbaya koyun.
- Mantar kültürleri
- Depolanmış mantar silika stok kültürleriniaseptik koşullar altında yeniden etkinleştirin 22istila edilmiş silikanın yaklaşık 50 granülünü uygun bir agar ortamına serperek. Morfolojik değişiklikleri ve patojenite kaybını önlemek için, alt kültür suşları reaktivasyondan sonra 3x'ten fazla değildir. Patates dekstroz agar (PDA; Malzeme Tablosuna bakınız) rutin olarak C. graminicola kültüründe kullanılırken, yulaf ezmeli agar (OA; Malzeme Tablosuna bakınız) S. maydis için kullanılır.
- Mantar stoklarını kültürlemek için PDA'yı hazırlamak için, 500 mL deiyonize (DI) su içinde ticari olarak hazırlanmış 19.5 g susuz pda'yı askıya alın. OA yapmak için, ticari olarak hazırlanmış 36 g kurutulmuş OA'yı DI suda 15-30 dakika kaynatın, üç kat tülbentten süzün ve süzüntüyü DI su ile 500 mL'ye getirin. Sterilize etmek için otoklav ortamı.
- Transformant suşlarla çalışırken erimiş, soğutulmuş ortamı uygun bir antibiyotikle (örneğin, higromisin B, genetin) artırın. 500 mL ortamdaki nihai higromisin veya genetin konsantrasyonları sırasıyla 250 μg / mL ve 100 μg / mL'dir.
- Sporlanan bir miselyum gelişene kadar kültürleri en uygun koşullar altında inkübe edin. Colletotrichum graminicola ve S. maydis , sürekli floresan ışığı ve ortam nemi seviyeleri ile 23 ° C'de iyi büyür. Sporülasyon, S. maydis için aşılamadan (dai) 7 gün sonra veya C. graminicola için 14 dai gerçekleşir.
2. Yaprak kılıfı aşılamaları
- Camyünü filtre ünitesi montajı
- Kapağı ve 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün konik tabanından yaklaşık 1.5 mm kesmek için ağır hizmet tipi makas veya makas kullanın (bkz.
- Şekil 0.5'de gösterildiği gibi, orta deliği kapatmak için kesilen tüpün içine bir parça cam yünü (yaklaşık 0.5 cm x 2 cm; Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin.
- Borosilikat cam tahrişe neden olabileceğinden cam yünü keserken eldiven giyin.
- Yaprak kılıf destek raflarının hazırlanması
- Eteksiz 96 oyuklu bir PCR plakasını (Malzeme Tablosuna bakın) Şekil 8A'da gösterildiği gibi altı adet iki sütunlu (2 x 3 oyuklu) destek rafına kesin.
- İki sütunlu rafları, kuyuların konik tabanları yukarı ve düz üst kısımları aşağı bakacak şekilde çevirin (Şekil 3B).
- Her bir desteği nemli filtre kağıdı içeren bir cam Petri plakasına yerleştirin ve kapakla kapatın (bkz. Bu ünite, kılıflar için küçük bir nem odası işlevi görür.
- Aşı hazırlama
- Her mantar suşu için, monte edilmiş bir cam yünü filtre ünitesini, Şekil 2'de gösterildiği gibi sağlam bir steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. İkincisi, bir toplama tüpü olarak işlev görür.
- Tüpleri etiketleyin.
- Önce her bir plakayı 3-4 mL steril DI su ile doldurarak spor yapan kültürlerden conidia hasat edin. Bazı durumlarda koloni yüzeyinde bir sıvı tabakası oluşturmak için daha fazla su gerekebilir. Bu sistemde ıslatıcı maddelere gerek yoktur.
- Tüm plakayı eşit şekilde kazımak için steril bir konik uçlu havaneli ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak agardaki sporları gevşetin.
- 1 mL spor süspansiyonunu aseptik olarak bir cam yünü filtre ünitesine uygulayın ve sporların yerçekimi ile toplama tüpüne akmasına izin verin.
- Filtrelenmiş spor süspansiyonlarını içeren toplama tüplerini 3.500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Sporlar, mikrosantrifüj tüpünün dibinde peletlenmelidir.
NOT: C. graminicola sporlarının burada önerilenden daha yüksek hızlarda santrifüjlenmesi, önemli bir canlılık kaybına neden olur. - Sıvıyı otoklavlanabilir bir kaba dökün, 1 mL steril DI su ekleyin ve peletlenmiş sporları yeniden süspanse etmek için hafifçe çalkalayın. Adım 2.3.6'daki gibi santrifüjleyin.
- Çimlenmeyi veya penetrasyonu azaltabilecek otomatik inhibitörler içerebilecek herhangi bir konidiyal matrisi çıkarmak için sporları 3x yıkayın.
- Üçüncü yıkamadan sonra, miktar tayini için sporları yeniden süspanse etmek için 300-500 μL steril DI su ekleyin.
- Spor konsantrasyonunu belirlemek için 100x büyütmede bileşik mikroskop altında bir hemositometre kullanın. Saymadan önce spor boyama gerekli değildir.
- Steril DI su ile 5 x 105 spor/mL süspansiyon hazırlayın.
NOT: C. graminicola spor süspansiyonu, hızlı canlılık kaybından önce oda sıcaklığında 4 saatten fazla tutulamaz. Soğutma conidia canlılığı artırmaz.
- Kılıf aşıları
- Bitkileri mantar suşları ile aşılamadan önce ilgili biyogüvenlik uygulamalarını ve prosedürlerini kontrol edin.
- Kılıfın üst üste binen kenarı boyunca bir küçük resim geçirerek kılıfı V2 fidelerinin ilk gerçek yaprağından çıkarın ve sürgünden yavaşça gevşetin. Çıkarmaya çalışmadan önce kılıfı çekimin her iki tarafından gevşetin.
- Geri kazanılan yaprak kılıflarını 3-5 cm'lik parçalar halinde kesin. Aşılamadan önce kılıfların yüzeyini dezenfekte etmek gerekli değildir.
- İç (adaksiyal) epidermal tabakayı ortaya çıkarmak için her bir parçayı çok nazikçe açın.
- Kılıfları aşılama için hazırlarken, kurumasını önlemek için kalan eksize edilmiş kılıfları nemli bir kağıt havluyla sarılı tutun.
- Şekil 20'te gösterildiği gibi, kılıf parçasının ortasındaki iç yüzeye, doğrudan orta kaburganın üzerine 4 μL mantar sporu süspansiyonu yerleştirin.
- Aşılanmış yaprak kılıflarını, Şekil 5'te gösterildiği gibi nemli bir filtre kağıdı içeren bir cam Petri plakasının içindeki desteğe orta kaburga altta olacak şekilde yatay olarak yerleştirin.
- Her raf yedi adede kadar kılıf tutar. Numune hazırlama veya inkübasyon sırasında meydana gelebilecek kopya kaybını telafi etmek için suş başına en az beş kılıf aşılayın.
- Küçük nem odalarını nemli çimlenme kağıdıyla kaplı şeffaf bir saklama kutusuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Kutuyu kapakla örtün. Kutuyu 23 °C'de, mantara ve gözlemlenecek mantar gelişim aşamalarına bağlı olarak amaçlanan zaman boyunca sürekli aydınlatma ile inkübe edin. C. graminicola ile aşılanmış mısır kılıfları için zaman seyrinin bir özeti Tablo 1'de verilmiştir.
- Kılıflarda hastalık belirtileri/semptomları olup olmadığını her gün kontrol edin ve hem çimlenmeyi hem de filtre kağıtlarını nemli tutun. Yaprak kılıfları, aşılama yokluğunda belirgin bitki hücresi ölümü veya bozulması olmadan 6 güne kadar tutulabilir.
Şekil 2: Camyünü filtre ünitesinin hazırlanması. (A) Konik tabanı çıkarılmış mikrosantrifüj tüpü 1'in içine 0,5 cm x 0,5 cm'lik bir cam yünü top yerleştirilir. (İ.Ö.) Filtre tüpü daha sonra spor süspansiyon hazırlığı için monte edilmiş bir filtre ünitesi oluşturmak üzere mikrosantrifüj tüpü 2'ye yerleştirilir. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Eteksiz 96 oyuklu bir PCR plakasını kesme yöntemi. (A) PCR plakası altı destek rafına kesilmiş, 8 x 2 kuyucuk. Tek bir kılıf desteği örneği (B )'de gösterilmiştir. Yaprak kılıfları destek üzerine yatay olarak döşenir. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kılıf aşılama yöntemi. Kılıf bölümünün adaksiyal yüzeyine doğrudan uygulanan tek damla aşılama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kılıf inkübasyon yöntemi. Aşılanmış yaprak kılıfları, nemlendirilmiş filtre kağıdı içeren bir cam Petri plakasının içindeki bir destek rafına yatay olarak yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Canlı hücre mikroskobu
- Mikroskopi için numune hazırlama
- Yapışmamış sporları veya yüzeysel mantar büyümesini gidermek için kılıf parçalarını steril DI suyla nazikçe durulayın.
- Kılıfı, kılıf parçasının adaksiyal (iç) yüzeyi aşağı bakacak ve abaksiyal (dış) yüzey en üstte olacak şekilde temiz bir cam mikroskop lamına ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin.
- Kılıf uçlarından yaklaşık 1 cm kesmek için yeni bir tek kenarlı tıraş bıçağı kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve orta damarın her iki tarafındaki lamina dokusunun çoğunu çıkarın.
- Abaksiyal orta damardan dokuyu tıraş etmek ve aşılanan noktanın üzerindeki adaksiyal yüzeydeki epidermal tabakayı ortaya çıkarmak için tıraş bıçağını kılıfa göre 90°'lik bir açıyla tutun. Düzgün bir kalınlık sağlamaya çalışın. Yaprak kılıfları traş edildikten sonra, numuneye zarar verebileceğinden daha fazla budamak önerilmez.
- Tıraşlanan bölümlerin 1 cm x 1 cm'den büyük olmamasına dikkat edin. Bu işlem sırasında kılıfın ortasına bastırmaktan kaçının. Farklı spor süspansiyonları ile aşılanmış kılıflarla çalışırken, eldivenleri dezenfekte edin ve numuneler arasında tıraş bıçağını değiştirin.
- Temiz bir cam mikroskop lamını hazır bulundurun. Kılıf bölümünü bir kenardan kaldırın ve dikkatlice yeni bir kızağa aktarın. Kılıfın aşılanmış (adaksiyal) yüzeyi, objektif merceğe en yakın olan en üstte olmalıdır. Mantar yapılarına zarar vermemek için bölümleri nazikçe monte edin.
- Bölüme 60 μL steril DI su uygulayın ve 24 mm x 60 mm'lik bir cam lamel ekleyin (bkz. Hava kabarcıklarını önlemek için bunu yavaşça yapın.
- Mikroskopi için hazır olduğunuzda, her bir kenara küçük bir damla koyarak ve ardından damlaları bir oje fırçasıyla birleştirerek lameli şeffaf oje ile kapatın ( Malzeme Tablosuna bakın).
NOT: Bu kılıf protokolü, sitolojik boyalarla, örneğin 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nötr kırmızı veya tripan mavisi ile veya bitki hücresi canlılığını değerlendirmek için hücre plazmolizinin gözlemlenmesi için kullanılabilir. Kılıf boyama veya hücre plazmoliz deneyleri için lamel sızdırmaz hale getirmeyin. - Plazmoliz deneyleri için, lamel bir kenarına hipertonik bir çözelti (0.75 M sükroz veya 1 M sodyum klorür) ekleyin ve çözeltiyi numune boyunca lamel diğer kenarına çekmek için katlanmış tüy bırakmayan bir kağıt mendil kullanın. Boyama için, leke çözeltisini uygulamak için benzer bir yöntem kullanın.
- Geniş alan mikroskobu
- Yaprak kılıfları mikroskop lamlarına monte edildikten sonra, 400x büyütmede geniş alan ışık mikroskobu kullanarak mantar kolonizasyonu açısından inceleyin.
- Mantar yapılarını ayrıntılı olarak gözlemlemek için, numunelerin daha iyi görüntü kalitesi için yağ yerine suya daldırma objektifi kullanın. Kırılma indisi uyumsuzluğundan kaynaklanan küresel sapma görüntü bozulmasına neden olabilir. Geniş alan ışık mikroskopları ve konfokal mikroskoplar için su hedefleri mevcuttur.
- Kılıf başına nispi kolonizasyon miktarını belirlemek için, 100x büyütmede geniş alan ışık mikroskobu kullanarak her bir mantar penetrasyon bölgesinden istila edilen mısır hücrelerinin sayısını sayın. Bu niceleme, suşları, tedavileri ve/veya gelişim aşamalarını karşılaştıran herhangi bir istatistiksel analizden önce uygun bir tarama adımıdır.
- Konfokal lazer tarama mikroskobu
- Transgenik mantar suşlarının gelişimi sırasında mısır dokularındaki floresan proteinleri gözlemlemek için temel görüntü elde etme parametrelerini ayarlayın. Seçilen floresan işaretleyiciye göre en iyi uyarma/emisyon ayarlarını belirleyin.
NOT: Salgılanan proteinlerle oluşturulan floresan füzyonları analiz ederken 60x su hedefi tercih edilir. Modern konfokal mikroskoplar, artefaktları ve şekil sapmalarını önlemek için yüksek oranda düzeltilmiş suya daldırma hedeflerine sahiptir. - Floresan proteinlerin canlı hücre görüntülemesi amaçlanıyorsa, otofloresan için kontrol olarak dönüştürülmemiş mantar suşları kullanın. Ters konfokal mikroskopta ve mCherry floresan proteini için mantar-konak dinamiklerini yakalamak için aşağıdaki görüntü toplama parametrelerini kullanın. Lazer gücünü %5'e kadar ayarlayın, ifade seviyesine bağlı olarak 450-600 yüksek voltaj (HV), 1.375 X kazanç, %3 ofset, bölüm başına beş mısır hücresine kadar analiz için 1 optik yakınlaştırma faktörü ve bireysel hif için 2-5 optik yakınlaştırma faktörü.
NOT: Yüksek çözünürlüklü Z-yığını konfokal görüntüler, üç boyutlu veriler ve konakçı ile patojen arasındaki gerçek zamanlı etkileşimlerin daha iyi bir görünümünü sağlar. - Salgılanan füzyon proteinlerine karşılık gelen floresan yoğunluklarının ölçülmesi için, konfokal üreticinin görüntü analiz yazılımını veya çevrimiçi olarak ücretsiz olarak indirilebilen ImageJ gibi bir görüntü işleme programını kullanın. Floresan sinyallerinin buna göre nasıl ölçüleceğine ilişkin ayrıntılar için bir kılavuza bakın.
- Transgenik mantar suşlarının gelişimi sırasında mısır dokularındaki floresan proteinleri gözlemlemek için temel görüntü elde etme parametrelerini ayarlayın. Seçilen floresan işaretleyiciye göre en iyi uyarma/emisyon ayarlarını belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıdaki örnekler, mısır yaprağı kılıfı aşılama yönteminin kullanılmasını takiben temsili sonuçları açıklamaktadır. Bu örnekler, bu optimize edilmiş tahlil ile mısır-mantar etkileşimlerinin gözlemlenmesi ve karşılaştırılmasının gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilebileceği kolaylık, hız ve hassasiyeti göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme ayrıca nicel bilgilerin çıkarılmasına izin vererek karşılaştırmalı moleküler, sitolojik ve fizyolojik çalışmalar için yararlı bir araç sağlar. Her başarılı başvuru için atıfta bulunulan orijinal yayınlarda daha fazla ayrıntı bulunabilir.
Örnek veri 1: Mantar durumunun değerlendirilmesi ve mantar enfeksiyonuna bitki tepkilerinin tespiti için aşılanmış yaprak kılıflarında boyama ve plazmoliz kullanımı
Mısır yaprağı kılıfları, Colletotrichum graminicola ve Stenocarpella maydis'in canlı konakçı hücrelerdeki enfeksiyon süreçlerini parlak alan mikroskobu ile görselleştirmek ve karşılaştırmak için kullanılmıştır ve kolonizasyon modellerinin ve zaman kurslarının ayrıntılı açıklamalarına izin vermiştir (yayınlanmamış sonuçlar; Şekil 6).
Bu çalışmalar, S. maydis'in , melanize appressoria üreten C. graminicola'nın aksine, farklılaşmamış hif şişlikleri yoluyla epidermal hücreleri doğrudan istila ettiğini ortaya koymuştur. Epidermal hücrelerin içine girdikten sonra, her iki patojen de görünüşte sağlam hücre duvarlarından geçerek hücreden hücreye ilerler (Şekil 6A, B).
Kılıflar, mantar hiflerini kolonize etmenin doğasını ve kapsamını daha kolay değerlendirmek için tripan mavisi veya DAPI ile boyanabilir (Şekil 6). Tripan mavisi boyama, C. graminicola'nın başlangıçta hücreler arasında çok dar bağlantılarla hareket eden kalın birincil hifler yoluyla istila ettiğini ortaya koymaktadır. Daha sonra mantar nekrotrofik bir aşamaya geçer ve koloninin merkezinde daha ince ikincil hif üretir (Şekil 6 C-E)12,14,16,17.
Şekil 6: Parlak alan veya epifloresan mikroskobu ile görüntülenen boyanmamış veya lekeli aşılanmış mısır yaprağı kılıfları. (A) Stenocarpella maydis ile aşılamadan 48 saat sonra hücre içi hifler (hpi). Enfeksiyon hafif şişmiş hif uçları (ok) ile gerçekleşir. (B) Colletotrichum graminicola ile hücre içi hifler 48 hpi. Enfeksiyon melanize appressoria (oklar) yoluyla gerçekleşir. (C) Hyphae of C. graminicola, tripan mavisi ile boyanmış, dar bağlantılar (ok) yoluyla ilerleyen koloni kenarında hücreden hücreye ilerler, 72 hpi. (D) Dar bir bağlantı (ok) yoluyla mısır hücre duvarından geçen 72 hpi'de C. graminicola tripan mavisi lekeli hifinin daha yakından görünümü. (E) Koloni merkezinde 72 hpi, tripan mavisi ile boyanmış C. graminicola'nın hifleri. Daha kalın birincil hiflerden (oklar) çıkan daha dar ikincil hifler görülebilir. (F) Hifler C. graminicola 72 hpi, DAPI ile boyanmış bir yaprak kılıfı üzerinde ilerleyen koloni kenarında. Lekeli mantar ve bitki çekirdekleri UV ışığı altında floresan verir. Her paneldeki ölçek çubukları 50 μm'ye eşittir. Epifloresan mikroskobu ile birleştirilmiş monokromatik bir dijital kamera kullanılarak elde edilen mikrograflar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kılıflar, patojenik mantarlar tarafından enfeksiyon ve kolonizasyon sırasında mısır hücrelerinin gelişimsel sitolojisini ve canlılığını incelemek için nötr kırmızı ile boyanabilir ve/veya plazmolize tabi tutulabilir (Şekil 7).
Colletotrichum graminicola konakçı sitoplazmadan bir zarla ayrılan kalın primer hiflere sahip canlı mısır hücrelerini istila eden hemibiotrofik bir mantardır (Şekil 7A-C)12,14,16,17. Stenocarpella maydis ise, bir fitotoksin23 üreten ve epidermal hücreleri (granüle olan ve plazmolize olmayan) istila etmeden önce öldüren nekrotrofik bir mantardır (Şekil 7D).
C. graminicola ve diğer yaprak patojenlerine karşı mısır savunması, reaktif oksijen türlerinin (ROS), özellikle hidrojen peroksitin (H2O2)12,15 birikmesini içerir. Bitki-patojen etkileşimlerinin oksidatif kimyasını araştırmak için, hücre boyama için 3,3'-diaminobenzidin (DAB) kullanılabilir24. DAB,H2O2tarafından oksitlenir ve mısır yaprağı kılıflarında görülebilen koyu kahverengi bir çökelti üretir (Şekil 7 E,F)12,24. Pigmentin üretimi, bir konakçı direnç tepkisi ile ilgili oksidatif bir patlamanın bir göstergesidir.
Şekil 7: Parlak alan mikroskobu ile görüntülenen lekeli ve/veya plazmolize aşılanmış mısır yaprağı kılıfları. (A) C. graminicola 24 hpi ile aşılanmış ve plazmolize ve nötr kırmızı ile boyamaya tabi tutulmuş yaprak kılıfı. Appressoria (oklar) altındaki canlı mısır hücreleri, patojenin istiladan önce hücreleri öldürmediğini göstererek plazmoliz yapar ve boyanır. (B) Yaprak kılıfı 48 hpi ile C. graminicola, plazmolize tabi tutulur ve nötr kırmızı ile boyanır. Birincil hif (ok) tarafından kolonize edilen mısır hücreleri hala canlıdır, bu da C. graminicola'nın hücreleri bir biyotrof olarak istila ettiğini ortaya koymaktadır. (C) Yaprak kılıfı 48 hpi ile C. graminicola, koloninin ilerleyen kenarında hücreden hücreye hareket eden hifleri gösterir. Kılıflar plazmolize edilmiş ancak lekelenmemiştir. Koloni kenarına bitişik kolonize olmayan hücreler (oklar) plazmolize olmaya devam eder. (D) Penetrasyondan önce S. maydis ile yaprak kılıfı 24 hpi. Çimlenmiş sporun (ok) altındaki hücreler granül gibi görünür ve plazmoliz yapmaz, bu da S. maydis'in penetrasyondan önce onları öldürdüğünü ve bir nekrotrof gibi davrandığını gösterir. (E) C. graminicola ile Mp305 24 hpi ile yetiştirilmiş ve DAB ile boyanmış dayanıklı mısırın yaprak kılıfı. Koyu boyama, görüntünün merkezindeki tek hücrenin güçlü bir oksidatif tepkisini gösterirken, tek tek appressoriaların çoğunu çevreleyen kahverengi pigment haleleri görülebilir ve fotoğrafın üst kısmındaki hücrelerde granülasyon gözlemlenebilir. (F) Appressoria çevresinde biriken kahverengi pigment halelerinin ve yakındaki mısır hücre duvarlarında pigment birikiminin daha yakından görünümü (oklar). 20 μm olan (F) hariç, her paneldeki ölçek çubukları 50 μm'ye eşittir. Epifloresan mikroskobu ile birleştirilmiş monokromatik bir dijital kamera kullanılarak elde edilen mikrograflar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Örnek veri 2: Floresan proteinleri eksprese eden mantarlarla canlı hücre görüntüleme
Sitoplazmik floresan proteinleri eksprese eden mantar hifleri, epifloresan veya konfokal mikroskop kullanılarak herhangi bir lekeye ihtiyaç duymadan canlı kılıf hücrelerinde yüksek çözünürlükte görüntülenebilmektedir (Şekil 8).
Floresan proteinler, plantadaki canlı mantar hücrelerindeki konumlarını ve aktivitelerini izlemek için mitokondri, çekirdekler veya endomembran sistemi gibi çeşitli mantar organellerini hedefleyebilir (Şekil 8C)25,26,27,28 (yayınlanmamış sonuçlar). Floresan proteinler, çeşitli işlevler için raportör olarak hizmet etmek üzere farklı mantar promotörleri tarafından da yönlendirilebilir: örneğin, BiP şaperon sekresyon stres tepkisi proteini tarafından yönlendirilen RFP gösterilmiştir (Şekil 8D)29 (yayınlanmamış sonuçlar). Yaprak kılıflarının kullanılması, konakçı hücrelerikolonize ederken mantar hifleri tarafından biriktirilen ve salgılanan ayrı ayrı etiketlenmiş floresan füzyon proteinlerinin görselleştirilmesini sağlar 8,9 (Şekil 8E). Çekirdekler veya plazma zarı gibi çeşitli hücresel bölmeleri hedef alan floresan proteinleri eksprese eden transgenik mısır hatları da mevcuttur30,31 ve enfeksiyonun çekirdekler gibi mısır hücresel yapıları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için aşılamalar için kullanılabilir. Bu transgenik mısır hatlarının kullanımı, istila edilmemiş mısır hücrelerindeki çekirdeklerin tipik olarak C. graminicola tarafından kolonize edilmiş hücrelere en yakın hücre duvarına göç ettiğini göstermiştir (yayınlanmamış sonuçlar; Şekil 8F).
Şekil 8: Floresan proteinleri eksprese eden Colletotrichum graminicola epifloresan (A, B) veya konfokal (C, D, E, F) görüntüleme. (A) ToxA promotörü 34'ün kontrolü altında sitoplazmik olarak mRFP eksprese eden bir C. graminicola suşu ile boyanmamış, plazmolize yaprak kılıfı48 hpi. Bu yaprak kılıflarında önemli otofloresan da fark edilir. (B) ToxA promotörün kontrolü altında sitoplazmik olarak SGFP'yi eksprese eden bir C. graminicola suşu ile boyanmamış yaprak kılıfı 48 hpi. (C) Bir HDEL ankrajı35 ile endomembran sistemini hedef alan SGFP'yi eksprese eden Colletotrichum graminicola . (D) BiP şaperonunun C. graminicola homoloğu için promotörün kontrolü altında mRFP ile dönüştürülmüş C. graminicola ile boyanmamış yaprak kılıfı 24 hpi. Birincil hifdeki kırmızı floresan, sekresyon stresine yanıt olarak BiP aktivasyonunun bir göstergesidir. (E) 44 hpi'de mısır yaprağı kılıfı hücre duvarını geçen C. graminicola WT birincil hifinde arabinofuranosidaz birikimi::mKiraz füzyon proteini. (F) ToxA promotörünün, kontrolü altında sitoplazmik olarak mRFP eksprese eden bir C. graminicola suşu ile bitki çekirdeklerini hedefleyen30,31, 48 hpi YFP'yi eksprese eden transgenik bir mısır hattının yaprak kılıfı. Her paneldeki ölçek çubukları, 50 μm'ye eşit olduğu panel A hariç, 20 μm'ye eşittir. Mikrograflar, epifloresan mikroskobu ile birleştirilmiş monokromatik bir dijital kamera kullanılarak elde edildi. (C-F)'deki görüntüler lazer taramalı konfokal mikroskop ile çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Örnek veri 3: Mantar suşları arasındaki uyumlu/uyumsuz yanıtların ve etkileşimlerin ayrıntılı sitolojisini incelemek için mısır yaprağı kılıflarının kullanımı
Patojenik olmayan bir C. graminicola mutant suşu (cpr1 MT), mısır yaprağı kılıflarındaki vahşi tip (WT) suş ile karşılaştırıldı (Şekil 9A, B)12.
Sitoplazmik floresan proteinleri ile etiketlenmiş suşların canlı hücre görüntülemesi, mutantın mısır yaprağı kılıfları içinde hücreden hücreye harekette spesifik olarak bozulduğunu gösterdi. Kılıf protokolü, cpr1 MT'nin zamanın %95'inde ilk kolonize hücre ile sınırlı olduğunu ortaya çıkaran hassas miktar tayinini mümkün kılmıştır (Şekil 9C)12. Bu, enfeksiyonların% 5'inden daha azının aynı zaman diliminde ilk kolonize hücre içinde kaldığı WT'nin belirgin bir tezat oluşturuyordu12. İlginç bir şekilde, cpr1 MT, WT suşu gibi lokal olarak dondurularak öldürülen kılıflarda başlangıçta enfekte olmuş ilk hücrenin ötesinde saprofit olarak büyüyebildi (Şekil 9D). Bu, cpr1 MT'nin kolonize olamamasının, özellikle canlı mısır hücresinin aktif tepkisi ile ilişkili olduğunu gösterdi.
Yaprak kılıfı aşılama testi, GFP eksprese eden cpr1 MT ve RFP eksprese eden WT suşları arasındaki etkileşimleri, aynı yaprak kılıfı12 üzerinde birlikte aşılayarak test etmek için kullanıldı. Suşlar birbirine yakın aşılandığında (en fazla 8 mısır hücresi ayrı), cpr1 MT hücreden hücreye biyotrof olarak normal şekilde büyüyebildi (Şekil 9E, F). Plazmoliz deneyleri, cpr1 MT mantarının canlı hücreleregirdiğini doğruladı 12. Tüm bu ayrıntılı gözlemler, kılıf tahlilleri ile mümkün kılındı ve C. graminicola'nın WT suşu tarafından üretilen ancak cpr1 MT12'de bulunmayan uyumluluğu indükleyen yayılabilir bir faktörün varlığını ima etti.
Şekil 9: Colletotrichum graminicola'nın WT ve cpr1 MT suşlarını içeren uyumlu ve uyumsuz etkileşimler. Farklı floresan proteinlerin kullanılması, mısır yaprağı kılıfları12 üzerine birlikte aşılandığında iki suşun ayırt edilmesini sağladı. (A) 48 hpi'de mısır yaprağı kılıflarında sitoplazmik mRFP'yi eksprese eden WT C. graminicola suşu. (B) 72 hpi'de mısır yaprağı kılıflarında SGFP'yi eksprese eden C. graminicola cpr1 MT suşu. CPR1 MT nadiren (zamanın% <5'i) ilk enfekte hücrenin ötesinde, aşılamadan 6 gün sonrasına kadar kolonize olur. (C) 72 dpi'de SGFP'yi eksprese eden C. graminicola cpr1 MT suşunun daha yakından görünümü. Bu durumda, hücre duvarını bir sonraki hücreye geçmeyi başardı, ancak daha sonra gelişmeyi durdurdu. (D) Öldürülmüş kılıf dokularında SGFP, 48 hpi eksprese eden C. graminicola cpr1 MT suşu. cpr1 MT suşu, WT'ye benzer şekilde cansız mısır kılıf hücrelerini hızla kolonize eder. (E) WT-MRFP C. graminicola ve cpr1 MT-GFP C. graminicola suşları, mısır yaprağı kılıfları (48 hpi) üzerinde birbirine yakın olarak birlikte aşılandığında, cpr1 MT-GFP suşu, bir biyotrof olarak normal olarak canlı mısır kılıf hücrelerinde ilerleme yeteneğini yeniden kazanır. Canlı hücrelerin içindeki biyotrofik büyüme, plazmoliz deneyleri ile doğrulandı. (F) SGFP'yi eksprese eden C. graminicola cpr1 MT suşunun daha yakından görünümü, WT'ye bitişik olarak aşılandığında hücreden hücreye büyür (en fazla 8 mısır hücresi ayrı). Ölçek çubukları 50 μm (A, B ve E) veya 20 μm'ye (C, D ve F) eşittir. Mikrograflar, epifloresan mikroskobu ile birleştirilmiş monokromatik bir dijital kamera kullanılarak elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Aşılanmış kılıflar, transkripsiyonel aktivite analizi için RNA ekstraksiyonu için dokular üretmek için de kullanılmıştır32,33. Kılıflar bu amaç için idealdi, çünkü enfeksiyon sürecini izlemek için ekstraksiyondan önce incelenebilirler, böylece çoklu replikasyonlarda numune tekdüzeliği sağlanır. Bu çalışmalar, Colletotrichum yaşam tarzı geçiş aşamaları arasında diferansiyel olarak ifade edilen gen dalgalarının tanımlanmasına izin verdi32,33.
Örnek veri 4: Optimal olmayan deneylerin sonuçları
Yetersiz canlı hücre görüntüleme, üst üste binen epidermal hücre katmanlarına ve optik olarak opak örneklere yol açan yaprak kılıflarının yetersiz kesilmesinin bir sonucu olabilir (Şekil 10).
Şekil 10: Yaprak kılıflarının yetersiz kesilmesi nedeniyle optimal olmayan deneysel sonuç. A) Mantar gelişiminin invivo olarak incelenmesine müdahale eden çoklu epidermal hücre katmanları örneği. (B) Canlı hücre görüntülemeyi etkileyen üst üste binen hücre katmanları örneği. Ölçek çubukları 20 μm'ye eşittir. Mikrograflar, epifloresan mikroskobu ile birleştirilmiş monokromatik bir dijital kamera kullanılarak elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Diğer bir potansiyel suboptimal deney sonucu, düşük (Şekil 11A) veya yüksek sayıda sporla sonuçlanabilecek ayarlanmamış bir aşı konsantrasyonudur: ikincisi, çimlenmenin azalmasına veya baskılayıcı penetrasyona neden olabilir (Şekil 11B). İkincisi, her bir mantar penetrasyon bölgesinde kolonize edilen mısır hücrelerinin nicelleştirilmesini de engelleyebilir.
Şekil 11: Yanlış ayarlanmış aşı konsantrasyonu nedeniyle yetersiz deney sonucu. Bir. Düşük C. graminicola spor süspansiyon konsantrasyonu, kılıflara aşılanır ve bu da az sayıda mantar penetrasyon bölgesi ile sonuçlanır. B. Yaprak kılıflarında yüksek C. graminicola inoculum konsantrasyonu, yakın çevrede çoklu appressoria ve azalmış konakçı hücre penetrasyonuna neden olur. Ölçek çubukları 20 μm'ye eşittir. Mikrograflar, epifloresan mikroskobu ile birleştirilmiş monokromatik bir dijital kamera kullanılarak elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Mikroskobik gözlem süresi (hpi) | Mısır yaprağı kılıflarına aşılanmış C. graminicola'nın gelişim aşaması |
| 12 | Appressoria (Appressoria) |
| 24 | Birincil hifler |
| 36 | İkincil hifler |
| 48 | İkincil hifler |
| 60 | Acervuli Dili |
| 72 | Acervuli Dili |
| 108 | Acervuli Dili |
Tablo 1: Colletotrichum graminicola enfeksiyon zaman seyri: Yaşam tarzı geçişi boyunca mantar gelişimi kilometre taşlarına dayalı olarak C. graminicola suşu M1.001 ile aşılanmış mısır yaprağı kılıflarının zaman seyrinin özeti. Her 12 saatte bir mikroskobik gözlemler yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan optimize edilmiş yaprak kılıfı aşılama yöntemi, pirinç yaprağı kılıfları6,8,36 için geliştirilmiş ve uygulanmış olan orijinal bir protokolden değiştirilmiştir. Geniş alan veya konfokal mikroskopi ile canlı bitki hücrelerinde mantar büyümesi ve gelişiminin doğrudan, ayrıntılı gözlemlerine izin verir. Protokol, mısır kolonizasyonu sırasında, uyumlu ve uyumsuz etkileşimler sırasında mantar gelişimi ve konakçı tepkileri dahil olmak üzere çeşitli mikroskobik fenomenlerin karakterizasyonu, karşılaştırılması ve nicelleştirilmesi için uygundur; plantada spesifik mantar proteinlerinin üretimi ve salgılanması; ve mısır-mantar etkileşimi sırasında üretilen yaygın veya yeni patojenite faktörlerinin sitolojisi ve biyokimyası. Bu yöntemi mısırın hemibiotrofik ve nekrotrofik patojenleri ile kullandık. Biyotrofik patojenlerle (örneğin pas mantarları) aşılama girişiminde bulunmadık, ancak kılıflar canlı kaldıkları için bu uygulama için de yararlı olacaktır. Bu yöntemi, konukçu ve çeşide özgü direncin sitolojisinin araştırılması için sorgum kılıflarına da uyguladık 7,37. Sorgum kılıfları için, protokolde yapılan tek ayarlama, merkeze tek bir damla uygulamak yerine tüm kılıfı spor süspansiyonu ile doldurmaktı. Bu, sorgum kılıflarının daha küçük çapı nedeniyle gerekliydi.
Bu kılıf tahlillerinin kullanımı, patojenite için kritik olan konak kolonizasyonu ve mantar moleküllerinin mekanizmaları hakkındaki ayrıntılı çalışmalarımızı büyük ölçüde ilerletmiştir. Örneğin, yöntemin uygulanması, her iki durumda da aşırı duyarlı direnç tepkileri de dahil olmak üzere, C. sublineola'nın mısır tarafından ve C. graminicola sorgum tarafından konakçı olmayan tanındığını göstermiştir7. Mısır yaprağı kılıfları, aynı kılıf üzerinde belirli bir mesafedeki mantar suşları arasındaki etkileşimleri test etmek için de kullanıldı. Bu durumda, patojenik bir WT ve patojenik olmayan cpr1 MT suşunun canlı kılıflar üzerinde birlikte aşılanması, mısır hücrelerinin WT suşu tarafından duyarlılığının indüklendiğini gösterdi ve patojenite12'de yer alan yayılabilir bir faktör için kanıt sağladı. Kılıflar, farklı floresan proteinleri eksprese eden iki suşun farklılaşmasına ve tek başına veya birlikte aşılanan suşlar için kolonizasyon sürecinin nicelleştirilmesine ve istatistiksel karşılaştırmalarına izin verdi.
Bu mısır yaprağı kılıfı testi, canlı hücre görüntüleme için tüm bitki aşılamalarına göre çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, protokol, canlı konakçı hücrelerle gerçek zamanlı olarak etkileşime giren patojenlerin temizlenmesine veya sabitlenmesine gerek kalmadan üstün görüntüleme sağlar. Örneğin, mısır yaprağı kılıfları kullanılarak yapılan çalışmalar, hemibiotrofik C. graminicola'da biyotrofiden nekrotrofiye belirgin bir geçişin saptanmasını sağladı ve patojenik olmayan bir mutant ile fonksiyonel karşılaştırmaları kolaylaştırdı 7,12,16,17. M. oryzae ile aşılanmış eksize edilmiş pirinç yaprağı kılıflarının, bütün pirinç bitkilerinde gözlemlenenlere karşılık gelmeyen semptomlar gösterebildiği bildirilsede, 36, mısır kılıflarında kolonizasyon, doku çökmesi ve lezyon gelişiminin zamanlaması ve görünümü, bütün yapraklardakine benzer12,14. Kılıf testinin ikinci bir avantajı, replikasyonlar arasında daha fazla eşzamanlılık göstermesi ve mantar kolonizasyonunun deneysel tekrarlanabilirliğigöstermesidir 12,18. Tüm bitki aşılaması, düzensiz seviyelerde mantar penetrasyonuna18 neden olabilirken, kılıf aşılamalarının daha yüksek kontrollü koşulları daha fazla eşzamanlılık sağlar ve etkileşimlerin daha hassas bir şekilde araştırılmasına ve ölçülmesine izin verir. Bu artan eşzamanlılık, transkriptom analizlerinde kılıfların kullanımını kolaylaştırmıştır32,33. Ayrıca, kılıf protokolü, transkriptom analizi için gerekli numune hazırlama hızını sağladı: her bir kılıfın kırpılması, durulanması ve taranması, RNA ekstraksiyonu için hızlı dondurulmadan önce 2 dakikadan fazla sürmedi32,33.
Enfeksiyonun başarılı canlı hücre görüntülemesi için kritik adımlar şunları içerir: 1) Kılıflar, deneyler için kesimden hemen sonra kullanılmalıdır. Eksize edilen aşılanmış kılıflar 6 günden fazla tutulmamalıdır: mantar kolonizasyonu ağırsa, daha çabuk bozulurlar12; 2) Daha tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için aynı gelişim çağındaki kılıfları seçmeye dikkat edin; 3) Maksimum sporülasyona ulaşmış kültürlerden taze bir spor süspansiyonu kullanın; 4) Optik olarak net numuneler üretmek için daha verimli kırpma için keskin tıraş bıçakları kullanın; 5) Bu işlem canlı yapıları ve görüntü kalitesini olumsuz etkileyebileceğinden, numunelerin aşırı ve gereksiz manipülasyonunu en aza indirin; 6) Filtre kağıdının yeterince nemli olduğundan emin olmak için nem odalarını günlük olarak kontrol edin; ve 7) Numuneleri konfokal bir mikroskopta görüntülerken, numuneler arasında floresan sinyallerini karşılaştırırken yoğunluk değişikliklerine veya önyargıya neden olmamak için deney sırasında toplama ayarlarını sabit tutun. Floresan proteinler, lazer yoğunluğu ve süresi çok yüksekse fotoağartma yapabilir ve doku kesitleri uzun süre kapalı bir lamel altında tutulursa daha zayıf sinyaller verebilirler. En tekrarlanabilir sonuçlar için koşulları, malzemeleri ve zaman çizelgelerini standartlaştırmak ve optimize etmek için tüm uygun kontroller dahil olmak üzere ön deneyler yapılmalıdır.
Sorun giderme
Elle kesme, optik olarak şeffaf kılıflar üretmek için yetersizdir
Tıraş bıçağının körelmiş olması mümkündür. Bu durumda, uygun şekilde atın ve yeni bir tek kenarlı tıraş bıçağına geçin. Orta derecede basınç uygulayın ve bıçağı kılıfa 90° açıyla tutun. Düz ve yarı saydam bir kesit gözlemlenene kadar numuneyi nazikçe, ancak tutarlı bir şekilde kazıyın. Konfokal lazer tarama mikroskobuna geçmeden önce kılıfların bileşik mikroskop altında kontrol edilmesi tavsiye edilir.
Aşılanmış mısır kılıfı son derece kırılgandır
Bu, mantar bitki dokusunun çoğunu kolonize ettiğinde meydana gelir. Sonuç olarak, doku bozulur ve çöker. Halihazırda nekrotrofik aşamada olan numuneleri hazırlarken, bölümü bir mikroskop lamına hafifçe bastırın, bir damla steril DI su uygulayın ve numuneyi temiz bir lamel ile bir-iki kez kazıyın.
Düşük spor çimlenmesi ve penetrasyon in vivo
Bu, çimlenmeyi veya penetrasyonu engelleyen çok sayıda spordan kaynaklanıyor olabilir. Aşı konsantrasyonunun 5 x 105 spor/mL'ye ayarlandığından emin olun. Sorun devam ederse, konsantrasyonu 5 x 104 spor/mL olarak ayarlayın. İn vivo deney için bir kontrol olarak, aynı spor süspansiyonundan 50 μL'yi yeni bir PDA plakasına yerleştirin ve eşit şekilde yayın. Spor canlılığını ve çimlenmesini günlük olarak kontrol edin.
Kılıflar arasında asenkron mantar gelişim aşamaları
Mısır bitkilerinin aynı büyüme aşamasında olduğundan ve kılıf bölümlerinin aynı düğümden elde edildiğinden emin olun. Ayrıca, sporların canlı olduğundan ve mantar kültürlerinin optimum aşamada olduğundan emin olun (ör., aşı hazırlığı için 2 haftadan eski kültürler C . graminicola).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını ve ifşa edecek hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar mali destekleri için USDA-NIFA'ya teşekkür eder (hibe numaraları 2018-67013-28489 ve 2020-70410-32901). Bu yazıda ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yalnızca yazarlara aittir ve ABD Tarım Bakanlığı'nın görüşlerini yansıtmayabilir. Brezilya'dan Sınır Tanımayan Bilim misafir öğrencisi Mayara de Silva'ya Şekil 6A ve Şekil 7D'de yer alan görüntüler için teşekkür ederiz. Ayrıca, Olympus konfokal mikroskoplarına erişim sağladığı için Kentucky Üniversitesi Bitki Patolojisi Bölümü'ne de teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. Plant pathological methods: fungi and bacteria. , Burgess Publishing Co. (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
