Summary
يصف هذا البروتوكول جهازا بسيطا يحاكي طريقة لفة دينغ ، وينشئ نموذجا للفئران لإصابة العضلات الهيكلية ، ويستخدم تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين لمراقبة أمراض الأنسجة التالفة ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم للكشف عن التغيرات في علامات تلف المصل.
Abstract
تعد طريقة لفة دينغ واحدة من أكثر عمليات التلاعب شيوعا في عيادات التدليك الصينية التقليدية (Tuina) وواحدة من أكثر عمليات التلاعب المعاصرة تأثيرا في الصين. يعتمد على طريقة الدرفلة التقليدية المستخدمة بشكل شائع في نوع Zen بإصبع واحد ويسمى طريقة لفة Ding. نظرا لآثارها المضادة للالتهابات والمعززة للدورة الدموية ، فإن طريقة دينغ المتدحرجة لها تأثيرات علاجية سليمة على اعتلال عضلي. بسبب المساحة الكبيرة للقوة المطبقة على جلد الإنسان ، فإن طريقة لفة دينغ تمثل تحديا في الأداء على التجارب ذات مناطق الجلد الصغيرة ، مثل الفئران والأرانب. بالإضافة إلى ذلك ، تختلف قوة Tuina المطبقة على جسم الإنسان عن تلك المطبقة على التجارب ، لذلك قد يحدث أن تكون القوة عالية جدا أو منخفضة جدا لتحقيق التأثير العلاجي ل Tuina أثناء التجربة. تهدف هذه التجربة إلى إنشاء مدلك بسيط مناسب للفئران بناء على معلمات التلاعب المتداول الخاصة ب Ding (القوة ، التردد ، مدة Tuina). يمكن للجهاز توحيد التلاعب في التجارب على وتقليل التباين في قوة Tuina المطبقة على المختلفة بسبب عوامل ذاتية. تم إنشاء نموذج فئران لإصابة العضلات الهيكلية التي يسببها notexin ، وتم استخدام علامات إصابة البلازما الكرياتين كيناز (CK) وبروتين ربط الأحماض الدهنية 3 (FABP3) لتقييم التأثير العلاجي لتوينا على إصابة العضلات الهيكلية. أظهرت النتائج أن مدلك Tuina هذا يمكن أن يقلل من مستويات تعبير CK و FABP3 ويبطئ درجة إصابة العضلات الهيكلية. لذلك ، فإن مدلك Tuina الموصوف هنا ، والذي يحاكي طريقة لفة Ding ، يساهم في توحيد معالجة Tuina في البحث التجريبي ويساعد بشكل كبير في الأبحاث اللاحقة حول الآلية الجزيئية ل Tuina للاعتلال العضلي.
Introduction
إصابات العضلات هي إصابات رضحية شائعة في الحياة السريرية واليومية ، ناتجة عن ضربات خارجية (كدمات) أو إجهاد مزمن لألياف العضلات (السلالات) ، وما إلى ذلك ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي في العضلات والألم ، حتى يؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المريض1. بدء إعادة التأهيل في أقرب وقت ممكن بعد إصابة إجهاد حاد هو المفتاح لتقليل وقت العودة إلى الرياضة2 وفي تقليل الألم 3,4. في الطب الغربي الحديث ، تتبع الإسعافات الأولية السريرية لإصابات العضلات مبادئ الراحة والجليد والضغط والارتفاع (RICE) لوقف النزيف الضار في الأنسجة العضلية5 والعقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات لتخفيف الألم6. أصبح اكتشاف علاجات جديدة مثل exosomes7 وهندسة الأنسجة8 استراتيجيات علاجية محتملة لأمراض العضلات والهيكل العظمي ، مما يعوض عن أوجه القصور في العلاجات الدوائية السابقة. ومع ذلك ، يمكن أن يزيد أيضا من تكلفة العلاج للمرضى ، مما يضعهم تحت ضغط مالي هائل9. لذلك ، يوصى بالعلاجات البديلة والتكميلية لعلاج مشاكل العضلات والعظام10. يستخدم Tuina على نطاق واسع سريريا في الصين كطريقة طبية تقليدية ويحظى بشعبية بين المرضى لفعاليته وآثاره الجانبية الأقل. علاج Tuina للاضطرابات العضلية الهيكلية يمكن أن يخفف الألم ويحسن الوظيفة11،12،13. أسس السيد دينغ جيفنغ ، وهو ممارس مشهور في شنغهاي توينا ، طريقة لفة دينغ14. إنها تقنية فريدة من نوعها للدحرجة والسحق مع مساحة قوة كبيرة وقوة موحدة ولطيفة واختراق مكثف.
تعتمد النماذج الحيوانية المختلفة على مسببات مختلفة. لها مزايا وعيوب ، واختيار النماذج الحيوانية الصحيحة والمناسبة له أهمية كبيرة للتجارب الأساسية ، مما يساعد على فهم مسارات الإشارات الخلوية والجزيئية للتجديد والإصلاح بعد إصابة العضلات الهيكلية لتطوير علاجات جديدة لعلاج أمراض العضلات الهيكلية. تستخدم النماذج المستحثة كيميائيا لإصابة العضلات على نطاق واسع ، مع حقن العضلات الهيكلية التي تسبب نخر الألياف العضلية وتنتج مناطق متجددة يمكن أن تتجدد بشكل فعال في غضون أسبوعين15. يمكن أن يسبب كل من notexin و bupivacaine تلف العضلات. ومع ذلك ، يمكن أن يسبب notexin أضرارا سامة عضلية أكثر حدة للعضلات الهيكلية من bupivacaine ، والانتعاش الوظيفي الطبيعي أبطأ نسبيا16. لا يستغرق صب الحقن العضلي للأدوية وقتا أقل فحسب ، بل له أيضا تأثيرات خاضعة للرقابة ومدى تلف العضلات الهيكلية. هذا التحكم الكمي يجعل القولبة الناجحة أقل صعوبة15,17.
الاستجابة الالتهابية هي استجابة بيولوجية أساسية تمت دراستها على نطاق واسع في سياق اعتلال عضلي18,19. في المراحل المبكرة من إصابة العضلات الهيكلية ، يعطل نخر الألياف العضلية توازن العضلات المحلي ، وتتسلل العديد من الخلايا الالتهابية إلى موقع الإصابة ، وتفرز العديد من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات19. الكرياتين كيناز (CK) هو علامة حيوية تقليدية في المصل لتقييم إصابة العضلات والهيكل العظمي. ومع ذلك ، فإنه يفتقر إلى خصوصية الأنسجة20 والحساسية21 ، مما يحد من قدرته على تقييم مدى تلف العضلات الناجم عن المخدرات والإبلاغ بشكل غير مباشر عن مدى تعافي العضلات بعد الإصابة. أظهرت المؤشرات الحيوية الجديدة ، بما في ذلك بروتين ربط الأحماض الدهنية 3 (FABP3) ، مؤخرا خصوصية وحساسية عالية نسبيا للأنسجة في نماذج القوارض لإصابة العضلات والهيكل العظمي. FABP3 هي عائلة من البروتينات الملزمة التي يتم التعبير عنها بشكل أساسي في خلايا العضلات القلبية والهيكلية والمتورطة في استقلاب الأحماض الدهنية ونقلها وإشاراتها22. لذلك ، اخترنا مزيجا من اثنين من المؤشرات الحيوية ، CK و FABP3 ، لتقييم مدى تلف العضلات الهيكلية الناجم عن notexin والتعافي بعد العلاج.
في القوارض ، تكون العضلات ضحلة ، ومنطقة الجلد صغيرة ، مما يحدد أيضا أن المعلمات المختلفة للتدليك في القوارض لن تكون هي نفسها كما هو الحال في البشر ، كما هو الحال في العلاج الحيواني ، يجب على المعالج بالتدليك معالجتها بقوة أقل باستخدام طريقة لفة دينغ ، وقد لا تكون مواتية لتشغيل هذه التقنية بسبب صغر حجم المنطقة المصابة ، والتي يمكن أن تؤدي في النهاية إلى انخفاض في فعالية التدليك. لذلك ، استخدمت التجربة مدلك الدرفلة المصنوع داخليا ، والذي يتوافق مع خصائص طريقة لفة دينغ ، للتدخل وتقييم التأثير العلاجي لنموذج إصابة العضلات الهيكلية الناجم عن notexin في الفئران ، مما يساعد على توحيد معلمات Tuina في الدراسات على التجريبية من أجل التحقيق بعمق في الآلية الجزيئية لعمل Tuina ، طريقة علاج الطب الصيني التقليدي ، على أمراض العضلات والعظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل لجنة الرعاية المؤسسية والاستخدام في جامعة هونان للطب الصيني.
1. تجميع مدلك المتداول
- حدد مدلك يتكون من بكرة مطاطية ، وحامل شوكة ، ونابض ، وحاجز حد ، وجبيرة ضبط ، وبرغي ، ومقبض أكريليك (الشكل 1). تأكد من أن الأسطوانة المطاطية يبلغ طولها 3 سم وقطرها 1.6 سم ، ويبلغ طول الزنبرك 3 سم وقطرها 0.9 سم ، ويبلغ طول الحاجز المحدد 3 سم وعرضه 2 سم ، ويبلغ طول المقبض 12 سم وقطره 0.9 سم.
- التحكم في القوة: وفقا لنتائج الأدبيات23 ، وجد أن الضغط الهبوطي لطريقة دينغ للأسفل يبلغ حوالي 10٪ من وزن الجسم ، وبالتالي فإن الضغط المطبق أثناء تصميم الدرفلة الأمامية يبلغ حوالي 10٪ من وزن جسم الجرذ (0.2-0.3 نيوتن). اختبر الحد الأقصى لضغط المدلك على وحدة التحكم في الوزن ليكون حوالي 0.3 نيوتن عن طريق ضبط زاوية حاجز الحد. متطلبات الضغط هذه تلبي احتياجات الفئران.
- تأكد من أن الحد الأدنى للضغط حوالي 0.08 نيوتن عند التراجع (الشكل 2). تأكد من أن الضغط يتوافق بدقة مع متطلبات طريقة لفة Ding بأن نسبة القوى الأمامية والخلفية هي 3: 1.
- قبل العلاج ، اطلب من المشغل العمل مع برنامج بندول الإيقاع للتحكم في تردد التدحرج إلى 140 لفة / دقيقة وممارسة هذا أكثر من 3 مرات في التجربة المسبقة لضمان توحيد العملية.
2. إنشاء نموذج الفئران لإصابة العضلات والهيكل العظمي
- قسم عشوائيا 24 ذكرا من فئران Sprague-Dawley (يزن 200-250 جم) إلى ثلاث مجموعات من ثمانية فئران لكل منها ، بما في ذلك التحكم (C) ، notexin (NTX) ، و notexin مع Tuina (NTX + Tuina) ، وتتغذى على نظام غذائي قياسي. حافظ على دورة مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة ، المنزل في 20-25 درجة مئوية ورطوبة 50٪ -70٪.
- تخدير ب 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (40 مجم / كجم) عن طريق الحقن داخل الصفاق ثم قم بإزالة الشعر من الطرف السفلي الأيمن باستخدام كريم إزالة الشعر. بعد إزالة الفراء ، امسح الكريم المتبقي باستخدام محلول ملحي. تأكد من التخدير المناسب عن طريق استجابة قرصة إصبع القدم. ضع مرهما للعيون لترطيب العينين أثناء تخدير. توفير الدعم الحراري طوال العملية.
- تطهير الجلد البديل للطرف السفلي الأيمن بمحلول تطهير اليودوفور و 75٪ كحول قبل الحقن. المس قطعة قطن مبللة بمحلول تطهير اليودوفور في مركز جلد الطرف السفلي وضعه بحركة دائرية للخارج. كرر باستخدام قطعة قطن مبللة بالإيثانول.
- إنشاء نماذج إصابة العضلات والهيكل العظمي وفقا للطريقة المرجعية24. حقن notexin في ساق واحدة فقط (لمنع حقن notexin المزدوج). ارسم 200 ميكرولتر من محلول notexin (10 ميكروغرام / مل محلول notexin محضر بإضافة 100 ميكروغرام من notexin إلى 10 مل من محلول ملحي عادي في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل) في حقنة سعة 1 مل بإبرة 30 جم وحقن محلول notexin في العضل في عضلة الساق لإنتاج إصابة العضلات.
- حقن notexin ببطء وانتظر لمدة 3 ثوان قبل سحب الإبرة (ليتم حقنها بالكامل).
تنبيه: Notexin مادة كيميائية سامة تتطلب التنظيف الفوري بالكثير من الماء عند ملامسة جرح مفتوح وعناية طبية فورية إذا لزم الأمر. - حقن الفئران في المجموعة الضابطة مع 200 ميكرولتر من محلول ملحي. نقل الفئران المخدرة إلى أقفاص فارغة مع الفراش نظيفة. احرص على إزالة الحشو حول أنف الفئران وفمها للحفاظ على تنفسها واضحا. راقب بصريا لون الأنسجة ومعدل التنفس في نهاية الحقن حتى تستعيد الفئران وعيها الكافي.
- أعد الفئران إلى القفص المنزلي وعادة ما تربيها لمدة 24 ساعة.
3. علاج توينا
- ضع فأر SD في وضع الانبطاح مع تغطية رأسه بقطعة قماش سوداء على المنصة التجريبية المطهرة بنسبة 75٪ من الكحول لفضح عضلة الساق. لا تغطي بإحكام شديد.
- استخدام مدلك Tuina لمجموعة NTX + Tuina: أمسك المدلك وضع الأسطوانة على عضلة الساق للفأر وتدحرج للأمام حتى يلامس الزنبرك حاجز الحد. ثم تراجع القوة والعودة إلى موقعها الأصلي ، وبالتالي الحركة الترددية (الشكل 3).
- لف المدلك بسرعة 140 لفة في الدقيقة ، وقم بإجراء كل عملية لمدة 3 دقائق. قم بإجراء التدليك مرة واحدة في الصباح ومرة في فترة ما بعد الظهر لمدة 3 أيام متتالية.
- إعادة الفئران إلى قفص المنزل بعد كل علاج وصيام لمدة 8 ساعات بعد العلاج الأخير.
4. جمع الدم والأنسجة من الفئران بعد التجربة
- وفقا لمتطلبات لجنة أخلاقيات التجارب على ذات الصلة ، تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (40 ملغ / كغ ، الحقن داخل الصفاق). تأكد من التخدير المناسب عن طريق استجابة قرصة إصبع القدم. القتل الرحيم للفئران عن طريق إراقة الدم في الشريان الأورطي البطني بعد جمع الدم.
- تطهير الجلد البديل بمحلول تطهير اليودوفور والكحول بنسبة 75٪ قبل الحقن. المس قطعة قطن مبللة بالبوفيدون اليود إلى وسط جلد البطن وضعها بحركة دائرية للخارج. كرر باستخدام قطعة قطن مبللة بالإيثانول. كرر التطهير 3x.
- اطلب من المساعد استخدام مرقئين لرفع الجلد في منتصف البطن. كمشغل ، استخدم مشرطا لقطع جلد البطن والعضلات من الرافي إلى ارتفاق العانة.
- بعد فتح تجويف البطن ، افصل الأمعاء بكرات قطنية معقمة لكشف الشريان الأورطي البطني في جدار البطن الخلفي.
- حدد موقع الشريان الأورطي البطني ، وخذ 5 مل من دم الفئران في أنابيب جمع الدم ، واحصل على البلازما في 1.5 microtubes عن طريق الطرد المركزي عند 3000 × g لمدة 10 دقائق بعد الوقوف لمدة 1 ساعة. يخزن البلازما في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
- قم بفتح الجلد بالمقص الجراحي على طول فتحة أسفل البطن باتجاه الجانب الجانبي للطرف السفلي الأيمن ، وكشف عضلات الطرف السفلي ، وبعد فصل اللفافة بعناية بالملقط ، قم بقطع المشرط لإزالة عضلة الساق السليمة.
- اغسل عضلة الساق في محلول ملحي معقم لإزالة الشعر والدم الملتصقين.
- ضع عضلة الساق التي تمت إزالتها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد.
5. الكشف عن مستويات البلازما CK و FABP 3 بواسطة ELISA
- احسب وحدد عدد اللوحات المغلفة مسبقا المطلوبة لتجربة واحدة. قم بإزالة الألواح المطلوبة ، وضعها في إطار 96 بئرا ، ضع الألواح الدقيقة المتبقية مرة أخرى في كيس رقائق الألومنيوم لإغلاقها ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- قم بموازنة المجموعات والعينات في درجة حرارة الغرفة (25-28 درجة مئوية) لمدة 120 دقيقة ، وتوازن تماما مع درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يعد توازن المجموعة والعينة أمرا بالغ الأهمية ويجب موازنته بوقت كاف. - تعيين الآبار القياسية والعينة والفارغة. أضف 50 ميكرولتر من معيار CK أو FABP3 بتركيزات مختلفة (100 ، 50 ، 25 ، 12.5 ، 6.25 ، 0 نانوغرام / مل) إلى الآبار القياسية. كرر كل معيار مرة واحدة ، وتحتل ما مجموعه 12 بئرا.
- املأ آبار العينة ب 40 ميكرولتر من مخفف العينة (0.8 جم كلوريد الصوديوم ، 0.02 جم KH 2 PO 4، 0.29 جم Na 2 HPO 4 12H2O ، 0.02 جم KCl ، 0.01 جم NaN3في 100 مل من الماء المقطر المزدوج ، درجة الحموضة7.4) ، تليها 10 ميكرولتر من العينة المراد اختبارها. كرر كل عينة مرة واحدة ، وتحتل 48 بئرا في المجموع.
- باستثناء الآبار الفارغة الموجودة خلف بئر العينة الأخيرة ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة CK أو FABP3 الموسومة ب HRP (الجسم المضاد المسمى بالإنزيم) إلى كل معيار وعينة جيدة.
- أغلق الآبار بغشاء مانع للتسرب واحتضانها في حمام مائي أو ترموستات بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- تخلص من السائل ، واتركه حتى يجف على ورق ماص ، واملأ كل بئر بسائل الغسيل ، واتركه لمدة 20 ثانية ، وتخلص من سائل الغسيل ، واتركه حتى يجف على ورق النشاف ، وكرر غسل اللوحة 5 مرات (أو استخدم غسالة الأطباق).
- أضف 50 ميكرولتر من محلول الكروموجين A (20 مجم رباعي ميثيل بنزيدين 10 مل إيثانول في 100 مل من الماء المقطر المزدوج) و 50 ميكرولتر من محلول الكروموجين B (0.1 م / لتر حامض الستريك ، 0.2 م / لتر عازل فوسفات هيدروجين الصوديوم ، درجة الحموضة 5.0-5.4) إلى كل بئر. يحفظ بعيدا عن الضوء لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- بالنسبة للآبار القياسية وآبار العينات والآبار الفارغة ، أضف 50 ميكرولتر من محلول الإنهاء إلى كل بئر ، وقم بقياس قيمة الكثافة الضوئية لكل بئر عند 450 نانومتر في غضون 15 دقيقة.
6. التحليل النسيجي لإصابة عضلات الساق التي يسببها notexin في الفئران
- تحضير أقسام البارافين بسمك 5 ميكرومتر ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين للفحص المجهري الخفيف كما هو موضح في25.
7. معالجة الصور وتحليل البيانات
- قراءة وتحليل الصور التي تم التقاطها بواسطة نظام التصوير باستخدام برنامج التحليل. انقل حقل عرض الصورة المحدد إلى وسط الشاشة باستخدام الماوس، وانقر فوق 40x، ثم انقر فوق التقاط لقطة.
- سجل قيم OD من ELISA في جدول بيانات واحسب مستويات الفئران CK و FABP3 في العينات باستخدام المنحنى القياسي.
- استخدام برامج التحليل الإحصائي للتحليلات الإحصائية. التعبير عن القياسات كمتوسط ± الانحراف المعياري (
) ، وتحليل المقارنات بين المجموعات بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه ، مع اختبار LSD عندما كان التباين منتظما ، وطريقة Tamhane T2 عندما كان التباين غير منتظم. واعتبر الفرق ذا دلالة إحصائية عند قيمة p أقل من 0.05.
) ، وتحليل المقارنات بين المجموعات بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه ، مع اختبار LSD عندما كان التباين منتظما ، وطريقة Tamhane T2 عندما كان التباين غير منتظم. واعتبر الفرق ذا دلالة إحصائية عند قيمة p أقل من 0.05.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل مراقبة الخصائص المورفولوجية لعضلات الهيكل العظمي للفئران بعد الإصابة ، تم تلطيخ عضلة الساق بالهيماتوكسيلين والإيوزين ، وتمت قراءة الصور الملطخة باستخدام برنامج تحليل كما هو موضح في البروتوكول ل 8 فئران لكل مجموعة. في الفئران المصابة بإصابة عضلية في الساق ناتجة عن notexin (مجموعة NTX) ، تمزق العديد من خلايا العضلات وضمور ونخرية وترتيبها بشكل غير منتظم. كان هناك أيضا تسلل مرتفع للعدلات والخلايا الليمفاوية حول المنطقة المصابة (الشكل 4 ب). ومع ذلك ، بعد علاج Tuina بمدلك التدحرج ، تحسنت الحالة المرضية لخلايا العضلات في مجموعة NTX + Tuina ، مع عدد أقل من الخلايا الممزقة والضامرة والنخرية ، وعدد قليل فقط من الخلايا الالتهابية التي تتسلل مقارنة بمجموعة NTX (الشكل 4C). في المجموعة الضابطة ، كانت الخلايا العضلية للفئران متساوية الحجم ، مرتبة عن كثب ، وبدون تسلل الخلايا الالتهابية (الشكل 4 أ).
لمزيد من التأكيد على التأثير العلاجي ل Tuina على إصابة gastrocnemius في الفئران باستخدام مدلك Ding المتداول ، استخدمنا ELISA للكشف عن مستويات علامات إصابة العضلات الهيكلية CK و FABP3 ل 8 فئران لكل مجموعة. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، زادت مستويات CK و FABP3 بشكل ملحوظ في مجموعة NTX ، وانخفضت مستويات CK و FABP3 بشكل ملحوظ في مجموعة NTX + Tuina مقارنة بمجموعة NTX (الشكل 5). تشير هذه النتائج إلى أن حقن notexin تسبب في أضرار جسيمة لعضلة gastrocnemius في الفئران ، في حين أن Tuina يمكن أن تقلل من هذا الضرر.
الشكل 1: الخريطة المادية للمدلك المتداول. وهي تتألف بشكل أساسي من أسطوانة مطاطية ، وحامل شوكة ، ونابض ، وحاجز حد ، وجبيرة ضبط ، وبرغي ، ومقبض أكريليك. شريط المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: قياس قوة مدلك التدحرج. الحد الأقصى لضغط الدرفلة الأمامية هو 0.3 نيوتن ، والحد الأدنى للضغط حوالي 0.08 نيوتن عند التراجع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: علاج توينا باستخدام مدلك الدرفلة. ضع الأسطوانة على عضلة الساق للفأر وتدحرج للأمام حتى يلامس الزنبرك حاجز الحد ، ثم يتراجع عن القوة ويعود إلى موضعه الأصلي ، وبالتالي يرد الحركة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور تمثيلية للمقطع العرضي الملون ب HE. (أ) لم تصب العضلة الساقية لفئران المجموعة الضابطة (C) إصابة كبيرة بعد الحقن بالمحلول الملحي. (ب) تسبب حقن النوتيكسين في عضلة الساق في الفئران في مجموعة notexin (NTX) في إصابة عضلية شديدة ، مما أدى إلى ضمور الخلايا العضلية والنخر وأحجام مختلفة ، مصحوبا بتسلل هائل للعدلات والخلايا الليمفاوية. (ج) تم تخفيف إصابة عضلة الساق في مجموعة الفئران notexin و Tuina (NTX + Tuina) ، وتم تقليل عدد الخلايا العضلية الضامرة والنخرية والعدلات والخلايا الليمفاوية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تعبير CK و FABP3. تم حصاد البلازما بعد الانتهاء من Tuina ، وتم الكشف عن تركيزات CK و FABP3 في بلازما الفئران في السيطرة (C) ، notexin (NTX) ، و notexin و Tuina (NTX + Tuina) بواسطة ELISA. * P < 0.05 ، ** P < 0.01 باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار LSD بعد التخصيص. القيم هي المتوسط ± SEM ، n = 8 في جميع المجموعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا وصفنا بروتوكولا لعلاج توينا لإصابة العضلات الهيكلية في الفئران ثم قمنا بتحليل درجة إصابة العضلات الهيكلية بعد العلاج للتحقق من فعالية الطريقة. والجدير بالذكر أن نماذج إصابة عضلات الهيكل العظمي للفئران ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تحريض الدواء (notexin ، bupivacaine) 16 ، والكدمة الحادة26 ، والسحق 27 ، ونقص التروية28 ، يمكن أن تتداخل مع Tuina. من خلال تلطيخ HE لمراقبة التغيرات النسيجية المرضية واكتشاف ELISA لتحديد علامات تلف العضلات الهيكلية ، يظهر بشكل حدسي أن notexin يسبب أضرارا جسيمة لعضلة gastrocnemius للفئران ، في حين أن المدلك الذي يحاكي طريقة لفة Ding يمكن أن يقلل من تلف العضلات. هذه توفر أدلة مقنعة على فعالية Tuina في علاج إصابات العضلات والهيكل العظمي.
هناك العديد من الإجراءات الضرورية التي يجب مراعاتها عند إجراء Tuina على الفئران التي تحاكي طريقة لفة Ding. قبل العلاج ، يجب تدريب مشغل Tuina مسبقا على استخدام مدلك الدرفلة 3x على الأقل ، لضبط زاوية الحاجز بمساعدة مستشعر الضغط للتحكم المناسب في القوة ، والتحكم في تردد Tuina عند 140 لفة / دقيقة. في هذه الأثناء ، حافظ على هدوء الفئران من خلال تغطية رؤوسها بمنديل أسود دون أن تكون ضيقة بشكل غير ملائم لضمان قدرتها على التنفس بحرية. إذا كافح الجرذ فجأة ليكون نشطا في عملية Tuina ، فانتظر حتى يهدأ قبل متابعة Tuina.
الحد من هذه التجربة هو أن هذا المدلك مناسب للفئران بدلا من الصغيرة ، مثل الفئران. بالنسبة للحيوانات بخلاف الفئران ، يمكن تغيير بعض تكوينات الأداة. مثل حجم البكرات ، وزاوية الحاجز ، وقوة الزنبرك ، وبطبيعة الحال ، يجب استخدام مستشعر الضغط لاختبار قوة التدحرج. لقد صنعنا فقط مدلك Tuina يحاكي طريقة لفة Ding هنا. ومع ذلك ، كعلاج غير دوائي للطب الصيني التقليدي ، هناك العديد من معالجات Tuina ، مثل الدفع والترطيب والضغط والعجن. يمكن إجراء كل هذه التلاعبات وفقا لمعايير التشغيل الخاصة بأساتذة Tuina المشهورين ذوي الصلة لإنتاج أداة أكثر ملاءمة للبحوث الحيوانية لتوحيد العملية التجريبية والسماح للنتائج التجريبية بأن تكون أكثر دقة ومصداقية.
في الختام ، نقدم وصفا تفصيليا لطريقة تصنيع مدلك الدرفلة التي تحاكي بشكل فعال طريقة لفة Ding أثناء التجارب على. يتمتع المدلك بفعالية علاجية كبيرة في إصابة العضلات الهيكلية في الفئران ويضع الأساس لمزيد من الأبحاث حول توحيد Tuina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 82174521) ، مشروع الابتكار لطلاب الدراسات العليا بجامعة هونان للطب الصيني (2022CX109)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | JIANGXI FENGLIN | 20220521 | |
| 1.5 microtubes | Servicebio | EP-150X-J | |
| 15 mL centrifuge tube | Servicebio | EP-1501-J | |
| 30G needle | CONPUVON | 220318 | |
| 5 mL blood collection tube | Servicebio | QX0023 | |
| Acrylic handle | Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd | 65643645 | |
| Adjustment splint | CREROMEM | 20220729 | |
| Cotton Swab | INOHV | 22080215 | |
| Enzyme-labeled Instrument | Rayto | RT-6100 | |
| Ethanol | INOHV | 211106 | |
| Fork holder | Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd | JL001 | |
| Hair removal cream | Veet, France | LOTC190922002 | |
| Hematoxylin dyeing solution set | Wuhan Google Biotech | G1005 | |
| Imaging system | Nikon, Japan | Nikon DS-U3 | |
| IODOPHOR disfecting solution | Hale&Hearty | 20221205 | |
| Light microscope | Nikon, Japan | Nikon Eclipse E100 | |
| Limit baffle | CREROMEM | 20220724 | |
| Notexin | Latoxan S.A.S. | L8104-100UG | |
| Pentobarbital sodium | Merck KGaA | P3761 | |
| Rat creatine kinase (CK) ELISA kit | LunChangShuoBiotech | YD-35237 | |
| Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit | LunChangShuoBiotech | YD-35730 | |
| Rubber roller | Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd | 202207 | |
| Screw | Weiyan Hardware | B05Z122 | |
| Sprague Dawley rats | Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co. | SYXK2019-0009 | |
| Spring | Bingzhang Hardware | TH001 | |
| Surgical blade | Covetrus | #23 | |
| Weigh controller | Iyoys | HY-XSQ |
References
- Lempainen, L., et al. Management of anterior thigh injuries in soccer players: practical guide. BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 14 (1), 41 (2022).
- Bayer, M. L., Mackey, A., Magnusson, S. P., Krogsgaard, M. R., Kjær, M. Treatment of acute muscle injuries (in Danish). Ugeskrift for Laeger. 181 (8), V11180753 (2019).
- Serner, A., et al. Progression of Strength, Flexibility, and Palpation Pain During Rehabilitation of Athletes with Acute Adductor Injuries: A Prospective Cohort Study. The Journal of Orthopaedic and Sports Physical Therapy. 51 (3), 126-134 (2021).
- Gozubuyuk, O. B., Koksal, C., Tasdemir, E. N. Rehabilitation of a patient with bilateral rectus abdominis full thickness tear sustained in recreational strength training: a case report. Physiotherapy Theory and Practice. 38 (13), 3216-3225 (2022).
- Hotfiel, T., et al. Current Conservative Treatment and Management Strategies of Skeletal Muscle Injuries. Zeitschrift für Orthopädie und Unfallchirurgie. 154 (3), 245-253 (2016).
- de Sire, A., et al. Pharmacological Treatment for Acute Traumatic Musculoskeletal Pain in Athletes. Medicina. 57 (11), 1208 (2021).
- Connor, D. E., et al. Therapeutic potential of exosomes in rotator cuff tendon healing. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 37 (5), 759-767 (2019).
- Martins, A. L. L., Giorno, L. P., Santos, A. R. Jr Tissue Engineering Applied to Skeletal Muscle: Strategies and Perspectives. Bioengineering. 9 (12), 744 (2022).
- Horgan, D., et al. Clouds across the new dawn for clinical, diagnostic and biological data: accelerating the development, delivery and uptake of personalized medicine. Diagnosis. , (2023).
- Urits, I., et al. A Comprehensive Review of Alternative Therapies for the Management of Chronic Pain Patients: Acupuncture, Tai Chi, Osteopathic Manipulative Medicine, and Chiropractic Care. Advances in Therapy. 38 (1), 76-89 (2021).
- Lee, N. W., et al. Chuna (or Tuina) Manual Therapy for Musculoskeletal Disorders: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2017, 8218139 (2017).
- Xie, J., Deng, D. X., Chen, Y., Peng, L. Progress in the intervention of massage techniques on skeletal muscle injury. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 34 (04), 199-201 (2018).
- Yuan, Y., Zhang, H., Zhang, G. H., Xue, X. N. Research progress on microstructure changes and rehabilitation treatment of exercise-induced skeletal muscle injury. Massage and Rehabilitation Medicine. 14 (6), 29-33 (2023).
- Zhao, Y. The Establishment of Famous Tuina Master Ding Jifeng and Wei Fa - Commemorating the 100th Anniversary of Mr. Ding Jifeng's Birthday. Traditional Chinese Medicine Culture. 9 (6), 18-21 (2014).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PloS one. 11 (1), e0147198 (2016).
- Plant, D. R., Colarossi, F. E., Lynch, G. S. Notexin causes greater myotoxic damage and slower functional repair in mouse skeletal muscles than bupivacaine. Muscle & Nerve. 34 (5), 577-585 (2006).
- Tierney, M. T., Sacco, A. Inducing and Evaluating Skeletal Muscle Injury by Notexin and Barium Chloride. Methods in Molecular Biology. 1460, 53-60 (2016).
- Torres-Ruiz, J., Alcalá-Carmona, B., Alejandre-Aguilar, R., Gómez-Martín, D. Inflammatory myopathies and beyond: The dual role of neutrophils in muscle damage and regeneration. Frontiers in Immunology. 14, 1113214 (2023).
- Tu, H., Li, Y. L. Inflammation balance in skeletal muscle damage and repair. Frontiers in Immunology. 14, 1133355 (2023).
- Castro, C., Gourley, M. Diagnosis and treatment of inflammatory myopathy: issues and management. Therapeutic Advances in Musculoskeletal Disease. 4 (2), 111-120 (2012).
- Dabby, R., et al. Asymptomatic or minimally symptomatic hyperCKemia: histopathologic correlates. The Israel Medical Association Journal: IMAJ. 8 (2), 110-113 (2006).
- Khodabukus, A., et al. Tissue-Engineered Human Myobundle System as a Platform for Evaluation of Skeletal Muscle Injury Biomarkers. Toxicological Sciences. 176 (1), 124-136 (2020).
- Zhou, X. W., Jin, W. D., Zhu, L., Liu, X. H., Zhou, B. H. Experimental observation on the influence of different frequency, intensity and action time of Ding rolling manipulation on hemodynamics. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine. (06), 42-44 (1998).
- Pablos, A., et al. Protective Effects of Foam Rolling against Inflammation and Notexin Induced Muscle Damage in Rats. International Journal of Medical Sciences. 17 (1), 71-81 (2017).
- Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Enhancing Tumor Content through Tumor Macrodissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (180), e62961 (2022).
- Deng, P., et al. Contusion concomitant with ischemia injury aggravates skeletal muscle necrosis and hinders muscle functional recovery. Experimental Biology and Medicine. 247 (17), 1577-1590 (2022).
- Dobek, G. L., Fulkerson, N. D., Nicholas, J., Schneider, B. S. Mouse model of muscle crush injury of the legs. Comparative Medicine. 63 (3), 227-232 (2013).
- Armstrong, D. M., et al. Sildenafil citrate protects skeletal muscle of ischemia-reperfusion injury: immunohistochemical study in rat model. Acta Cirúrgica Brasileira. 28 (4), 282-287 (2013).
