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Medicine

चूहों में नोटक्सिन-प्रेरित मांसपेशियों की चोट पर डिंग के रोल विधि की नकल करना

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1College of Acupuncture and Tuina and Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल एक साधारण उपकरण का वर्णन करता है जो डिंग की रोल विधि की नकल करता है, कंकाल की मांसपेशियों की चोट का एक चूहा मॉडल स्थापित करता है, और सीरम क्षति मार्करों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए क्षतिग्रस्त ऊतक और एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख के विकृति का निरीक्षण करने के लिए हेमटोक्सिलिन-ईोसिन धुंधला का उपयोग करता है।

Abstract

डिंग की रोल विधि पारंपरिक चीनी मालिश (तुइना) क्लीनिकों में सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली जोड़तोड़ में से एक है और चीन में सबसे प्रभावशाली समकालीन ट्यूना जोड़तोड़ में से एक है। यह पारंपरिक रोलिंग विधि पर आधारित है जो आमतौर पर वन फिंगर ज़ेन शैली में उपयोग की जाती है और इसे डिंग की रोल विधि नाम दिया जाता है। इसके विरोधी भड़काऊ और रक्त परिसंचरण को बढ़ावा देने वाले प्रभावों के कारण, डिंग की रोलिंग विधि का मायोपैथी पर ध्वनि चिकित्सीय प्रभाव पड़ता है। मानव त्वचा पर लागू बल के बड़े क्षेत्र के कारण, डिंग की रोल विधि चूहों और खरगोशों जैसे छोटे त्वचा क्षेत्रों के साथ प्रयोगात्मक जानवरों पर प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, मानव शरीर पर लागू टुइना की ताकत प्रयोगात्मक जानवरों पर लागू होने से भिन्न होती है, इसलिए ऐसा हो सकता है कि प्रयोग के दौरान ट्यूना के चिकित्सीय प्रभाव को प्राप्त करने के लिए ताकत बहुत अधिक या बहुत कम हो। इस प्रयोग का उद्देश्य डिंग के रोलिंग हेरफेर मापदंडों (ताकत, आवृत्ति, ट्यूना अवधि) के आधार पर चूहों के लिए उपयुक्त एक सरल मालिश बनाना है। डिवाइस पशु प्रयोगों में हेरफेर को मानकीकृत कर सकता है और व्यक्तिपरक कारकों के कारण विभिन्न जानवरों पर लागू ट्यूना बल में भिन्नता को कम कर सकता है। नोटेक्सिन-प्रेरित कंकाल की मांसपेशियों की चोट का एक चूहा मॉडल स्थापित किया गया था, और प्लाज्मा चोट मार्कर क्रिएटिन किनेज (सीके) और फैटी एसिड बाइंडिंग प्रोटीन 3 (एफएबीपी 3) का उपयोग कंकाल की मांसपेशियों की चोट पर ट्यूना के चिकित्सीय प्रभाव का आकलन करने के लिए किया गया था। परिणामों से पता चला कि यह ट्यूना मसाजर सीके और एफएबीपी 3 अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर सकता है और कंकाल की मांसपेशियों की चोट की डिग्री को धीमा कर सकता है। इसलिए, यहां वर्णित टुइना मसाजर, डिंग की रोल विधि की नकल करते हुए, प्रयोगात्मक अनुसंधान में ट्यूना हेरफेर को मानकीकृत करने में योगदान देता है और मायोपैथी के लिए ट्यूना के आणविक तंत्र पर बाद के शोध के लिए बहुत मदद करता है।

Introduction

मांसपेशियों की चोटें नैदानिक और दैनिक जीवन में आम दर्दनाक चोटें हैं, जो बाहरी वार (विरोधाभास) या मांसपेशियों के तंतुओं (उपभेदों) आदि के पुराने ओवरस्ट्रेन के कारण होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप मांसपेशियों की शिथिलता और दर्द होता है, यहां तक कि रोगी के जीवन की गुणवत्ता को भी गंभीरता से प्रभावित करता है1. एक तीव्र तनाव की चोट के बाद जितनी जल्दी हो सके पुनर्वास शुरू करना खेल2 पर लौटने के समय को कम करने औरदर्द 3,4 को कम करने की कुंजी है। आधुनिक पश्चिमी चिकित्सा में, मांसपेशियों की चोटों के लिए नैदानिक प्राथमिक चिकित्सा दर्द से राहत देने के लिए मांसपेशियों के ऊतकों5 और गैर-स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं में हानिकारक रक्तस्राव को रोकने के लिए आराम, बर्फ, संपीड़न और ऊंचाई (आरआईसीई) के सिद्धांतों का पालन करतीहै। एक्सोसोम7 और ऊतक इंजीनियरिंग8 जैसे उपन्यास उपचारों की खोज कंकाल की मांसपेशियों की बीमारियों के लिए संभावित उपचार रणनीति बन गई, जो पिछले औषधीय उपचारों की कमियों की भरपाई करती है। हालांकि, यह रोगियों के लिए उपचार की लागत भी बढ़ा सकता है, जिससे उन्हें जबरदस्त वित्तीय दबावमें डाल दिया जा सकता है। इसलिए, मस्कुलोस्केलेटल समस्याओं10 के इलाज के लिए वैकल्पिक और पूरक चिकित्सा की सिफारिश कर रहे हैं. ट्यूना व्यापक रूप से चीन में एक पारंपरिक चिकित्सा पद्धति के रूप में चिकित्सकीय रूप से उपयोग किया जाता है और इसकी प्रभावकारिता और कम दुष्प्रभावों के लिए रोगियों के बीच लोकप्रिय है। मस्कुलोस्केलेटल विकारों के लिए ट्यूना थेरेपी दर्द को कम कर सकती है और समारोह11,12,13में सुधार कर सकती है। श्री डिंग जिफेंग, एक प्रसिद्ध शंघाई तुइना अभ्यासी, ने डिंग की रोल विधि14 की स्थापना की। यह एक बड़ी बल क्षेत्र, समान और कोमल बल और तीव्र पैठ के साथ एक अनूठी रोलिंग और क्रशिंग तकनीक है।

विभिन्न पशु मॉडल विभिन्न एटियलजि पर आधारित होते हैं। उनके फायदे और नुकसान हैं, और सही और उपयुक्त पशु मॉडल का चयन बुनियादी प्रयोगों के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, जो कंकाल की मांसपेशियों की चोटों के उपचार के लिए नए उपचार विकसित करने के लिए पुनर्जनन और मरम्मत के सेलुलर और आणविक सिग्नलिंग मार्गों को समझने में मदद करता है। मांसपेशियों की चोट के रासायनिक प्रेरित मॉडल व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, कंकाल की मांसपेशी के इंजेक्शन के साथ मायोफाइबर परिगलन का कारण बनता है और पुनर्जीवित क्षेत्रों का उत्पादन करता है जो 2 सप्ताह15 के भीतर प्रभावी ढंग से पुन: उत्पन्न कर सकते हैं। नॉटेक्सिन और बुपीवाकेन दोनों मांसपेशियों को नुकसान पहुंचा सकते हैं। हालांकि, नोटेक्सिन बुपीवाकेन की तुलना में कंकाल की मांसपेशियों को अधिक गंभीर मायोटॉक्सिक क्षति का कारण बन सकता है, और प्राकृतिक कार्यात्मक वसूली अपेक्षाकृत धीमीहै16. ड्रग इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन मोल्डिंग में न केवल कम समय लगता है, बल्कि कंकाल की मांसपेशियों की क्षति के नियंत्रित प्रभाव और सीमा भी होती है। यह मात्रात्मक नियंत्रण सफल मोल्डिंग को कम कठिन15,17 बनाता है।

भड़काऊ प्रतिक्रिया एक आवश्यक जैविक प्रतिक्रिया है जिसका मायोपैथी18,19के संदर्भ में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। कंकाल की मांसपेशियों की चोट के शुरुआती चरणों में, myofiber परिगलन स्थानीय मांसपेशी homeostasis बाधित, और कई भड़काऊ कोशिकाओं चोट साइट घुसपैठ, कई समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स19 स्रावित करते हैं. क्रिएटिन किनेज (सीके) कंकाल की मांसपेशियों की चोट का आकलन करने के लिए एक पारंपरिक सीरम बायोमार्कर है। हालांकि, इसमें ऊतक विशिष्टता20 और संवेदनशीलता21 का अभाव है, जो दवा-प्रेरित मांसपेशियों की क्षति की सीमा का आकलन करने की अपनी क्षमता को सीमित करता है और अप्रत्यक्ष रूप से चोट के बाद मांसपेशियों की वसूली की सीमा की रिपोर्ट करता है। फैटी एसिड बाइंडिंग प्रोटीन 3 (एफएबीपी 3) सहित उपन्यास बायोमार्कर ने हाल ही में कंकाल की मांसपेशियों की चोट के कृंतक मॉडल में अपेक्षाकृत उच्च ऊतक विशिष्टता और संवेदनशीलता दिखाई है। FABP3 बाध्यकारी प्रोटीन का एक परिवार है जो मुख्य रूप से हृदय और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और फैटी एसिड चयापचय, परिवहन और सिग्नलिंग22 में फंसा होता है। इसलिए, हमने उपचार के बाद नॉटेक्सिन-प्रेरित कंकाल की मांसपेशियों की क्षति और वसूली की सीमा का आकलन करने के लिए दो बायोमार्कर, सीके और एफएबीपी 3 का संयोजन चुना।

कृन्तकों में, मांसपेशियां उथली होती हैं, और त्वचा का क्षेत्र छोटा होता है, जो यह भी निर्धारित करता है कि कृन्तकों में मालिश के विभिन्न पैरामीटर मनुष्यों के समान नहीं होंगे, जैसे कि पशु चिकित्सा में, मालिश चिकित्सक को डिंग के रोल विधि का उपयोग करके कम बल के साथ उनका इलाज करना चाहिए, और घायल क्षेत्र के छोटे आकार के कारण इस तकनीक के संचालन के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है, जो अंततः मालिश की प्रभावशीलता में कमी का कारण बन सकता है। इसलिए, प्रयोग ने घर में बने रोलिंग मालिश का उपयोग किया, जो डिंग की रोल विधि की विशेषताओं के अनुरूप है, चूहों में नॉटेक्सिन-प्रेरित कंकाल की मांसपेशियों की चोट मॉडल के चिकित्सीय प्रभाव में हस्तक्षेप करने और मूल्यांकन करने के लिए, जो मानकीकृत करने में मदद करता है तुइना की कार्रवाई के आणविक तंत्र की गहराई से जांच करने के लिए प्रयोगात्मक पशु अध्ययन में तुइना के पैरामीटर, मस्कुलोस्केलेटल रोगों पर एक पारंपरिक चीनी चिकित्सा उपचार विधि।

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Protocol

जानवरों से जुड़ी प्रक्रियाओं को चीनी चिकित्सा के हुनान विश्वविद्यालय में संस्थागत देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. रोलिंग मालिश की विधानसभा

  1. एक मालिश का चयन करें जिसमें एक रबर रोलर, कांटा धारक, वसंत, सीमा चकरा, समायोजन स्प्लिंट, पेंच और ऐक्रेलिक हैंडल (चित्र 1) शामिल हैं। सुनिश्चित करें कि रबर रोलर 3 सेमी लंबा और 1.6 सेमी व्यास मापता है, वसंत 3 सेमी लंबा और 0.9 सेमी व्यास का होता है, सीमा बाधक 3 सेमी लंबा और 2 सेमी चौड़ा होता है, और हैंडल 12 सेमी लंबा और 0.9 सेमी व्यास का होता है।
  2. बल नियंत्रण: साहित्य के परिणाम23 के अनुसार, डिंग की रोल विधि नीचे की ओर दबाव शरीर के वजन का लगभग 10% पाया गया, इसलिए फॉरवर्ड रोलिंग के डिजाइन के दौरान लागू दबाव चूहे के शरीर के वजन (0.2-0.3 एन) का लगभग 10% है। सीमा चकरा के कोण को समायोजित करके वजन नियंत्रक पर मालिश के अधिकतम दबाव का परीक्षण लगभग 0.3 N करें। यह दबाव आवश्यकता चूहे की जरूरतों को पूरा करती है।
  3. सुनिश्चित करें कि न्यूनतम दबाव लगभग 0.08 एन है जब वापस रोलिंग (चित्रा 2)। सुनिश्चित करें कि दबाव डिंग की रोल विधि की आवश्यकता के अनुरूप है कि आगे और पीछे की ताकतों का अनुपात 3: 1 है।
  4. उपचार से पहले, ऑपरेटर से 140 रोल/मिनट तक रोलिंग आवृत्ति को नियंत्रित करने के लिए मेट्रोनोम सॉफ्टवेयर के साथ काम करने के लिए कहें और ऑपरेशन को मानकीकृत करने के लिए पूर्व-प्रयोग में 3x से अधिक का अभ्यास करें।

2. कंकाल की मांसपेशियों की चोट के चूहे के मॉडल की स्थापना

  1. बेतरतीब ढंग से 24 नर, स्प्रैग-डॉली चूहों (वजन 200-250 ग्राम) को आठ चूहों के तीन समूहों में विभाजित करें, जिनमें नियंत्रण (सी), नॉटेक्सिन (एनटीएक्स), और ट्यूना (एनटीएक्स + ट्यूना) के साथ नॉटेक्सिन शामिल हैं, और एक मानक आहार पर फ़ीड करें। 12 घंटे के अंधेरे चक्र, 20-25 डिग्री सेल्सियस और 50% -70% आर्द्रता पर घर बनाए रखें।
  2. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम (40 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एनेस्थेटाइज़ करें और फिर बालों को हटाने वाली क्रीम के साथ दाहिने निचले अंग से बालों को हटा दें। फर को हटाने के बाद, खारा का उपयोग करके अवशिष्ट क्रीम को पोंछ लें। पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करें। आंखों को मॉइस्चराइज करने के लिए नेत्र मरहम लागू करें, जबकि जानवर संज्ञाहरण के अधीन है। पूरी प्रक्रिया के दौरान थर्मल समर्थन प्रदान करें।
  3. इंजेक्शन से पहले आयोडोफोर कीटाणुशोधन समाधान और 75% शराब के साथ दाहिने निचले अंग के लिए वैकल्पिक त्वचा कीटाणुशोधन। निचले छोर की त्वचा के केंद्र में आयोडोफोर कीटाणुनाशक समाधान में भिगोए गए एक कपास झाड़ू को स्पर्श करें और बाहर की ओर एक गोलाकार गति में लागू करें। एक इथेनॉल लथपथ कपास झाड़ू के साथ दोहराएं।
  4. संदर्भ विधि24 के अनुसार कंकाल की मांसपेशियों की चोट मॉडल स्थापित करें. केवल एक पैर में notexin इंजेक्ट करें (डबल notexin इंजेक्शन को रोकने के लिए)। 30 जी सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज में नोटेक्सिन समाधान के 200 माइक्रोन (15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सामान्य खारा के 10 एमएल में 100 माइक्रोग्राम नॉटेक्सिन जोड़कर तैयार किए गए नॉटेक्सिन समाधान) को ड्रा करें और मांसपेशियों की चोट पैदा करने के लिए गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी में इंट्रामस्क्युलर रूप से नॉटेक्सिन समाधान इंजेक्ट करें।
  5. नोटेक्सिन को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें और सुई को बाहर निकालने से पहले 3 सेकंड तक प्रतीक्षा करें (पूरी तरह से इंजेक्ट करने के लिए)।
    चेतावनी: नोटक्सिन एक जहरीला रसायन है जिसे खुले घाव के संपर्क में आने पर बहुत सारे पानी के साथ तत्काल फ्लशिंग की आवश्यकता होती है और यदि आवश्यक हो तो शीघ्र चिकित्सा ध्यान दें।
  6. खारा समाधान के 200 माइक्रोन के साथ नियंत्रण समूह में चूहों इंजेक्षन. साफ बिस्तर के साथ खाली पिंजरों के लिए संवेदनाहारी चूहों ले जाएँ. उनकी सांस को साफ रखने के लिए चूहों की नाक और मुंह के आसपास की गद्दी को हटाने का ध्यान रखें। इंजेक्शन के अंत में ऊतक के रंग और श्वसन दर का नेत्रहीन निरीक्षण करें जब तक कि चूहों को पर्याप्त चेतना प्राप्त न हो जाए।
  7. चूहों को घर के पिंजरे में लौटाएं और आम तौर पर उन्हें 24 घंटे के लिए पीछे करें।

3. ट्यूना थेरेपी

  1. गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी को बेनकाब करने के लिए प्रयोगात्मक मंच पर एक काले कपड़े से ढके अपने सिर को एक काले कपड़े से ढंकने के साथ एक एसडी चूहे को रखें। खूप कसकर ढकवू नका.
  2. NTX+Tuina समूह के लिए Tuina मसाजर का उपयोग करना: मालिश को पकड़ें और रोलर को चूहे की गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी पर रखें और तब तक आगे रोल करें जब तक कि वसंत सीमा से संपर्क न कर ले। फिर बल को वापस लें और अपनी मूल स्थिति में लौट आएं, जिससे पारस्परिक आंदोलन (चित्रा 3) हो।
  3. मालिश प्रति मिनट 140 रोल की गति से रोल करें, और 3 मिनट के लिए प्रत्येक ऑपरेशन करें। लगातार 3 दिनों तक सुबह एक बार और दोपहर में एक बार मालिश करें।
  4. प्रत्येक उपचार के बाद घर पिंजरे के लिए चूहों लौटें और अंतिम उपचार के बाद 8 घंटे के लिए उपवास करें।

4. प्रयोग के बाद चूहों से रक्त और ऊतकों को इकट्ठा करना

  1. प्रासंगिक पशु प्रयोग नैतिकता समिति की आवश्यकताओं के अनुसार, 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम (40 मिलीग्राम / किग्रा, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करें। रक्त संग्रह के बाद पेट की महाधमनी रक्तपात द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु।
  2. इंजेक्शन से पहले आयोडोफोर कीटाणुशोधन समाधान और 75% अल्कोहल के साथ वैकल्पिक त्वचा कीटाणुशोधन। पेट की त्वचा के केंद्र में पोविडोन-आयोडीन में भिगोए गए एक कपास झाड़ू को स्पर्श करें और बाहर की ओर एक गोलाकार गति में लागू करें। एक इथेनॉल लथपथ कपास झाड़ू के साथ दोहराएं। कीटाणुशोधन 3x दोहराएं।
  3. सहायक को पेट के बीच में त्वचा को उठाने के लिए दो हेमोस्टैट का उपयोग करने के लिए कहें। ऑपरेटर के रूप में, पेट की त्वचा और मांसपेशियों को रैप से जघन सिम्फिसिस तक काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
  4. उदर गुहा खोलने के बाद, पीछे पेट की दीवार में पेट महाधमनी बेनकाब करने के लिए बाँझ कपास गेंदों के साथ आंत्र अलग.
  5. उदर महाधमनी का पता लगाएँ, रक्त संग्रह ट्यूबों में चूहे के रक्त के 5 एमएल ले लो, और 1 घंटे के लिए खड़े रक्त के बाद 10 मिनट के लिए 3000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा 1.5 माइक्रोट्यूब में प्लाज्मा प्राप्त करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मा स्टोर करें।
  6. निचले निचले अंग के पार्श्व पहलू की ओर निचले पेट के उद्घाटन के साथ सर्जिकल कैंची के साथ त्वचा को खोलें, निचले अंग की मांसपेशियों को उजागर करें, और संदंश के साथ प्रावरणी को सावधानीपूर्वक अलग करने के बाद, बरकरार गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी को हटाने के लिए स्केलपेल को काट लें।
  7. चिपकने वाले बालों और रक्त को हटाने के लिए बाँझ खारा में गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी को धोएं।
  8. हटाए गए गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड होता है।

5. एलिसा द्वारा प्लाज्मा सीके और एफएबीपी 3 स्तरों का पता लगाना

  1. गणना करें और एक प्रयोग के लिए आवश्यक पूर्व लिपटे प्लेटों की संख्या का निर्धारण. आवश्यक प्लेटें निकालें, उन्हें 96 अच्छी तरह से फ्रेम में जगह, शेष microplates वापस सील करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी बैग में डाल दिया, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  2. 120 मिनट के लिए कमरे के तापमान (25-28 डिग्री सेल्सियस) पर किट और नमूने को संतुलित करें, कमरे के तापमान को पूरी तरह से संतुलित करें।
    नोट: किट और नमूने का संतुलन महत्वपूर्ण है और इसे पर्याप्त समय तक संतुलित किया जाना चाहिए।
  3. मानक, नमूना और खाली कुएं सेट करें। मानक कुओं में विभिन्न सांद्रता (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 एनजी/एमएल) पर सीके या एफएबीपी3 मानक के 50 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक मानक को एक बार दोहराएं, कुल 12 कुओं पर कब्जा कर लें।
  4. नमूना मंदक के 40 माइक्रोन (0.8 ग्राम NaCl, 0.02 ग्राम KH 2 PO 4, 0.29 ग्राम Na2 HPO 4 12H2O, 0.02 ग्राम KCl, 0.01ग्राम NaN3डबल आसुत जल के 100 एमएल, पीएच7.4) के साथ नमूना कुओं को भरें, इसके बाद परीक्षण किए जाने वाले नमूने के 10 माइक्रोन के बाद। प्रत्येक नमूने को एक बार दोहराएं, कुल 48 कुओं पर कब्जा कर लें।
  5. पिछले नमूने के पीछे दो कुओं स्थित रिक्त कुओं को छोड़कर, प्रत्येक मानक और नमूना अच्छी तरह से एचआरपी लेबल वाले एंटी-ह्यूमन सीके या एफएबीपी 3 एंटीबॉडी (एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  6. सील फिल्म के साथ कुओं सील और 60 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान या थर्मोस्टेट में सेते हैं.
  7. तरल त्यागें, शोषक कागज पर थपथपाकर सुखाएं, प्रत्येक अच्छी तरह से धोने वाले तरल से भरें, 20 एस के लिए छोड़ दें, धोने के तरल को हिलाएं, सोख्ता कागज पर थपथपाकर सुखाएं, और प्लेट को 5x धोने के लिए दोहराएं (या प्लेट वॉशर का उपयोग करें)।
  8. क्रोमोजेन समाधान ए के 50 माइक्रोन (डबल आसुत जल के 100 एमएल में 20 मिलीग्राम टेट्रामेथिलबेनज़िडिन, 10 एमएल इथेनॉल) और क्रोमोजेन समाधान बी (0.1 एम / एल साइट्रिक एसिड, 0.2 एम / एल सोडियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट बफर, पीएच 5.0-5.4) के 50 माइक्रोन जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए प्रकाश से दूर रखें.
  9. मानक कुओं, नमूना कुओं और रिक्त कुओं के लिए, प्रत्येक कुएं में समाप्ति समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें, और 15 मिनट के भीतर 450 एनएम पर प्रत्येक कुएं के ऑप्टिकल घनत्व मूल्य को मापें।

6. चूहों में नॉटेक्सिन-प्रेरित गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों की चोट का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

  1. 25 में वर्णित के रूप में प्रकाश सूक्ष्म परीक्षा के लिए hematoxylin और eosin के साथ दाग 5 माइक्रोन मोटी पैराफिन वर्गों तैयार करें.

7. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण

  1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ इमेजिंग सिस्टम द्वारा कैप्चर की गई छवियों को पढ़ें और उनका विश्लेषण करें। माउस के साथ स्क्रीन के केंद्र में दृश्य के चयनित छवि फ़ील्ड ले जाएँ, 40x क्लिक करें, और उसके बाद स्नैपशॉट ले क्लिक करें।
  2. एक स्प्रेडशीट में एलिसा से आयुध डिपो मूल्यों रिकॉर्ड और मानक वक्र का उपयोग नमूनों में चूहे सीके और FABP3 स्तरों की गणना.
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। मानक विचलन (Equation 1) ± मतलब के रूप में माप व्यक्त करें, और एक तरफा एनोवा द्वारा समूहों के बीच तुलना का विश्लेषण करें, एलएसडी परीक्षण के साथ जब विचरण एक समान था, और तम्हाने टी 2 विधि जब विचरण एक समान नहीं था। अंतर को 0.05 से कम पी-मान पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

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Representative Results

चोट के बाद चूहे के कंकाल की मांसपेशियों के रूपात्मक गुणों का निरीक्षण करने के लिए, गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी को हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन के साथ दाग दिया गया था, और सना हुआ छवियों को एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ पढ़ा गया था जैसा कि प्रति समूह 8 चूहों के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित है। नॉटेक्सिन (एनटीएक्स समूह) द्वारा प्रेरित गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशियों की चोट वाले चूहों में, कई मांसपेशियों की कोशिकाएं टूट गईं, एट्रोफिक, नेक्रोटिक और अनियमित रूप से व्यवस्थित हो गईं। प्रभावित क्षेत्र (चित्रा 4 बी) के आसपास न्यूट्रोफिल और लिम्फोसाइटों की एक उच्च घुसपैठ भी थी। हालांकि, रोलिंग मसाजर के साथ ट्यूना उपचार के बाद, एनटीएक्स + ट्यूना समूह में मांसपेशियों की कोशिकाओं की रोग संबंधी स्थिति में सुधार हुआ, कम टूटने, एट्रोफिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं के साथ, और एनटीएक्स समूह(चित्रा 4सी)की तुलना में घुसपैठ करने वाली भड़काऊ कोशिकाओं की केवल एक छोटी संख्या। नियंत्रण समूह में, चूहों की मांसपेशियों की कोशिकाओं को समान रूप से आकार, बारीकी से व्यवस्थित किया गया था, और भड़काऊ सेल घुसपैठ(चित्रा 4ए)के बिना।

डिंग के रोलिंग मसाजर का उपयोग करने वाले चूहों में गैस्ट्रोकनेमियस चोट पर ट्यूना के चिकित्सीय प्रभाव की पुष्टि करने के लिए, हमने प्रति समूह 8 चूहों के लिए कंकाल की मांसपेशियों की चोट मार्करों सीके और एफएबीपी 3 के स्तर का पता लगाने के लिए एलिसा का उपयोग किया। नियंत्रण समूह की तुलना में, सीके और एफएबीपी 3 के स्तर एनटीएक्स समूह में काफी बढ़ गए थे, और सीके और एफएबीपी 3 दोनों स्तरों को एनटीएक्स समूह (चित्रा 5) की तुलना में एनटीएक्स + ट्यूना समूह में स्पष्ट रूप से कमी आई थी। इन परिणामों से पता चलता है कि नॉटेक्सिन के इंजेक्शन ने चूहों में गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों को गंभीर नुकसान पहुंचाया, जबकि टुइना इस क्षति को कम कर सकता है।

Figure 1
चित्र 1: रोलिंग मालिश भौतिक मानचित्र। इसमें मुख्य रूप से एक रबर रोलर, कांटा धारक, वसंत, सीमा चकच, समायोजन स्प्लिंट, पेंच और ऐक्रेलिक हैंडल शामिल हैं। स्केल बार = 1 सेमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: रोलिंग मालिश बल माप। फॉरवर्ड रोलिंग का अधिकतम दबाव 0.3 N है, और वापस लुढ़कने पर न्यूनतम दबाव लगभग 0.08 N है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रोलिंग मालिश का उपयोग कर ट्यूना थेरेपी। चूहे की गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी पर रोलर रखें और तब तक आगे रोल करें जब तक कि वसंत सीमा से संपर्क न करे, फिर बल को वापस ले लें और अपनी मूल स्थिति में लौट आएं, जिससे आंदोलन का आदान-प्रदान हो। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: चूहे gastrocnemius मांसपेशी के एचई-दाग पार अनुभाग के प्रतिनिधि छवियों. (ए) नियंत्रण (सी) समूह चूहों की गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशी खारा इंजेक्शन के बाद काफी घायल नहीं हुई थी। (बी) नॉटेक्सिन (एनटीएक्स) समूह में चूहों की गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशी में नोटक्सिन इंजेक्शन ने गंभीर मांसपेशियों की चोट का कारण बना, जिसके परिणामस्वरूप मायोसाइट शोष, परिगलन और अलग-अलग आकार होते हैं, साथ ही न्यूट्रोफिल और लिम्फोसाइटों की भारी घुसपैठ होती है। (सी) गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों की चोट चूहों के नॉटेक्सिन और ट्यूना (एनटीएक्स + तुइना) समूह में क्षीण हो गई थी, और एट्रोफिक और नेक्रोटिक मायोसाइट्स, न्यूट्रोफिल और लिम्फोसाइटों की संख्या कम हो गई थी। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: सीके और एफएबीपी 3 अभिव्यक्ति। ट्यूना के पूरा होने के बाद प्लाज्मा काटा गया था, और एलिसा द्वारा नियंत्रण में चूहों (सी), नोटेक्सिन (एनटीएक्स), और नोटेक्सिन और ट्यूना (एनटीएक्स + टुइना) के प्लाज्मा में सीके और एफएबीपी 3 की सांद्रता का पता लगाया गया था। * पी < 0.05, ** पी < 0.01 पोस्ट-हॉक एलएसडी परीक्षण के साथ एक तरफा एनोवा का उपयोग कर। मान सभी समूहों में एसईएम ± मतलब हैं, एन = 8। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हमने चूहों में कंकाल की मांसपेशियों की चोट के ट्यूना उपचार के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया और फिर विधि की प्रभावशीलता को सत्यापित करने के लिए उपचार के बाद कंकाल की मांसपेशियों की चोट की डिग्री का विश्लेषण किया। विशेष रूप से, चूहे के कंकाल की मांसपेशियों की चोट मॉडल, जिसमें ड्रग इंडक्शन (नॉटेक्सिन, बुपीवाकेन)16, ब्लंट कॉन्ट्यूशन26, क्रश27, और इस्किमिया-रिपरफ्यूजन28 शामिल हैं, टुइना के साथ हस्तक्षेप किया जा सकता है। कंकाल की मांसपेशियों की क्षति के मार्करों को निर्धारित करने के लिए हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों और एलिसा का पता लगाने के लिए एचई धुंधला होने के माध्यम से, यह सहज रूप से दिखाया गया है कि नोटेक्सिन चूहों की गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशियों को गंभीर नुकसान पहुंचाता है, जबकि डिंग की रोल विधि का अनुकरण करने वाला मालिश मांसपेशियों की क्षति को कम कर सकता है। ये कंकाल की मांसपेशियों की चोटों के इलाज में ट्यूना की प्रभावशीलता के लिए ठोस सबूत प्रदान करते हैं।

कई आवश्यक प्रक्रियाएं हैं जिन पर डिंग की रोल विधि की नकल करते हुए चूहों पर तुइना का प्रदर्शन करते समय विचार किया जाना चाहिए। उपचार से पहले, ट्यूना ऑपरेटर को रोलिंग मसाजर का कम से कम 3x उपयोग करने के लिए अग्रिम रूप से प्रशिक्षित किया जाना चाहिए, उचित बल नियंत्रण के लिए दबाव संवेदक की सहायता से चकरा के कोण को समायोजित करने के लिए, और 140 रोल/मिनट पर ट्यूना की आवृत्ति को नियंत्रित करने के लिए। इस बीच, चूहों को अपने सिर को एक काले बंदना के साथ कवर करके शांत रखें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे स्वतंत्र रूप से सांस ले सकें। यदि चूहा अचानक ट्यूना प्रक्रिया में सक्रिय होने के लिए संघर्ष करता है, तो टुइना को जारी रखने से पहले शांत होने तक प्रतीक्षा करें।

इस प्रयोग की सीमा यह है कि यह मालिश चूहों जैसे छोटे जानवरों के बजाय चूहों के लिए उपयुक्त है। चूहों के अलावा अन्य जानवरों के लिए, कुछ उपकरण विन्यास बदला जा सकता है। जैसे रोलर्स का आकार, बैफल का कोण, वसंत की ताकत, और स्वाभाविक रूप से, रोलिंग बल का परीक्षण करने के लिए दबाव सेंसर का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। हमने यहां केवल डिंग की रोल विधि का अनुकरण करते हुए एक ट्यूना मसाजर बनाया है। हालांकि, पारंपरिक चीनी चिकित्सा के गैर-औषधीय चिकित्सा के रूप में, विभिन्न ट्यूना जोड़तोड़ हैं, जैसे कि धक्का देना, नम करना, दबाना और सानना। इन सभी जोड़तोड़ प्रासंगिक प्रसिद्ध Tuina स्वामी के ऑपरेटिंग मापदंडों के अनुसार बनाया जा सकता है एक उपकरण का उत्पादन करने के लिए पशु अनुसंधान के लिए अधिक उपयुक्त प्रयोगात्मक आपरेशन मानकीकरण और प्रयोगात्मक परिणाम अधिक सटीक और विश्वसनीय होने के लिए.

अंत में, हम रोलिंग मालिश की निर्माण विधि का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं जो पशु प्रयोगों के दौरान डिंग की रोल विधि को प्रभावी ढंग से अनुकरण करता है। चूहों में कंकाल की मांसपेशियों की चोट पर मालिश करने वाले की महत्वपूर्ण चिकित्सीय प्रभावकारिता है और तुइना के मानकीकरण पर आगे के शोध की नींव रखता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 82174521), हुनान यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन (2022CX109) के स्नातक छात्रों के लिए इनोवेशन प्रोजेक्ट के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe JIANGXI FENGLIN 20220521
1.5 microtubes  Servicebio EP-150X-J
15 mL centrifuge tube Servicebio EP-1501-J
30G needle CONPUVON 220318
5 mL blood collection tube Servicebio QX0023
Acrylic handle Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd 65643645
Adjustment splint CREROMEM 20220729
Cotton Swab INOHV 22080215
Enzyme-labeled Instrument Rayto RT-6100 
Ethanol INOHV 211106
Fork holder Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd JL001
Hair removal cream Veet, France LOTC190922002
Hematoxylin dyeing solution set Wuhan Google Biotech G1005
Imaging system  Nikon, Japan Nikon DS-U3
IODOPHOR disfecting solution Hale&Hearty 20221205
Light microscope Nikon, Japan Nikon Eclipse E100
Limit baffle CREROMEM 20220724
Notexin Latoxan S.A.S. L8104-100UG
Pentobarbital sodium Merck KGaA P3761
Rat creatine kinase (CK) ELISA kit LunChangShuoBiotech YD-35237
Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit LunChangShuoBiotech YD-35730
Rubber roller Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd 202207
Screw Weiyan Hardware B05Z122
Sprague Dawley rats Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co. SYXK2019-0009
Spring Bingzhang Hardware TH001
Surgical blade Covetrus #23
Weigh controller Iyoys HY-XSQ

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Huang, B., Ruan, L., Wang, L., Xue, H., Sun, M., Duan, M., Peng, L. Mimicking Ding's Roll Method on Notexin-Induced Muscle Injury in Rats. J. Vis. Exp. (198), e65820, doi:10.3791/65820 (2023).

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