Summary
פרוטוקול זה מתאר מכשיר פשוט המחקה את שיטת הגלגול של דינג, מבסס מודל חולדה של פגיעה בשרירי השלד, ומשתמש בצביעת המטוקסילין-אאוזין כדי לבחון את הפתולוגיה של רקמות פגועות ובדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים כדי לזהות שינויים בסמני נזק בסרום.
Abstract
שיטת הגלגול של דינג היא אחת המניפולציות הנפוצות ביותר במרפאות עיסוי סיני מסורתי (Tuina) ואחת המניפולציות העכשוויות המשפיעות ביותר בסין. היא מבוססת על שיטת הגלגול המסורתית הנפוצה בז'אנר הזן באצבע אחת ונקראת שיטת הגלגול של דינג. בשל השפעותיה האנטי דלקתיות ומעודדות זרימת הדם, לשיטת הגלגול של דינג יש השפעות טיפוליות טובות על מיופתיה. בגלל שטח הכוח הגדול המופעל על עור האדם, שיטת הגלגול של דינג מאתגרת לביצוע על חיות ניסוי עם אזורי עור קטנים, כגון חולדות וארנבות. בנוסף, הכוח של טווינה המיושם על גוף האדם שונה מזה המיושם על חיות ניסוי, ולכן זה יכול לקרות כי הכוח הוא גבוה מדי או נמוך מדי כדי להשיג את ההשפעה הטיפולית של Tuina במהלך הניסוי. ניסוי זה נועד ליצור מכשיר עיסוי פשוט המתאים לחולדות בהתבסס על פרמטרי מניפולציית הגלגול של דינג (חוזק, תדירות, משך טווינה). המכשיר יכול לתקנן מניפולציות בניסויים בבעלי חיים ולהפחית את השונות בכוח טווינא המופעל על בעלי חיים שונים בשל גורמים סובייקטיביים. מודל חולדה של פגיעה בשרירי השלד כתוצאה מ-notexin-inducis הוקם, וסמני פגיעה בפלזמה קריאטין קינאז (CK) וחלבון קושר חומצות שומן 3 (FABP3) שימשו להערכת ההשפעה הטיפולית של Tuina על פגיעה בשרירי השלד. התוצאות הראו כי מעסה Tuina זה יכול להפחית את רמות הביטוי של CK ו- FABP3 ולהאט את מידת הפגיעה בשרירי השלד. לכן, מכשיר העיסוי Tuina המתואר כאן, המחקה את שיטת הגלגול של דינג, תורם לסטנדרטיזציה של מניפולציית Tuina במחקר ניסיוני ומסייע רבות למחקר הבא על המנגנון המולקולרי של Tuina למיופתיה.
Introduction
פגיעות שרירים הן פציעות טראומטיות שכיחות בחיי הקליניקה ובחיי היומיום, הנגרמות כתוצאה ממכות חיצוניות (חבלות) או ממאמץ יתר כרוני של סיבי שריר (מתחים) וכו', וכתוצאה מכך לתפקוד לקוי של השרירים ולכאבים, ואף משפיעים באופן חמור על איכות חייו של המטופל1. התחלת שיקום מוקדם ככל האפשר לאחר פציעת מאמץ חריפה היא המפתח לקיצור זמן החזרה לספורט2 ולהפחתת כאב 3,4. ברפואה המערבית המודרנית, עזרה ראשונה קלינית לפציעות שרירים עוקבת אחר עקרונות המנוחה, הקרח, הדחיסה וההגבהה (RICE) כדי לעצור דימום מזיק לרקמת השריר5 ותרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות להקלה על כאב6. גילוי טיפולים חדשניים כגון אקסוזומים7 והנדסת רקמות8 הפכו לאסטרטגיות טיפול פוטנציאליות במחלות שרירי שלד, המפצות על חסרונותיהם של טיפולים תרופתיים קודמים. עם זאת, זה יכול גם לייקר את עלות הטיפול בחולים, לשים אותם תחת לחץ כלכלי עצום9. לכן, טיפולים אלטרנטיביים ומשלימים מומלצים לטיפול בבעיות שרירים ושלד10. טווינה נמצאת בשימוש קליני נרחב בסין כשיטה רפואית מסורתית והיא פופולרית בקרב חולים בשל יעילותה ופחות תופעות לוואי. טיפול טווינא בהפרעות שרירים ושלד יכול להקל על הכאב ולשפר את התפקוד11,12,13. מר דינג ג'יפנג, מתרגל טואינה מפורסם משנחאי, ייסד את שיטת הרול14 של דינג. זוהי טכניקת גלגול וריסוק ייחודית עם שטח כוח גדול, כוח אחיד ועדין, וחדירה אינטנסיבית.
מודלים שונים של בעלי חיים מבוססים על אטיולוגיות שונות. יש להם יתרונות וחסרונות, ולבחירת מודלים נכונים ומתאימים של בעלי חיים יש משמעות רבה לניסויים בסיסיים, המסייעים להבין את מסלולי האיתות התאיים והמולקולריים של התחדשות ותיקון לאחר פגיעה בשרירי השלד כדי לפתח טיפולים חדשים לטיפול במחלות שרירי השלד. מודלים כימיים של פגיעה בשרירים נמצאים בשימוש נרחב, עם זריקות של שרירי השלד הגורמות לנמק מיופייבר ומייצרות אזורים מחודשים שיכולים להתחדש ביעילות תוך שבועיים15. גם נוטקסין וגם בופיוואקאין עלולים לגרום נזק לשרירים. עם זאת, נוטקסין יכול לגרום נזק מיוטוקסי חמור יותר לשרירי השלד מאשר bupivacaine, וההתאוששות התפקודית הטבעית איטית יחסית16. הזרקה תוך שרירית של תרופות לא רק לוקחת פחות זמן, אלא גם יש לה השפעות מבוקרות והיקף הנזק לשרירי השלד. בקרה ניתנת לכימות זו הופכת את היציקה המוצלחת לפחות קשה15,17.
תגובה דלקתית היא תגובה ביולוגית חיונית שנחקרה בהרחבה בהקשר של מיופתיה18,19. בשלבים המוקדמים של פגיעה בשרירי השלד, נמק מיופייבר משבש את הומאוסטזיס השריר המקומי, ותאי דלקת רבים חודרים לאתר הפציעה ומפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים רבים19. קריאטין קינאז (CK) הוא סמן ביולוגי מסורתי בסרום להערכת פגיעה בשרירי השלד. עם זאת, הוא חסר ספציפיות רקמות20 ורגישות21, מה שמגביל את יכולתו להעריך את היקף הנזק לשרירים הנגרם על ידי תרופות ולדווח בעקיפין על מידת התאוששות השרירים לאחר פציעה. סמנים ביולוגיים חדשניים, כולל חלבון קושר חומצות שומן 3 (FABP3), הראו לאחרונה ספציפיות ורגישות גבוהות יחסית לרקמות במודלים של מכרסמים של פגיעה בשרירי השלד. FABP3 היא משפחה של חלבונים קושרים המתבטאים בעיקר בתאי שריר הלב והשלד ומעורבים בחילוף חומרים, הובלה ואיתות של חומצות שומן22. לכן, בחרנו בשילוב של שני סמנים ביולוגיים, CK ו- FABP3, כדי להעריך את מידת הנזק לשרירי השלד הנגרם על ידי נוטקסין ואת ההתאוששות לאחר הטיפול.
במכרסמים השרירים רדודים, ושטח העור קטן, מה שקובע גם שהפרמטרים השונים של עיסוי במכרסמים לא יהיו זהים לאלה שבבני אדם, כמו בטיפול באמצעות בעלי חיים, המעסה צריך לטפל בהם בפחות כוח בשיטת הגלגול של דינג, וייתכן שלא יתרום להפעלת טכניקה זו בשל גודלו הקטן של האזור הפגוע, מה שיכול בסופו של דבר להוביל לירידה ביעילות העיסוי. לכן, הניסוי השתמש במעסה המתגלגל שנעשה בבית, התואם את המאפיינים של שיטת הגלגול של דינג, כדי להתערב ולהעריך את ההשפעה הטיפולית של מודל הפגיעה בשרירי השלד בחולדות, המסייע לתקנן את הפרמטרים של טווינה במחקרים ניסיוניים בבעלי חיים על מנת לחקור לעומק את מנגנון הפעולה המולקולרי של טווינה, שיטת טיפול ברפואה סינית מסורתית, במחלות שרירים ושלד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכים המערבים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש המוסדית באוניברסיטת הונאן לרפואה סינית.
1. הרכבת המעסה המתגלגל
- בחרו מכשיר עיסוי המורכב מגלגלת גומי, מחזיק מזלגות, קפיץ, מבולבל גבול, סד כוונון, בורג וידית אקרילית (איור 1). ודאו שגלגלת הגומי היא באורך 3 ס"מ ובקוטר 1.6 ס"מ, בקפיץ באורך 3 ס"מ ובקוטר 0.9 ס"מ, בלבל הגבול הוא באורך 3 ס"מ וברוחב 2 ס"מ, ומידותיו של הידית באורך 12 ס"מ ובקוטר 0.9 ס"מ.
- בקרת כוח: על פי תוצאות הספרות23, שיטת הגלגול של דינג בלחץ כלפי מטה נמצאה כ-10% ממשקל הגוף, כך שהלחץ המופעל במהלך תכנון הגלגול קדימה הוא כ-10% ממשקל הגוף של החולדה (0.2-0.3 N). בדוק את הלחץ המרבי של המעסה על בקר השקילה להיות בערך 0.3 N על ידי התאמת הזווית של בלבול הגבול. דרישת לחץ זו עונה על צרכי החולדה.
- ודא שהלחץ המינימלי הוא בערך 0.08 N בעת גלגול לאחור (איור 2). ודא שהלחץ תואם בדיוק את דרישת שיטת הגלגול של דינג שהיחס בין הכוחות קדימה ואחורה הוא 3:1.
- לפני הטיפול, בקש מהמפעיל לעבוד עם תוכנת המטרונום כדי לשלוט בתדירות הגלגול ל -140 גלילים לדקה ותרגל זאת יותר מ -3 פעמים בניסוי המקדים כדי להבטיח שהפעולה סטנדרטית.
2. הקמת מודל חולדה לפגיעה בשרירי השלד
- חלקו באופן אקראי 24 חולדות זכרים, Sprague-Dawley (במשקל 200-250 גרם) לשלוש קבוצות של שמונה חולדות כל אחת, כולל ביקורת (C), נוטקסין (NTX) ונוטקסין עם טווינה (NTX + Tuina), וניזונים מתזונה סטנדרטית. יש לשמור על מחזור אור של 12 שעות/12 שעות חושך, להגיע לטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס ולחות של 50%-70%.
- מרדימים עם 1% נתרן pentobarbital (40 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקה intraperitoneal ולאחר מכן להסיר שיער מן הגפה התחתונה הימנית עם קרם הסרת שיער. לאחר הסרת הפרווה, נגבו את שאריות הקרם באמצעות מי מלח. יש לוודא הרדמה נאותה על ידי תגובת צביטה בבוהן. החל משחה אופתלמית כדי לחות את העיניים בזמן החיה תחת הרדמה. לספק תמיכה תרמית לאורך כל ההליך.
- חיטוי עור חלופי לגפה התחתונה הימנית עם תמיסת חיטוי יודופור ו-75% אלכוהול לפני ההזרקה. לגעת בצמר גפן ספוג בתמיסת חיטוי יודופור במרכז העור של הגפיים התחתונות ולמרוח בתנועה סיבובית כלפי חוץ. חזרו על הפעולה עם צמר גפן ספוג אתנול.
- קביעת מודלים לפגיעה בשרירי השלד על פי שיטת הייחוס24. יש להזריק נוטקסין ברגל אחת בלבד (למניעת הזרקת נוטקסין כפול). יש לשאוב 200 מיקרוליטר של תמיסת נוטקסין (10 מיקרוגרם/מ"ל תמיסת נוטקסין שהוכנה על ידי הוספת 100 מיקרוגרם נוטקסין ל-10 מ"ל מלח רגיל בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל) לתוך מזרק של 1 מ"ל עם מחט 30 גרם ולהזריק את תמיסת הנוטקסין תוך שרירית לשריר הגסטרוקנמיוס כדי לייצר פגיעה בשריר.
- להזריק את הנוטקסין לאט ולחכות 3 שניות לפני שליפת המחט (להזרקה מלאה).
זהירות: נוטקסין הוא כימיקל רעיל הדורש שטיפה מיידית עם הרבה מים במגע עם פצע פתוח וטיפול רפואי מיידי במידת הצורך. - הזריקו לחולדות בקבוצת הביקורת 200 מיקרוליטר של תמיסת מלח. העבירו חולדות מורדמות לכלובים ריקים עם מצעים נקיים. הקפידו להסיר את הריפוד סביב האף והפה של החולדות כדי לשמור על נשימה צלולה. התבוננו ויזואלית בצבע הרקמה ובקצב הנשימה בסוף ההזרקה עד שהחולדות חוזרות להכרה מספקת.
- החזירו חולדות לכלוב הביתי ובדרך כלל גידלו אותן למשך 24 שעות.
3. טיפול Tuina
- הניחו חולדת SD במצב נוטה כשראשה מכוסה בבד שחור על משטח הניסוי שעבר חיטוי ב-75% אלכוהול כדי לחשוף את שריר הגסטרוקנמיוס. אין לכסות חזק מדי.
- שימוש במעסה Tuina לקבוצת NTX+Tuina: החזיקו את מכשיר העיסוי והניחו את הרולר על שריר הגסטרוקנמיוס של החולדה וגלגלו קדימה עד שהקפיץ יבוא במגע עם הבלבול הגבולי. לאחר מכן משכו את הכוח וחזרו למקומו המקורי, ובכך חזרו לתנועה (איור 3).
- גלגלו את מכשיר העיסוי במהירות של 140 גלילים לדקה, ובצעו כל פעולה במשך 3 דקות. בצעו את העיסויים פעם אחת בבוקר ופעם אחר הצהריים במשך 3 ימים רצופים.
- יש להחזיר חולדות לכלוב הביתי לאחר כל טיפול ולצום במשך 8 שעות לאחר הטיפול האחרון.
4. איסוף דם ורקמות מחולדות לאחר הניסוי
- על פי דרישות ועדת האתיקה הרלוונטית לניסויים בבעלי חיים, יש להרדים חולדות באמצעות הזרקה תוך-צפקית של 1% נתרן פנטוברביטלי (40 מ"ג/ק"ג, הזרקה תוך צפקית). יש לוודא הרדמה נאותה על ידי תגובת צביטה בבוהן. הרדימו חולדות על ידי הקזת דם באבי העורקים הבטני לאחר איסוף דם.
- חיטוי עור חלופי בתמיסת חיטוי יודופור ו-75% אלכוהול לפני ההזרקה. יש לגעת במקלון צמר גפן ספוג בפובידון-יוד במרכז עור הבטן ולמרוח בתנועה מעגלית כלפי חוץ. חזרו על הפעולה עם צמר גפן ספוג אתנול. יש לחזור על החיטוי 3x.
- בקש מהעוזר להשתמש בשני המוסטטים כדי להרים את העור באמצע הבטן. כמפעיל, השתמש באזמל כדי לחתוך את עור הבטן והשרירים מהראפה לסימפיזת הערווה.
- לאחר פתיחת חלל הבטן, מפרידים את המעי עם כדורי צמר גפן סטריליים כדי לחשוף את אבי העורקים הבטני בדופן הבטן האחורית.
- אתר את אבי העורקים הבטני, קח 5 מ"ל של דם חולדה לתוך צינורות איסוף דם, ולקבל את הפלזמה לתוך 1.5 microtubes על ידי צנטריפוגה ב 3000 x גרם במשך 10 דקות לאחר דם עומד במשך 1 שעה. יש לאחסן פלזמה בטמפרטורה של -80°C.
- חותכים את העור עם מספריים כירורגיים לאורך פתח הבטן התחתונה לכיוון האספקט הצידי של הגפה התחתונה הימנית, חושפים את שרירי הגפיים התחתונות, ולאחר הפרדה זהירה של הפאשיה עם מלקחיים, חותכים את האזמל כדי להסיר את שריר הגסטרוקנמיוס השלם.
- לשטוף את שריר gastrocnemius במי מלח סטריליים כדי להסיר שיער דבק ודם.
- הכניסו את שריר הגסטרוקנמיוס שהוסר לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל המכיל 4% פרפורמלדהיד.
5. זיהוי פלסמה CK ו- FABP 3 רמות על ידי ELISA
- חשב וקבע את מספר הלוחות העטופים מראש הדרושים לניסוי אחד. הסר את הצלחות הדרושות, הנח אותן במסגרת 96 בארות, החזיר את שאר המיקרו-צלחות לשקית רדיד אלומיניום לאיטום, ואחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- יש לאזן את הערכות והדגימות בטמפרטורת החדר (25-28 מעלות צלזיוס) למשך 120 דקות, תוך שיווי משקל מלא לטמפרטורת החדר.
הערה: שיווי משקל של הערכה והדגימה הוא קריטי ויש לאזן אותו לזמן מספיק. - הגדר בארות סטנדרטיות, דגימות וריקות. הוסף 50 μL של תקן CK או FABP3 בריכוזים שונים (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 ng/mL) לבארות הסטנדרטיות. חזור על כל תקן פעם אחת, ותופס בסך הכל 12 בארות.
- מלא בארות מדגם עם 40 μL של מדלל מדגם (0.8 גרם NaCl, 0.02 גרם KH 2 PO 4, 0.29 גרם Na 2 HPO 4 12H2O, 0.02 גרם KCl, 0.01 גרם NaN3ב 100 מ"ל של מים מזוקקים כפול, pH7.4), ולאחר מכן 10 μL של הדגימה להיבדק. חזור על כל דגימה פעם אחת, כובש 48 בארות בסך הכל.
- למעט הבארות הריקות הממוקמות שתי בארות מאחורי באר הדגימה האחרונה, יש להוסיף 100 μL של נוגדן אנטי-אנושי מסוג CK או FABP3 (נוגדן המסומן באנזים) לכל תקן ולדגום היטב.
- אטמו את הבארות בסרט איטום ודגרו באמבט מים או תרמוסטט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- יש להשליך את הנוזל, לייבש בטפיחות קלות על נייר סופג, למלא כל באר בנוזל כביסה, להשאיר למשך 20 שניות, לנער את נוזל הכביסה, לייבש בטפיחות קלות על נייר ניקוי, ולחזור על שטיפת הצלחת 5 פעמים (או להשתמש במכונת כביסה לצלחות).
- הוסף 50 μL של תמיסת כרומוגן A (20 מ"ג tetramethylbenzidine, 10 מ"ל אתנול ב 100 מ"ל של מים מזוקקים כפול) ו 50 μL של תמיסת כרומוגן B (0.1 M/L חומצת לימון, 0.2 M/L נתרן dihydrogen פוספט חיץ , pH 5.0-5.4) לכל באר. יש להרחיק מאור למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C.
- עבור בארות סטנדרטיות, בארות מדגם ובארות ריקות, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת סיום לכל באר, ומדוד את ערך הצפיפות האופטית של כל באר ב 450 ננומטר בתוך 15 דקות.
6. ניתוח היסטולוגי של פגיעת שריר גסטרוקנמיוס הנגרמת על ידי נוטקסין בחולדות
- הכינו קטעי פרפין בעובי 5 מיקרומטר מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין לבדיקה מיקרוסקופית קלה כמתוארב-25.
7. עיבוד תמונה וניתוח נתונים
- קרא ונתח את התמונות שצולמו על ידי מערכת ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח. הזז את שדה הראייה של התמונה שנבחרה למרכז המסך באמצעות העכבר, לחץ על 40x ולאחר מכן לחץ על צלם תמונה.
- רשום את ערכי OD מה- ELISA בגיליון אלקטרוני וחשב את רמות ה- CK וה- FABP3 של החולדה בדגימות באמצעות העקומה הסטנדרטית.
- השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי עבור הניתוחים הסטטיסטיים. אקספרס מדידות כממוצע ± סטיית תקן (
), ונתח את ההשוואות בין קבוצות על ידי ANOVA חד-כיוונית, עם מבחן LSD כאשר השונות הייתה אחידה, ושיטת Tamhane T2 כאשר השונות לא הייתה אחידה. ההבדל נחשב מובהק סטטיסטית בערך p קטן מ-0.05.
), ונתח את ההשוואות בין קבוצות על ידי ANOVA חד-כיוונית, עם מבחן LSD כאשר השונות הייתה אחידה, ושיטת Tamhane T2 כאשר השונות לא הייתה אחידה. ההבדל נחשב מובהק סטטיסטית בערך p קטן מ-0.05.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת לבחון את התכונות המורפולוגיות של שריר השלד של חולדה לאחר פציעה, שריר הגסטרוקנמיוס הוכתם בהמטוקסילין ובאאוזין, והתמונות המוכתמות נקראו באמצעות תוכנת ניתוח כמתואר בפרוטוקול עבור 8 חולדות לקבוצה. בחולדות עם פגיעה בשריר הגסטרוקנמיוס שנגרמה על ידי נוטקסין (קבוצת NTX), תאי שריר רבים נקרעו, נטרופיים, נמקיים ומסודרים באופן לא סדיר. הייתה גם חדירה גבוהה של נויטרופילים ולימפוציטים סביב האזור הפגוע (איור 4B). אולם לאחר טיפול טווינה במעסה המתגלגל, המצב הפתולוגי של תאי שריר בקבוצת NTX+Tuina השתפר, עם פחות תאים קרועים, אטרופיים ונמקיים, ורק מספר קטן של תאים דלקתיים חודרים בהשוואה לקבוצת NTX (איור 4C). בקבוצת הביקורת, תאי השריר של חולדות היו בגודל שווה, מסודרים היטב וללא חדירת תאי דלקת (איור 4A).
כדי לאשר עוד יותר את ההשפעה הטיפולית של Tuina על פגיעה בגסטרוקנמיוס בחולדות שהשתמשו במעסה המתגלגל של דינג, השתמשנו ב-ELISA כדי לזהות את רמות סמני הפגיעה בשרירי השלד CK ו-FABP3 עבור 8 חולדות בכל קבוצה. בהשוואה לקבוצת הביקורת, רמות CK ו-FABP3 עלו באופן משמעותי בקבוצת NTX, ורמות CK ו-FABP3 ירדו באופן משמעותי בקבוצת NTX+Tuina בהשוואה לקבוצת NTX (איור 5). תוצאות אלה מצביעות על כך שהזרקת נוטקסין גרמה נזק חמור לשריר הגסטרוקנמיוס בחולדות, בעוד טווינה יכולה להפחית נזק זה.
איור 1: מפה פיזית של מעסה מתגלגל. הוא כולל בעיקר רולר גומי, מחזיק מזלג, קפיץ, מבולבל גבול, סד כוונון, בורג וידית אקרילית. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מדידת כוח מעסה מתגלגל. הלחץ המרבי של גלגול קדימה הוא 0.3 N, והלחץ המינימלי הוא בערך 0.08 N בעת גלגול לאחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: טיפול בטווינה באמצעות מעסה מתגלגל. מניחים את הרולר על שריר הגסטרוקנמיוס של החולדה ומגלגלים קדימה עד שהקפיץ יוצר קשר עם בלבול הגבול, ואז מושכים את הכוח וחוזרים למקומו המקורי, ובכך גומלים את התנועה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של חתך רוחב מוכתם HE, של שריר הגסטרוקנמיוס של חולדה. (A) שריר הגסטרוקנמיוס של חולדות קבוצת הביקורת (C) לא נפגע באופן משמעותי לאחר הזרקת מי מלח. (B) הזרקת נוטקסין לשריר הגסטרוקנמיוס של חולדות מקבוצת נוטקסין (NTX) גרמה לפגיעה חמורה בשריר, וכתוצאה מכך לניוון מיוציטים, נמק וגדלים שונים, מלווה בחדירה מסיבית של נויטרופילים ולימפוציטים. (C) הפגיעה בשריר הגסטרוקנמיוס נחלשה בקבוצת החולדות נוטקסין וטווינה (NTX+Tuina), ומספר המיוציטים האטרופיים והנמקיים, הנויטרופילים והלימפוציטים הופחת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ביטוי CK ו-FABP3. פלזמה נקצרו לאחר השלמת Tuina, וריכוזים של CK ו- FABP3 בפלזמה של חולדות בבקרה (C), notexin (NTX), ו notexin ו Tuina (NTX+Tuina) זוהו על ידי ELISA. *P < 0.05, **P < 0.01 באמצעות ANOVA חד-כיווני עם בדיקת LSD פוסט-הוק. הערכים הם ממוצעים ± SEM, n=8 בכל הקבוצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, תיארנו פרוטוקול לטיפול בטווינה בפגיעה בשרירי השלד בחולדות ולאחר מכן ניתחנו את מידת הפגיעה בשרירי השלד לאחר הטיפול כדי לאמת את יעילות השיטה. יש לציין כי מודלים של פגיעות בשרירי השלד של חולדות, כולל, אך לא רק, השראת תרופות (notexin, bupivacaine)16, קונטוזיה קהה 26, ריסוק 27 ואיסכמיה-רפרפוזיה28, ניתנים להתערבות עם טווינה. באמצעות צביעת HE כדי לבחון את השינויים ההיסטופתולוגיים וזיהוי ELISA כדי לקבוע את הסמנים של נזק לשרירי השלד, נראה באופן אינטואיטיבי כי הנוטקסין גורם נזק חמור לשריר הגסטרוקנמיוס של חולדות, בעוד המעסה המדמה את שיטת הגלגול של דינג יכול להפחית את הנזק לשרירים. אלה מספקים ראיות משכנעות ליעילותו של טווינה בטיפול בפציעות שרירי השלד.
ישנם מספר הליכים הכרחיים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע Tuina על חולדות המחקות את שיטת הגליל של דינג. לפני הטיפול, יש לאמן מראש את מפעיל הטוינה להשתמש במעסה המתגלגל לפחות פי 3, לכוונן את זווית הבלבל בעזרת חיישן הלחץ לבקרת כוח נכונה, ולשלוט בתדירות הטווינא ב-140 גלילים לדקה. בינתיים, שמרו על החולדות שקטות על ידי כיסוי ראשיהן בבנדנה שחורה מבלי להיות הדוקים יתר על המידה כדי להבטיח שהן יכולות לנשום בחופשיות. אם החולדה מתקשה לפתע להיות פעילה בתהליך הטווינה, חכו עד שיהיה שקט לפני שתמשיכו בטווינה.
המגבלה של ניסוי זה היא שמכשיר עיסוי זה מתאים לחולדות ולא לבעלי חיים קטנים יותר, כגון עכברים. עבור בעלי חיים שאינם חולדות, ניתן לשנות תצורות מסוימות של מכשירים. כגון גודל הגלילים, זווית הבלם, חוזק הקפיץ, ובאופן טבעי, יש להשתמש בחיישן הלחץ כדי לבדוק את כוח הגלגול. יצרנו כאן רק מכשיר עיסוי Tuina המדמה את שיטת הגלגול של דינג. עם זאת, כטיפול לא תרופתי של הרפואה הסינית המסורתית, ישנן מניפולציות שונות של טווינה, כגון דחיפה, לחות, לחיצה ולישה. כל המניפולציות הללו יכולות להיעשות על פי פרמטרי ההפעלה של מאסטרים מפורסמים רלוונטיים של טווינה כדי לייצר מכשיר מתאים יותר למחקר בבעלי חיים כדי לתקנן את פעולת הניסוי ולאפשר לתוצאות הניסוי להיות מדויקות ואמינות יותר.
לסיכום, אנו מספקים תיאור מפורט של שיטת הייצור של מעסה הגלגול המדמה ביעילות את שיטת הגלגול של דינג במהלך ניסויים בבעלי חיים. למעסה יעילות טיפולית משמעותית על פגיעה בשרירי השלד בחולדות והוא מניח את היסודות למחקר נוסף על הסטנדרטיזציה של טווינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '82174521), פרויקט חדשנות לסטודנטים לתארים מתקדמים של אוניברסיטת הונאן לרפואה סינית (2022CX109)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | JIANGXI FENGLIN | 20220521 | |
| 1.5 microtubes | Servicebio | EP-150X-J | |
| 15 mL centrifuge tube | Servicebio | EP-1501-J | |
| 30G needle | CONPUVON | 220318 | |
| 5 mL blood collection tube | Servicebio | QX0023 | |
| Acrylic handle | Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd | 65643645 | |
| Adjustment splint | CREROMEM | 20220729 | |
| Cotton Swab | INOHV | 22080215 | |
| Enzyme-labeled Instrument | Rayto | RT-6100 | |
| Ethanol | INOHV | 211106 | |
| Fork holder | Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd | JL001 | |
| Hair removal cream | Veet, France | LOTC190922002 | |
| Hematoxylin dyeing solution set | Wuhan Google Biotech | G1005 | |
| Imaging system | Nikon, Japan | Nikon DS-U3 | |
| IODOPHOR disfecting solution | Hale&Hearty | 20221205 | |
| Light microscope | Nikon, Japan | Nikon Eclipse E100 | |
| Limit baffle | CREROMEM | 20220724 | |
| Notexin | Latoxan S.A.S. | L8104-100UG | |
| Pentobarbital sodium | Merck KGaA | P3761 | |
| Rat creatine kinase (CK) ELISA kit | LunChangShuoBiotech | YD-35237 | |
| Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit | LunChangShuoBiotech | YD-35730 | |
| Rubber roller | Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd | 202207 | |
| Screw | Weiyan Hardware | B05Z122 | |
| Sprague Dawley rats | Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co. | SYXK2019-0009 | |
| Spring | Bingzhang Hardware | TH001 | |
| Surgical blade | Covetrus | #23 | |
| Weigh controller | Iyoys | HY-XSQ |
References
- Lempainen, L., et al. Management of anterior thigh injuries in soccer players: practical guide. BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 14 (1), 41 (2022).
- Bayer, M. L., Mackey, A., Magnusson, S. P., Krogsgaard, M. R., Kjær, M. Treatment of acute muscle injuries (in Danish). Ugeskrift for Laeger. 181 (8), V11180753 (2019).
- Serner, A., et al. Progression of Strength, Flexibility, and Palpation Pain During Rehabilitation of Athletes with Acute Adductor Injuries: A Prospective Cohort Study. The Journal of Orthopaedic and Sports Physical Therapy. 51 (3), 126-134 (2021).
- Gozubuyuk, O. B., Koksal, C., Tasdemir, E. N. Rehabilitation of a patient with bilateral rectus abdominis full thickness tear sustained in recreational strength training: a case report. Physiotherapy Theory and Practice. 38 (13), 3216-3225 (2022).
- Hotfiel, T., et al. Current Conservative Treatment and Management Strategies of Skeletal Muscle Injuries. Zeitschrift für Orthopädie und Unfallchirurgie. 154 (3), 245-253 (2016).
- de Sire, A., et al. Pharmacological Treatment for Acute Traumatic Musculoskeletal Pain in Athletes. Medicina. 57 (11), 1208 (2021).
- Connor, D. E., et al. Therapeutic potential of exosomes in rotator cuff tendon healing. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 37 (5), 759-767 (2019).
- Martins, A. L. L., Giorno, L. P., Santos, A. R. Jr Tissue Engineering Applied to Skeletal Muscle: Strategies and Perspectives. Bioengineering. 9 (12), 744 (2022).
- Horgan, D., et al. Clouds across the new dawn for clinical, diagnostic and biological data: accelerating the development, delivery and uptake of personalized medicine. Diagnosis. , (2023).
- Urits, I., et al. A Comprehensive Review of Alternative Therapies for the Management of Chronic Pain Patients: Acupuncture, Tai Chi, Osteopathic Manipulative Medicine, and Chiropractic Care. Advances in Therapy. 38 (1), 76-89 (2021).
- Lee, N. W., et al. Chuna (or Tuina) Manual Therapy for Musculoskeletal Disorders: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2017, 8218139 (2017).
- Xie, J., Deng, D. X., Chen, Y., Peng, L. Progress in the intervention of massage techniques on skeletal muscle injury. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 34 (04), 199-201 (2018).
- Yuan, Y., Zhang, H., Zhang, G. H., Xue, X. N. Research progress on microstructure changes and rehabilitation treatment of exercise-induced skeletal muscle injury. Massage and Rehabilitation Medicine. 14 (6), 29-33 (2023).
- Zhao, Y. The Establishment of Famous Tuina Master Ding Jifeng and Wei Fa - Commemorating the 100th Anniversary of Mr. Ding Jifeng's Birthday. Traditional Chinese Medicine Culture. 9 (6), 18-21 (2014).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PloS one. 11 (1), e0147198 (2016).
- Plant, D. R., Colarossi, F. E., Lynch, G. S. Notexin causes greater myotoxic damage and slower functional repair in mouse skeletal muscles than bupivacaine. Muscle & Nerve. 34 (5), 577-585 (2006).
- Tierney, M. T., Sacco, A. Inducing and Evaluating Skeletal Muscle Injury by Notexin and Barium Chloride. Methods in Molecular Biology. 1460, 53-60 (2016).
- Torres-Ruiz, J., Alcalá-Carmona, B., Alejandre-Aguilar, R., Gómez-Martín, D. Inflammatory myopathies and beyond: The dual role of neutrophils in muscle damage and regeneration. Frontiers in Immunology. 14, 1113214 (2023).
- Tu, H., Li, Y. L. Inflammation balance in skeletal muscle damage and repair. Frontiers in Immunology. 14, 1133355 (2023).
- Castro, C., Gourley, M. Diagnosis and treatment of inflammatory myopathy: issues and management. Therapeutic Advances in Musculoskeletal Disease. 4 (2), 111-120 (2012).
- Dabby, R., et al. Asymptomatic or minimally symptomatic hyperCKemia: histopathologic correlates. The Israel Medical Association Journal: IMAJ. 8 (2), 110-113 (2006).
- Khodabukus, A., et al. Tissue-Engineered Human Myobundle System as a Platform for Evaluation of Skeletal Muscle Injury Biomarkers. Toxicological Sciences. 176 (1), 124-136 (2020).
- Zhou, X. W., Jin, W. D., Zhu, L., Liu, X. H., Zhou, B. H. Experimental observation on the influence of different frequency, intensity and action time of Ding rolling manipulation on hemodynamics. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine. (06), 42-44 (1998).
- Pablos, A., et al. Protective Effects of Foam Rolling against Inflammation and Notexin Induced Muscle Damage in Rats. International Journal of Medical Sciences. 17 (1), 71-81 (2017).
- Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Enhancing Tumor Content through Tumor Macrodissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (180), e62961 (2022).
- Deng, P., et al. Contusion concomitant with ischemia injury aggravates skeletal muscle necrosis and hinders muscle functional recovery. Experimental Biology and Medicine. 247 (17), 1577-1590 (2022).
- Dobek, G. L., Fulkerson, N. D., Nicholas, J., Schneider, B. S. Mouse model of muscle crush injury of the legs. Comparative Medicine. 63 (3), 227-232 (2013).
- Armstrong, D. M., et al. Sildenafil citrate protects skeletal muscle of ischemia-reperfusion injury: immunohistochemical study in rat model. Acta Cirúrgica Brasileira. 28 (4), 282-287 (2013).
