Summary
Bu protokol, Ding'in yuvarlanma yöntemini taklit eden, iskelet kası hasarının bir sıçan modelini oluşturan ve hasarlı dokunun patolojisini gözlemlemek için hematoksilen-eozin boyamasını ve serum hasar belirteçlerindeki değişiklikleri tespit etmek için enzime bağlı immünosorbent testini kullanan basit bir cihazı tanımlar.
Abstract
Ding'in rulo yöntemi, geleneksel Çin masajı (Tuina) kliniklerinde en sık kullanılan manipülasyonlardan biridir ve Çin'deki en etkili çağdaş Tuina manipülasyonlarından biridir. Tek parmak Zen türünde yaygın olarak kullanılan ve Ding'in yuvarlanma yöntemi olarak adlandırılan geleneksel yuvarlanma yöntemine dayanmaktadır. Anti-enflamatuar ve kan dolaşımını teşvik edici etkileri nedeniyle, Ding'in yuvarlanma yöntemi miyopati üzerinde sağlam terapötik etkilere sahiptir. İnsan derisine uygulanan geniş kuvvet alanı nedeniyle, Ding'in yuvarlanma yönteminin, sıçanlar ve tavşanlar gibi küçük deri alanlarına sahip deney hayvanları üzerinde gerçekleştirilmesi zordur. Ek olarak, insan vücuduna uygulanan Tuina'nın gücü, deney hayvanlarına uygulanandan farklıdır, bu nedenle, deney sırasında Tuina'nın terapötik etkisini elde etmek için gücün çok yüksek veya çok düşük olması olabilir. Bu deney, Ding'in yuvarlanma manipülasyon parametrelerine (güç, frekans, Tuina süresi) dayalı olarak sıçanlar için uygun basit bir masaj aleti oluşturmayı amaçlamaktadır. Cihaz, hayvan deneylerinde manipülasyonu standartlaştırabilir ve öznel faktörler nedeniyle farklı hayvanlara uygulanan Tuina kuvvetindeki değişimi azaltabilir. Noteksin kaynaklı iskelet kası hasarının bir sıçan modeli oluşturuldu ve Tuina'nın iskelet kası hasarı üzerindeki terapötik etkisini değerlendirmek için plazma hasarı belirteçleri kreatin kinaz (CK) ve yağ asidi bağlayıcı protein 3 (FABP3) kullanıldı. Sonuçlar, bu Tuina masajının CK ve FABP3 ekspresyon seviyelerini azaltabileceğini ve iskelet kası yaralanmasının derecesini yavaşlatabileceğini gösterdi. Bu nedenle, burada tarif edilen Tuina masajı, Ding'in rulo yöntemini taklit ederek, deneysel araştırmalarda Tuina manipülasyonunun standartlaştırılmasına katkıda bulunur ve Tuina'nın miyopati için moleküler mekanizması üzerine sonraki araştırmalar için çok yardımcı olur.
Introduction
Kas yaralanmaları, klinik ve günlük yaşamda sık görülen, dışarıdan alınan darbeler (kontüzyonlar) veya kas liflerinin kronik aşırı zorlanması (gerilmeler) vb. nedeniyle kas fonksiyon bozukluğu ve ağrı ile sonuçlanan, hatta hastanın yaşam kalitesini ciddi şekilde etkileyen travmatik yaralanmalardır1. Akut zorlanma yaralanmasından sonra rehabilitasyona mümkün olduğunca erken başlamak, sporadönüş süresini kısaltmanın 2 ve ağrıyı azaltmanınanahtarıdır 3,4. Modern Batı tıbbında, kas yaralanmaları için klinik ilk yardım, kas dokusuna zararlı kanamayı durdurmak için dinlenme, buz, kompresyon ve yükselme (RICE)ilkelerini takip eder 5 ve ağrıyı hafifletmek için steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar6. Eksozom7 ve doku mühendisliği8 gibi yeni tedavilerin keşfi, iskelet kası hastalıkları için potansiyel tedavi stratejileri haline geldi ve önceki farmakolojik tedavilerin eksikliklerini telafi etti. Bununla birlikte, hastalar için tedavi maliyetini de artırabilir ve onları muazzam bir mali baskı altına sokabilir9. Bu nedenle, kas-iskelet sistemi problemlerini tedavi etmek için alternatif ve tamamlayıcı tedaviler önerilmektedir10. Tuina, Çin'de geleneksel bir tıbbi yöntem olarak klinik olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve etkinliği ve daha az yan etkisi nedeniyle hastalar arasında popülerdir. Kas-iskelet sistemi bozuklukları için Tuina terapisi ağrıyı hafifletebilir ve işlevi iyileştirebilir11,12,13. Ünlü bir Şanghay Tuina uygulayıcısı olan Bay Ding Jifeng, Ding'in rulo yöntemi14'ü kurdu. Geniş bir kuvvet alanına, düzgün ve yumuşak kuvvete ve yoğun penetrasyona sahip benzersiz bir haddeleme ve kırma tekniğidir.
Farklı hayvan modelleri farklı etiyolojilere dayanmaktadır. Avantajları ve dezavantajları vardır ve doğru ve uygun hayvan modellerinin seçimi, iskelet kası yaralanmasından sonra rejenerasyon ve onarımın hücresel ve moleküler sinyal yollarının anlaşılmasına yardımcı olan temel deneyler için büyük önem taşımaktadır. Kimyasal olarak indüklenen kas yaralanması modelleri, miyofiber nekrozuna neden olan ve 2 hafta içinde etkili bir şekilde yenilenebilen rejenere alanlar üreten iskelet kası enjeksiyonları ile yaygın olarak kullanılmaktadır15. Hem notexin hem de bupivakain kas hasarına neden olabilir. Bununla birlikte, notexin, iskelet kasında bupivakainden daha ciddi miyotoksik hasara neden olabilir ve doğal fonksiyonel iyileşme nispeten daha yavaştır16. İlaç intramüsküler enjeksiyon kalıplama sadece daha az zaman almakla kalmaz, aynı zamanda iskelet kası hasarının kontrollü etkilerine ve derecesine sahiptir. Bu ölçülebilir kontrol, başarılı kalıplamayı daha az zorlaştırır15,17.
İnflamatuar yanıt, miyopati bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiş önemli bir biyolojik yanıttır18,19. İskelet kası yaralanmasının erken evrelerinde, miyofiber nekrozu lokal kas homeostazını bozar ve birçok enflamatuar hücre yaralanma bölgesine sızarak birçok proinflamatuar sitokinsalgılar 19. Kreatin kinaz (CK), iskelet kası hasarını değerlendirmek için kullanılan geleneksel bir serum biyobelirtecidir. Bununla birlikte, doku özgüllüğü20 ve duyarlılık21'den yoksundur, bu da ilaca bağlı kas hasarının derecesini değerlendirme ve yaralanma sonrası kas iyileşmesinin derecesini dolaylı olarak bildirme yeteneğini sınırlar. Yağ asidi bağlayıcı protein 3 (FABP3) dahil olmak üzere yeni biyobelirteçler, son zamanlarda iskelet kası yaralanmasının kemirgen modellerinde nispeten yüksek doku özgüllüğü ve duyarlılığı göstermiştir. FABP3, esas olarak kalp ve iskelet kası hücrelerinde eksprese edilen ve yağ asidi metabolizması, taşınması ve sinyalizasyonunda rol oynayan bir bağlayıcı protein ailesidir22. Bu nedenle, noteksinin neden olduğu iskelet kası hasarının derecesini ve tedaviden sonra iyileşmeyi değerlendirmek için iki biyobelirteç olan CK ve FABP3'ün bir kombinasyonunu seçtik.
Kemirgenlerde kaslar sığdır ve cilt alanı küçüktür, bu da kemirgenlerde masajın çeşitli parametrelerinin hayvan terapisinde olduğu gibi insanlarda olduğu gibi aynı olmayacağını belirler, masaj terapisti onları Ding'in rulo yöntemini kullanarak daha az kuvvetle tedavi etmelidir ve yaralı bölgenin küçük boyutu nedeniyle bu tekniğin çalışmasına elverişli olmayabilir, bu da sonuçta masajın etkinliğinde bir azalmaya yol açabilir. Bu nedenle, deney, sıçanlarda noteksin kaynaklı iskelet kası yaralanması modelinin terapötik etkisine müdahale etmek ve değerlendirmek için Ding'in yuvarlanma yönteminin özelliklerine uyan evde yapılan yuvarlanma masajını kullandı, bu da Tuina'nın moleküler etki mekanizmasını derinlemesine araştırmak için deneysel hayvan çalışmalarında Tuina'nın parametrelerini standartlaştırmaya yardımcı oldu. kas-iskelet sistemi hastalıklarında geleneksel bir Çin tıbbı tedavi yöntemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren prosedürler, Hunan Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Haddeleme masajının montajı
- Kauçuk rulo, çatal tutucu, yay, limit bölmesi, ayar ateli, vida ve akrilik saptan oluşan bir masaj aleti seçin (Şekil 1). Kauçuk silindirin 3 cm uzunluğunda ve 1.6 cm çapında, yayın 3 cm uzunluğunda ve 0.9 cm çapında, sınır bölmesinin 3 cm uzunluğunda ve 2 cm genişliğinde ve sapın 12 cm uzunluğunda ve 0.9 cm çapında olduğundan emin olun.
- Kuvvet kontrolü: Literatür sonuçlarınagöre 23, Ding'in yuvarlanma yönteminde aşağı doğru basıncın vücut ağırlığının yaklaşık %10'u kadar olduğu, dolayısıyla ileri yuvarlanma tasarımı sırasında uygulanan basıncın sıçanın vücut ağırlığının yaklaşık %10'u (0.2-0.3 N) olduğu bulunmuştur. Limit bölmesinin açısını ayarlayarak masaj aletinin tartım kontrol cihazındaki maksimum basıncını yaklaşık 0,3 N olacak şekilde test edin. Bu basınç gereksinimi sıçanın ihtiyaçlarını karşılar.
- Geri dönerken minimum basıncın yaklaşık 0.08 N olduğundan emin olun (Şekil 2). Basıncın, ileri ve geri kuvvetlerin oranının 3: 1 olduğu Ding'in yuvarlanma yönteminin gerekliliğine tam olarak uygun olduğundan emin olun.
- Tedaviden önce, operatörden haddeleme frekansını 140 rulo/dk'ya kadar kontrol etmek için metronom yazılımıyla çalışmasını isteyin ve işlemin standartlaştırıldığından emin olmak için bunu ön deneyde 3 kattan fazla uygulayın.
2. İskelet kası yaralanmasının sıçan modelinin oluşturulması
- 24 erkek, Sprague-Dawley sıçanını (200-250 g ağırlığında) rastgele olarak, kontrol (C), notexin (NTX) ve Tuina (NTX + Tuina) ile notexin dahil olmak üzere her biri sekiz sıçandan oluşan üç gruba bölün ve standart bir diyetle beslenin. 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngüsünde, 20-25 °C'de ve %50-70 nemde evde muhafaza edin.
- İntraperitoneal enjeksiyon ile %1 pentobarbital sodyum (40 mg/kg) ile uyuşturun ve ardından tüy dökücü krem ile sağ alt ekstremitedeki tüyleri alın. Kürkü çıkardıktan sonra, kalan kremi tuzlu su kullanarak silin. Ayak parmağını kıstırma tepkisi ile yeterli anesteziyi onaylayın. Hayvan anestezi altındayken gözleri nemlendirmek için oftalmik merhem sürün. Prosedür boyunca termal destek sağlayın.
- Enjeksiyondan önce iyodofor dezenfeksiyon solüsyonu ve% 75 alkol ile sağ alt ekstremite için alternatif cilt dezenfeksiyonu. İyodofor dezenfekte edici solüsyona batırılmış bir pamuklu çubuğa alt ekstremite derisinin ortasına dokunun ve dışa doğru dairesel hareketlerle uygulayın. Etanole batırılmış pamuklu çubukla tekrarlayın.
- Referans yöntemine göre iskelet kası yaralanma modelleri oluşturun24. Notexin'i sadece bir bacağa enjekte edin (çift notexin enjeksiyonunu önlemek için). 30G iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya 200 μL notexin solüsyonu (15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 mL normal saline 100 μg notexin eklenerek hazırlanan 10 μg / mL notexin solüsyonu) çekin ve kas yaralanması oluşturmak için notexin solüsyonunu intramüsküler olarak gastroknemius kasına enjekte edin.
- Notexin'i yavaşça enjekte edin ve iğneyi çıkarmadan önce 3 saniye bekleyin (tamamen enjekte edilecek).
DİKKAT: Notexin, açık bir yara ile temas ettiğinde derhal bol su ile yıkanmasını ve gerekirse derhal tıbbi yardım alınmasını gerektiren toksik bir kimyasaldır. - Kontrol grubundaki sıçanlara 200 μL salin solüsyonu enjekte edin. Anestezi uygulanmış fareleri temiz yataklı boş kafeslere taşıyın. Nefeslerini temiz tutmak için farelerin burnunun ve ağzının etrafındaki dolguyu çıkarmaya dikkat edin. Sıçanlar yeterli bilinci yeniden kazanana kadar enjeksiyonun sonunda doku rengini ve solunum hızını görsel olarak gözlemleyin.
- Fareleri ev kafesine geri koyun ve tipik olarak 24 saat boyunca yetiştirin.
3. Tuina terapisi
- Gastroknemius kasını ortaya çıkarmak için% 75 alkolle dezenfekte edilmiş deney platformuna başı siyah bir bezle kaplı bir SD sıçan yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Çok sıkı örtmeyin.
- NTX+Tuina grubu için Tuina masaj aletini kullanma: Masaj aletini tutun ve silindiri sıçanın gastroknemius kasına yerleştirin ve yay sınır bölmesine temas edene kadar ileri doğru yuvarlayın. Ardından kuvveti geri çekin ve orijinal konumuna geri dönün, böylece ileri geri hareket (Şekil 3).
- Masaj aletini dakikada 140 rulo hızında yuvarlayın ve her işlemi 3 dakika boyunca gerçekleştirin. Masajları sabah bir kez ve öğleden sonra bir kez art arda 3 gün boyunca yapın.
- Her tedaviden sonra fareleri ev kafesine geri koyun ve son tedaviden sonra 8 saat aç kalın.
4. Deneyden sonra sıçanlardan kan ve doku toplanması
- İlgili hayvan deneyleri etik kurulunun gerekliliklerine göre, sıçanlara %1'lik pentobarbital sodyum (40 mg/kg, intraperitoneal enjeksiyon) intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi yapılır. Ayak parmağını kıstırma tepkisi ile yeterli anesteziyi onaylayın. Kan alındıktan sonra abdominal aort kanı alarak sıçanlara ötenazi yapın.
- Enjeksiyondan önce iyodofor dezenfeksiyon solüsyonu ve% 75 alkol ile alternatif cilt dezenfeksiyonu. Povidon-iyot ile ıslatılmış bir pamuklu çubuğu karın derisinin ortasına dokunun ve dışa doğru dairesel hareketlerle uygulayın. Etanole batırılmış pamuklu çubukla tekrarlayın. Dezenfeksiyonu 3 kez tekrarlayın.
- Asistandan karnın ortasındaki cildi kaldırmak için iki hemostat kullanmasını isteyin. Operatör olarak, karın derisini ve kasları raphe'den kasık simfizine kesmek için bir neşter kullanın.
- Karın boşluğunu açtıktan sonra, karın arka duvarındaki abdominal aortu ortaya çıkarmak için bağırsağı steril pamuk topları ile ayırın.
- Abdominal aortu bulun, 5 mL sıçan kanını kan alma tüplerine alın ve 1 saat boyunca kan bekledikten sonra 10 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüj ederek plazmayı 1.5 mikrotüplere alın. Plazmayı -80 °C'de saklayın.
- Alt ekstremite kaslarını açığa çıkararak alt karın açıklığı boyunca sağ alt ekstremitenin lateral yönüne doğru cildi cerrahi makasla kesin ve fasyayı forseps ile dikkatlice ayırdıktan sonra, sağlam gastroknemius kasını çıkarmak için neşteri kesin.
- Yapışan saçları ve kanı çıkarmak için gastroknemius kasını steril salinle yıkayın.
- Çıkarılan gastroknemius kasını %4 paraformaldehit içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
5. Plazma CK ve FABP 3 seviyelerinin ELISA ile tespiti
- Bir deney için gereken önceden sarılmış plakaların sayısını hesaplayın ve belirleyin. Gerekli plakaları çıkarın, 96 oyuklu çerçeveye yerleştirin, kalan mikroplakaları sızdırmazlık için alüminyum folyo torbaya geri koyun ve 4 °C'de saklayın.
- Kitleri ve numuneleri oda sıcaklığında (25-28 °C) 120 dakika dengeleyin, oda sıcaklığına tamamen dengeleyin.
NOT: Kitin ve numunenin dengelenmesi kritiktir ve yeterli sürede dengelenmelidir. - Standart, numune ve boş kuyucukları ayarlayın. Standart kuyucuklara farklı konsantrasyonlarda (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 ng/mL) 50 μL CK veya FABP3 standardı ekleyin. Her standardı bir kez tekrarlayın, toplam 12 kuyu işgal edin.
- Numune kuyucuklarını 40 μL numune seyreltici (0,8 g NaCl, 0,02 g KH 2 PO 4, 0,29 g Na 2 HPO 4 12H2O, 0,02 g KCl, 0,01 g NaN3100 mL çift damıtılmış su içinde, pH7,4) ile doldurun ve ardından test edilecek numuneden 10 μL ekleyin. Her numuneyi bir kez tekrarlayın, toplamda 48 kuyu işgal edin.
- Son numune kuyusunun arkasında bulunan iki kuyucuk dışındaki boş kuyucuklar dışında, her standart ve numune kuyucuğuna 100 μL HRP etiketli anti-insan CK veya FABP3 antikoru (enzim etiketli antikor) ekleyin.
- Kuyucukları sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda veya termostatta 60 dakika inkübe edin.
- Sıvıyı atın, emici kağıt üzerinde kurulayın, her kuyucuğu yıkama sıvısıyla doldurun, 20 saniye bekletin, yıkama sıvısını sallayın, kurutma kağıdına hafifçe vurarak kurulayın ve plakayı 5 kez yıkamayı tekrarlayın (veya bir plaka yıkayıcı kullanın).
- Her bir kuyucuğa 50 μL kromojen çözeltisi A (100 mL çift damıtılmış su içinde 20 mg tetrametilbenzidin 10 mL etanol) ve 50 μL kromojen çözeltisi B (0.1 M/L sitrik asit, 0.2 M/L sodyum dihidrojen fosfat tamponu, pH 5.0-5.4) ekleyin. 37 °C'de 15 dakika ışıktan uzak tutun.
- Standart kuyular, numune kuyuları ve boş kuyular için, her kuyucuğa 50 μL sonlandırma çözeltisi ekleyin ve her kuyucuğun optik yoğunluk değerini 15 dakika içinde 450 nm'de ölçün.
6. Sıçanlarda notexin kaynaklı gastroknemius kas hasarının histolojik analizi
- 25'te tarif edildiği gibi hafif mikroskobik inceleme için hematoksilen ve eozin ile boyanmış 5 μm kalınlığında parafin kesitleri hazırlayın.
7. Görüntü işleme ve veri analizi
- Görüntüleme sisteminin yakaladığı görüntüleri analiz yazılımı ile okuyun ve analiz edin. Seçili görüntü alanını fareyle ekranın ortasına taşıyın, 40x'i tıklatın ve ardından Anlık Görüntü Al'ı tıklatın.
- ELISA'dan gelen OD değerlerini bir elektronik tabloya kaydedin ve standart eğriyi kullanarak numunelerdeki sıçan CK ve FABP3 seviyelerini hesaplayın.
- İstatistiksel analizler için istatistiksel analiz yazılımı kullanın. Ölçümleri ortalama ± standart sapma (
) olarak ifade edin ve gruplar arasındaki karşılaştırmaları tek yönlü ANOVA ile, varyans tekdüze olduğunda LSD testi ve varyans tekdüze olmadığında Tamhane T2 yöntemi ile analiz edin. Fark, 0.05'ten küçük bir p değerinde istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
) olarak ifade edin ve gruplar arasındaki karşılaştırmaları tek yönlü ANOVA ile, varyans tekdüze olduğunda LSD testi ve varyans tekdüze olmadığında Tamhane T2 yöntemi ile analiz edin. Fark, 0.05'ten küçük bir p değerinde istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yaralanma sonrası sıçan iskelet kasının morfolojik özelliklerini gözlemlemek için gastroknemius kası hematoksilen ve eozin ile boyandı ve boyanan görüntüler grup başına 8 sıçan için protokolde anlatıldığı gibi bir analiz yazılımı ile okundu. Notexin (NTX grubu) tarafından indüklenen gastroknemius kas hasarı olan sıçanlarda, birçok kas hücresi yırtılmış, atrofik, nekrotik ve düzensiz düzenlenmiştir. Ayrıca etkilenen bölge çevresinde yüksek oranda nötrofil ve lenfosit infiltrasyonu vardı (Şekil 4B). Bununla birlikte, yuvarlanan masaj aleti ile Tuina tedavisinden sonra, NTX + Tuina grubundaki kas hücrelerinin patolojik durumu, NTX grubuna kıyasla daha az rüptüre, atrofik ve nekrotik hücre ve sadece az sayıda enflamatuar hücre infiltrasyonu ile düzeldi (Şekil 4C). Kontrol grubunda, sıçanların kas hücreleri eşit büyüklükte, yakından düzenlenmiş ve inflamatuar hücre infiltrasyonu olmadan yapılmıştır (Şekil 4A).
Ding'in yuvarlanma masajını kullanan sıçanlarda Tuina'nın gastroknemius hasarı üzerindeki terapötik etkisini daha fazla doğrulamak için, grup başına 8 sıçan için iskelet kası yaralanma belirteçleri CK ve FABP3 seviyelerini tespit etmek için ELISA'yı kullandık. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, CK ve FABP3 seviyeleri NTX grubunda anlamlı olarak artmış ve NTX + Tuina grubunda NTX grubuna kıyasla hem CK hem de FABP3 seviyeleri belirgin şekilde azalmıştır (Şekil 5). Bu sonuçlar, notexin enjeksiyonunun sıçanlarda gastroknemius kasında ciddi hasara neden olduğunu, Tuina'nın ise bu hasarı azaltabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Yuvarlanma masajı fiziksel haritası. Esas olarak bir kauçuk rulo, çatal tutucu, yay, limit bölmesi, ayar ateli, vida ve akrilik tutamaktan oluşur. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yuvarlanma masajı kuvveti ölçümü. İleri haddelemenin maksimum basıncı 0,3 N'dir ve geri yuvarlanırken minimum basınç yaklaşık 0,08 N'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yuvarlanma masajı kullanarak Tuina terapisi. Silindiri sıçanın gastroknemius kasına yerleştirin ve yay sınır bölmesine temas edene kadar ileri doğru yuvarlayın, ardından kuvveti geri çekin ve orijinal konumuna geri dönün, böylece hareketi ileri geri hareket ettirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sıçan gastroknemius kasının HE boyalı kesitinin temsili görüntüleri. (A) Kontrol (C) grubu sıçanların gastroknemius kası, salin enjeksiyonundan sonra önemli ölçüde yaralanmadı. (B) Notexin (NTX) grubundaki sıçanların gastroknemius kasına notexin enjeksiyonu, ciddi kas hasarına neden oldu, bu da miyosit atrofisi, nekroz ve değişen boyutlarda, büyük bir nötrofil ve lenfosit infiltrasyonu ile sonuçlandı. (C) Notexin ve Tuina (NTX+Tuina) grubu sıçanlarda gastroknemius kas hasarı azaldı ve atrofik ve nekrotik miyosit, nötrofil ve lenfosit sayısı azaldı. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: CK ve FABP3 ifadesi. Tuina'nın tamamlanmasından sonra plazma hasat edildi ve kontrol (C), noteksin (NTX) ve notexin ve Tuina (NTX+Tuina) sıçanların plazmasındaki CK ve FABP3 konsantrasyonları ELISA ile tespit edildi. *P < 0.05, **P < 0.01, post-hoc LSD testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak. Değerler tüm gruplarda ortalama ± SEM, n=8'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, sıçanlarda iskelet kası hasarının Tuina tedavisi için bir protokol tanımladık ve daha sonra yöntemin etkinliğini doğrulamak için tedaviden sonra iskelet kası yaralanmasının derecesini analiz ettik. Özellikle, ilaç indüksiyonu (notexin, bupivakain)16, künt kontüzyon26, crush27 ve iskemi-reperfüzyon28 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere sıçan iskelet kası yaralanma modellerine Tuina ile müdahale edilebilir. Histopatolojik değişiklikleri gözlemlemek için HE boyama ve iskelet kası hasarının belirteçlerini belirlemek için ELISA tespiti yoluyla, noteksinin sıçanların gastroknemius kasında ciddi hasara neden olduğu, Ding'in yuvarlanma yöntemini simüle eden masajın ise kas hasarını azaltabileceği sezgisel olarak gösterilmiştir. Bunlar, Tuina'nın iskelet kası yaralanmalarının tedavisinde etkinliği için ikna edici kanıtlar sağlar.
Ding'in yuvarlanma yöntemini taklit eden sıçanlarda Tuina yaparken göz önünde bulundurulması gereken birkaç gerekli prosedür vardır. Tedaviden önce, Tuina operatörü, yuvarlanma masaj aletini en az 3 kez kullanmak, uygun kuvvet kontrolü için basınç sensörü yardımıyla bölmenin açısını ayarlamak ve Tuina'nın frekansını 140 rulo / dak'da kontrol etmek için önceden eğitilmelidir. Bu arada, özgürce nefes alabilmelerini sağlamak için aşırı sıkı olmadan başlarını siyah bir bandana ile örterek fareleri sessiz tutun. Sıçan aniden Tuina sürecinde aktif olmak için mücadele ederse, Tuina'ya devam etmeden önce sessizleşene kadar bekleyin.
Bu deneyin sınırlaması, bu masaj aletinin fareler gibi daha küçük hayvanlardan ziyade sıçanlar için uygun olmasıdır. Sıçanlar dışındaki hayvanlar için bazı cihaz konfigürasyonları değiştirilebilir. Silindirlerin boyutu, bölmenin açısı, yayın gücü ve doğal olarak yuvarlanma kuvvetini test etmek için basınç sensörünün kullanılması gerekir. Burada sadece Ding'in yuvarlanma yöntemini simüle eden bir Tuina masajı yaptık. Bununla birlikte, geleneksel Çin tıbbının farmakolojik olmayan bir tedavisi olarak, itme, nemlendirme, presleme ve yoğurma gibi çeşitli Tuina manipülasyonları vardır. Tüm bu manipülasyonlar, deneysel işlemi standartlaştırmak ve deneysel sonuçların daha doğru ve güvenilir olmasını sağlamak için hayvan araştırmalarına daha uygun bir cihaz üretmek için ilgili ünlü Tuina ustalarının çalışma parametrelerine göre yapılabilir.
Sonuç olarak, hayvan deneyleri sırasında Ding'in yuvarlanma yöntemini etkili bir şekilde simüle eden yuvarlanma masajının üretim yönteminin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Masaj, sıçanlarda iskelet kası hasarı üzerinde önemli terapötik etkinliğe sahiptir ve Tuina'nın standardizasyonu üzerine daha fazla araştırma için temel oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No.82174521), Hunan Çin Tıbbı Üniversitesi Lisansüstü Öğrencileri için İnovasyon Projesi(2022CX109) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | JIANGXI FENGLIN | 20220521 | |
| 1.5 microtubes | Servicebio | EP-150X-J | |
| 15 mL centrifuge tube | Servicebio | EP-1501-J | |
| 30G needle | CONPUVON | 220318 | |
| 5 mL blood collection tube | Servicebio | QX0023 | |
| Acrylic handle | Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd | 65643645 | |
| Adjustment splint | CREROMEM | 20220729 | |
| Cotton Swab | INOHV | 22080215 | |
| Enzyme-labeled Instrument | Rayto | RT-6100 | |
| Ethanol | INOHV | 211106 | |
| Fork holder | Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd | JL001 | |
| Hair removal cream | Veet, France | LOTC190922002 | |
| Hematoxylin dyeing solution set | Wuhan Google Biotech | G1005 | |
| Imaging system | Nikon, Japan | Nikon DS-U3 | |
| IODOPHOR disfecting solution | Hale&Hearty | 20221205 | |
| Light microscope | Nikon, Japan | Nikon Eclipse E100 | |
| Limit baffle | CREROMEM | 20220724 | |
| Notexin | Latoxan S.A.S. | L8104-100UG | |
| Pentobarbital sodium | Merck KGaA | P3761 | |
| Rat creatine kinase (CK) ELISA kit | LunChangShuoBiotech | YD-35237 | |
| Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit | LunChangShuoBiotech | YD-35730 | |
| Rubber roller | Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd | 202207 | |
| Screw | Weiyan Hardware | B05Z122 | |
| Sprague Dawley rats | Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co. | SYXK2019-0009 | |
| Spring | Bingzhang Hardware | TH001 | |
| Surgical blade | Covetrus | #23 | |
| Weigh controller | Iyoys | HY-XSQ |
References
- Lempainen, L., et al. Management of anterior thigh injuries in soccer players: practical guide. BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 14 (1), 41 (2022).
- Bayer, M. L., Mackey, A., Magnusson, S. P., Krogsgaard, M. R., Kjær, M. Treatment of acute muscle injuries (in Danish). Ugeskrift for Laeger. 181 (8), V11180753 (2019).
- Serner, A., et al. Progression of Strength, Flexibility, and Palpation Pain During Rehabilitation of Athletes with Acute Adductor Injuries: A Prospective Cohort Study. The Journal of Orthopaedic and Sports Physical Therapy. 51 (3), 126-134 (2021).
- Gozubuyuk, O. B., Koksal, C., Tasdemir, E. N. Rehabilitation of a patient with bilateral rectus abdominis full thickness tear sustained in recreational strength training: a case report. Physiotherapy Theory and Practice. 38 (13), 3216-3225 (2022).
- Hotfiel, T., et al. Current Conservative Treatment and Management Strategies of Skeletal Muscle Injuries. Zeitschrift für Orthopädie und Unfallchirurgie. 154 (3), 245-253 (2016).
- de Sire, A., et al. Pharmacological Treatment for Acute Traumatic Musculoskeletal Pain in Athletes. Medicina. 57 (11), 1208 (2021).
- Connor, D. E., et al. Therapeutic potential of exosomes in rotator cuff tendon healing. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 37 (5), 759-767 (2019).
- Martins, A. L. L., Giorno, L. P., Santos, A. R. Jr Tissue Engineering Applied to Skeletal Muscle: Strategies and Perspectives. Bioengineering. 9 (12), 744 (2022).
- Horgan, D., et al. Clouds across the new dawn for clinical, diagnostic and biological data: accelerating the development, delivery and uptake of personalized medicine. Diagnosis. , (2023).
- Urits, I., et al. A Comprehensive Review of Alternative Therapies for the Management of Chronic Pain Patients: Acupuncture, Tai Chi, Osteopathic Manipulative Medicine, and Chiropractic Care. Advances in Therapy. 38 (1), 76-89 (2021).
- Lee, N. W., et al. Chuna (or Tuina) Manual Therapy for Musculoskeletal Disorders: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2017, 8218139 (2017).
- Xie, J., Deng, D. X., Chen, Y., Peng, L. Progress in the intervention of massage techniques on skeletal muscle injury. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 34 (04), 199-201 (2018).
- Yuan, Y., Zhang, H., Zhang, G. H., Xue, X. N. Research progress on microstructure changes and rehabilitation treatment of exercise-induced skeletal muscle injury. Massage and Rehabilitation Medicine. 14 (6), 29-33 (2023).
- Zhao, Y. The Establishment of Famous Tuina Master Ding Jifeng and Wei Fa - Commemorating the 100th Anniversary of Mr. Ding Jifeng's Birthday. Traditional Chinese Medicine Culture. 9 (6), 18-21 (2014).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PloS one. 11 (1), e0147198 (2016).
- Plant, D. R., Colarossi, F. E., Lynch, G. S. Notexin causes greater myotoxic damage and slower functional repair in mouse skeletal muscles than bupivacaine. Muscle & Nerve. 34 (5), 577-585 (2006).
- Tierney, M. T., Sacco, A. Inducing and Evaluating Skeletal Muscle Injury by Notexin and Barium Chloride. Methods in Molecular Biology. 1460, 53-60 (2016).
- Torres-Ruiz, J., Alcalá-Carmona, B., Alejandre-Aguilar, R., Gómez-Martín, D. Inflammatory myopathies and beyond: The dual role of neutrophils in muscle damage and regeneration. Frontiers in Immunology. 14, 1113214 (2023).
- Tu, H., Li, Y. L. Inflammation balance in skeletal muscle damage and repair. Frontiers in Immunology. 14, 1133355 (2023).
- Castro, C., Gourley, M. Diagnosis and treatment of inflammatory myopathy: issues and management. Therapeutic Advances in Musculoskeletal Disease. 4 (2), 111-120 (2012).
- Dabby, R., et al. Asymptomatic or minimally symptomatic hyperCKemia: histopathologic correlates. The Israel Medical Association Journal: IMAJ. 8 (2), 110-113 (2006).
- Khodabukus, A., et al. Tissue-Engineered Human Myobundle System as a Platform for Evaluation of Skeletal Muscle Injury Biomarkers. Toxicological Sciences. 176 (1), 124-136 (2020).
- Zhou, X. W., Jin, W. D., Zhu, L., Liu, X. H., Zhou, B. H. Experimental observation on the influence of different frequency, intensity and action time of Ding rolling manipulation on hemodynamics. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine. (06), 42-44 (1998).
- Pablos, A., et al. Protective Effects of Foam Rolling against Inflammation and Notexin Induced Muscle Damage in Rats. International Journal of Medical Sciences. 17 (1), 71-81 (2017).
- Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Enhancing Tumor Content through Tumor Macrodissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (180), e62961 (2022).
- Deng, P., et al. Contusion concomitant with ischemia injury aggravates skeletal muscle necrosis and hinders muscle functional recovery. Experimental Biology and Medicine. 247 (17), 1577-1590 (2022).
- Dobek, G. L., Fulkerson, N. D., Nicholas, J., Schneider, B. S. Mouse model of muscle crush injury of the legs. Comparative Medicine. 63 (3), 227-232 (2013).
- Armstrong, D. M., et al. Sildenafil citrate protects skeletal muscle of ischemia-reperfusion injury: immunohistochemical study in rat model. Acta Cirúrgica Brasileira. 28 (4), 282-287 (2013).
