Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Gerät, das die Rollmethode von Ding nachahmt, ein Rattenmodell für Skelettmuskelverletzungen erstellt und Hämatoxylin-Eosin-Färbung verwendet, um die Pathologie von geschädigtem Gewebe zu beobachten, und einen enzymgebundenen Immunsorbent-Assay verwendet, um Veränderungen der Serumschadensmarker zu erkennen.
Abstract
Die Ding-Roll-Methode ist eine der am häufigsten verwendeten Manipulationen in traditionellen chinesischen Massagekliniken (Tuina) und eine der einflussreichsten zeitgenössischen Tuina-Manipulationen in China. Sie basiert auf der traditionellen Rollmethode, die im Ein-Finger-Zen-Genre üblich ist und als Ding-Rollmethode bezeichnet wird. Aufgrund ihrer entzündungshemmenden und durchblutungsfördernden Wirkung hat die Ding-Rollmethode eine fundierte therapeutische Wirkung bei Myopathie. Aufgrund der großen Kraftfläche, die auf die menschliche Haut ausgeübt wird, ist die Rollmethode von Ding bei Versuchstieren mit kleinen Hautbereichen, wie Ratten und Kaninchen, eine Herausforderung. Darüber hinaus unterscheidet sich die Stärke von Tuina, die auf den menschlichen Körper angewendet wird, von derjenigen, die auf Versuchstiere angewendet wird, so dass es vorkommen kann, dass die Stärke zu hoch oder zu niedrig ist, um die therapeutische Wirkung von Tuina während des Experiments zu erzielen. Dieses Experiment zielt darauf ab, ein einfaches Massagegerät zu entwickeln, das für Ratten geeignet ist, basierend auf den Rollmanipulationsparametern von Ding (Stärke, Frequenz, Tuina-Dauer). Das Gerät kann die Manipulation in Tierversuchen standardisieren und die Variation der Tuina-Kraft, die auf verschiedene Tiere angewendet wird, aufgrund subjektiver Faktoren reduzieren. Es wurde ein Rattenmodell für Notexin-induzierte Skelettmuskelverletzungen etabliert und die Plasmaverletzungsmarker Kreatinkinase (CK) und Fettsäurebindungsprotein 3 (FABP3) verwendet, um die therapeutische Wirkung von Tuina auf Skelettmuskelverletzungen zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass dieses Tuina-Massagegerät die CK- und FABP3-Expression reduzieren und den Grad der Skelettmuskelverletzung verlangsamen konnte. Daher trägt das hier beschriebene Tuina-Massagegerät, das die Rollmethode von Ding nachahmt, zur Standardisierung der Tuina-Manipulation in der experimentellen Forschung bei und ist eine große Hilfe für die anschließende Erforschung des molekularen Mechanismus von Tuina bei Myopathie.
Introduction
Muskelverletzungen sind häufige traumatische Verletzungen im klinischen und täglichen Leben, die durch äußere Schläge (Prellungen) oder chronische Überlastung von Muskelfasern (Zerrungen) usw. verursacht werden und zu Muskelfunktionsstörungen und Schmerzen führen, die sogar die Lebensqualität des Patienten ernsthaft beeinträchtigen1. Ein möglichst frühzeitiger Beginn der Rehabilitation nach einer akuten Zerrungsverletzung ist der Schlüssel, um die Zeit bis zur Rückkehr zum Sport2 zu verkürzen und die Schmerzen zu lindern 3,4. In der modernen westlichen Medizin folgt die klinische Erste Hilfe bei Muskelverletzungen den Prinzipien von Ruhe, Eis, Kompression und Hochlagerung (RICE), um verletzende Blutungen in das Muskelgewebe zu stoppen5 und nichtsteroidale Antirheumatika zur Schmerzlinderung6. Die Entdeckung neuartiger Therapien wie Exosomen7 und Tissue Engineering8 wurden zu potenziellen Behandlungsstrategien für Skelettmuskelerkrankungen und kompensierten die Mängel früherer pharmakologischer Behandlungen. Sie kann jedoch auch die Behandlungskosten für die Patienten erhöhen und sie unter enormen finanziellen Druck setzen9. Daher werden alternative und komplementäre Therapien zur Behandlung von Problemen des Bewegungsapparates empfohlen10. Tuina ist in China als traditionelle medizinische Methode weit verbreitet und bei Patienten wegen seiner Wirksamkeit und weniger Nebenwirkungen beliebt. Die Tuina-Therapie bei Erkrankungen des Bewegungsapparates kann Schmerzen lindern und die Funktion verbessern11,12,13. Herr Ding Jifeng, ein berühmter Tuina-Praktizierender aus Shanghai, begründete Dings Rollmethode14. Es handelt sich um eine einzigartige Walz- und Zerkleinerungstechnik mit einer großen Kraftfläche, gleichmäßiger und sanfter Kraft und intensivem Eindringen.
Unterschiedliche Tiermodelle basieren auf unterschiedlichen Ätiologien. Sie haben Vor- und Nachteile, und die Auswahl korrekter und geeigneter Tiermodelle ist von großer Bedeutung für grundlegende Experimente, die helfen, die zellulären und molekularen Signalwege der Regeneration und Reparatur nach Skelettmuskelverletzungen zu verstehen, um neue Therapien zur Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen zu entwickeln. Chemisch induzierte Modelle von Muskelverletzungen sind weit verbreitet, wobei Injektionen von Skelettmuskeln eine Myokularnekrose verursachen und regenerierte Bereiche erzeugen, die sich innerhalb von 2 Wochen effektiv regenerieren können15. Sowohl Notexin als auch Bupivacain können Muskelschäden verursachen. Notexin kann jedoch schwerere myotoxische Schäden an der Skelettmuskulatur verursachen als Bupivacain, und die natürliche funktionelle Erholung ist relativ langsam16. Das intramuskuläre Spritzgießen von Medikamenten nimmt nicht nur weniger Zeit in Anspruch, sondern hat auch kontrollierte Auswirkungen und das Ausmaß der Skelettmuskelschäden. Diese quantifizierbare Kontrolle macht eine erfolgreiche Formgebung weniger schwierig15,17.
Die Entzündungsreaktion ist eine wesentliche biologische Reaktion, die im Zusammenhang mit der Myopathie ausführlich untersucht wurde18,19. In den frühen Stadien der Skelettmuskelverletzung stört die Myofasernekrose die lokale Muskelhomöostase, und viele Entzündungszellen infiltrieren die Verletzungsstelle und sezernieren viele entzündungsfördernde Zytokine19. Die Kreatinkinase (CK) ist ein traditioneller Serum-Biomarker zur Beurteilung von Skelettmuskelverletzungen. Es fehlt jedoch die Gewebespezifität20 und die Sensitivität21, was seine Fähigkeit einschränkt, das Ausmaß der medikamenteninduzierten Muskelschädigung zu beurteilen und indirekt über das Ausmaß der Muskelregeneration nach einer Verletzung zu berichten. Neuartige Biomarker, darunter das Fettsäure-bindende Protein 3 (FABP3), haben kürzlich eine relativ hohe Gewebespezifität und -sensitivität in Nagetiermodellen für Skelettmuskelverletzungen gezeigt. FABP3 ist eine Familie von Bindungsproteinen, die hauptsächlich in Herz- und Skelettmuskelzellen exprimiert werden und am Fettsäurestoffwechsel, -transport und -signalweg beteiligt sind22. Daher wählten wir eine Kombination aus zwei Biomarkern, CK und FABP3, um das Ausmaß der Notexin-induzierten Skelettmuskelschädigung und die Erholung nach der Behandlung zu beurteilen.
Bei Nagetieren sind die Muskeln flach und der Hautbereich ist klein, was auch bestimmt, dass die verschiedenen Parameter der Massage bei Nagetieren nicht die gleichen sind wie beim Menschen, wie z. B. in der Tiertherapie, der Masseur sollte sie mit weniger Kraft mit der Ding-Rollmethode behandeln und ist aufgrund der geringen Größe des verletzten Bereichs möglicherweise nicht förderlich für die Durchführung dieser Technik. was letztendlich zu einer Verringerung der Wirksamkeit der Massage führen kann. Daher wurde in dem Experiment das selbst hergestellte Rollmassagegerät verwendet, das den Merkmalen der Ding-Rollmethode entspricht, um zu intervenieren und die therapeutische Wirkung des Notexin-induzierten Skelettmuskelverletzungsmodells bei Ratten zu bewerten, was dazu beiträgt, die Parameter von Tuina in experimentellen Tierversuchen zu standardisieren, um den molekularen Wirkmechanismus von Tuina eingehend zu untersuchen. eine Behandlungsmethode der traditionellen chinesischen Medizin bei Erkrankungen des Bewegungsapparates.
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Protocol
Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Care and Use Committee der Hunan University of Chinese Medicine genehmigt.
1. Montage des Rollmassagegeräts
- Wählen Sie ein Massagegerät aus, das aus einer Gummirolle, einem Gabelhalter, einer Feder, einer Begrenzungsschallwand, einer Einstellschiene, einer Schraube und einem Acrylgriff besteht (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Gummiwalze 3 cm lang und 1,6 cm im Durchmesser misst, die Feder 3 cm lang und 0,9 cm im Durchmesser misst, die Begrenzungspralle 3 cm lang und 2 cm breit ist und der Griff 12 cm lang und 0,9 cm im Durchmesser misst.
- Kraftkontrolle: Nach den Literaturergebnissen23 wurde festgestellt, dass der Abwärtsdruck der Ding-Rollmethode etwa 10 % des Körpergewichts beträgt, so dass der Druck, der während des Designs des Vorwärtsrollens ausgeübt wird, etwa 10 % des Körpergewichts der Ratte (0,2-0,3 N) beträgt. Testen Sie den maximalen Druck des Massagegeräts auf der Wägesteuerung auf etwa 0,3 N, indem Sie den Winkel der Begrenzungsblende einstellen. Dieser Druckbedarf entspricht den Bedürfnissen der Ratte.
- Stellen Sie sicher, dass der Mindestdruck beim Zurückrollen etwa 0,08 N beträgt (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass der Druck genau der Anforderung der Ding'schen Rollmethode entspricht, dass das Verhältnis der Vorwärts- und Rückwärtskräfte 3:1 beträgt.
- Bitten Sie den Bediener vor der Behandlung, mit der Metronom-Software zu arbeiten, um die Walzfrequenz auf 140 Rollen/min zu steuern, und üben Sie dies mehr als 3x im Vorversuch, um sicherzustellen, dass der Betrieb standardisiert ist.
2. Etablierung eines Rattenmodells der Skelettmuskelverletzung
- 24 männliche Sprague-Dawley-Ratten (mit einem Gewicht von 200-250 g) werden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen von jeweils acht Ratten aufgeteilt, einschließlich Kontroll- (C), Notexin (NTX) und Notexin mit Tuina (NTX + Tuina), und mit einer Standarddiät gefüttert. Halten Sie einen 12-stündigen Licht-/12-Stunden-Dunkelzyklus bei 20-25 °C und 50%-70% Luftfeuchtigkeit ein.
- Anästhesieren Sie mit 1% Pentobarbital-Natrium (40 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion und entfernen Sie dann Haare von der rechten unteren Extremität mit Haarentfernungscreme. Nachdem Sie das Fell entfernt haben, wischen Sie die restliche Creme mit Kochsalzlösung ab. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch Einkneifen der Zehen. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um die Augen mit Feuchtigkeit zu versorgen, während das Tier unter Narkose steht. Bieten Sie während des gesamten Eingriffs thermische Unterstützung.
- Abwechselnde Hautdesinfektion der rechten unteren Extremität mit Jodophor-Desinfektionslösung und 75%igem Alkohol vor der Injektion. Berühren Sie ein in Jodophor-Desinfektionslösung getränktes Wattestäbchen in der Mitte der Haut der unteren Extremität und tragen Sie es in kreisenden Bewegungen nach außen auf. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem mit Ethanol getränkten Wattestäbchen.
- Erstellung von Modellen für Skelettmuskelverletzungen gemäß der Referenzmethode24. Injizieren Sie Notexin nur in ein Bein (um eine doppelte Notexin-Injektion zu verhindern). Ziehen Sie 200 μl Notexinlösung (10 μg/ml Notexinlösung, hergestellt durch Zugabe von 100 μg Notexin zu 10 ml normaler Kochsalzlösung in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen) in eine 1-ml-Spritze mit einer 30-g-Nadel und injizieren Sie die Notexinlösung intramuskulär in den Gastrocnemius-Muskel, um eine Muskelverletzung zu verursachen.
- Injizieren Sie das Notexin langsam und warten Sie 3 Sekunden, bevor Sie die Nadel herausziehen (um vollständig injiziert zu werden).
VORSICHT: Notexin ist eine giftige Chemikalie, die bei Kontakt mit einer offenen Wunde sofort mit viel Wasser gespült und bei Bedarf sofort ärztlich versorgt werden muss. - Injizieren Sie den Ratten in der Kontrollgruppe 200 μl Kochsalzlösung. Bringen Sie betäubte Ratten in leere Käfige mit sauberer Einstreu. Achte darauf, die Polsterung um Nase und Mund der Ratten zu entfernen, damit sie frei atmen können. Beobachten Sie visuell die Gewebefarbe und die Atemfrequenz am Ende der Injektion, bis die Ratten wieder ausreichend zu Bewusstsein kommen.
- Bringen Sie Ratten in den häuslichen Käfig zurück und ziehen Sie sie in der Regel 24 Stunden lang auf.
3. Tuina-Therapie
- Legen Sie eine SD-Ratte in Bauchlage, wobei der Kopf mit einem schwarzen Tuch bedeckt ist, auf die mit 75%igem Alkohol desinfizierte Versuchsplattform, um den Gastrocnemius-Muskel freizulegen. Nicht zu fest abdecken.
- Verwendung des Tuina-Massagegeräts für die NTX+Tuina-Gruppe: Halten Sie das Massagegerät und legen Sie die Rolle auf den Gastrocnemius-Muskel der Ratte und rollen Sie nach vorne, bis die Feder die Begrenzungsschallwand berührt. Ziehen Sie dann die Kraft zurück und kehren Sie in ihre ursprüngliche Position zurück, wodurch die Bewegung hin- und hergeht (Abbildung 3).
- Rollen Sie das Massagegerät mit einer Geschwindigkeit von 140 Rollen pro Minute und führen Sie jeden Vorgang 3 Minuten lang durch. Führen Sie die Massagen an 3 aufeinanderfolgenden Tagen einmal morgens und einmal nachmittags durch.
- Bringen Sie die Ratten nach jeder Behandlung in den häuslichen Käfig zurück und fasten Sie 8 Stunden nach der letzten Behandlung.
4. Entnahme von Blut und Gewebe von Ratten nach dem Experiment
- Ratten sind gemäß den Vorgaben der zuständigen Tierversuchs-Ethikkommission durch intraperitoneale Injektion von 1 % Pentobarbital-Natrium (40 mg/kg, intraperitoneale Injektion) zu betäuben. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch Einkneifen der Zehen. Euthanasie von Ratten durch Aderlass der Bauchaorta nach der Blutentnahme.
- Wechseln Sie die Hautdesinfektion mit Jodophor-Desinfektionslösung und 75%igem Alkohol vor der Injektion ab. Berühren Sie ein in Povidon-Jod getränktes Wattestäbchen in der Mitte der Bauchhaut und tragen Sie es in kreisenden Bewegungen nach außen auf. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem mit Ethanol getränkten Wattestäbchen. Desinfektion 3x wiederholen.
- Bitten Sie den Assistenten, zwei Hämostate zu verwenden, um die Haut in der Mitte des Bauches anzuheben. Verwenden Sie als Operateur ein Skalpell, um die Bauchhaut und die Muskeln von der Raphe bis zur Schambeinfuge zu durchtrennen.
- Nach dem Öffnen der Bauchhöhle trennen Sie den Darm mit sterilen Wattebäuschen, um die Bauchschlagader in der hinteren Bauchdecke freizulegen.
- Lokalisieren Sie die Bauchschlagader, entnehmen Sie 5 ml Rattenblut in Blutentnahmeröhrchen und erhalten Sie das Plasma in 1,5 Mikroröhrchen, indem Sie 10 Minuten lang bei 3000 x g zentrifugieren, nachdem Sie 1 Stunde lang Blut gestanden haben. Plasma bei -80 °C lagern.
- Schneiden Sie die Haut mit einer chirurgischen Schere entlang der unteren Bauchöffnung in Richtung der seitlichen Seite der rechten unteren Extremität auf, legen Sie die Muskeln der unteren Extremitäten frei, und schneiden Sie nach vorsichtiger Trennung der Faszie mit einer Pinzette das Skalpell ab, um den intakten Gastrocnemius-Muskel zu entfernen.
- Waschen Sie den Gastrocnemius-Muskel in steriler Kochsalzlösung, um anhaftende Haare und Blut zu entfernen.
- Legen Sie den entfernten Gastrocnemius-Muskel in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das 4 % Paraformaldehyd enthält.
5. Nachweis von CK- und FABP-3-Plasmaspiegeln mittels ELISA
- Berechnen und bestimmen Sie die Anzahl der vorgewickelten Platten, die für ein Experiment erforderlich sind. Entfernen Sie die erforderlichen Platten, legen Sie sie in den 96-Well-Rahmen, legen Sie die restlichen Mikrotiterplatten zum Verschließen wieder in den Aluminiumfolienbeutel und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Die Kits und Proben werden bei Raumtemperatur (25-28 °C) für 120 Minuten ausgeglichen und vollständig auf Raumtemperatur gebracht.
HINWEIS: Die Äquilibrierung des Kits und der Probe ist kritisch und muss auf eine ausreichende Zeit äquilibriert werden. - Legen Sie Standard-, Proben- und Blindvertiefungen fest. 50 μl CK- oder FABP3-Standard in unterschiedlichen Konzentrationen (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 0 ng/ml) in die Standardvertiefungen geben. Wiederholen Sie jeden Standard einmal und belegen Sie insgesamt 12 Vertiefungen.
- Füllen Sie die Probenvertiefungen mit 40 μl Probenverdünnungsmittel (0,8 g NaCl, 0,02 g KH2PO 4, 0,29 g Na2HPO412H2O,0,02 g KCl, 0,01 gNaN3in 100 ml doppelt destilliertem Wasser, pH7,4), gefolgt von 10 μl der zu testenden Probe. Wiederholen Sie jede Probe einmal und belegen Sie insgesamt 48 Vertiefungen.
- Mit Ausnahme der Leervertiefungen, die sich zwei Vertiefungen hinter der letzten Probenvertiefung befinden, geben Sie 100 μl HRP-markierten Anti-Human-CK- oder FABP3-Antikörper (enzymmarkierter Antikörper) in jede Standard- und Probenvertiefung.
- Die Vertiefungen mit Siegelfolie verschließen und im 37 °C warmen Wasserbad oder Thermostat 60 min inkubieren.
- Entsorgen Sie die Flüssigkeit, tupfen Sie sie auf saugfähigem Papier trocken, füllen Sie jede Vertiefung mit Waschflüssigkeit, lassen Sie sie 20 s einwirken, schütteln Sie die Waschflüssigkeit ab, tupfen Sie sie auf Löschpapier trocken und wiederholen Sie das Waschen der Platte 5 Mal (oder verwenden Sie eine Tellerwaschmaschine).
- 50 μl Chromogenlösung A (20 mg Tetramethylbenzidin, 10 ml Ethanol in 100 ml doppelt destilliertem Wasser) und 50 μl Chromogenlösung B (0,1 m/l Zitronensäure, 0,2 m/l Natriumdihydrogenphosphatpuffer, pH 5,0-5,4) in jede Vertiefung geben. 15 Minuten bei 37 °C von Licht fernhalten.
- Bei Standard-Wells, Proben-Wells und Blind-Wells werden 50 μl Terminierungslösung in jede Vertiefung gegeben und der optische Dichtewert jedes Wells bei 450 nm innerhalb von 15 Minuten gemessen.
6. Histologische Analyse der Notexin-induzierten Gastrocnemius-Muskelverletzung bei Ratten
- 5 μm dicke Paraffinschnitte, die mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt sind, werden für die lichtmikroskopische Untersuchung wie in25 beschrieben vorbereitet.
7. Bildverarbeitung und Datenanalyse
- Lesen und analysieren Sie die vom Bildgebungssystem aufgenommenen Bilder mit einer Analysesoftware. Verschieben Sie das ausgewählte Bildfeld mit der Maus in die Mitte des Bildschirms, klicken Sie auf 40x, und klicken Sie dann auf Schnappschuss erstellen.
- Zeichnen Sie die OD-Werte aus dem ELISA in einer Tabelle auf und berechnen Sie die CK- und FABP3-Werte der Ratte in den Proben anhand der Standardkurve.
- Verwenden Sie für die statistischen Analysen eine Software für statistische Analysen. Drücken Sie die Messungen als Mittelwert ± Standardabweichung (
) aus und analysieren Sie die Vergleiche zwischen den Gruppen mittels einseitiger ANOVA, mit dem LSD-Test, wenn die Varianz gleichmäßig war, und der Tamhane-T2-Methode, wenn die Varianz nicht gleichmäßig war. Die Differenz wurde bei einem p-Wert von weniger als 0,05 als statistisch signifikant angesehen.
) aus und analysieren Sie die Vergleiche zwischen den Gruppen mittels einseitiger ANOVA, mit dem LSD-Test, wenn die Varianz gleichmäßig war, und der Tamhane-T2-Methode, wenn die Varianz nicht gleichmäßig war. Die Differenz wurde bei einem p-Wert von weniger als 0,05 als statistisch signifikant angesehen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um die morphologischen Eigenschaften des Rattenskelettmuskels nach einer Verletzung zu beobachten, wurde der Musculus gastrocnemius mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und die gefärbten Bilder wurden mit einer Analysesoftware ausgelesen, wie im Protokoll für 8 Ratten pro Gruppe beschrieben. Bei Ratten mit einer durch Notexin induzierten Gastrocnemius-Muskelverletzung (NTX-Gruppe) waren viele Muskelzellen gerissen, atrophisch, nekrotisch und unregelmäßig angeordnet. Es gab auch eine hohe Infiltration von Neutrophilen und Lymphozyten um den betroffenen Bereich herum (Abbildung 4B). Nach der Tuina-Behandlung mit dem rollenden Massagegerät verbesserte sich jedoch der pathologische Zustand der Muskelzellen in der NTX+Tuina-Gruppe, mit weniger gerissenen, atrophischen und nekrotischen Zellen und nur einer geringen Anzahl von Entzündungszellen, die im Vergleich zur NTX-Gruppe infiltrierten (Abbildung 4C). In der Kontrollgruppe waren die Muskelzellen der Ratten gleichmäßig groß, eng angeordnet und ohne Entzündungszellinfiltration (Abbildung 4A).
Um die therapeutische Wirkung von Tuina auf Gastrocnemius-Verletzungen bei Ratten mit Dings Rollmassagegerät weiter zu bestätigen, verwendeten wir ELISA, um die Konzentrationen der Skelettmuskelverletzungsmarker CK und FABP3 für 8 Ratten pro Gruppe zu bestimmen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe waren die CK- und FABP3-Spiegel in der NTX-Gruppe signifikant erhöht, und sowohl die CK- als auch die FABP3-Spiegel waren in der NTX+Tuina-Gruppe im Vergleich zur NTX-Gruppe deutlich erniedrigt (Abbildung 5). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Injektion von Notexin bei Ratten schwere Schäden am Gastrocnemius-Muskel verursachte, während Tuina diese Schäden reduzieren kann.
Abbildung 1: Physische Karte des rollenden Massagegeräts. Es besteht hauptsächlich aus einer Gummirolle, einem Gabelhalter, einer Feder, einer Begrenzungsschallwand, einer Einstellschiene, einer Schraube und einem Acrylgriff. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kraftmessung des Rollmassagegeräts. Der maximale Druck beim Vorwärtsrollen beträgt 0,3 N und der Mindestdruck beim Zurückrollen etwa 0,08 N. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Tuina-Therapie mit rollendem Massagegerät. Legen Sie die Rolle auf den Gastrocnemius-Muskel der Ratte und rollen Sie nach vorne, bis die Feder die Endschallwand berührt, dann ziehen Sie die Kraft zurück und kehren Sie in ihre ursprüngliche Position zurück, wodurch die Bewegung hin- und hergeht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder des HE-gefärbten Querschnitts des Gastrocnemius-Muskels der Ratte. (A) Der Gastrocnemius-Muskel der Ratten der Kontrollgruppe (C) wurde nach der Injektion mit Kochsalzlösung nicht signifikant verletzt. (B) Die Notexin-Injektion in den Gastrocnemius-Muskel von Ratten in der Notexin (NTX)-Gruppe verursachte schwere Muskelverletzungen, die zu Myozytenatrophie, Nekrose und unterschiedlichen Größen führten, begleitet von einer massiven Infiltration von Neutrophilen und Lymphozyten. (C) Die Schädigung des Gastrocnemius-Muskels wurde in der Gruppe der Ratten mit Notexin und Tuina (NTX+Tuina) abgeschwächt, und die Anzahl der atrophischen und nekrotischen Myozyten, Neutrophilen und Lymphozyten war reduziert. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: CK- und FABP3-Ausdruck. Das Plasma wurde nach Abschluss von Tuina entnommen, und die Konzentrationen von CK und FABP3 im Plasma von Ratten in Kontrolle (C), Notexin (NTX) und Notexin und Tuina (NTX+Tuina) wurden mittels ELISA nachgewiesen. *P < 0,05, **P < 0,01 bei Verwendung von Einweg-ANOVA mit Post-hoc-LSD-Test. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM, n=8 in allen Gruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier beschrieben wir ein Protokoll für die Tuina-Behandlung von Skelettmuskelverletzungen bei Ratten und analysierten dann den Grad der Skelettmuskelverletzung nach der Behandlung, um die Wirksamkeit der Methode zu überprüfen. Insbesondere können Modelle zur Verletzung der Skelettmuskulatur von Ratten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Induktion von Medikamenten (Notexin, Bupivacain)16, die stumpfe Prellung26, die Quetschung27 und die Ischämie-Reperfusion28, mit Tuina interveniert werden. Durch HE-Färbung zur Beobachtung der histopathologischen Veränderungen und ELISA-Detektion zur Bestimmung der Marker für Skelettmuskelschäden wird intuitiv gezeigt, dass das Notexin schwere Schäden am Gastrocnemius-Muskel von Ratten verursacht, während das Massagegerät, das die Ding-Roll-Methode simuliert, die Muskelschädigung reduzieren kann. Diese liefern überzeugende Beweise für die Wirksamkeit von Tuina bei der Behandlung von Skelettmuskelverletzungen.
Es gibt mehrere notwendige Verfahren, die bei der Durchführung von Tuina an Ratten berücksichtigt werden sollten, die Dings Rollmethode nachahmen. Vor der Behandlung sollte der Tuina-Bediener im Voraus darin geschult werden, das rollende Massagegerät mindestens 3x zu verwenden, den Winkel der Schallwand mit Hilfe des Drucksensors für eine ordnungsgemäße Kraftkontrolle einzustellen und die Frequenz von Tuina bei 140 Rollen/min zu steuern. Halten Sie die Ratten in der Zwischenzeit ruhig, indem Sie ihre Köpfe mit einem schwarzen Halstuch bedecken, ohne zu eng zu sein, um sicherzustellen, dass sie frei atmen können. Wenn die Ratte plötzlich Schwierigkeiten hat, im Tuina-Prozess aktiv zu sein, warte, bis es ruhig ist, bevor du mit dem Tuina-Prozess fortfährst.
Die Einschränkung dieses Experiments besteht darin, dass dieses Massagegerät eher für Ratten als für kleinere Tiere wie Mäuse geeignet ist. Bei anderen Tieren als Ratten können einige Gerätekonfigurationen geändert werden. Zum Beispiel die Größe der Rollen, der Winkel der Schallwand, die Stärke der Feder und natürlich der Drucksensor müssen verwendet werden, um die Rollkraft zu testen. Wir haben hier nur ein Tuina-Massagegerät hergestellt, das Dings Rollmethode simuliert. Als nicht-pharmakologische Therapie der Traditionellen Chinesischen Medizin gibt es jedoch verschiedene Tuina-Manipulationen, wie z.B. Drücken, Befeuchten, Pressen und Kneten. Alle diese Manipulationen können gemäß den Betriebsparametern relevanter berühmter Tuina-Meister durchgeführt werden, um ein Instrument herzustellen, das für die Tierforschung besser geeignet ist, um den Versuchsbetrieb zu standardisieren und die Versuchsergebnisse genauer und glaubwürdiger zu machen.
Abschließend bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Herstellungsmethode des Rollmassagegeräts, die die Ding'sche Rollmethode im Tierversuch effektiv simuliert. Das Massagegerät hat eine signifikante therapeutische Wirksamkeit bei Skelettmuskelverletzungen bei Ratten und legt den Grundstein für die weitere Forschung zur Standardisierung von Tuina.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos.82174521), Innovationsprojekt für Doktoranden der Hunan University of Chinese Medicine (2022CX109) unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | JIANGXI FENGLIN | 20220521 | |
| 1.5 microtubes | Servicebio | EP-150X-J | |
| 15 mL centrifuge tube | Servicebio | EP-1501-J | |
| 30G needle | CONPUVON | 220318 | |
| 5 mL blood collection tube | Servicebio | QX0023 | |
| Acrylic handle | Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd | 65643645 | |
| Adjustment splint | CREROMEM | 20220729 | |
| Cotton Swab | INOHV | 22080215 | |
| Enzyme-labeled Instrument | Rayto | RT-6100 | |
| Ethanol | INOHV | 211106 | |
| Fork holder | Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd | JL001 | |
| Hair removal cream | Veet, France | LOTC190922002 | |
| Hematoxylin dyeing solution set | Wuhan Google Biotech | G1005 | |
| Imaging system | Nikon, Japan | Nikon DS-U3 | |
| IODOPHOR disfecting solution | Hale&Hearty | 20221205 | |
| Light microscope | Nikon, Japan | Nikon Eclipse E100 | |
| Limit baffle | CREROMEM | 20220724 | |
| Notexin | Latoxan S.A.S. | L8104-100UG | |
| Pentobarbital sodium | Merck KGaA | P3761 | |
| Rat creatine kinase (CK) ELISA kit | LunChangShuoBiotech | YD-35237 | |
| Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit | LunChangShuoBiotech | YD-35730 | |
| Rubber roller | Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd | 202207 | |
| Screw | Weiyan Hardware | B05Z122 | |
| Sprague Dawley rats | Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co. | SYXK2019-0009 | |
| Spring | Bingzhang Hardware | TH001 | |
| Surgical blade | Covetrus | #23 | |
| Weigh controller | Iyoys | HY-XSQ |
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