ラットにおけるノテキシン誘発性筋損傷に関するDing's Roll法の模倣

Summary

このプロトコルは鼎のロール方法をまねる簡単な装置を記述し、骨格筋傷害のラット モデルを確立し、血清の損傷のマーカーの変更を検出するために傷つけられたティッシュおよび酵素つながれたimmunosorbentの試金の病理学を観察するのにヘマトキシリンeosinの汚損を使用する。

Abstract

ディンのロール法は、伝統的な中国式マッサージ(推拿)クリニックで最も一般的に使用されているマニピュレーションの1つであり、中国で最も影響力のある現代のトゥイナマニピュレーションの1つです。これは、一本指禅のジャンルで一般的に使用される伝統的な圧延方法に基づいており、鼎のロール法と呼ばれています。抗炎症作用と血行促進作用により、鼎のローリング法はミオパチーに効果があります。Dingのロール法は、ヒトの皮膚にかかる力の領域が大きいため、ラットやウサギなどの皮膚面積が小さい実験動物では実行が困難です。また、人体に施す推拿の強度は実験動物に施す強度と異なるため、実験中に推拿の治療効果が得られない強度が高すぎたり低すぎたりすることがあります。この実験は、Dingのローリング操作パラメータ(強度、頻度、推拿持続時間)に基づいて、ラットに適した簡単なマッサージャーを作成することを目的としています。この装置は、動物実験における操作を標準化し、主観的要因による異なる動物に加えられる推拿力の変動を減らすことができます。ノテキシン誘発性骨格筋損傷のラットモデルを確立し、血漿損傷マーカーであるクレアチンキナーゼ(CK)と脂肪酸結合タンパク質3(FABP3)を使用して、骨格筋損傷に対するTuinaの治療効果を評価しました。その結果、この推拿マッサージャーはCKとFABP3の発現レベルを低下させ、骨格筋の損傷の程度を遅らせることができることが示されました。したがって、ディンのロール法を模倣した本稿の推拿マッサージャーは、実験研究における推拿操作の標準化に寄与し、その後の推拿のミオパチーに対する分子機構の研究に大いに役立つ。

Introduction

筋肉損傷は、臨床および日常生活における一般的な外傷性損傷であり、外部打撃(挫傷)または筋線維の慢性的な過度の緊張(緊張)などによって引き起こされ、筋肉の機能障害や痛みを引き起こし、^{患者の生活の質に}深刻な影響を与えることさえあります1。急性運動過多損傷後のできるだけ早い時期にリハビリテーションを開始することは、スポーツ復帰までの期間を短縮し^{2、痛みを軽減する}ための鍵となります^3,4。現代の西洋医学では、筋肉損傷の臨床応急処置は、筋肉組織への有害な出血を止めるための安静、氷、圧迫、挙上(RICE)の原則に従い⁵、痛みを和らげるための非ステロイド性抗炎症薬⁶。エクソソーム⁷や組織工学⁸などの新しい治療法の発見は、骨格筋疾患の潜在的な治療戦略となり、以前の薬理学的治療の欠点を補うものとなった。しかし、それはまた、患者の治療費を増加させ、彼らを途方もない経済的圧力にさらす可能性があります⁹。したがって、筋骨格系の問題を治療するには、代替療法および補完療法が推奨されます¹⁰。推拿は、伝統的な医療方法として中国で臨床的に広く使用されており、その有効性と副作用の少なさから患者に人気があります。筋骨格系障害の推拿療法は、痛みを和らげ、機能を改善することができます11,12,13。上海の有名な推拗開業医である丁吉峰氏は、丁のロールメソッド¹⁴を設立しました。これは、大きな力の面積、均一で穏やかな力、そして強い浸透力を備えた独自の圧延および破砕技術です。

異なる動物モデルは、異なる病因に基づいています。それらには長所と短所があり、正確で適切な動物モデルの選択は、骨格筋損傷後の再生と修復の細胞および分子シグナル伝達経路を理解し、骨格筋疾患の治療のための新しい治療法を開発するのに役立つ基礎実験にとって非常に重要です。筋肉損傷の化学的に誘発されたモデルは広く使用されており、骨格筋の注射は筋線維壊死を引き起こし、2週間以内に効果的に再生できる再生領域を生成します¹⁵。ノテキシンとブピバカインはどちらも筋肉の損傷を引き起こす可能性があります。しかし、ノテキシンはブピバカインよりも骨格筋に重度の筋毒性損傷を引き起こす可能性があり、自然な機能回復は比較的遅い¹⁶。薬剤の筋肉内射出成形は、時間がかからないだけでなく、骨格筋の損傷の効果と程度も制御されています。この定量化可能な制御により、成形の成功がそれほど困難になりません^15,17。

炎症反応は、ミオパシーの文脈で広く研究されている本質的な生物学的反応です^18,19。骨格筋損傷の初期段階では、筋線維壊死が局所的な筋肉の恒常性を破壊し、多くの炎症細胞が損傷部位に浸潤し、多くの炎症誘発性サイトカインを分泌します¹⁹。クレアチンキナーゼ(CK)は、骨格筋損傷を評価するための従来の血清バイオマーカーです。しかし、組織特異性²⁰および感度²¹を欠いているため、薬物誘発性筋損傷の程度を評価し、損傷後の筋回復の程度を間接的に報告する能力が制限されます。脂肪酸結合タンパク質3(FABP3)を含む新しいバイオマーカーは、最近、骨格筋損傷のげっ歯類モデルにおいて比較的高い組織特異性と感度を示しています。FABP3は、主に心筋細胞および骨格筋細胞で発現し、脂肪酸の代謝、輸送、およびシグナル伝達に関与する結合タンパク質ファミリーである²²。そこで、CKとFABP3の2つのバイオマーカーを組み合わせて、ノテキシンによる骨格筋の損傷の程度と治療後の回復を評価しました。

げっ歯類では、筋肉が浅く、皮膚面積が小さいため、げっ歯類のマッサージのさまざまなパラメータは、動物療法などの人間と同じではないため、マッサージセラピストはDingのロール法を使用してより少ない力で治療する必要があり、損傷した領域のサイズが小さいため、この技術の操作を助長しない可能性があります。 これは最終的にマッサージの効果の低下につながる可能性があります。そこで、本実験では、鼎のロール法の特徴に合致した自社製ローリングマッサージャーを用いて、ラットにおけるノテキシン誘発性骨格筋損傷モデルの治療効果を介入・評価し、実験動物実験における推拿のパラメータの標準化に役立ち、推拿の分子作用機序を深く調べました。 筋骨格系疾患に対する漢方薬の治療法。

Protocol

動物が関与する処置は、湖南中医薬大学の施設ケアおよび使用委員会によって承認されています。

1.ローリングマッサージャーの組み立て

1. ゴムローラー、フォークホルダー、スプリング、リミットバッフル、調整スプリント、ネジ、アクリルハンドルで構成されるマッサージャーを選択します(図1)。ゴムローラーの長さ3cm、直径1.6cm、スプリングの長さ3cm、直径0.9cm、リミットバッフルの長さ3cm、幅2cm、ハンドルの長さ12cm、直径0.9cmを確認してください。
2. 力制御:文献結果²³によると、鼎のロール法の下向き圧力は体重の約10%であることが判明したため、前方転がりの設計中に加えられる圧力はラットの体重の約10%(0.2〜0.3 N)です。リミットバッフルの角度を調整して、計量コントローラーのマッサージャーの最大圧力が約0.3Nになるようにテストします。この圧力要件は、ラットのニーズを満たします。
3. ロールバック時の最小圧力が約0.08Nであることを確認してください(図2)。圧力が、前方力と後方力の比率が3:1であるというDingのロール法の要件に正確に準拠していることを確認してください。
4. 治療前に、オペレーターにメトロノームソフトウェアを使用してローリング頻度を140ロール/分に制御するように依頼し、操作が標準化されていることを確認するために、事前実験でこれを3倍以上練習します。

2. ラット骨格筋損傷モデルの確立

1. 24匹の雄のSprague-Dawleyラット(体重200〜250 g)を、対照(C)、ノテキシン(NTX)、および推拿によるノテキシン(NTX + Tuina)を含む8匹のラットの3つのグループにランダムに分割し、標準食を食べます。12時間の明度/12時間の暗度サイクルを維持し、20〜25°C、湿度50%〜70%で飼育します。
2. 腹腔内注射により1%ペントバルビタールナトリウム(40mg/kg)で麻酔をかけ、脱毛クリームで右下肢の脱毛を行います。毛を取り除いた後、生理食塩水を使用して残りのクリームを拭きます。つま先つまみ反応で適切な麻酔を確認します。動物が麻酔下にある間、眼科用軟膏を塗って目を潤します。手順全体を通してサーマルサポートを提供します。
3. 注射前にヨードフォア消毒液と75%アルコールによる右下肢の皮膚消毒を交互に行います。ヨードフォア消毒液に浸した綿棒を下肢の皮膚の中心に触れ、外側に円を描くように塗布します。エタノールを染み込ませた綿棒で繰り返します。
4. 参照方法²⁴に従って骨格筋損傷モデルを確立します。片方の脚のみにノテキシンを注射します(二重ノテキシン注射を防ぐため)。200 μL のノテキシン溶液 (15 mL 遠心チューブ内の 10 mL の生理食塩水 10 mL に 100 μg のノテキシンを加えて調製した 10 μg/mL のノテキシン溶液) を 30G の針で 1 mL のシリンジに吸い込み、ノテキシン溶液を筋肉内に腓腹筋に注入して筋肉損傷を引き起こします。
5. ノテキシンをゆっくりと注入し、3秒待ってから針を抜きます(完全に注射するため)。
   注意: ノテキシンは有毒な化学物質であり、開いた傷口に接触したらすぐに大量の水で洗い流し、必要に応じて迅速な医師の診察を受ける必要があります。
6. 対照群のラットに200μLの生理食塩水を注入する。麻酔をかけたラットを清潔な寝具のある空のケージに移します。ネズミの鼻と口の周りのパッドを取り外して、呼吸をクリアに保つように注意してください。ラットが十分な意識を取り戻すまで、注射終了時の組織の色と呼吸数を目視で観察します。
7. ネズミをホームケージに戻し、通常は24時間飼育します。

3.推拿療法

1. 75%アルコールで消毒した実験台の上に、頭を黒い布で覆った状態でSDラットをうつ伏せの姿勢に置き、腓腹筋を露出させます。きつく覆いすぎないでください。
2. NTX + TuinaグループでのTuinaマッサージャーの使用:マッサージャーを持ち、ローラーをラットの腓腹筋に置き、スプリングが限界バッフルに接触するまで前方に転がします。次に、力を引っ込めて元の位置に戻り、それによって往復運動を行います(図3)。
3. マッサージャーを毎分140ロールの速度で転がし、各操作を3分間実行します。午前と午後に1回、3日間連続してマッサージを行います。
4. 各治療後にラットをホームケージに戻し、最後の治療後8時間絶食します。

4. 実験後のラットの血液・組織採取

1. 関連する動物実験倫理委員会の要件に従って、1%ペントバルビタールナトリウム(40 mg / kg、腹腔内注射)の腹腔内注射によってラットに麻酔をかけます。.つま先つまみ反応で適切な麻酔を確認します。採血後の腹部大動脈瀉血によるラットの安楽死。
2. 注射前にヨードフォア消毒液と75%アルコールで皮膚を交互に消毒します。ポビドンヨードに浸した綿棒を腹部の皮膚の中心に触れ、外側に円を描くように塗ります。エタノールを染み込ませた綿棒で繰り返します。消毒を3回繰り返します。
3. アシスタントに2つの止血剤を使用して腹部の真ん中の皮膚を持ち上げるように依頼します。オペレーターとして、メスを使用して、縫線から恥骨結合までの腹部の皮膚と筋肉を切断します。
4. 腹腔を開いた後、滅菌綿球で腸を分離し、後腹壁の腹部大動脈を露出させます。
5. 腹部大動脈の位置を特定し、ラットの血液5mLを採血管に取り込み、血液を1時間放置した後、3000 x g で10分間遠心分離して血漿を1.5マイクロチューブに採取します。プラズマは-80°Cで保存してください。
6. 下腹部の開口部に沿って手術用ハサミで右下肢の外側に向かって皮膚を切り開き、下肢の筋肉を露出させ、鉗子で筋膜を慎重に分離した後、メスを切って無傷の腓腹筋を取り除きます。
7. 腓腹筋を滅菌生理食塩水で洗浄し、付着した髪や血液を取り除きます。
8. 切除した腓腹筋を、4%パラホルムアルデヒドを含む15mLの遠心チューブに入れます。

5. ELISAによる血漿CKおよびFABP3レベルの検出

1. 1回の実験に必要な包装済みプレートの数を計算して決定します。必要なプレートを取り外し、96ウェルフレームに置き、残りのマイクロプレートをアルミホイルバッグに戻し、密封し、4°Cで保存します。
2. キットとサンプルを室温(25〜28°C)で120分間平衡化し、室温に完全に平衡化します。
   注:キットとサンプルの平衡化は重要であり、十分な時間で平衡化する必要があります。
3. 標準ウェル、サンプルウェル、ブランクウェルを設定します。異なる濃度(100、50、25、12.5、6.25、0 ng/mL)の CK または FABP3 標準試料 50 μL を標準ウェルに添加します。各標準を1回繰り返し、合計12ウェルを占有します。
4. サンプルウェルに40 μLのサンプル希釈液(0.8 gのNaCl、0.02 gの_KH2PO₄、0.29gのNa2_HPO4 12H₂O、0.02 gのKCl、0.01gの_NaN3)を100 mLの二重蒸留水、pH_7.4)で満たし、続いて10 μLの試験対象サンプルを充填します。各サンプルを1回繰り返し、合計48ウェルを占有します。
5. 最後のサンプルウェルの 2 つのウェルの後ろにあるブランクウェルを除き、100 μL の HRP 標識抗ヒト CK または FABP3 抗体(酵素標識抗体)を各標準試料およびサンプルウェルに添加します。
6. ウェルをシーリングフィルムで密封し、37°Cのウォーターバスまたはサーモスタットで60分間インキュベートします。
7. 液体を捨て、吸収紙で軽くたたいて乾かし、各ウェルに洗浄液を入れ、20秒間放置し、洗浄液を振り落とし、あぶらとり紙で軽くたたいて乾かし、プレートを5回繰り返します(またはプレートウォッシャーを使用します)。
8. 50 μLの発色剤溶液A(20 mgのテトラメチルベンジジン、10 mLのエタノール、100 mLの二重蒸留水)と50 μLの発色剤溶液B(0.1 M / Lクエン酸、0.2 M / Lリン酸二水素ナトリウム緩衝液、pH 5.0〜5.4)を各ウェルに加えます。37°Cで15分間光から遠ざけてください。
9. スタンダードウェル、サンプルウェル、ブランクウェルの場合、各ウェルに50 μLの終端溶液を添加し、15分以内に450 nmで各ウェルの光学濃度値を測定します。

6. ラットにおけるノテキシン誘発性腓腹筋損傷の組織学的解析

1. ヘマトキシリンとエオシンで染色した厚さ5μmのパラフィン切片を、²⁵に記載されているように光学顕微鏡検査用に準備します。

7. 画像処理とデータ解析

1. イメージングシステムで撮影した画像を解析ソフトウェアで読み取り、解析します。選択した画像の視野をマウスで画面の中央に移動し、[40x] をクリックして、[ スナップショットの撮影] をクリックします。
2. ELISAのOD値をスプレッドシートに記録し、検量線を使用してサンプル中のラットCKおよびFABP3レベルを計算します。
3. 統計分析には、統計解析ソフトウェアを使用します。測定値を標準偏差±平均値として表し()、分散が一様な場合はLSD検定、分散が一様でない場合のタムハネT2法で一元配置分散分析により、グループ間の比較を分析します。この差は、0.05未満の p値で統計的に有意であると見なされました。

Representative Results

損傷後のラット骨格筋の形態学的特性を観察するために、腓腹筋をヘマトキシリンとエオシンで染色し、染色した画像を、1群あたり8匹のラットのプロトコルに記載されているように解析ソフトウェアで読み取った。ノテキシンによって誘発された腓腹筋損傷ラット(NTX群)では、多くの筋細胞が破裂、萎縮、壊死し、不規則に配列した。また、患部周辺には好中球やリンパ球の浸潤が多く見られました(図4B)。しかし、ローリングマッサージャーによる推拿治療後、NTX+Tuina群の筋細胞の病態は改善し、NTX群と比較して破裂細胞、萎縮細胞、壊死細胞が少なく、浸潤する炎症細胞の数も少なかった(図4C)。対照群では、ラットの筋肉細胞は均等にサイズ化され、密に配置され、炎症細胞浸潤はありませんでした(図4A)。

Dingのローリングマッサージャーを利用したラットの腓腹筋損傷に対するTuinaの治療効果をさらに確認するために、ELISAを使用して、グループあたり8匹のラットの骨格筋損傷マーカーCKおよびFABP3のレベルを検出しました。対照群と比較して、CKおよびFABP3レベルはNTX群で有意に増加し、NTX+Tuina群ではNTX群と比較してCKおよびFABP3レベルともに顕著に低下しました(図5)。これらの結果は、ノテキシンの注射がラットの腓腹筋に深刻な損傷を与えたことを示唆していますが、推拿はこの損傷を軽減できます。

図1:ローリングマッサージャーの物理マップ。 主にゴムローラー、フォークホルダー、スプリング、リミットバッフル、調整スプリント、ネジ、アクリルハンドルで構成されています。スケールバー = 1 cm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:ローリングマッサージャーの力測定。 正転の最大圧力は0.3N、巻き戻し時の最低圧力は約0.08Nです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:ローリングマッサージャーを用いた推拿療法。 ローラーをラットの腓腹筋に置き、スプリングが限界バッフルに接触するまで前方に転がし、力を引っ込めて元の位置に戻り、それによって動きを往復させます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:ラット腓腹筋のHE染色断面の代表画像。 (A)対照(C)群ラットの腓腹筋は生理食塩水注射後に有意な損傷を受けなかった。(B)ノテキシン(NTX)群のラットの腓腹筋へのノテキシン注射は、重度の筋損傷を引き起こし、筋細胞の萎縮、壊死、およびさまざまなサイズを引き起こし、好中球とリンパ球の大規模な浸潤を伴いました。(C)腓腹筋損傷は、ラットのnotexinおよびtuina(NTX+Tuina)群で減弱し、萎縮性および壊死性筋細胞、好中球、およびリンパ球の数が減少した。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:CKとFABP3の発現。 血漿は、Tuinaの完了後に採取し、コントロール(C)ラットの血漿中のCKおよびFABP3の濃度、ノテキシン(NTX)、およびノテキシンおよびトゥイナ(NTX+Tuina)をELISAで検出した。*P < 0.05、**P < 0.01 は、一元配置分散分析と事後 LSD テストを使用した場合。値はSEM±平均値で、すべてのグループでn = 8です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここでは、ラットの骨格筋損傷に対する推拿治療のプロトコールを記載し、治療後の骨格筋損傷の程度を解析し、その有効性を検証した。特に、薬物誘導(ノテキシン、ブピバカイン)¹⁶、鈍的挫傷²⁶、挫傷²⁷、虚血再灌流²⁸を含むがこれらに限定されないラット骨格筋損傷モデルは、推拿で介入することができる。病理組織学的変化を観察するためのHE染色と骨格筋損傷のマーカーを決定するためのELISA検出により、ノテキシンがラットの腓腹筋に深刻な損傷を与えるのに対し、ディンロール法をシミュレートするマッサージャーは筋肉の損傷を軽減できることが直感的に示されました。これらは、骨格筋損傷の治療におけるTuinaの有効性について説得力のある証拠を提供します。

Dingのロール法を模倣したラットで推拿を行う際に考慮すべきいくつかの必要な手順があります。治療の前に、推拿オペレーターは、ローリングマッサージャーを少なくとも3回使用し、適切な力制御のために圧力センサーの助けを借りてバッフルの角度を調整し、推拿の頻度を140ロール/分で制御するように事前に訓練する必要があります。その間、ネズミが自由に呼吸できるように、過度にきつく締めることなく黒いバンダナで頭を覆って、ネズミを静かにさせてください。ネズミが突然トゥイナプロセスで活動するのに苦労した場合は、ネズミが静かになるまで待ってからトゥイナを続行します。

この実験の限界は、このマッサージャーがマウスなどの小動物ではなくラットに適していることです。ラット以外の動物については、一部の機器構成を変更することができます。ローラーのサイズ、バッフルの角度、スプリングの強度など、そして当然のことながら、圧延力をテストするために圧力センサーを使用する必要があります。ここでは、Dingのロール法をシミュレートしたTuinaマッサージャーのみを作成しました。しかし、漢方薬の非薬理療法として、押す、湿らせる、押す、こねるなど、さまざまな推拿操作があります。これらすべての操作は、関連する有名なトゥイナマスターの動作パラメータに従って行うことができ、動物研究により適した機器を製造し、実験操作を標準化し、実験結果をより正確で信頼できるものにすることができます。

結論として、動物実験中にDingのロール法を効果的にシミュレートするローリングマッサージャーの製造方法について詳しく説明します。マッサージャーは、ラットの骨格筋損傷に対して有意な治療効果があり、推拿の標準化に関するさらなる研究の基礎を築きます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	JIANGXI FENGLIN	20220521
1.5 microtubes	Servicebio	EP-150X-J
15 mL centrifuge tube	Servicebio	EP-1501-J
30G needle	CONPUVON	220318
5 mL blood collection tube	Servicebio	QX0023
Acrylic handle	Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd	65643645
Adjustment splint	CREROMEM	20220729
Cotton Swab	INOHV	22080215
Enzyme-labeled Instrument	Rayto	RT-6100
Ethanol	INOHV	211106
Fork holder	Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd	JL001
Hair removal cream	Veet, France	LOTC190922002
Hematoxylin dyeing solution set	Wuhan Google Biotech	G1005
Imaging system	Nikon, Japan	Nikon DS-U3
IODOPHOR disfecting solution	Hale&Hearty	20221205
Light microscope	Nikon, Japan	Nikon Eclipse E100
Limit baffle	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
Pentobarbital sodium	Merck KGaA	P3761
Rat creatine kinase (CK) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35237
Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35730
Rubber roller	Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd	202207
Screw	Weiyan Hardware	B05Z122
Sprague Dawley rats	Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co.	SYXK2019-0009
Spring	Bingzhang Hardware	TH001
Surgical blade	Covetrus	#23
Weigh controller	Iyoys	HY-XSQ