模仿丁氏滚动法治疗大鼠肌损伤

Summary

该协议描述了一种模仿Ding滚动方法的简单装置，建立了骨骼肌损伤的大鼠模型，并使用苏木精-伊红染色观察受损组织的病理学和酶联免疫吸附测定法来检测血清损伤标志物的变化。

Abstract

丁氏翻滚法是中国传统按摩诊所中最常用的推拿法之一，也是中国当代推拿法中最有影响力的推拿法之一。它以单指禅宗流派中常用的传统卷法为基础，命名为丁氏卷法。由于其抗炎和促进血液循环的作用，丁氏滚动法对肌病有很好的治疗效果。由于施加在人体皮肤上的力面积很大，丁氏滚动法在皮肤面积小的实验动物（如大鼠和兔子）上具有挑战性。此外，推拿应用于人体的强度与应用于实验动物的强度不同，因此在实验过程中可能会发生强度过高或过低而无法达到推拿的治疗效果。该实验旨在根据 Ding 的滚动操作参数（强度、频率、推拿持续时间）创建一种适合大鼠的简单按摩器。该装置可以标准化动物实验中的操作，并减少由于主观因素而施加到不同动物身上的推拿力的变化。建立大鼠骨骼肌损伤模型，采用血浆损伤标志物肌酸激酶（CK）和脂肪酸结合蛋白3（FABP3）评价推拿对骨骼肌损伤的治疗效果。结果表明，该推拿按摩器可降低CK和FABP3的表达水平，减缓骨骼肌损伤的程度。因此，本文介绍的推拿按摩器，模仿丁氏滚动法，有助于实验研究中推拿操作的标准化，对后续推拿治疗肌病分子机制的研究有很大帮助。

Introduction

肌肉损伤是临床和日常生活中常见的创伤性损伤，由外部打击（挫伤）或肌纤维慢性过度拉伤（拉伤）等引起，导致肌肉功能障碍和疼痛，甚至严重影响^{患者的生活质量1}。急性劳损后尽早开始康复是缩短恢复运动时间的关键² 和减轻疼痛 ^3,4。在现代西医中，肌肉损伤的临床急救遵循休息、冰敷、加压和抬高 （RICE） 原则，以阻止肌肉组织有害出血⁵ 和非甾体抗炎药缓解疼痛⁶。外泌体⁷ 和组织工程⁸ 等新疗法的发现成为骨骼肌疾病的潜在治疗策略，弥补了先前药物治疗的不足。然而，它也会增加患者的治疗成本，使他们承受巨大的经济压力⁹.因此，建议使用替代疗法和补充疗法来治疗肌肉骨骼问题¹⁰.推拿作为传统医疗方法在中国临床上被广泛使用，因其疗效好、副作用少而受到患者的欢迎。推拿治疗肌肉骨骼疾病可以减轻疼痛并改善功能^11,12,13。上海著名推拿法师丁继峰先生创立了丁氏卷法¹⁴。它是一种独特的轧碎技术，受力面积大，力均匀柔和，穿透力强。

不同的动物模型基于不同的病因。它们各有利弊，选择正确、合适的动物模型对基础实验具有重要意义，有助于了解骨骼肌损伤后再生和修复的细胞和分子信号通路，为开发治疗骨骼肌疾病的新疗法奠定基础意义。化学诱导的肌肉损伤模型被广泛使用，骨骼肌注射引起肌纤维坏死并产生可以在 2 周内有效再生的再生区域¹⁵。notexin 和布比卡因都会导致肌肉损伤。然而，与布比卡因相比，notexin 对骨骼肌的肌毒性损伤更严重，并且自然功能恢复相对较慢¹⁶.药物肌内注射成型不仅时间更短，而且对骨骼肌损伤的效果和程度也可控。这种可量化的控制使成功的成型难度降低^15,17。

炎症反应是一种重要的生物学反应，已在肌病的背景下进行了广泛研究^18,19。在骨骼肌损伤的早期阶段，肌纤维坏死会破坏局部肌肉稳态，许多炎症细胞浸润损伤部位，分泌许多促炎细胞因子¹⁹。肌酸激酶 （CK） 是用于评估骨骼肌损伤的传统血清生物标志物。然而，它缺乏组织特异性²⁰ 和敏感性²¹，这限制了其评估药物诱导的肌肉损伤程度和间接报告损伤后肌肉恢复程度的能力。包括脂肪酸结合蛋白 3 （FABP3） 在内的新型生物标志物最近在骨骼肌损伤的啮齿动物模型中显示出相对较高的组织特异性和敏感性。FABP3 是一个结合蛋白家族，主要在心脏和骨骼肌细胞中表达，与脂肪酸代谢、转运和信号传导有关²²。因此，我们选择了两种生物标志物CK和FABP3的组合，以评估notexin诱导的骨骼肌损伤和治疗后的恢复程度。

在啮齿类动物中，肌肉较浅，皮肤面积较小，这也决定了啮齿类动物按摩的各种参数不会与人类相同，例如在动物治疗中，按摩治疗师应使用丁氏滚动法以较小的力气对待它们，并且可能由于受伤部位的尺寸较小，不利于该技术的操作， 这最终会导致按摩效果的降低。因此，本实验利用自制的符合丁氏滚动法特点的滚动按摩器，对notexin诱导的大鼠骨骼肌损伤模型的治疗效果进行干预和评价，有助于在实验动物研究中标准化推拿参数，以深入研究推拿的分子作用机制。 一种中医治疗方法，用于肌肉骨骼疾病。

Protocol

涉及动物的程序已获得湖南中医药大学机构护理和使用委员会的批准。

1.滚动按摩器的组装

1. 选择由橡胶滚轮、叉架、弹簧、限位挡板、调节夹板、螺钉和亚克力手柄组成的按摩器（图 1）。确保胶辊长 3 厘米，直径 1.6 厘米，弹簧长 3 厘米，直径 0.9 厘米，限位挡板长 3 厘米，宽 2 厘米，手柄长 12 厘米，直径 0.9 厘米。
2. 力控制：根据文献结果²³，发现丁氏滚动法向下的压力约为体重的10%，因此在设计前滚时施加的压力约为大鼠体重的10%（0.2-0.3 N）。通过调整限位挡板的角度，测试称重控制器上按摩器的最大压力约为 0.3 N。这种压力要求满足了大鼠的需要。
3. 回滚时确保最小压力约为 0.08 N（图 2）。确保压力精确符合丁氏横滚法要求，即正反向力比为3：1。
4. 在处理之前，要求操作人员使用节拍器软件将滚动频率控制在 140 卷/分钟，并在预实验中练习 3 次以上，以确保操作标准化。

2. 骨骼肌损伤大鼠模型的建立

1. 将 24 只雄性 Sprague-Dawley 大鼠（体重 200-250 g）随机分为三组，每组 8 只大鼠，包括对照组 （C）、notexin （NTX） 和 notexin 与推拿 （NTX + 推拿），并以标准饮食为食。保持在12小时光照/12小时黑暗循环中，在20-25°C和50%-70%湿度下。
2. 腹膜内注射用1%戊巴比妥钠（40mg / kg）麻醉，然后用脱毛膏去除右下肢的毛发。去除毛皮后，用生理盐水擦拭残留的乳霜。通过脚趾捏合反应确认充分麻醉。在动物麻醉时涂抹眼药膏滋润眼睛。在整个过程中提供热支持。
3. 注射前用碘伏消毒液和 75% 酒精交替对右下肢进行皮肤消毒。将浸泡在碘伏消毒液中的棉签接触下肢皮肤中心，然后以打圈的方式向外涂抹。用浸有乙醇的棉签重复上述步骤。
4. 根据参考方法²⁴建立骨骼肌损伤模型。仅在一条腿上注射 notexin（以防止双重 notexin 注射）。用 30G 针头将 200 μL notexin 溶液（通过在 15 mL 离心管中加入 10 μg notexin 加入 10 mL 生理盐水制备的 10 μg/mL notexin 溶液制备）放入 30G 针头的 1 mL 注射器中，并将 notexin 溶液肌肉注射到腓肠肌中以产生肌肉损伤。
5. 缓慢注射notexin并等待3秒后再拔出针头（以完全注射）。
   注意：Notexin 是一种有毒化学物质，接触开放性伤口后需要立即用大量水冲洗，并在必要时及时就医。
6. 向对照组的大鼠注射200μL生理盐水。将麻醉的大鼠移至空笼子中，并铺有干净的垫料。注意去除老鼠鼻子和嘴巴周围的衬垫，以保持它们的呼吸畅通。目视观察注射结束时的组织颜色和呼吸频率，直到大鼠恢复足够的意识。
7. 将大鼠放回笼子，通常饲养24小时。

3. 推拿疗法

1. 将SD大鼠置于俯卧位，头部用黑布覆盖在用75%酒精消毒的实验平台上，以暴露腓肠肌。不要盖得太紧。
2. NTX+推拿组使用推拿按摩器：握住按摩器，将滚轮放在大鼠的腓肠肌上，向前滚动，直到弹簧接触限位挡板。然后缩回力并返回其原始位置，从而进行往复运动（图 3）。
3. 以每分钟 140 卷的速度滚动按摩器，每次操作 3 分钟。连续3天上午和下午各进行一次按摩。
4. 每次处理后将大鼠放回笼中，并在最后一次处理后禁食8小时。

4.实验后从大鼠身上采集血液和组织

1. 根据相关动物实验伦理委员会的要求，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（40mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠。通过脚趾捏合反应确认充分麻醉。采血后通过腹主动脉放血对大鼠实施安乐死。
2. 注射前用碘伏消毒液和75%酒精交替进行皮肤消毒。将浸泡在聚维酮碘中的棉签触摸腹部皮肤的中心，然后以圆周运动向外涂抹。用浸有乙醇的棉签重复上述步骤。重复消毒 3 次。
3. 让助手使用两个止血钳来抬起腹部中间的皮肤。作为操作者，使用手术刀切开腹部皮肤和肌肉，从臀部到耻骨联合。
4. 打开腹腔后，用无菌棉球将肠分开，露出腹后壁的腹主动脉。
5. 找到腹主动脉，将5mL大鼠血液取入采血管中，并在静置血液1小时后以3000× g 离心10分钟，将血浆放入1.5个微管中。将血浆储存在-80°C。
6. 用手术剪刀沿着下腹部开口向右下肢的外侧切开皮肤，露出下肢肌肉，用镊子小心地分离筋膜后，切开手术刀以去除完整的腓肠肌。
7. 用无菌盐水清洗腓肠肌，以去除粘附的毛发和血液。
8. 将去除的腓肠肌放入含有 4% 多聚甲醛的 15 mL 离心管中。

5. ELISA检测血浆CK和FABP 3水平

1. 计算并确定一次实验所需的预包装板数量。取出所需的板，将它们放入96孔框架中，将剩余的微孔板放回铝箔袋中密封，并将它们储存在4°C。
2. 将试剂盒和样品在室温（25-28°C）下平衡120分钟，完全平衡至室温。
   注意：试剂盒和样品的平衡至关重要，必须平衡到足够的时间。
3. 设置标准孔、样品孔和空白孔。向标准孔中加入不同浓度（100、50、25、12.5、6.25、0 ng/mL）的 50 μL CK 或 FABP3 标准品。每个标准重复一次，总共占据12个孔。
4. 用 40 μL 样品稀释剂（0.8 g NaCl、0.02 g KH 2 PO 4、0.29 gNa 2 HPO 4 12H₂O、0.02 g KCl、0.01 g NaN₃在 100 mL 双蒸水，pH_7.4 中）填充样品孔，然后加入 10 μL 待测样品。重复每个样品一次，总共占用 48 个孔。
5. 除了位于最后一个样品孔后面两个孔的空白孔外，向每个标准品和样品孔中加入 100 μL HRP 标记的抗人 CK 或 FABP3 抗体（酶标记抗体）。
6. 用密封膜密封孔，并在37°C水浴或恒温器中孵育60分钟。
7. 丢弃液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液填充每个孔，静置 20 秒，甩掉洗涤液，在吸墨纸上拍干，然后重复洗涤板 5 次（或使用洗板机）。
8. 向每个孔中加入 50 μL 显色剂溶液 A（20 mg 四甲基联苯胺、10 mL 乙醇溶于 100 mL 双蒸水中）和 50 μL 显色剂溶液 B（0.1 M/L 柠檬酸、0.2 M/L 磷酸二氢钠缓冲液，pH 5.0-5.4）。在37°C下避光15分钟。
9. 对于标准孔、样品孔和空白孔，向每个孔中加入 50 μL 终止溶液，并在 15 分钟内测量每个孔在 450 nm 处的光密度值。

6. notexin诱导的大鼠腓肠肌损伤的组织学分析

1. 准备用苏木精和伊红染色的 5 μm 厚石蜡切片，用于光学显微镜检查，如²⁵ 中所述。

7. 图像处理和数据分析

1. 使用分析软件读取和分析成像系统捕获的图像。用鼠标将选定的图像视野移动到屏幕中央，单击 40 倍，然后单击“ 拍摄快照”。
2. 在电子表格中记录ELISA的OD值，并使用标准曲线计算样品中的大鼠CK和FABP3水平。
3. 使用统计分析软件进行统计分析。将测量值表示为平均值±标准差 （），并通过单因素方差分析分析组间比较，方差均匀时采用 LSD 检验，方差不均匀时采用 Tamhane T2 方法。当 p 值小于 0.05 时，该差异被认为具有统计学意义。

Representative Results

为了观察损伤后大鼠骨骼肌的形态学特性，用苏木精和伊红对腓肠肌进行染色，并用方案中描述的分析软件读取染色图像，每组8只大鼠。在notexin诱导的腓肠肌损伤大鼠（NTX组）中，许多肌肉细胞破裂、萎缩、坏死和排列不规则。受影响区域周围也有中性粒细胞和淋巴细胞的高浸润（图4B）。然而，在用滚动按摩器治疗推拿后，NTX+推拿组肌肉细胞的病理状况有所改善，破裂、萎缩和坏死细胞较少，与NTX组相比，只有少量炎症细胞浸润（图4C）。在对照组中，大鼠的肌肉细胞大小均匀，排列紧密，没有炎症细胞浸润（图4A）。

为了进一步证实推拿对使用丁氏滚动按摩器的大鼠腓肠肌损伤的治疗效果，我们使用ELISA检测每组8只大鼠的骨骼肌损伤标志物CK和FABP3水平。与对照组相比，NTX组CK和FABP3水平显著升高，NTX+Tuina组CK和FABP3水平均明显降低（图5）。这些结果表明，注射 notexin 对大鼠腓肠肌造成严重损害，而推拿可以减少这种损害。

图1：滚动按摩器物理图。 它主要包括胶辊、叉架、弹簧、限位挡板、调节夹板、螺钉和亚克力手柄。比例尺 = 1 厘米。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2：滚动按摩器力测量。 前滚最大压力为0.3 N，后滚时最小压力约为0.08 N。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3：使用滚动按摩器的推拿疗法。 将滚轮放在大鼠的腓肠肌上，向前滚动，直到弹簧接触限位挡板，然后收回力并返回其原始位置，从而往复运动。 请点击这里查看此图的较大版本.

图4：HE染色的大鼠腓肠肌横截面的代表性图像。 （A）对照组（C）组大鼠注射生理盐水后腓肠肌无明显损伤。（B）将notexin注射到notexin（NTX）组大鼠腓肠肌中引起严重的肌肉损伤，导致肌细胞萎缩、坏死和大小不一，并伴有中性粒细胞和淋巴细胞的大量浸润。（C）notexin和推拿（NTX+Tuina）组大鼠腓肠肌损伤减轻，萎缩坏死肌细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量减少。比例尺 = 100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5：CK 和 FABP3 表达。 推拿完成后采集血浆，ELISA检测对照组大鼠血浆中CK和FABP3的浓度（C）、notexin（NTX）和notexin和推拿（NTX+Tuina）的浓度。*P < 0.05，**P < 0.01，使用单因素方差分析和事后 LSD 检验。值为 SEM ±均值，所有组均为 n=8。 请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

在这里，我们描述了推拿治疗大鼠骨骼肌损伤的方案，然后分析了治疗后骨骼肌损伤的程度，以验证该方法的有效性。值得注意的是，大鼠骨骼肌损伤模型，包括但不限于药物诱导（notexin、布比卡因）¹⁶、钝挫伤²⁶、挤压 27 和缺血再灌注²⁸，可以用推拿进行干预。通过HE染色观察组织病理学变化和ELISA检测确定骨骼肌损伤标志物，直观地表明notexin对大鼠腓肠肌造成严重损伤，而按摩器模拟丁氏滚动法可以减少肌肉损伤。这些为推拿治疗骨骼肌损伤的有效性提供了令人信服的证据。

在模仿丁氏滚动法对大鼠进行推拿时，应考虑几个必要的程序。在治疗之前，推拿操作员应提前接受培训，至少使用滚动按摩器 3 次，在压力传感器的帮助下调整挡板的角度以进行适当的力控制，并将推拿的频率控制在 140 卷/分钟。同时，用黑色头巾遮住老鼠的头，不要让老鼠过紧，以确保它们可以自由呼吸，以保持老鼠安静。如果老鼠突然难以在推拿过程中活跃起来，请等到它安静下来后再继续推拿。

这个实验的局限性在于，这种按摩器适用于大鼠，而不是较小的动物，如小鼠。对于大鼠以外的动物，可以更改某些仪器配置。如滚子的尺寸、挡板的角度、弹簧的强度，自然需要用压力传感器来测试滚动力。我们在这里只制作了一个模拟丁氏滚动法的推拿按摩器。然而，作为中医的非药物疗法，推、润、压、揉等推拿手法多种多样。所有这些操作都可以根据相关著名推拿大师的操作参数进行，以生产出更适合动物研究的仪器，使实验操作标准化，使实验结果更加准确可信。

综上所述，我们详细介绍了在动物实验中有效模拟丁氏滚动法的滚动按摩器的制造方法。该按摩器对大鼠骨骼肌损伤具有显著的治疗效果，为推拿标准化的进一步研究奠定了基础。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	JIANGXI FENGLIN	20220521
1.5 microtubes	Servicebio	EP-150X-J
15 mL centrifuge tube	Servicebio	EP-1501-J
30G needle	CONPUVON	220318
5 mL blood collection tube	Servicebio	QX0023
Acrylic handle	Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd	65643645
Adjustment splint	CREROMEM	20220729
Cotton Swab	INOHV	22080215
Enzyme-labeled Instrument	Rayto	RT-6100
Ethanol	INOHV	211106
Fork holder	Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd	JL001
Hair removal cream	Veet, France	LOTC190922002
Hematoxylin dyeing solution set	Wuhan Google Biotech	G1005
Imaging system	Nikon, Japan	Nikon DS-U3
IODOPHOR disfecting solution	Hale&Hearty	20221205
Light microscope	Nikon, Japan	Nikon Eclipse E100
Limit baffle	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
Pentobarbital sodium	Merck KGaA	P3761
Rat creatine kinase (CK) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35237
Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35730
Rubber roller	Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd	202207
Screw	Weiyan Hardware	B05Z122
Sprague Dawley rats	Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co.	SYXK2019-0009
Spring	Bingzhang Hardware	TH001
Surgical blade	Covetrus	#23
Weigh controller	Iyoys	HY-XSQ