Fremstilling af en enkeltcellesuspension fra musehalspulsårer til enkeltcellesekventering

Summary

Her beskriver vi en to-trins cellefordøjelsesprotokol til fremstilling af en enkeltcellesuspension af musehalspulsårer.

Abstract

Carotidarterier er store blodkar i nakken, der leverer blod og ilt til hjernen, men carotisstenose opstår, når halspulsårerne er tilstoppet af plak. Afsløring af den cellulære sammensætning af halspulsåren på enkeltcelleniveau er afgørende for behandling af carotis aterosklerose. Der er imidlertid ingen brugsklar protokol til fremstilling af enkeltcellesuspensioner fra halspulsårer. For at opnå en passende protokol til dissociation af normale halspulsårer på enkeltcelleniveau med mindre skade på celler, designede vi en to-trins fordøjelsesmetode ved at integrere fordøjelsesprocessen af collagenase/DNase og trypsin. Acridin orange / propidiumiodid (AO / PI) dobbeltfluorescenstælling blev brugt til at detektere cellelevedygtighed og koncentration, og det blev fundet, at enkeltcellesuspensionen opfyldte kravene til enkeltcellesekventering med levedygtigheden af celler over 85% og en høj cellekoncentration. Efter enkeltcelle databehandling blev der påvist en median på ~ 2500 transkripter pr. Celle i hver halspulsårecelle. Især var en række celletyper af den normale halspulsåre, herunder vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er), fibroblaster, endotelceller (EC'er) og makrofager og dendritiske celler (Mφ / DC'er), samtidig detekterbare. Denne protokol kan anvendes til fremstilling af en enkeltcellesuspension af blodkar fra andre væv med passende modifikationer.

Introduction

Åreforkalkning er en kronisk inflammatorisk sygdom forbundet med risikofaktorer som forhøjet blodtryk, hyperlipidæmi og hæmodynamik¹. Carotidarteriebifurkationer er tilbøjelige til hæmodynamiske ændringer og fører til dannelse af carotisplak. Den kliniske præsentation af carotis aterosklerose kan være akut såsom slagtilfælde og forbigående cerebral iskæmi eller kronisk såsom tilbagevendende forbigående cerebral iskæmi og vaskulær demens². Mekanisk er carotisplaque resultatet af interaktionen mellem forskellige karvægceller og forskellige blodlegemer under patologiske tilstande. Derfor er det særligt vigtigt at afsløre encelleatlaset af carotiskar under fysiologiske og patologiske tilstande for at forebygge og behandle udvikling af carotisplaque.

Enkeltcelle RNA-sekventering er en af de mest kraftfulde teknologier inden for biologisk forskning på grund af dens ultrahøje opløsning og påvisning af celleheterogenitet fra den samme celletype af organismer ^3,4. Forskere har brugt enkeltcelle RNA-sekventering til at udføre forskning på mange områder, såsom hjerte-kar-sygdomme⁵ og kræft⁶. Imidlertid er hurtig og præcis adskillelse af væv i enkeltceller stadig en af de største udfordringer. Enzymatisk dissociation er en almindeligt anvendt metode, der dominerende omfatter collagenase, papain, trypsin, DNase og hyaluronidase. Specifikt er collagenaser de vigtigste enzymarter til enkeltcellefordøjelse, hovedsageligt hydrolyserende kollagenkomponenter i bindevæv. Forskellige kollagenasetyper kan anvendes til dissociation af forskellige væv, såsom brystkirtlen⁷, glomerulus⁸, iridocorneal vinkel⁹, knæleddet 10, aorta¹¹ og lunge¹². På grund af de unikke fysiologiske egenskaber ved forskellige væv kan dissociation ved hjælp af samme metode forårsage mange problemer med at erhverve enkeltceller, såsom lav cellelevedygtighed, lavt celleantal og store celleaffald. Derfor er opfindelsen af fordøjelsesmetoder til forskellige væv afgørende for fremstilling af enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet.

Denne protokol sigter mod at udvikle en to-trins cellefordøjelsesmetode til fremstilling af en enkeltcellesuspension af halspulsåren hos vildtypemus. I henhold til halspulsårens egenskaber kombinerede vi collagenase/DNase med trypsin for at opnå en højkvalitets enkeltcellesuspension af musens halspulsåre, fordi collagenase kan hydrolysere kollagen af halsvævene, som blev yderligere fordøjet af trypsin til en enkeltcellesuspension. Acridin orange / propidiumiodid (AO / PI) dobbeltfluorescenstælling blev brugt til at detektere cellelevedygtighed og koncentration, og det blev fundet, at enkeltcellesuspensionen opfyldte kravene til enkeltcellesekventering med levedygtigheden af celler over 85% og en høj cellekoncentration. Efter enkeltcelle databehandling blev fire celletyper, herunder vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er), fibroblaster, endotelceller (EC'er) og makrofager og dendritiske celler (Mφ / DC'er), identificeret i normale musehalspulsårer efter fordøjelsen. Fordelene ved denne protokol er, at: 1) flere celletyper i halspulsåren kan identificeres, 2) cellelevedygtighed er velbevaret, og 3) det kan let gentages uden specielt udstyr. Denne protokol er velegnet til forskere, der er interesserede i at studere enkeltcelle multiomics af musens halspulsårer. Denne protokol kan også være nyttig i dissociation af andre blodkar med passende ændringer.

Protocol

Alle dyreforsøg, der er beskrevet nedenfor, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Soochow University.

1. Reagenser og materialeforberedelse

1. Brug 1x PBS uden calcium og magnesium og 2,5 U / ml heparinnatriumsalt til at forberede perfusionsopløsningen. Opbevares ved 4 °C og forkøles på is, når det anvendes.
2. Forbered dissociationsreagens A, der indeholder 125 CDU/ml collagenase II og 60 E/ml DNase I, ved at fortynde 1250 CDU/ml collagenase II og 3000 E/ml DNase I med HBSS. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
3. Forbered dissociationsreagens B, der indeholder en slutkoncentration på 0,12% trypsin ved at fortynde 1 ml 0,25% EDTA-frit trypsin (uden phenolrødt) til 1 ml 1x PBS. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
4. Forbered 10 ml 1,5% FBS og 10 ml 5% FBS i 1x PBS. Brug 1,5% FBS til at samle halspulsårer og holde på is før brug. Brug 5% FBS til at neutralisere fordøjelsen og opbevares ved stuetemperatur (RT).
5. Få de eksperimentelle materialer, herunder 1 ml sprøjter, 20 ml sprøjter med 26-G nåle, seks-brønds cellekulturplader, 1,5 ml centrifugerør, 40 μm sterile cellesier og isbeholdere.

2. Forberedelse af udstyr

1. Steriliser alt kirurgisk udstyr, herunder et stereoskopisk mikroskop, dissekering saks, mikrodissekerende saks og finspids tang.
2. Tænd for den automatiske celletæller, og vedligehold den på RT.
3. Tænd vandbadet til 37 °C på forhånd.
4. Forafkøl mikrocentrifugen til 4 °C før brug.

3. Isolering af musens halspulsåre

1. Bedøv musen ved hjælp af 1,25% tribromethanol ved intraperitoneal injektion (0,24 ml for hver 10 g kropsvægt) og vend musen for at kontrollere, om der er en oprettende refleks efter 3 min. Derefter aflives musen ved cervikal dislokation og læg den på ryggen. Spray musens hud med 75% alkohol.
2. Brug steriliseret dissekeringssaks til at åbne huden og udsætte brysthulen. Skær membranen op.
3. Fortsæt med at skære opad til underkæben og fjern forsigtigt overskydende bindevæv og fedt, udsætte halspulsåren.
4. Skær musens ringere vena cava for at få blodet til at strømme ud af den lukkede cirkulation.
5. Injicer 20 ml forkølet perfusionsopløsning langsomt og kontinuerligt i venstre ventrikel med en sprøjte.
   BEMÆRK: Hvis perfusion er vellykket, vil blodrige organer som lever, milt og nyrer blive gråhvide.
6. Skræl alt fedt og bindevæv omkring halspulsåren af med mikrodissekerende saks under et stereoskopisk mikroskop.
   BEMÆRK: Dette trin skal udføres langsomt og omhyggeligt for at forhindre beskadigelse af halspulsåren.
7. Isoler halspulsåren fra musen, vask med 1x PBS for at skylle blodet igen og overfør til seks-brøndplader indeholdende 1,5% FBS på is.

4. Fordøjelse af halspulsåren i enkeltcellesuspension

1. Brug mikrodissekerende saks til at dissekere halspulsåren i længderetningen og læg fladt i en anden 6-brønds cellekulturplade indeholdende 1 ml 1,5% FBS på is.
2. Skyl intima forsigtigt med 1,5% FBS for at fjerne det resterende blod.
   BEMÆRK: Skylning skal være blid og langsom for at undgå at skade endotelceller.
3. Skær hver halspulsåre i ca. 2 mm² vævsstykker ved hjælp af mikrodissekerende saks i 1,5% FBS.
4. Disse vævsstykker overføres til et 1,5 ml centrifugerør med 1 ml brede borespidser, centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C for at synke vævene til bunden.
5. Supernatanten kasseres, og vævene resuspenderes i 500 μl dissociationsreagens A.
6. Røret anbringes i et 37 °C vandbad i 1 time. Pipette forsigtigt med en 1 ml pipette hvert 10. minut.
7. Tilsæt 500 μL 5% FBS i røret og bland godt med en 1 ml pipette.
8. Cellesuspensionen filtreres gennem en 40 μm steril cellesi over i et nyt 1,5 ml centrifugeglas og centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
9. Supernatanten fjernes forsigtigt, og cellepellettet resuspenderes i 200 μl dissociationsreagens B.
10. Anbring i et 37 °C vandbad og fordøje i yderligere 5 minutter. Afpipetter forsigtigt hvert 2. minut under fordøjelsen for at adskille sig fuldstændigt i en enkeltcellesuspension.
11. Brug 200 μL 5% FBS til at afslutte fordøjelsesreaktionen, og centrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
12. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 100 μl 1x PBS på is.

5. Cellesuspensionsundersøgelse og enkeltcelle RNA-sekventering

1. Der tilsættes 10 μL AO/PI-opløsning i 10 μL enkeltcellesuspension og blandes forsigtigt med en 20 μL pipette.
2. Pipette 20 μL af blandingen ind i kammerobjektglasset og vent i 1 min.
3. Læg diaset i det automatiserede celletællerinstrument.
4. Vælg AO/PI-levedygtighedsanalysen , og vent derefter på kvalitetsrapporten.
5. Brug et enkeltcelle 3ʹ reagenssæt til at generere enkeltcellede gelperler i emulsionen på en enkeltcellecontroller og forstærke det stregkodede cDNA i en termisk cyklist efter producentens protokol.
   BEMÆRK: Her blev Chromium Single Cell 3ʹReagenssæt v3 brugt.
6. Udfør sekventering på en sequencer med en parringsstrategi på 150 bp (PE150). Brug et softwareprogram (Cell Ranger) til at konvertere rå basisopkaldsfiler til fastq-filer ved hjælp af mkfastq-pipelinen . Brug derefter Count Pipeline i Cell Ranger til at udføre justering, filtrering, stregkodetælling og UMI-optælling (unique molecular identifier) for at generere stregkodematricer¹³.
7. Udfør reduktion og visualisering af datadimensionalitet med R-pakken Seurat¹⁴.
   1. Først læser Read10X() -funktionen i Seurat outputtet fra Cell Ranger-pipelinen og bruger derefter tællematrixen til at oprette et Serat-objekt. Derefter filtreres cellerne ud med ekspression af <200 eller >4000 gener eller et mitokondrielt genforhold, der var mere end 10% af delmængden () af Seurat.
   2. Brug NormalizeData () og FindVariableFeatures() til at normalisere dataene og identificere henholdsvis 2000 meget variable funktioner.
   3. Udfør principal component analysis (PCA) på de skalerede data, og klynger cellerne med dims = 30 og opløsning = 0,5. Til sidst skal du bruge funktionen RunUMAP () til at visualisere enkeltcelledatasæt og FindAllMarkers() til at finde hver klyngebiomarkør.

Representative Results

Denne protokol beskriver en to-trins cellefordøjelsesmetode til fremstilling af en enkeltcellesuspension af musehalspulsårer (figur 1). Denne to-trins cellefordøjelsesmetode kombinerer collagenase/DNase med trypsin for effektivt at adskille musens karotidvaskulære væg for at opnå enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet til enkeltcellesekventering. Efter dissociation blev cellekoncentrationen og cellelevedygtigheden beregnet af en automatiseret celletæller. Det lyse felt viste morfologien af carotis vaskulære celler efter fordøjelse, og AOPI dual-fluorescensfarvning detekterede samtidig cellelevedygtighed (figur 2A, B). Især sammenlignet med anvendelse af dissociationsreagens A alene kan carotisarterievæv adskilles mere grundigt, når det kombineres med dissociationsreagens B. Vi fandt yderligere et levedygtigt celletal på ni arterier, og den gennemsnitlige cellediameter opfyldte kravene til enkeltcellesekventering efter totrins cellefordøjelse (figur 2C). I mellemtiden blev i alt 176.000 enkeltceller indsamlet fra ni venstre carotider, og de fleste vaskulære kar blev dissocieret i enkeltceller med høj levedygtighed (figur 2C).

Efter justering, filtrering, stregkodetælling og UMI-tælling blev rådataene for enkeltcellesekventering analyseret med R-pakken Seurat. Fordelingen af gener pr. celle, UMI pr. celle og mitokondrieaflæsninger pr. celle er vist i violinplots (figur 3A-C). Især blev en median på ~ 2500 transkripter pr. Celle detekteret i hver halspulsårecelle. Efter fjernelse af celler af lav kvalitet blev 14.580 celler detekteret og anvendt til nedstrøms enkeltcelle RNA-seq-analyse. Ved hjælp af 2000 variable gener med lignende profiler viste uovervåget Seurat-baseret klyngedannelse fire hovedcelletyper, herunder VSMC'er (74,0%), fibroblaster (16,5%), EC'er (6,5%) og Mφ / DC'er (3,0%) i normale musehalspulsårer efter fordøjelse (figur 3D-F).

Figur 1: Skematisk diagram over fordøjelsen af musehalspulsåren. Efter at musehalspulsåren blev isoleret og skåret, blev 500 μL dissociationsreagens A tilsat for at dissociere musens halspulsåre. Når cellesuspensionen blev filtreret og centrifugeret, blev 200 μL dissociationsreagens B tilsat til yderligere dissociation for at opnå en enkeltcellesuspension. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Enkeltcellesuspensionspræparat fra musehalspulsåren . (A) Cellemorfologien og cellelevedygtigheden af halspulsåreceller efter 1 times fordøjelse med dissociationsreagens A er vist i det lyse feltbillede og AOPI-farvning. Nukleerede celler farvet med grøn fluorescens er levende celler, mens de farvede med rød fluorescens er døde celler. Skalabjælke = 100 μm. (B) Cellemorfologien og cellelevedygtigheden af halspulsåreceller efter totrinscellefordøjelse vises i det lyse feltbillede og AOPI-farvning. Nukleerede celler farvet med grøn fluorescens er levende celler, mens de farvede med rød fluorescens er døde celler. Skalabjælke = 100 μm. (C) Cellelevedygtigheden, det samlede celletal, levedygtigt celletal og den gennemsnitlige cellediameter blev målt efter totrinscellefordøjelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Standard kvalitetskontrol (QC) metrics for scRNA-seq og cellelandskabet i halspulsåren . (A) Violinplots, der viser fordelingen af gener pr. celle (nFeature RNA), (B) UMI pr. celle (nCount_RNA) og (C) mitokondrielæsninger pr. celle (procent mt) for scRNA-seq-dataene. (D) UMAP-plot (Uniform manifold approximation and projection), der viser de fire identificerede celletyper i halspulsåren. (E) Prikplot, der viser markørerne, der definerer hver type celleklynge i panel D. Størrelsen af hver cirkel angiver celleandelen i gruppen, der udtrykker hvert transkript. De blå prikker angiver stærkt udtrykte gener, og de grå prikker angiver gener med lavt udtryk. (F) Stablet søjleplot, der viser den relative forekomst af de fire celletyper detekteret af scRNA-seq hos vildtypemus (WT). Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Her giver vi en detaljeret protokol til fremstilling af en højkvalitets enkeltcellesuspension fra halspulsåren hos vildtypemus, hvor en to-trins fordøjelsesmetode, der integrerer fordøjelsesprocessen af collagenase/DNase og trypsin, blev konstrueret. Efter kvalitetskontrollen af enkeltcellesuspensionen fandt vi, at den opfyldte kravene til enkeltcellesekventering med cellernes levedygtighed over 85% og en høj cellekoncentration. Desuden blev en række celletyper i halspulsåren, herunder VSMC'er, fibroblaster, EC'er og Mφ / DC'er, med succes påvist efter enkeltcelle databehandling.

Nuværende metoder til fremstilling af carotis enkeltcellesuspensioner er stadig knappe. Depuydt et al. opnåede en enkeltcellesuspension fra humane carotisplaques ved at kombinere collagenase, DNase, Human Albumin Fraction V og Flavopiridol ved 37 °C i 30 min¹⁵. Efter fluorescensaktiveret cellesortering identificerede de 14 forskellige cellepopulationer, herunder endotelceller, glatte muskelceller, mastceller, B-celler, myeloide celler og T-celler¹⁵. Desuden fordøjede forskere rotte almindelige halspulsårer ved hjælp af 0,25% trypsin-EDTA og 0,1% collagenase ved 37 ° C og udførte med succes enkeltcelle RNA-sekventering¹⁶. Fem celletyper, herunder VSMC'er, fibroblaster, EC'er, overgangsceller og makrofager, blev identificeret i både normale og eksperimentelle halspulsårer¹⁶. Derudover er der også udarbejdet en protokol til opnåelse af EF-berigede encellede præparater af halspulsåren¹⁷. Efter afslutning af luminal enzymatisk fordøjelse vil halspulsåreskylning opnå nok enkeltcellepellets til scRNAseq og scATACseq¹⁷. For fleksibelt at kontrollere fordøjelsestiden udviklede vi en to-trins fordøjelsesmetode til musehalspulsårer, der adskiller trinene i vævsdissociation og enkeltcellesuspensionspræparat. Processen starter med 125 CDU/ml collagenase II og 60 E/ml DNase I i 1 time, efterfulgt af EDTA-fri trypsin i 5 min. Det er vigtigt, at vi passende kan ændre ethvert trin i metoden til fordøjelse af andre blodkarvæv baseret på blodkarens egenskaber.

Der er nogle begrænsninger ved den beskrevne metode. For det første ved vi ikke, om denne metode kan bruges til primær cellekultur in vitro. Da halspulsårevæggen er tyndere og har færre celler, er det udfordrende at dyrke og udvide in vitro . For det andet, i modsætning til andre fordøjelsesmetoder, kræver denne protokol blid pipettering for at dissociere celler under fordøjelsen. Et rystende vandbad kan også resultere i en enkeltcellesuspension af god kvalitet. For det tredje, da vores metode kan anvendes til normale halspulsårer, skal det undersøges, om det er egnet til fordøjelse af carotisplaque.

Afslutningsvis designede vi en to-trins fordøjelsesmetode for at opnå en højkvalitets enkeltcellesuspension fra halspulsåren hos vildtypemus. Denne protokol kan bruges til at forberede enkeltcellesuspensioner til andre fartøjer med mindre ændringer, hvilket gør det meget nyttigt i kardiovaskulær forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C