Summary
यहाँ हम माउस मन्या धमनियों के एक एकल सेल निलंबन की तैयारी के लिए एक दो कदम सेल पाचन प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
कैरोटिड धमनियां गर्दन में प्रमुख रक्त वाहिकाएं होती हैं जो मस्तिष्क को रक्त और ऑक्सीजन की आपूर्ति करती हैं, लेकिन कैरोटिड स्टेनोसिस तब होता है जब कैरोटिड धमनियां पट्टिका से भरी होती हैं। एकल कोशिका स्तर पर मन्या धमनी के सेलुलर संरचना का खुलासा मन्या atherosclerosis के इलाज के लिए आवश्यक है. हालांकि, मन्या धमनियों से एकल सेल निलंबन की तैयारी के लिए कोई तैयार करने के लिए उपयोग प्रोटोकॉल नहीं है. कोशिकाओं को कम नुकसान के साथ एकल-कोशिका स्तर पर सामान्य कैरोटिड धमनियों के पृथक्करण के लिए एक उपयुक्त प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए, हमने कोलेजनेज/डीएनएएस और ट्रिप्सिन की पाचन प्रक्रिया को एकीकृत करके दो-चरणीय पाचन विधि तैयार की है। एक्रिडिन ऑरेंज/प्रोपिडियम आयोडाइड (एओ/पीआई) दोहरी प्रतिदीप्ति गिनती सेल व्यवहार्यता और एकाग्रता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और यह पाया गया कि एकल सेल निलंबन 85% से अधिक कोशिकाओं की व्यवहार्यता और एक उच्च सेल एकाग्रता के साथ, एकल सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यकताओं को संतुष्ट. एकल सेल डाटा प्रोसेसिंग के बाद, प्रत्येक मन्या धमनी सेल में प्रति सेल ~ 2500 टेप का एक औसत पाया गया. विशेष रूप से, सामान्य कैरोटिड धमनी के विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार, जिनमें संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (वीएसएमसी), फाइब्रोब्लास्ट्स, एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी), और मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाएं (एम φ / डीसी) शामिल हैं, समवर्ती रूप से पता लगाने योग्य थे। इस प्रोटोकॉल उचित संशोधनों के साथ अन्य ऊतकों से रक्त वाहिकाओं के एक एकल कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
एथेरोस्क्लेरोसिस एक पुरानी सूजन की बीमारी है जो उच्च रक्तचाप, हाइपरलिपिडिमिया और हेमोडायनामिक्स जैसे जोखिम कारकों सेजुड़ी है। कैरोटिड धमनी द्विभाजन हेमोडायनामिक परिवर्तनों से ग्रस्त हैं और कैरोटिड पट्टिका गठन की ओर ले जाते हैं। मन्या atherosclerosis के नैदानिक प्रस्तुति इस तरह के स्ट्रोक और क्षणिक मस्तिष्क ischemia के रूप में तीव्र हो सकता है, या आवर्तक क्षणिक मस्तिष्क ischemia और संवहनी मनोभ्रंश2 के रूप में पुरानी हो सकता है. यंत्रवत्, मन्या पट्टिका रोग स्थितियों के तहत विभिन्न पोत दीवार कोशिकाओं और विभिन्न रक्त कोशिकाओं के बीच बातचीत का परिणाम है। इसलिए, शारीरिक और रोग शर्तों के तहत मन्या जहाजों के एकल सेल एटलस का खुलासा मन्या पट्टिका विकास को रोकने और इलाज के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण जैविक अनुसंधान की सबसे शक्तिशाली प्रौद्योगिकियों में से एक है क्योंकि इसके अल्ट्राहाई रिज़ॉल्यूशन और एक ही सेल प्रकार के जीवों से सेल विषमता का पतालगाने के लिए 3,4. शोधकर्ताओं ने कई क्षेत्रों में अनुसंधान करने के लिए एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण का उपयोग किया है, जैसे हृदय रोग5 और कैंसर6। हालांकि, एकल कोशिकाओं में ऊतकों को जल्दी और सटीक रूप से अलग करना अभी भी मुख्य चुनौतियों में से एक है। एंजाइमेटिक पृथक्करण एक आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है जिसमें मुख्य रूप से कोलेजनेज, पपैन, ट्रिप्सिन, डीएनेज और हाइलूरोनिडेस शामिल हैं। विशेष रूप से, कोलेजेनेस एकल-कोशिका पाचन के लिए प्रमुख एंजाइम प्रजातियां हैं, मुख्य रूप से संयोजी ऊतकों में कोलेजन घटकों को हाइड्रोलाइज़ करना। विभिन्न कोलेजन प्रकार विभिन्न ऊतकों के पृथक्करण के लिए लागू होते हैं, जैसे स्तन ग्रंथि7, ग्लोमेरुलस8, इरिडोकोर्नियल कोण9, घुटने का जोड़ 10, महाधमनी11 और फेफड़े12। विभिन्न ऊतकों के अद्वितीय शारीरिक गुणों के कारण, एक ही विधि का उपयोग करके पृथक्करण एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने में कई परेशानी पैदा कर सकता है, जैसे कि कम सेल व्यवहार्यता, कम सेल नंबर और बड़े सेल मलबे। इसलिए, उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए विभिन्न ऊतकों के लिए पाचन विधियों का आविष्कार आवश्यक है।
इस प्रोटोकॉल जंगली प्रकार चूहों की मन्या धमनी के एक एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए एक दो कदम सेल पाचन विधि विकसित करना है. कैरोटिड धमनी की विशेषताओं के अनुसार, हमने माउस कैरोटिड धमनी के उच्च-गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए ट्रिप्सिन के साथ कोलेजनेज / डीएनएएस को जोड़ा क्योंकि कोलेजनेज कैरोटिड ऊतकों के कोलेजन को हाइड्रोलाइज कर सकता है, जिसे ट्रिप्सिन द्वारा एकल-कोशिका निलंबन में आगे पचाया गया था। एक्रिडिन ऑरेंज/प्रोपिडियम आयोडाइड (एओ/पीआई) दोहरी प्रतिदीप्ति गिनती सेल व्यवहार्यता और एकाग्रता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और यह पाया गया कि एकल सेल निलंबन 85% से अधिक कोशिकाओं की व्यवहार्यता और एक उच्च सेल एकाग्रता के साथ, एकल सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यकताओं को संतुष्ट. एकल-सेल डेटा प्रोसेसिंग के बाद, पाचन के बाद सामान्य माउस कैरोटिड धमनियों में संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (वीएसएमसी), फाइब्रोब्लास्ट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी), और मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाओं (एम φ / डीसी) सहित चार सेल प्रकारों की पहचान की गई थी। इस प्रोटोकॉल के फायदे हैं कि: 1) मन्या धमनी में कई सेल प्रकार की पहचान की जा सकती है, 2) सेल व्यवहार्यता अच्छी तरह से संरक्षित है, और 3) यह आसानी से विशेष उपकरणों के बिना दोहराया जा सकता है. यह प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है जो माउस कैरोटिड धमनियों के एकल-कोशिका मल्टीओमिक्स का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं। यह प्रोटोकॉल उचित संशोधनों के साथ अन्य रक्त वाहिकाओं के पृथक्करण में भी सहायक हो सकता है।
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Protocol
नीचे वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं को सूचो विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. अभिकर्मकों और सामग्री की तैयारी
- छिड़काव समाधान तैयार करने के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम और 2.5 यू / एमएल हेपरिन सोडियम नमक के बिना 1x पीबीएस का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और उपयोग किए जाने पर बर्फ पर प्रीकूल करें।
- हबीएसएस के साथ 1250 सीडीयू/एमएल कोलेजनेज II और 3000 यू/एमएल डीएनएएस I को पतला करके 1250 सीडीयू/एमएल कोलेजनेज II और 3000 यू/एमएल डीएनएएस I युक्त पृथक्करण अभिकर्मक ए तैयार करें। उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- पृथक्करण अभिकर्मक बी तैयार करें जिसमें 0.25% ईडीटीए-मुक्त ट्रिप्सिन (फिनोल लाल के बिना) के 1 एमएल को 1x पीबीएस के 1 एमएल में पतला करके 0.12% ट्रिप्सिन की अंतिम एकाग्रता होती है। उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 1.5% FBS के 10 एमएल और 1x पीबीएस में 5% FBS के 10 एमएल तैयार करें. कैरोटिड धमनियों को पूल करने के लिए 1.5% FBS का उपयोग करें और उपयोग करने से पहले बर्फ पर रखें। पाचन को बेअसर करने और कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करने के लिए 5% एफबीएस का उपयोग करें।
- प्रयोगात्मक सामग्री, 1 एमएल सीरिंज, 26 जी सुइयों के साथ 20 एमएल सीरिंज, छह अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटें, 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब, 40 माइक्रोन बाँझ सेल छलनी, और बर्फ कंटेनर सहित प्राप्त करें।
2. उपकरण तैयार करना
- एक त्रिविम माइक्रोस्कोप, विदारक कैंची, सूक्ष्म विदारक कैंची, और ठीक टिप संदंश सहित सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों, निष्फल बाँझ.
- स्वचालित सेल काउंटर चालू करें और इसे आरटी पर बनाए रखें।
- पहले से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पानी के स्नान पर बारी.
- उपयोग करने से पहले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रीकोल करें।
3. माउस कैरोटिड धमनी का अलगाव
- इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन (शरीर के वजन के प्रत्येक 10 ग्राम के लिए 0.24 एमएल) द्वारा 1.25% ट्राइब्रोमोथेनॉल का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें और माउस को फ्लिप करने के लिए जांचें कि क्या 3 मिनट के बाद एक सही पलटा है। फिर, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस euthanize और यह उसकी पीठ पर रखना. माउस की त्वचा को 75% अल्कोहल से स्प्रे करें।
- त्वचा को खोलने और छाती गुहा को उजागर करने के लिए निष्फल विदारक कैंची का प्रयोग करें। डायाफ्राम को काटें।
- निचले जबड़े को ऊपर की ओर काटने जारी रखें और ध्यान से अतिरिक्त संयोजी ऊतकों और वसा को हटा दें, मन्या धमनी को उजागर.
- बंद परिसंचरण से बाहर रक्त प्रवाह बनाने के लिए माउस के अवर वेना कावा में कटौती.
- धीरे-धीरे और लगातार एक सिरिंज के साथ बाएं वेंट्रिकल में प्रीचिल्ड परफ्यूजन समाधान के 20 एमएल इंजेक्ट करें।
नोट: छिड़काव सफल है, तो यकृत, प्लीहा और गुर्दे जैसे रक्त युक्त अंग ग्रे-सफेद हो जाएंगे। - एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत सूक्ष्म विदारक कैंची के साथ मन्या धमनी के आसपास सभी वसा और संयोजी ऊतकों को छीलें।
नोट: कैरोटिड धमनी को नुकसान को रोकने के लिए यह कदम धीरे-धीरे और सावधानी से किया जाना चाहिए। - माउस से मन्या धमनी को अलग करें, रक्त को फिर से फ्लश करने के लिए 1x पीबीएस के साथ धोएं, और बर्फ पर 1.5% एफबीएस युक्त छह-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करें।
4. एकल कोशिका निलंबन में मन्या धमनी के पाचन
- कैरोटिड धमनी अनुदैर्ध्य काटना और बर्फ पर 1.5% FBS के 1 एमएल युक्त एक और 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में फ्लैट रखना करने के लिए सूक्ष्म विदारक कैंची का प्रयोग करें.
- अवशिष्ट रक्त को हटाने के लिए 1.5% FBS के साथ इंटिमा को सावधानी से फ्लश करें।
नोट: एंडोथेलियल कोशिकाओं को घायल करने से बचने के लिए फ्लशिंग कोमल और धीमी होनी चाहिए। - 1.5% FBS में microdissecting कैंची का उपयोग कर लगभग 2 मिमी2 ऊतक टुकड़े में प्रत्येक मन्या धमनी कटौती.
- इन ऊतक टुकड़ों को 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1 एमएल चौड़ी बोर युक्तियों के साथ स्थानांतरित करें, ऊतकों को नीचे तक डुबोने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पृथक्करण अभिकर्मक ए के 500 माइक्रोन में ऊतकों को फिर से निलंबित करें।
- ट्यूब को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। पिपेट धीरे एक 1 एमएल विंदुक हर 10 मिनट के साथ.
- ट्यूब में 5% एफबीएस के 500 माइक्रोन जोड़ें और 1 एमएल विंदुक के साथ अच्छी तरह मिलाएं।
- एक 40 माइक्रोन बाँझ सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन को एक नई 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
- सतह पर तैरनेवाला ध्यान से निकालें और पृथक्करण अभिकर्मक बी के 200 माइक्रोन में सेल गोली resuspended
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें और एक और 5 मिनट के लिए पचाने. धीरे पाचन के दौरान हर 2 मिनट विंदुक पूरी तरह से एक एकल कोशिका निलंबन में अलग करने के लिए.
- पाचन प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए 5% एफबीएस के 200 माइक्रोन का उपयोग करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बर्फ पर 1x पीबीएस के 100 माइक्रोन में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
5. सेल निलंबन परीक्षा और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण
- एकल सेल निलंबन के 10 माइक्रोन में एओ/पीआई समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें और धीरे से 20 माइक्रोन पिपेट के साथ मिलाएं।
- कक्ष स्लाइड में मिश्रण के पिपेट 20 माइक्रोन और 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
- स्लाइड को स्वचालित सेल काउंटर इंस्ट्रूमेंट में लोड करें।
- AO/PI व्यवहार्यता परख का चयन करें, फिर गुणवत्ता रिपोर्ट की प्रतीक्षा करें।
- एक एकल सेल नियंत्रक पर पायस में एकल सेल जेल मोती उत्पन्न करने के लिए एक एकल सेल 3ʹ अभिकर्मक किट का प्रयोग करें और निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक थर्मल साइक्लर में बारकोडेड सीडीएनए बढ़ाना.
नोट: यहां, क्रोमियम सिंगल सेल 3ʹअभिकर्मक किट v3 का उपयोग किया गया था। - एक युग्मित अंत 150 बीपी (PE150) पढ़ने की रणनीति के साथ एक sequencer पर अनुक्रमण प्रदर्शन. mkfastq पाइपलाइन का उपयोग करके कच्चे बेस कॉल फ़ाइलों को fastq फ़ाइलों में बदलने के लिए एक सॉफ़्टवेयर एप्लिकेशन (सेल रेंजर) का उपयोग करें। फिर, सुविधा बारकोड matrices13 उत्पन्न करने के लिए संरेखण, फ़िल्टरिंग, बारकोड गिनती, और अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMI) गिनती प्रदर्शन करने के लिए सेल रेंजर की गणना पाइपलाइन का उपयोग करें.
- आर पैकेज Seurat14 के साथ डेटा आयामीता में कमी और दृश्य प्रदर्शन करें।
- सबसे पहले, Seurat का Read10X() फ़ंक्शन सेल रेंजर पाइपलाइन के आउटपुट में पढ़ता है और फिर Seurat ऑब्जेक्ट बनाने के लिए काउंट मैट्रिक्स का उपयोग करता है। फिर, <200 या >4000 जीन या माइटोकॉन्ड्रियल जीन अनुपात की अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं को फ़िल्टर करें जो सेरात के सबसेट () फ़ंक्शन द्वारा 10% से अधिक था।
- डेटा को सामान्य करने और क्रमशः 2000 अत्यधिक परिवर्तनशील सुविधाओं की पहचान करने के लिए NormalizeData () और FindVariableFeatures() का उपयोग करें।
- स्केल किए गए डेटा पर प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (पीसीए) करें, और कोशिकाओं को डिम्स = 30 और रिज़ॉल्यूशन = 0.5 के साथ क्लस्टर करें। अंत में, प्रत्येक क्लस्टर बायोमार्कर को खोजने के लिए एकल-कक्ष डेटासेट और FindAllMarkers() को विज़ुअलाइज़ करने के लिए RunUMAP() फ़ंक्शन का उपयोग करें।
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Representative Results
यह प्रोटोकॉल माउस मन्या धमनियों(चित्रा 1)के एक एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए एक दो कदम सेल पाचन विधि का वर्णन करता है. यह दो-चरण सेल पाचन विधि कोलेजनेज/डीएनएएस को ट्रिप्सिन के साथ जोड़ती है ताकि एकल-कोशिका अनुक्रमण के लिए उच्च-गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए माउस कैरोटिड संवहनी दीवार को प्रभावी ढंग से अलग किया जा सके। पृथक्करण के बाद, सेल एकाग्रता और सेल व्यवहार्यता की गणना एक स्वचालित सेल काउंटर द्वारा की गई थी। उज्ज्वल क्षेत्र ने पाचन के बाद कैरोटिड संवहनी कोशिकाओं की आकृति विज्ञान दिखाया, और एओपीआई दोहरे प्रतिदीप्ति धुंधला एक साथ सेल व्यवहार्यता(चित्रा 2ए,बी)का पता लगाया। विशेष रूप से, पृथक्करण अभिकर्मक ए अकेले का उपयोग करने की तुलना में, पृथक्करण अभिकर्मक बी के साथ संयुक्त होने पर कैरोटिड धमनी ऊतक को अधिक अच्छी तरह से अलग किया जा सकता है। हम आगे नौ धमनियों की एक व्यवहार्य सेल गिनती पाया, और औसत सेल व्यास दो कदम सेल पाचन (चित्रा 2C) के बाद एकल कोशिका अनुक्रमण की आवश्यकताओं को संतुष्ट. इस बीच, कुल 176,000 एकल कोशिकाओं को नौ बाएं कैरोटिड्स से एकत्र किया गया था, और अधिकांश संवहनी वाहिकाओं को उच्च व्यवहार्यता(चित्रा 2सी)के साथ एकल कोशिकाओं में अलग कर दिया गया था।
संरेखण, फ़िल्टरिंग, बारकोड गिनती, और यूएमआई गिनती के बाद, एकल सेल अनुक्रमण के कच्चे डेटा आर पैकेज Seurat के साथ विश्लेषण किया गया. प्रति सेल जीन का वितरण, प्रति सेल यूएमआई, और प्रति सेल माइटोकॉन्ड्रियल रीड वायलिन भूखंडों (चित्रा 3ए-सी) में दिखाए जाते हैं। विशेष रूप से, प्रत्येक कैरोटिड धमनी कोशिका में प्रति सेल ~ 2500 प्रतिलेखों का एक माध्यिका पाया गया था। निम्न-गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को हटाने के बाद, 14,580 कोशिकाओं का पता लगाया गया और डाउनस्ट्रीम सिंगल-सेल आरएनए-सीक्यू विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया। समान प्रोफाइल के साथ 2000 चर जीन का उपयोग करते हुए, असुरक्षित सेरात-आधारित क्लस्टरिंग ने वीएसएमसी (74.0%), फाइब्रोब्लास्ट्स (16.5%), ईसी (6.5%), और एमφ/डीसी (3.0%) सहित चार मुख्य सेल प्रकार दिखाए, पाचन के बाद सामान्य माउस कैरोटिड धमनियों में (चित्र 3 डी-एफ)।
चित्रा 1: माउस मन्या धमनी पाचन के योजनाबद्ध आरेख. माउस मन्या धमनी अलग और कटौती की गई थी के बाद, हदफ्छ्जी अभिकर्मक के 500 माइक्रोन माउस मन्या धमनी अलग करने के लिए जोड़ा गया था. जब सेल निलंबन को फ़िल्टर किया गया और अपकेंद्रित्र किया गया, तो एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए आगे पृथक्करण अभिकर्मक बी के 200 माइक्रोन को जोड़ा गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: माउस मन्या धमनी से एकल सेल निलंबन तैयारी. (ए) पृथक्करण अभिकर्मक ए के साथ 1 एच पाचन के बाद कैरोटिड धमनी कोशिकाओं की कोशिका आकृति विज्ञान और सेल व्यवहार्यता उज्ज्वल क्षेत्र दृश्य और एओपीआई धुंधला में दिखाई जाती है। हरे रंग की प्रतिदीप्ति से सना हुआ न्यूक्लियेटेड कोशिकाएं जीवित कोशिकाएं हैं, जबकि लाल प्रतिदीप्ति से सना हुआ मृत कोशिकाएं हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी) सेल आकृति विज्ञान और दो कदम सेल पाचन के बाद मन्या धमनी कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता उज्ज्वल क्षेत्र दृश्य और एओपीआई धुंधला में दिखाया गया है. हरे रंग की प्रतिदीप्ति से सना हुआ न्यूक्लियेटेड कोशिकाएं जीवित कोशिकाएं हैं, जबकि लाल प्रतिदीप्ति से सना हुआ मृत कोशिकाएं हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (सी) सेल व्यवहार्यता, कुल सेल गिनती, व्यवहार्य सेल गिनती, और औसत सेल व्यास दो कदम सेल पाचन के बाद मापा गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: मानक गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) स्आरएनए-सीक्यू और मन्या धमनी के सेल परिदृश्य के लिए मेट्रिक्स । (ए) वायलिन भूखंड प्रति सेल जीन का वितरण दिखा रहा है (nFeature आरएनए), (बी) यूएमआई प्रति सेल (nCount_RNA), और (सी) माइटोकॉन्ड्रियल प्रति सेल (प्रतिशत एमटी) स्आरएनए-सीक्यू डेटा के लिए पढ़ता है। (डी) समान कई गुना सन्निकटन और प्रक्षेपण (यूएमएपी) साजिश कैरोटिड धमनी के चार पहचान सेल प्रकार दिखा रहा है। (ई) डॉट प्लॉट पैनल डी में प्रत्येक प्रकार के सेल क्लस्टर को परिभाषित करने वाले मार्करों को दिखा रहा है। प्रत्येक वृत्त का आकार प्रत्येक प्रतिलेख को व्यक्त करने वाले समूह के भीतर कोशिका अनुपात को दर्शाता है। नीले डॉट्स अत्यधिक व्यक्त जीन को इंगित करते हैं और ग्रे डॉट्स कम अभिव्यक्ति वाले जीन को इंगित करते हैं। (एफ) जंगली प्रकार चूहों (डब्ल्यूटी) के scRNA-seq द्वारा पता लगाया चार सेल प्रकार के रिश्तेदार बहुतायत प्रदर्शित खड़ी बार साजिश. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहां हम जंगली प्रकार के चूहों की कैरोटिड धमनी से उच्च गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसमें कोलेजनेज/डीएनएएस और ट्रिप्सिन की पाचन प्रक्रिया को एकीकृत करने वाली दो-चरणीय पाचन विधि का निर्माण किया गया था। सिंगल-सेल सस्पेंशन की गुणवत्ता जांच के बाद, हमने पाया कि यह सिंगल-सेल सीक्वेंसिंग की आवश्यकताओं को पूरा करता है, जिसमें 85% से अधिक कोशिकाओं की व्यवहार्यता और उच्च सेल एकाग्रता है। इसके अलावा, कैरोटिड धमनी में विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार, जिनमें वीएसएमसी, फाइब्रोब्लास्ट्स, ईसी और एम φ / डीसी शामिल हैं, एकल-सेल डेटा प्रोसेसिंग के बाद सफलतापूर्वक पता लगाया गया था।
मन्या एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए वर्तमान तरीकों अभी भी दुर्लभ हैं. Depuydt एट अल कोलेजनेज, DNase, मानव एल्ब्यूमिन अंश वी, और Flavopiridol 30 मिनट15 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संयोजन से मानव मन्या सजीले टुकड़े से एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त किया. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई के बाद, वे endothelial कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, माइलॉयड कोशिकाओं, और टी कोशिकाओं15 सहित 14 अलग सेल आबादी की पहचान की. इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए और 0.1% कोलेजनेज का उपयोग करके चूहे आम कैरोटिड धमनियों को पचाया और सफलतापूर्वक एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण16 का प्रदर्शन किया। वीएसएमसी, फाइब्रोब्लास्ट्स, ईसी, संक्रमणकालीन कोशिकाओं और मैक्रोफेज सहित पांच सेल प्रकार, सामान्य और प्रयोगात्मक मन्या धमनियों16 दोनों में पहचाने गए थे। इसके अलावा, मन्या धमनी के ईसी समृद्ध एकल सेल तैयारी प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी17 स्थापित किया गया है. ल्यूमिनल एंजाइमेटिक पाचन को पूरा करने के बाद, कैरोटिड धमनी फ्लशिंग scRNAseq और scATACseq17 के लिए पर्याप्त एकल कोशिका छर्रों प्राप्त होगा. पाचन समय को लचीले ढंग से नियंत्रित करने के लिए, हमने माउस कैरोटिड धमनियों के लिए दो-चरणीय पाचन विधि विकसित की, ऊतक पृथक्करण और एकल-कोशिका निलंबन तैयारी के चरणों को अलग किया। प्रक्रिया 1 घंटे के लिए 125 सीडीयू/एमएल कोलेजनेज II और 60 यू/एमएल डीएनएएस I से शुरू होती है, इसके बाद 5 मिनट के लिए ईडीटीए-फ्री ट्रिप्सिन होता है। गौरतलब है कि हम रक्त वाहिकाओं की विशेषताओं के आधार पर अन्य रक्त वाहिका ऊतकों के पाचन के लिए विधि के किसी भी चरण को उचित रूप से संशोधित कर सकते हैं।
वर्णित विधि की कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, हम नहीं जानते कि इस विधि इन विट्रो में प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या है. चूंकि कैरोटिड धमनी की दीवार पतली होती है और इसमें कम कोशिकाएं होती हैं, इसलिए इन विट्रो में संस्कृति और विस्तार कैसे करना चुनौतीपूर्ण है। दूसरा, अन्य पाचन विधियों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल को पाचन के दौरान कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोमल पाइपिंग की आवश्यकता होती है। एक मिलाते हुए पानी के स्नान के परिणामस्वरूप एक अच्छी गुणवत्ता वाला एकल-कोशिका निलंबन भी हो सकता है। तीसरा, चूंकि हमारी विधि सामान्य कैरोटिड धमनियों पर लागू होती है, चाहे वह कैरोटिड पट्टिका के पाचन के लिए उपयुक्त हो, इसका अध्ययन किया जाना बाकी है।
अंत में, हमने जंगली प्रकार के चूहों की कैरोटिड धमनी से उच्च गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए दो-चरणीय पाचन विधि तैयार की है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग मामूली संशोधनों के साथ अन्य जहाजों के लिए एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए किया जा सकता है, जिससे यह हृदय अनुसंधान में बहुत मददगार हो जाता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82070450 से सीटी और 82170466 से एलजेड) और चीन पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (7121102223 से एफएल) की फैलोशिप से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
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