Summary
在这里，我们描述了一种两步细胞消化方案，用于制备小鼠颈动脉的单细胞悬浮液。
Abstract
颈动脉是颈部的主要血管，为大脑提供血液和氧气，但当颈动脉被斑块堵塞时，就会发生颈动脉狭窄。在单细胞水平上揭示颈动脉的细胞组成对于治疗颈动脉粥样硬化至关重要。然而，目前尚无现成的方案用于制备颈动脉单细胞悬浮液。为了获得在单细胞水平上解离正常颈动脉且对细胞损伤较小的合适方案，我们设计了一种两步消化方法，通过整合胶原酶/DNase 和胰蛋白酶的消化过程。采用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）双荧光计数检测细胞活力和浓度，发现单细胞悬液满足单细胞测序要求，细胞活力超过85%，细胞浓度高。单细胞数据处理后，在每个颈动脉细胞中检测到每个细胞的中位数~2500个转录本。值得注意的是，可同时检测到正常颈动脉的多种细胞类型，包括血管平滑肌细胞 （VSMC）、成纤维细胞、内皮细胞 （EC） 以及巨噬细胞和树突状细胞 （Mφ/DC）。该方案可用于制备具有适当修饰的来自其他组织的血管的单细胞悬浮液。
Introduction
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，与高血压、高脂血症和血流动力学等危险因素有关1。颈动脉分叉容易发生血流动力学改变，导致颈动脉斑块形成。颈动脉粥样硬化的临床表现可以是急性的，如卒中和短暂性脑缺血，也可以是慢性的，如复发性短暂性脑缺血和血管性痴呆2。从机械上讲，颈动脉斑块是病理条件下不同血管壁细胞与各种血细胞相互作用的结果。因此，揭示生理和病理条件下的颈动脉血管单细胞图谱对于预防和治疗颈动脉斑块的发展尤为重要。
单细胞 RNA 测序是生物学研究中最强大的技术之一，因为它具有超高分辨率和检测来自相同细胞类型生物体的细胞异质性 3,4。研究人员使用单细胞RNA测序在许多领域进行研究，例如心血管疾病5和癌症6。然而，快速准确地将组织分离成单细胞仍然是主要挑战之一。酶解离是一种常用的方法，主要包括胶原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、DNase 和透明质酸酶。具体来说，胶原酶是单细胞消化的主要酶种，主要水解结缔组织中的胶原成分。不同的胶原酶类型适用于不同组织的解离，如乳腺7、肾小球8、虹膜角角9、膝关节10、主动脉11、肺12。由于不同组织独特的生理特性，使用相同的方法解离可能会在获取单个细胞时造成许多麻烦，例如细胞活力低、细胞数量少、细胞碎片大等。因此，针对不同组织的消化方法的发明对于制备高质量的单细胞悬浮液至关重要。
该方案旨在开发一种两步细胞消化方法，以制备野生型小鼠颈动脉的单细胞悬浮液。根据颈动脉的特点，我们将胶原酶/DNase与胰蛋白酶联合使用，以获得高质量的小鼠颈动脉单细胞悬液，因为胶原酶可以水解颈动脉组织的胶原蛋白，颈动脉组织被胰蛋白酶进一步消化成单细胞悬浮液。采用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）双荧光计数检测细胞活力和浓度，发现单细胞悬液满足单细胞测序要求，细胞活力超过85%，细胞浓度高。经过单细胞数据处理，在消化后的正常小鼠颈动脉中鉴定出血管平滑肌细胞（VSMCs）、成纤维细胞、内皮细胞（ECs）和巨噬细胞和树突状细胞（Mφ/DCs）等4种细胞类型。该协议的优点是：1）可以识别颈动脉中的多种细胞类型，2）细胞活力保存良好，3）无需特殊设备即可轻松重复。该协议适用于有兴趣研究小鼠颈动脉单细胞多组学的研究人员。该方案还可能有助于通过适当的修改解离其他血管。
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Protocol
以下所有动物程序均由苏州大学机构动物护理和使用委员会批准。
1.试剂和材料准备
- 利用不含钙和镁的 1x PBS 和 2.5 U/mL 肝素钠盐制备灌注溶液。储存在4°C，使用时在冰上预冷。
- 用HBSS稀释1250CDU/mL胶原酶II和3000U/mL DNase I，制备含有125 CDU/mL胶原酶II和60U/mL DNase I的解离试剂A。储存在4°C直至使用。
- 通过将 1 mL 不含 EDTA 的胰蛋白酶（不含酚红）稀释到 1 mL 的 1x PBS 中，制备含有终浓度为 0.12% 胰蛋白酶的解离试剂 B。储存在4°C直至使用。
- 在 1x PBS 中制备 10 mL 的 1.5% FBS 和 10 mL 的 5% FBS。使用1.5%FBS汇集颈动脉，并在使用前保持冰敷。使用5%FBS中和消化并在室温（RT）下储存。
- 获取实验材料，包括 1 mL 注射器、20 mL 注射器和 26-G 针头、六孔细胞培养板、1.5 mL 离心管、40 μm 无菌细胞过滤器和冰容器。
2、设备准备
- 对所有手术设备进行消毒，包括立体显微镜、解剖剪刀、显微解剖剪刀和细尖镊子。
- 打开自动细胞计数仪并将其保持在室温。
- 提前将水浴打开至37°C。
- 使用前将微量离心机预冷至4°C。
3.小鼠颈动脉的隔离
- 通过腹膜内注射（每10g体重0.24mL）使用1.25%三溴乙醇麻醉小鼠，并在3分钟后翻转鼠标以检查是否有矫正反射。然后，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并将其仰卧。用75%的酒精喷洒小鼠的皮肤。
- 使用消毒的解剖剪刀打开皮肤并露出胸腔。切开隔膜。
- 继续向上切割至下颌，小心地去除多余的结缔组织和脂肪，露出颈动脉。
- 切开小鼠的下腔静脉，使血液从闭合循环中流出。
- 用注射器缓慢连续地将 20 mL 预冷灌注溶液注入左心室。
注意：如果灌注成功，肝脏、脾脏和肾脏等富含血液的器官将变成灰白色。 - 在立体显微镜下用显微解剖剪刀剥离颈动脉周围的所有脂肪和结缔组织。
注意：此步骤应缓慢而小心地进行，以防止颈动脉受损。 - 从小鼠中分离颈动脉，用1x PBS洗涤以再次冲洗血液，并在冰上转移到含有1.5%FBS的六孔板中。
4.将颈动脉消化成单细胞悬液
- 使用显微解剖剪刀纵向解剖颈动脉，并平放在另一个含有 1 mL 1.5% FBS 的 6 孔细胞培养板中。
- 用 1.5% FBS 小心冲洗内膜以去除残留的血液。
注意：冲洗应轻柔缓慢，以免损伤内皮细胞。 - 使用显微解剖剪刀在1.5%FBS中将每条颈动脉切成约2mm2 组织块。
- 将这些组织块转移到具有1mL宽孔尖端的1.5mL离心管中，在4°C下以400× g 离心5分钟以将组织沉入底部。
- 弃去上清液并将组织重悬于500μL解离试剂A中。
- 将试管置于37°C水浴中1小时。每 10 分钟用 1 mL 移液管轻轻移液。
- 向试管中加入 500 μL 5% FBS，并用 1 mL 移液管充分混合。
- 将细胞悬液通过40μm无菌细胞过滤器过滤到新的1.5mL离心管中，并在4°C下以400× g 离心5分钟。
- 小心地取出上清液，将细胞沉淀重悬于200μL解离试剂B中。
- 置于37°C水浴中，再消化5分钟。在消化过程中每 2 分钟轻轻移液一次，以完全解离成单细胞悬浮液。
- 使用200μL的5%FBS终止消化反应，并在4°C下以400× g 离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于冰上的100μL1x PBS中。
5. 细胞悬液检查和单细胞RNA测序
- 将 10 μL AO/PI 溶液加入 10 μL 单细胞悬浮液中，并用 20 μL 移液管轻轻混合。
- 将 20 μL 混合物移入腔室载玻片中并等待 1 分钟。
- 将载玻片装入自动细胞计数仪中。
- 选择 AO/PI 活力 检测，然后等待质量报告。
- 使用单细胞 3ʹ 试剂盒在单细胞控制器上的乳液中生成单细胞凝胶微球，并按照制造商的方案在热循环仪中扩增带条形码的 cDNA。
注：这里使用的是 Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3。 - 在具有双端 150 bp （PE150） 读数策略的测序仪上进行测序。使用软件应用程序 （Cell Ranger） 使用 mkfastq 管道将原始碱基调用文件转换为 fastq 文件。然后，使用 Cell Ranger 的 Count Pipeline 进行比对、过滤、条形码计数和唯一分子标识符 （UMI） 计数，以生成特征条形码矩阵13。
- 使用 R 包 Seurat14 执行数据降维和可视化。
- 首先，Seurat 的 Read10X（） 函数读取 Cell Ranger 管道的输出，然后使用计数矩阵创建 Seurat 对象。然后，通过修拉 的subset（） 函数过滤出表达<200或>4000个基因或线粒体基因比例超过10%的细胞。
- 使用 NormalizeData （） 和 FindVariableFeatures（） 分别对数据进行归一化并识别 2000 个高度可变的特征。
- 对缩放数据执行主成分分析 （PCA），并使用 dims = 30 和分辨率 = 0.5 对像元进行聚类。最后，使用 RunUMAP （） 函数可视化单细胞数据集，使用 FindAllMarkers（） 查找每个簇生物标志物。
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Representative Results
该方案描述了一种用于制备小鼠颈动脉单细胞悬浮液的两步细胞消化方法（图1）。这种两步细胞消化方法将胶原酶/DNase与胰蛋白酶相结合，可有效解离小鼠颈动脉血管壁，获得用于单细胞测序的高质量单细胞悬液。解离后，通过自动细胞计数仪计算细胞浓度和细胞活力。明场显示消化后颈动脉血管细胞的形态，AOPI双荧光染色同时检测细胞活力（图2A，B）。值得注意的是，与单独使用解离试剂A相比，与解离试剂B联合使用时，颈动脉组织可以更彻底地解离。我们进一步发现了九条动脉的活细胞计数，平均细胞直径满足两步细胞消化后单细胞测序的要求（图2C）。同时，从9个左颈动脉中共收集了176,000个单细胞，大多数血管解离成具有高活力的单细胞（图2C）。
经过比对、过滤、条形码计数和UMI计数后，使用R包Seurat分析单细胞测序的原始数据。每个细胞的基因分布，每个细胞的UMI和每个细胞的线粒体读数显示在小提琴图中（图3A-C）。值得注意的是，在每个颈动脉细胞中检测到每个细胞的中位数为 ~2500 个转录本。去除低质量细胞后，检测到 14,580 个细胞并用于下游单细胞 RNA-seq 分析。使用2000个具有相似特征的可变基因，基于Seurat的无监督聚类显示四种主要细胞类型，包括VSMC（74.0%），成纤维细胞（16.5%），ECs（6.5%）和Mφ / DCs（3.0%），消化后的正常小鼠颈动脉（图3D-F）。
图1：小鼠颈动脉消化示意图。 分离切割小鼠颈动脉后，加入500 μL解离试剂A，使小鼠颈动脉解离。过滤细胞悬液并离心时，加入200 μL解离试剂B进一步解离，得到单细胞悬液。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：小鼠颈动脉的单细胞悬浮液制备 。 （A）用解离试剂A消化1 h后颈动脉细胞的细胞形态和细胞活力显示在明视野视图和AOPI染色中。用绿色荧光染色的有核细胞是活细胞，而用红色荧光染色的有核细胞是死细胞。比例尺 = 100 μm。 （B）两步细胞消化后颈动脉细胞的细胞形态和细胞活力显示在明视野视图和AOPI染色中。用绿色荧光染色的有核细胞是活细胞，而用红色荧光染色的有核细胞是死细胞。比例尺 = 100 μm。 （C） 两步细胞消化后测量细胞活力、总细胞计数、活细胞计数和平均细胞直径。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：scRNA-seq 和颈动脉细胞景观的标准质量控制 （QC） 指标。 （A） 小提琴图显示 scRNA-seq 数据的每个细胞 （nFeature RNA）、（B） 每个细胞的 UMI （nCount_RNA） 和 （C） 每个细胞的线粒体读数 （% mt）。（D） 显示颈动脉四种已识别细胞类型的均匀流形近似和投影 （UMAP） 图。（E） 点图显示了图 D 中定义每种类型细胞簇的标记。每个圆圈的大小表示表达每个转录本的组内的细胞比例。蓝点表示高表达基因，灰点表示低表达基因。（F） 堆叠条形图显示野生型小鼠 （WT） scRNA-seq 检测到的四种细胞类型的相对丰度。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里，我们提供了从野生型小鼠颈动脉制备高质量单细胞悬浮液的详细方案，其中构建了一种整合胶原酶/ DNase和胰蛋白酶消化过程的两步消化方法。经过对单细胞悬液的质量检查，我们发现它满足了单细胞测序的要求，细胞活力超过85%，细胞浓度高。此外，经过单细胞数据处理，成功检测到颈动脉中的多种细胞类型，包括VSMCs、成纤维细胞、ECs和Mφ/DCs。
目前制备颈动脉单细胞悬液的方法仍然很少。Depuydt等人通过在37°C下将胶原酶，DNase，人白蛋白组分V和Flavopiridol在37°C下混合30分钟15，从人颈动脉斑块中获得单细胞悬浮液。经过荧光激活的细胞分选，他们鉴定了14个不同的细胞群，包括内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、B细胞、骨髓细胞和T细胞15。此外，研究人员在37°C下使用0.25%胰蛋白酶-EDTA和0.1%胶原酶消化大鼠颈总动脉，并成功进行了单细胞RNA测序16。在正常和实验性颈动脉中鉴定出五种细胞类型，包括 VSMC、成纤维细胞、EC、移行细胞和巨噬细胞16。此外，还建立了获得颈动脉富集EC单细胞制剂的方案17。完成管腔酶消化后，颈动脉冲洗将获得足够的单细胞沉淀用于 scRNAseq 和 scATACseq17。为了灵活控制消化时间，我们开发了一种小鼠颈动脉两步消化方法，将组织解离和单细胞悬浮液制备的步骤分开。该过程以 125 CDU/mL 胶原酶 II 和 60 U/mL DNase I 开始 1 小时，然后用不含 EDTA 的胰蛋白酶 5 分钟。重要的是，我们可以根据血管的特性适当地修改消化其他血管组织的方法的任何步骤。
所描述的方法存在一些局限性。首先，我们不知道这种方法是否可以用于 体外原代细胞培养。由于颈动脉壁较薄且细胞较少，因此如何在 体外 培养和扩增具有挑战性。其次，与其他消化方法不同，该方案需要温和的移液以在消化过程中解离细胞。摇动水浴也可能产生高质量的单细胞悬浮液。第三，由于我们的方法适用于正常的颈动脉，因此是否适合消化颈动脉斑块还有待研究。
总之，我们设计了一种两步消化方法，从野生型小鼠的颈动脉中获得高质量的单细胞悬液。该方案可用于为其他血管制备单细胞悬浮液，并进行微小的修改，使其对心血管研究非常有帮助。
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Disclosures
作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国自然科学基金（82070450 to C.T.和 82170466 to L.Z.）和中国博士后科学基金（7121102223 to F.L.）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
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