Summary
Her beskriver vi en to-trinns celle fordøyelse protokoll for å forberede en enkeltcelle suspensjon av mus carotis arterier.
Abstract
Carotisarterier er store blodkar i nakken som leverer blod og oksygen til hjernen, men carotisstenose oppstår når halspulsårene er tilstoppet av plakk. Å avsløre den cellulære sammensetningen av halspulsåren på enkeltcellenivå er avgjørende for behandling av aterosklerose av carotis. Imidlertid er det ingen klar til bruk protokoll for fremstilling av enkeltcellede suspensjoner fra karoten arterier. For å oppnå en egnet protokoll for dissosiasjon av normale halspulsårer på enkeltcellenivå med mindre skade på celler, designet vi en to-trinns fordøyelsesmetode ved å integrere fordøyelsesprosessen av kollagenase / DNase og trypsin. Akridin oransje / propidiumjodid (AO / PI) dual-fluorescens telling ble brukt til å oppdage cellens levedyktighet og konsentrasjon, og det ble funnet at enkeltcellesuspensjonen tilfredsstilte kravene til enkeltcellesekvensering, med levedyktigheten til celler over 85% og en høy cellekonsentrasjon. Etter encellet databehandling ble det påvist en median på ~2500 transkripsjoner per celle i hver halspulsårecelle. Spesielt var en rekke celletyper av den normale halspulsåren, inkludert vaskulære glatte muskelceller (VSMCs), fibroblaster, endotelceller (ECs) og makrofager og dendrittiske celler (Mφ / DCs), samtidig detekterbare. Denne protokollen kan anvendes for å forberede en encellesuspensjon av blodkar fra andre vev med passende modifikasjoner.
Introduction
Aterosklerose er en kronisk inflammatorisk sykdom assosiert med risikofaktorer som høyt blodtrykk, hyperlipidemi og hemodynamikk1. Carotisarteriebifurkasjoner er utsatt for hemodynamiske forandringer og fører til dannelse av carotisplakk. Den kliniske presentasjonen av aterosklerose på carotis kan være akutt som hjerneslag og forbigående cerebral iskemi, eller kronisk som residiverende forbigående cerebral iskemi og vaskulær demens2. Mekanisk er karoteplakk resultatet av samspillet mellom forskjellige karveggceller og forskjellige blodceller under patologiske forhold. Derfor er avsløring av enkeltcelleatlaset av karoten kar under fysiologiske og patologiske forhold spesielt viktig for å forebygge og behandle utvikling av carotisplakk.
Enkeltcelle RNA-sekvensering er en av de kraftigste teknologiene for biologisk forskning på grunn av sin ultrahøye oppløsning og påvisning av celleheterogenitet fra samme celletypeav organismer 3,4. Forskere har brukt enkeltcelle RNA-sekvensering til å utføre forskning på mange felt, for eksempel kardiovaskulær sykdom5 og kreft6. Imidlertid er rask og nøyaktig separering av vev i enkeltceller fortsatt en av hovedutfordringene. Enzymatisk dissosiasjon er en vanlig metode som dominerende inkluderer kollagenase, papain, trypsin, DNase og hyaluronidase. Spesielt er kollagenaser de viktigste enzymartene for encellet fordøyelse, hovedsakelig hydrolyserende kollagenkomponenter i bindevev. Ulike kollagenasetyper gjelder for dissosiasjon av forskjellige vev, for eksempel brystkjertelen7, glomerulus8, iridocorneal vinkel9, kneledd 10, aorta11 og lunge12. På grunn av de unike fysiologiske egenskapene til forskjellige vev, kan dissosiasjon ved hjelp av samme metode forårsake mange problemer med å anskaffe enkeltceller, for eksempel lav celle levedyktighet, lavt cellenummer og store celleavfall. Derfor er oppfinnelsen av fordøyelsesmetoder for forskjellige vev avgjørende for fremstilling av høykvalitets enkeltcellesuspensjoner.
Denne protokollen tar sikte på å utvikle en to-trinns cellefordøyelsesmetode for å fremstille en enkeltcellesuspensjon av halspulsåren hos villtypemus. I henhold til egenskapene til halspulsåren kombinerte vi kollagenase/DNase med trypsin for å oppnå en høyverdig encellesuspensjon av musehalspulsåren fordi kollagenase kan hydrolysere kollagen i halspulsvevet, som videre ble fordøyd av trypsin til en encellesuspensjon. Akridin oransje / propidiumjodid (AO / PI) dual-fluorescens telling ble brukt til å oppdage cellens levedyktighet og konsentrasjon, og det ble funnet at enkeltcellesuspensjonen tilfredsstilte kravene til enkeltcellesekvensering, med levedyktigheten til celler over 85% og en høy cellekonsentrasjon. Etter enkeltcelledatabehandling ble fire celletyper, inkludert vaskulære glatte muskelceller (VSMCs), fibroblaster, endotelceller (ECs) og makrofager og dendrittiske celler (Mφ / DCs), identifisert i normale musekarotisarterier etter fordøyelse. Fordelene med denne protokollen er at: 1) flere celletyper i halspulsåren kan identifiseres, 2) celle levedyktighet er godt bevart, og 3) det kan lett gjentas uten spesialutstyr. Denne protokollen er egnet for forskere som er interessert i å studere enkeltcelle multiomikk av musens halspulsårer. Denne protokollen kan også være nyttig i dissosiasjon av andre blodkar med passende modifikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Soochow University.
1. Reagenser og forberedelse av materialer
- Bruk 1x PBS uten kalsium og magnesium og 2,5 U / ml heparinnatriumsalt for å forberede perfusjonsoppløsningen. Oppbevares ved 4 °C, og forkjøles på is når den brukes.
- Klargjør dissosiasjonsreagens A som inneholder 125 CDU/ml kollagenase II og 60 U/ml DNase I ved å fortynne 1250 CDU/ml kollagenase II og 3000 U/ml DNase I med HBSS. Oppbevares ved 4 °C inntil bruk.
- Forbered dissosiasjonsreagens B som inneholder en endelig konsentrasjon på 0,12% trypsin ved å fortynne 1 ml 0,25% EDTA-fritt trypsin (uten fenolrødt) til 1 ml 1x PBS. Oppbevares ved 4 °C inntil bruk.
- Forbered 10 ml 1,5% FBS og 10 ml 5% FBS i 1x PBS. Bruk 1,5% FBS til å basseng carotis arterier og holde på is før bruk. Bruk 5% FBS for å nøytralisere fordøyelsen og lagre ved romtemperatur (RT).
- Få eksperimentelle materialer, inkludert 1 ml sprøyter, 20 ml sprøyter med 26-G nåler, seks-brønns cellekulturplater, 1,5 ml sentrifugerør, 40 μm sterile cellesiler og isbeholdere.
2. Forberedelse av utstyr
- Steriliser alt kirurgisk utstyr, inkludert et stereoskopisk mikroskop, dissekere saks, mikrodissekerende saks og fintipptang.
- Slå på den automatiserte celletelleren og vedlikehold den på RT.
- Skru på vannbadet til 37 °C på forhånd.
- Forkjøl mikrosentrifugen til 4 °C før bruk.
3. Isolering av musens halspulsåren
- Bedøv musen med 1,25% tribromoetanol ved intraperitoneal injeksjon (0,24 ml for hver 10 g kroppsvekt) og snu musen for å sjekke om det er en rettingsrefleks etter 3 minutter. Deretter avliver musen ved cervikal dislokasjon og legger den på ryggen. Spray musens hud med 75% alkohol.
- Bruk sterilisert dissekerende saks for å åpne opp huden og eksponere brysthulen. Klipp opp membranen.
- Fortsett å kutte oppover til underkjeven og fjern forsiktig overflødig bindevev og fett, og utsett halspulsåren.
- Klipp musens dårligere vena cava for å få blodstrømmen ut av den lukkede sirkulasjonen.
- Injiser 20 ml forkjølt perfusjonsoppløsning inn i venstre ventrikkel med en sprøyte sakte og kontinuerlig.
MERK: Hvis perfusjon er vellykket, vil blodrike organer som lever, milt og nyrer bli gråhvite. - Fjern alt fett og bindevev rundt halspulsåren med mikrodissekerende saks under et stereoskopisk mikroskop.
MERK: Dette trinnet bør gjøres sakte og forsiktig for å forhindre skade på halspulsåren. - Isoler halspulsåren fra musen, vask med 1x PBS for å skylle blodet igjen, og overfør til seksbrønnsplater som inneholder 1,5% FBS på is.
4. Fordøyelse av halspulsåren til encellesuspensjon
- Bruk mikrodissekerende saks til å dissekere halspulsåren i lengderetningen og legg flatt i en annen 6-brønns cellekulturplate inneholdende 1 ml 1,5% FBS på is.
- Skyll intima forsiktig med 1,5% FBS for å fjerne gjenværende blod.
MERK: Spyling bør være forsiktig og sakte for å unngå å skade endotelceller. - Klipp hver halspulsåre i ca. 2 mm2 vevsstykker ved hjelp av mikrodissekerende saks i 1,5% FBS.
- Overfør disse vevsbitene til et 1,5 ml sentrifugerør med 1 ml brede borespisser, sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C for å senke vevet til bunnen.
- Kast supernatanten og resuspender vevet i 500 μL dissosiasjonsreagens A.
- Plasser slangen i et vannbad på 37 °C i 1 time. Pipetter forsiktig med en 1 ml pipette hvert 10. minutt.
- Tilsett 500 μL 5% FBS i røret og bland godt med en 1 ml pipette.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 40 μm steril cellesil i et nytt 1,5 ml sentrifugerør og sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten forsiktig og resuspender cellepelleten i 200 μL dissosiasjonsreagens B.
- Plasser i et vannbad på 37 °C og fordøy i ytterligere 5 minutter. Pipetter forsiktig hvert 2. minutt under fordøyelsen for å dissosiere helt til en encellesuspensjon.
- Bruk 200 μL 5% FBS for å avslutte fordøyelsesreaksjonen, og sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
- Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 100 mikrol 1x PBS på is.
5. Cellesuspensjonsundersøkelse og enkeltcelle RNA-sekvensering
- Tilsett 10 mikrol AO/PI-oppløsning i 10 mikroliter encellesuspensjon og bland forsiktig med en 20 μL pipette.
- Pipette 20 μL av blandingen inn i kammerets lysbilde og vent i 1 min.
- Legg lysbildet inn i det automatiserte celletellerinstrumentet.
- Velg AO/PI levedyktighetsanalysen , og vent deretter på kvalitetsrapporten.
- Bruk et encellet 3ʹ-reagenssett for å generere encellede gelperler i emulsjonen på en enkeltcellekontroller og forsterke det strekkodede cDNA i en termisk syklist etter produsentens protokoll.
MERK: Her ble Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3 brukt. - Utfør sekvensering på en sequencer med en sammenkoblet 150 bp (PE150) lesestrategi. Bruk et program (Cell Ranger) til å konvertere rå baseanropsfiler til fastq-filer ved hjelp av mkfastq-pipelinen . Deretter bruker du Count Pipeline of Cell Ranger til å utføre justering, filtrering, strekkodetelling og UMI-telling (Unique Molecular Identifier) for å generere strekkodematriser13.
- Utfør reduksjon og visualisering av datadimensjonalitet med R-pakken Seurat14.
- Først leser Read10X() -funksjonen til Seurat i utdataene fra Cell Ranger-rørledningen og bruker deretter tellematrisen til å lage et Seurat-objekt. Deretter filtrerer du ut cellene med ekspresjon av <200 eller >4000 gener eller et mitokondrielt genforhold som var mer enn 10% av delmengden() -funksjonen til Seurat.
- Bruk henholdsvis NormalizeData () og FindVariableFeatures() til å normalisere dataene og identifisere 2000 svært variable funksjoner.
- Utfør prinsipal komponentanalyse (PCA) på de skalerte dataene, og gruppere cellene med dims = 30 og oppløsning = 0,5. Til slutt bruker du RunUMAP ()-funksjonen til å visualisere enkeltcelledatasettene og FindAllMarkers() for å finne hver klyngebiomarkør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver en to-trinns cellefordøyelsesmetode for fremstilling av encellesuspensjon av carotisarterier hos mus (figur 1). Denne to-trinns cellefordøyelsesmetoden kombinerer kollagenase / DNase med trypsin for effektivt å dissosiere musens carotisvaskulære vegg for å oppnå høykvalitets enkeltcellesuspensjoner for enkeltcellesekvensering. Etter dissosiasjon ble cellekonsentrasjonen og cellens levedyktighet beregnet av en automatisert celleteller. Det lyse feltet viste morfologien til carotisvaskulære celler etter fordøyelsen, og AOPI dual-fluorescensfarging påviste samtidig cellenes levedyktighet (figur 2A,B). Spesielt, sammenlignet med bruk av dissosiasjonsreagens A alene, kan halspulsåren bli mer grundig dissosiert når det kombineres med dissosiasjonsreagens B. Vi fant videre et levedyktig celletall på ni arterier, og gjennomsnittlig cellediameter tilfredsstilte kravene til enkeltcellesekvensering etter totrinns cellefordøyelse (figur 2C). Samtidig ble totalt 176 000 enkeltceller samlet inn fra ni venstre carotis, og de fleste karene ble dissosiert til enkeltceller med høy levedyktighet (figur 2C).
Etter justering, filtrering, strekkodetelling og UMI-telling ble rådataene for enkeltcellesekvensering analysert med R-pakken Seurat. Fordelingen av gener per celle, UMI per celle og mitokondrieavlesninger per celle er vist i fiolinplott (figur 3A-C). Spesielt ble en median på ~ 2500 transkripsjoner per celle detektert i hver halspulsårecelle. Etter å ha fjernet cellene av lav kvalitet, ble 14.580 celler detektert og brukt til nedstrøms enkeltcelle RNA-seq-analyse. Ved bruk av 2000 variable gener med lignende profiler, viste ikke-overvåket Seurat-basert clustering fire hovedcelletyper, inkludert VSMCs (74,0%), fibroblaster (16,5%), ECs (6,5%) og Mφ / DCs (3,0%), i normale mus carotisarterier etter fordøyelsen (figur 3D-F).
Figur 1 Skjematisk diagram over carotisfordøyelsen hos mus. Etter at arteria carotis hos mus var isolert og kuttet, ble det tilsatt 500 μL dissosiasjonsreagens A for å dissosiere arteria carotis hos mus. Når cellesuspensjonen ble filtrert og sentrifugert, ble 200 μL dissosiasjonsreagens B tilsatt for ytterligere dissosiasjon for å oppnå en enkeltcellesuspensjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Encellet suspensjonspreparat fra arteria carotis hos mus. (A) Cellemorfologien og cellelevedyktigheten til carotisarterieceller etter 1 time fordøyelse med dissosiasjonsreagens A er vist i lys feltvisning og AOPI-farging. Kjernefysiske celler farget med grønn fluorescens er levende celler, mens de som er farget med rød fluorescens er døde celler. Skala bar = 100 μm. (B) Cellemorfologien og cellelevedyktigheten til carotisarterieceller etter to-trinns cellefordøyelse er vist i lysfeltvisning og AOPI-farging. Kjernefysiske celler farget med grønn fluorescens er levende celler, mens de som er farget med rød fluorescens er døde celler. Skala bar = 100 μm. (C) Cellens levedyktighet, totalt celletall, levedyktig celletall og gjennomsnittlig cellediameter ble målt etter to-trinns cellefordøyelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Standard kvalitetskontroll (QC) beregninger for scRNA-seq og cellelandskapet i halspulsåren. (A) Fiolinplott som viser fordelingen av gener per celle (nFeature RNA), (B) UMI per celle (nCount_RNA) og (C) mitokondrielle avlesninger per celle (prosent mt) for scRNA-seq-dataene. (D) Uniform manifold approximation and projection (UMAP) plott som viser de fire identifiserte celletyper av halspulsåren. (E) Punktplott som viser markørene som definerer hver type celleklynge i panel D. Størrelsen på hver sirkel angir celleandelen i gruppen som uttrykker hver transkripsjon. De blå prikkene indikerer høyt uttrykte gener og de grå prikkene indikerer gener med lavt uttrykk. (F) Stablet stolpeplott som viser den relative overflod av de fire celletypene oppdaget av scRNA-seq av villtypemus (WT). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gir vi en detaljert protokoll for fremstilling av en høyverdig enkeltcellesuspensjon fra halspulsåren hos villtypemus, der en to-trinns fordøyelsesmetode som integrerer fordøyelsesprosessen av kollagenase / DNase og trypsin ble konstruert. Etter kvalitetskontrollen av encellesuspensjonen fant vi at den tilfredsstilte kravene til enkeltcellesekvensering, med levedyktigheten til celler over 85% og en høy cellekonsentrasjon. Videre ble en rekke celletyper i halspulsåren, inkludert VSMC, fibroblaster, EC og Mφ / DC, vellykket detektert etter enkeltcelledatabehandling.
Nåværende metoder for fremstilling av carotis enkeltcellesuspensjoner er fortsatt knappe. Depuydt et al. oppnådde en encellet suspensjon fra humane carotisplakk ved å kombinere kollagenase, DNase, human albuminfraksjon V og flavopiridol ved 37 °C i 30 minutter15. Etter fluorescensaktivert cellesortering identifiserte de 14 forskjellige cellepopulasjoner, inkludert endotelceller, glatte muskelceller, mastceller, B-celler, myeloide celler og T-celler15. Videre fordøyde forskere vanlige halspulsårer hos rotter ved bruk av 0,25% trypsin-EDTA og 0,1% kollagenase ved 37 ° C og utførte vellykket enkeltcelle RNA-sekvensering16. Fem celletyper, inkludert VSMC, fibroblaster, EC, overgangsceller og makrofager, ble identifisert i både normale og eksperimentelle halspulsårer16. I tillegg er det også etablert en protokoll for å oppnå EC-berikede enkeltcellepreparater av halspulsåren17. Etter å ha fullført luminal enzymatisk fordøyelse, vil carotisarteriespyling oppnå nok encellede pellets for scRNAseq og scATACseq17. For å fleksibelt kontrollere fordøyelsestiden utviklet vi en to-trinns fordøyelsesmetode for musekaroten arterier, som separerer trinnene for vevsdissosiasjon og enkeltcellesuspensjonspreparat. Prosessen starter med 125 CDU/ml kollagenase II og 60 U/ml DNase I i 1 time, etterfulgt av EDTA-fritt trypsin i 5 minutter. Det er viktig at vi på riktig måte kan endre ethvert trinn i metoden for fordøyelse av andre blodkarvev basert på blodkarets egenskaper.
Det er noen begrensninger i den beskrevne metoden. For det første vet vi ikke om denne metoden kan brukes til primær cellekultur in vitro. Siden halspulsåren er tynnere og har færre celler, er det utfordrende å dyrke og utvide in vitro . For det andre, i motsetning til andre fordøyelsesmetoder, krever denne protokollen skånsom pipettering for å dissosiere celler under fordøyelsen. Et ristende vannbad kan også resultere i en encellesuspensjon av god kvalitet. For det tredje, siden vår metode gjelder for normale halspulsårer, gjenstår det å studere om den er egnet for fordøyelsen av karoten plakk.
Avslutningsvis utviklet vi en to-trinns fordøyelsesmetode for å oppnå en høyverdig enkeltcellesuspensjon fra halspulsåren hos villtypemus. Denne protokollen kan brukes til å forberede enkeltcellesuspensjoner for andre fartøy med mindre modifikasjoner, noe som gjør den svært nyttig i kardiovaskulær forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Science Foundation of China (82070450 til C.T.and 82170466 til L.Z.) og fellesskapet fra China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 til F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
- Libby, P., et al.
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).
- Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).
- Stuart, T., et al.
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).
