Summary
Burada, fare karotis arterlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim protokolünü açıklıyoruz.
Abstract
Karotis arterler, boyundaki beyne kan ve oksijen sağlayan ana kan damarlarıdır, ancak karotis arterleri plak tarafından tıkandığında karotis darlığı meydana gelir. Karotis arterin hücresel bileşiminin tek hücre düzeyinde ortaya çıkarılması, karotis aterosklerozunun tedavisi için esastır. Bununla birlikte, karotis arterlerden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için kullanıma hazır bir protokol yoktur. Normal karotis arterlerin tek hücre düzeyinde hücrelere daha az zarar vererek ayrışması için uygun bir protokol elde etmek için, kollajenaz/DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre ederek iki aşamalı bir sindirim yöntemi tasarladık. Hücre canlılığını ve konsantrasyonunu tespit etmek için akridin turuncu/propidyum iyodür (AO/PI) çift floresan sayımı kullanıldı ve tek hücreli süspansiyonun, hücrelerin canlılığı ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığı, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu olduğu bulundu. Tek hücreli veri işlemeden sonra, her karotis arter hücresinde hücre başına ortalama ~ 2500 transkript tespit edildi. Özellikle, vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler), fibroblastlar, endotel hücreleri (EC'ler) ve makrofajlar ve dendritik hücreler (Mφ / DC'ler) dahil olmak üzere normal karotis arterin çeşitli hücre tipleri aynı anda tespit edilebilirdi. Bu protokol, uygun modifikasyonlarla diğer dokulardan kan damarlarının tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için uygulanabilir.
Introduction
Ateroskleroz, yüksek tansiyon, hiperlipidemi ve hemodinamik gibi risk faktörleriyle ilişkili kronik inflamatuar bir hastalıktır1. Karotis arter bifurkasyonları hemodinamik değişikliklere eğilimlidir ve karotis plak oluşumuna yol açar. Karotis aterosklerozunun klinik prezentasyonu inme ve geçici serebral iskemi gibi akut veya tekrarlayan geçici serebral iskemi ve vasküler demans gibi kronik olabilir2. Mekanik olarak karotis plak, patolojik koşullar altında farklı damar duvarı hücreleri ve çeşitli kan hücreleri arasındaki etkileşimin sonucudur. Bu nedenle, fizyolojik ve patolojik koşullar altında karotis damarlarının tek hücreli atlasının ortaya çıkarılması, karotis plak gelişiminin önlenmesi ve tedavisi için özellikle önemlidir.
Tek hücreli RNA dizilimi, ultra yüksek çözünürlüğü ve aynı hücre tipi organizmalardan hücre heterojenliğinin tespiti nedeniyle biyolojik araştırmaların en güçlü teknolojilerinden biridir 3,4. Araştırmacılar, kardiyovasküler hastalık5 ve kanser6 gibi birçok alanda araştırma yapmak için tek hücreli RNA dizilimini kullandılar. Bununla birlikte, dokuları hızlı ve doğru bir şekilde tek hücrelere ayırmak hala ana zorluklardan biridir. Enzimatik ayrışma, baskın olarak kollajenaz, papain, tripsin, DNaz ve hyaluronidaz içeren yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Spesifik olarak, kollajenazlar, tek hücreli sindirim için ana enzim türleridir ve esas olarak bağ dokularındaki kollajen bileşenlerini hidrolize eder. Meme bezi7, glomerulus8, iridokorneal açı9, diz eklemi10, aort11 ve akciğer12 gibi farklı dokuların ayrışması için farklı kollajenaz tipleri uygulanabilir. Farklı dokuların benzersiz fizyolojik özellikleri nedeniyle, aynı yöntemi kullanarak ayrışma, düşük hücre canlılığı, düşük hücre sayısı ve büyük hücre kalıntıları gibi tek hücrelerin elde edilmesinde birçok soruna neden olabilir. Bu nedenle, farklı dokular için sindirim yöntemlerinin icadı, yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için gereklidir.
Bu protokol, vahşi tip farelerin karotis arterinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim yöntemi geliştirmeyi amaçlamaktadır. Karotis arterin özelliklerine göre, fare karotis arterinin yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için kollajenaz / DNazı tripsin ile birleştirdik çünkü kollajenaz, tripsin tarafından daha fazla sindirilen karotis dokularının kollajenini hidrolize edebilir. Hücre canlılığını ve konsantrasyonunu tespit etmek için akridin turuncu/propidyum iyodür (AO/PI) çift floresan sayımı kullanıldı ve tek hücreli süspansiyonun, hücrelerin canlılığı ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığı, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu olduğu bulundu. Tek hücreli veri işlemeden sonra, sindirimden sonra normal fare karotis arterlerinde vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler), fibroblastlar, endotel hücreleri (EC'ler) ve makrofajlar ve dendritik hücreler (Mφ / DC'ler) dahil olmak üzere dört hücre tipi tanımlandı. Bu protokolün avantajları şunlardır: 1) karotis arterdeki çoklu hücre tipleri tanımlanabilir, 2) hücre canlılığı iyi korunur ve 3) özel ekipman olmadan kolayca tekrarlanabilir. Bu protokol, fare karotis arterlerinin tek hücreli multiomiklerini incelemek isteyen araştırmacılar için uygundur. Bu protokol, uygun modifikasyonlarla diğer kan damarlarının ayrışmasında da yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Soochow Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktifler ve malzeme hazırlama
- Perfüzyon çözeltisini hazırlamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS ve 2.5 U / mL heparin sodyum tuzu kullanın. 4 °C'de saklayın ve kullanıldığında buz üzerinde ön soğutun.
- 1250 CDU/mL kollajenaz II ve 3000 U/mL DNaz I'i HBSS ile seyrelterek 125 CDU/mL kollajenaz II ve 60 U/mL DNaz I içeren ayrışma reaktifi A'yı hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- 1 mL %0.25 EDTA içermeyen tripsini (fenol kırmızısı olmadan) 1 mL 1x PBS'ye seyrelterek %0.12 tripsin nihai konsantrasyonu içeren ayrışma reaktifi B'yi hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- 1x PBS'de 10 mL% 1.5 FBS ve% 10 mL% 5 FBS hazırlayın. Karotis arterleri havuzlamak için% 1.5 FBS kullanın ve kullanmadan önce buz üzerinde tutun. Sindirimi nötralize etmek ve oda sıcaklığında (RT) saklamak için% 5 FBS kullanın.
- 1 mL şırıngalar, 26-G iğneli 20 mL şırıngalar, altı oyuklu hücre kültürü plakaları, 1.5 mL santrifüj tüpleri, 40 μm steril hücre süzgeçleri ve buz kapları dahil olmak üzere deneysel materyalleri edinin.
2. Ekipman hazırlığı
- Stereoskopik mikroskop, diseksiyon makası, mikro diseksiyon makası ve ince uçlu forseps dahil tüm cerrahi ekipmanı sterilize edin.
- Otomatik hücre sayacını açın ve RT'de tutun.
- Su banyosunu önceden 37 °C'ye getirin.
- Kullanmadan önce mikrosantrifüjü 4 °C'ye önceden soğutun.
3. Fare karotis arterinin izolasyonu
- İntraperitoneal enjeksiyonla (vücut ağırlığının her 10 g'ı için 0,24 mL) %1,25 tribromoetanol kullanarak fareyi uyuşturun ve 3 dakika sonra düzeltme refleksi olup olmadığını kontrol etmek için fareyi çevirin. Ardından, fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın ve sırt üstü yatırın. Farenin cildine %75 alkol püskürtün.
- Cildi açmak ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için sterilize diseksiyon makası kullanın. Diyaframı keserek açın.
- Alt çeneye doğru yukarı doğru kesmeye devam edin ve karotis arteri açığa çıkararak fazla bağ dokularını ve yağı dikkatlice çıkarın.
- Kapalı dolaşımdan kan akışını sağlamak için farenin inferior vena kavasını kesin.
- Sol ventriküle 20 mL önceden soğutulmuş perfüzyon solüsyonunu bir şırınga ile yavaşça ve sürekli olarak enjekte edin.
NOT: Perfüzyon başarılı olursa, karaciğer, dalak ve böbrekler gibi kandan zengin organlar gri-beyaza döner. - Karotis arter çevresindeki tüm yağ ve bağ dokularını stereoskopik mikroskop altında mikro diseksiyon makası ile soyun.
NOT: Karotis arterin zarar görmesini önlemek için bu adım yavaş ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. - Karotis arteri fareden izole edin, kanı tekrar yıkamak için 1x PBS ile yıkayın ve buz üzerinde% 1.5 FBS içeren altı oyuklu plakalara aktarın.
4. Karotis arterin tek hücreli süspansiyona sindirilmesi
- Karotis arteri uzunlamasına incelemek için mikro diseksiyon makası kullanın ve buz üzerinde 1 mL% 1.5 FBS içeren başka bir 6 oyuklu hücre kültürü plakasına düz bir şekilde koyun.
- Kalan kanı çıkarmak için intimayı %1,5 FBS ile dikkatlice yıkayın.
NOT: Endotel hücrelerine zarar vermemek için yıkama nazik ve yavaş olmalıdır. - Her karotis arteri %1.5 FBS'de mikrodiseksiyon makası kullanarak yaklaşık 2mm'lik 2 doku parçalarına kesin.
- Bu doku parçalarını 1 mL genişliğinde delikli uçlara sahip 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, dokuları dibe batırmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve dokuları 500 μL ayrışma reaktifi A içinde yeniden süspanse edin.
- Tüpü 1 saat boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Her 10 dakikada bir 1 mL'lik bir pipetle nazikçe pipetleyin.
- Tüpe 500 μL %5 FBS ekleyin ve 1 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın.
- Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir steril hücre süzgecinden geçirerek yeni bir 1.5 mL'lik santrifüj tüpüne süzün ve 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 200 μL ayrışma reaktifi B içinde yeniden süspanse edin.
- 37 °C'lik bir su banyosuna koyun ve 5 dakika daha sindirin. Tek hücreli bir süspansiyona tamamen ayrışmak için sindirim sırasında her 2 dakikada bir hafifçe pipetleyin.
- Sindirim reaksiyonunu sonlandırmak için 200 μL %5 FBS kullanın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücre peletini buz üzerinde 100 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
5. Hücre süspansiyon muayenesi ve tek hücreli RNA dizilimi
- 10 μL tek hücreli süspansiyona 10 μL AO / PI çözeltisi ekleyin ve 20 μL'lik bir pipetle hafifçe karıştırın.
- Karışımdan 20 μL'yi hazneye pipetleyin ve 1 dakika bekleyin.
- Slaytı otomatik hücre sayacı cihazına yükleyin.
- AO/PI Canlılık testini seçin, ardından kalite raporunu bekleyin.
- Tek hücreli bir kontrolörde emülsiyonda tek hücreli jel boncuklar oluşturmak için tek hücreli bir 3ʹ reaktif kiti kullanın ve barkodlu cDNA'yı üreticinin protokolüne göre bir termal döngüleyicide çoğaltın.
NOT: Burada Chromium Single Cell 3ʹReaktif Kitleri v3 kullanılmıştır. - Eşleştirilmiş uçlu 150 bp (PE150) okuma stratejisine sahip bir sıralayıcıda sıralama gerçekleştirin. Ham temel çağrı dosyalarını mkfastq ardışık düzenini kullanarak fastq dosyalarına dönüştürmek için bir yazılım uygulaması (Cell Ranger) kullanın. Ardından, özellik barkod matrisleri13 oluşturmak için hizalama, filtreleme, barkod sayımı ve benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) sayımı gerçekleştirmek için Cell Ranger'ın Sayım İşlem Hattını kullanın.
- R paketi Seurat14 ile veri boyutsallığını azaltma ve görselleştirme gerçekleştirin.
- İlk olarak, Seurat'ın Read10X() işlevi, Cell Ranger ardışık düzeninin çıktısını okur ve ardından bir Seurat nesnesi oluşturmak için sayı matrisini kullanır. Ardından, <200 veya >4000 gen ekspresyonu veya Seurat'ın subset() fonksiyonu ile %10'dan fazla mitokondriyal gen oranı olan hücreleri filtreleyin.
- Verileri normalleştirmek ve sırasıyla 2000 yüksek değişkenli özelliği tanımlamak için NormalizeData () ve FindVariableFeatures() kullanın .
- Ölçeklendirilmiş veriler üzerinde temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirin ve hücreleri karartma = 30 ve çözünürlük = 0,5 ile kümeleyin. Son olarak, tek hücreli veri kümelerini görselleştirmek için RunUMAP () işlevini ve her bir küme biyobelirtecini bulmak için FindAllMarkers() işlevini kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, fare karotis arterlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim yöntemini açıklar (Şekil 1). Bu iki aşamalı hücre sindirim yöntemi, tek hücreli dizileme için yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar elde etmek üzere fare karotis vasküler duvarını etkili bir şekilde ayırmak için kollajenaz/DNazı tripsin ile birleştirir. Ayrışmadan sonra, hücre konsantrasyonu ve hücre canlılığı otomatik bir hücre sayacı tarafından hesaplandı. Parlak alan, sindirimden sonra karotis vasküler hücrelerin morfolojisini gösterdi ve AOPI çift floresan boyama aynı anda hücre canlılığını tespit etti (Şekil 2A, B). Özellikle, tek başına ayrışma reaktifi A'nın kullanılmasıyla karşılaştırıldığında, karotis arter dokusu, ayrışma reaktifi B ile birleştirildiğinde daha kapsamlı bir şekilde ayrışabilir. Ayrıca, dokuz arterin canlı bir hücre sayısını bulduk ve ortalama hücre çapı, iki aşamalı hücre sindiriminden sonra tek hücre diziliminin gereksinimlerini karşıladı (Şekil 2C). Bu arada, dokuz sol karotidden toplam 176.000 tek hücre toplandı ve çoğu vasküler damar, yüksek canlılığa sahip tek hücrelere ayrıldı (Şekil 2C).
Hizalama, filtreleme, barkod sayımı ve UMI sayımından sonra, tek hücreli dizilemenin ham verileri R paketi Seurat ile analiz edildi. Hücre başına genlerin dağılımı, hücre başına UMI ve hücre başına mitokondriyal okumalar keman grafiklerinde gösterilmiştir (Şekil 3A-C). Özellikle, her karotis arter hücresinde hücre başına ~ 2500 transkript medyanı tespit edildi. Düşük kaliteli hücreler çıkarıldıktan sonra, 14.580 hücre tespit edildi ve aşağı akış tek hücreli RNA-seq analizi için kullanıldı. Benzer profillere sahip 2000 değişken gen kullanılarak, denetimsiz Seurat tabanlı kümeleme, sindirimden sonra normal fare karotis arterlerinde VSMC'ler (% 74.0), fibroblastlar (% 16.5), EC'ler (% 6.5) ve Mφ / DC'ler (% 3.0) dahil olmak üzere dört ana hücre tipi gösterdi (Şekil 3D-F).
Şekil 1: Fare karotis arter sindiriminin şematik diyagramı. Fare karotis arteri izole edildikten ve kesildikten sonra, fare karotis arterini ayrıştırmak için 500 μL ayrışma reaktifi A eklendi. Hücre süspansiyonu filtrelendiğinde ve santrifüjlendiğinde, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için daha fazla ayrışma için 200 μL ayrışma reaktifi B eklendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare karotis arterinden tek hücreli süspansiyon preparatı . (A) Ayrışma reaktifi A ile 1 saatlik sindirimden sonra karotis arter hücrelerinin hücre morfolojisi ve hücre canlılığı, parlak alan görünümünde ve AOPI boyamasında gösterilir. Yeşil floresan ile boyanmış çekirdekli hücreler canlı hücreler iken, kırmızı floresan ile boyanmış olanlar ölü hücrelerdir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) İki aşamalı hücre sindiriminden sonra karotis arter hücrelerinin hücre morfolojisi ve hücre canlılığı, parlak alan görünümünde ve AOPI boyamasında gösterilir. Yeşil floresan ile boyanmış çekirdekli hücreler canlı hücreler iken, kırmızı floresan ile boyanmış olanlar ölü hücrelerdir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Hücre canlılığı, toplam hücre sayısı, canlı hücre sayısı ve ortalama hücre çapı, iki aşamalı hücre sindiriminden sonra ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: scRNA-seq ve karotis arterin hücre manzarası için standart kalite kontrol (QC) ölçümleri. (A) scRNA-seq verileri için hücre başına gen dağılımını (nFeature RNA), (B) hücre başına UMI (nCount_RNA) ve (C) hücre başına mitokondriyal okumaları (yüzde mt) gösteren keman grafikleri. (D) Karotis arterin tanımlanmış dört hücre tipini gösteren tek tip manifold yaklaşımı ve projeksiyonu (UMAP) grafiği. (E) D panelindeki her bir hücre kümesi türünü tanımlayan işaretçileri gösteren nokta grafiği. Her dairenin boyutu, her bir transkripti ifade eden grup içindeki hücre oranını gösterir. Mavi noktalar yüksek oranda eksprese edilen genleri, gri noktalar ise düşük ekspresyonlu genleri gösterir. (F) Yabani tip farelerin (WT) scRNA dizisi tarafından tespit edilen dört hücre tipinin nispi bolluğunu gösteren yığılmış çubuk grafiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, kollajenaz / DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre eden iki aşamalı bir sindirim yönteminin oluşturulduğu vahşi tip farelerin karotis arterinden yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Tek hücreli süspansiyonun kalite kontrolünden sonra, hücrelerin %85'in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığını gördük. Ayrıca, tek hücreli veri işlemeden sonra VSMC'ler, fibroblastlar, EC'ler ve Mφ/DC'ler dahil olmak üzere karotis arterdeki çeşitli hücre tipleri başarıyla tespit edildi.
Karotis tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için mevcut yöntemler hala azdır. Depuydt ve ark. kollajenaz, DNaz, İnsan Albümin Fraksiyonu V ve Flavopiridol'ü 37 °C'de 30 dakika15 birleştirerek insan karotis plaklarından tek hücreli bir süspansiyon elde etti. Floresanla aktive edilen hücre sıralamasından sonra, endotel hücreleri, düz kas hücreleri, mast hücreleri, B hücreleri, miyeloid hücreler ve T hücreleri 15 dahil olmak üzere14 farklı hücre popülasyonu tanımladılar. Ayrıca, araştırmacılar 37 ° C'de %0.25 tripsin-EDTA ve %0.1 kollajenaz kullanarak sıçan ortak karotis arterlerini sindirdiler ve tek hücreli RNA dizilimini başarıyla gerçekleştirdiler16. Hem normal hem de deneysel karotis arterlerde VSMC'ler, fibroblastlar, EC'ler, geçiş hücreleri ve makrofajlar dahil olmak üzere beş hücre tipi tanımlanmıştır16. Ek olarak, karotis arterin EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli preparatlarının elde edilmesi için bir protokol de oluşturulmuştur17. Luminal enzimatik sindirimi tamamladıktan sonra, karotis arter yıkaması, scRNAseq ve scATACseq17 için yeterli tek hücreli peletler elde edecektir. Sindirim süresini esnek bir şekilde kontrol etmek için, fare karotis arterleri için doku ayrışması ve tek hücreli süspansiyon hazırlama adımlarını ayıran iki aşamalı bir sindirim yöntemi geliştirdik. İşlem 1 saat boyunca 125 CDU / mL kollajenaz II ve 60 U / mL DNaz I ile başlar, ardından 5 dakika boyunca EDTA içermeyen tripsin ile devam eder. Önemli bir şekilde, kan damarlarının özelliklerine bağlı olarak diğer kan damarı dokularının sindirimi için yöntemin herhangi bir adımını uygun şekilde değiştirebiliriz.
Açıklanan yöntemin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu yöntemin in vitro birincil hücre kültürü için kullanılıp kullanılamayacağını bilmiyoruz. Karotis arter duvarı daha ince ve daha az hücreye sahip olduğundan, in vitro kültürleme ve genişletme zordur. İkincisi, diğer sindirim yöntemlerinden farklı olarak, bu protokol sindirim sırasında hücreleri ayırmak için nazik pipetleme gerektirir. Çalkalanan bir su banyosu da kaliteli bir tek hücreli süspansiyona neden olabilir. Üçüncüsü, yöntemimiz normal karotis arterlere uygulanabilir olduğundan, karotis plağının sindirimi için uygun olup olmadığı araştırılmaya devam etmektedir.
Sonuç olarak, vahşi tip farelerin karotis arterinden yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için iki aşamalı bir sindirim yöntemi tasarladık. Bu protokol, küçük değişikliklerle diğer damarlar için tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için kullanılabilir, bu da onu kardiyovasküler araştırmalarda çok yardımcı kılar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (82070450'den CT'ye ve 82170466'dan NZ'ye) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı'nın (7121102223'den FL'ye) burslarıyla desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
- Libby, P., et al.
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).
- Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).
- Stuart, T., et al.
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).
