Summary
ここでは、マウス頸動脈の単一細胞懸濁液を調製するための2段階の細胞消化プロトコルについて説明します。
Abstract
頸動脈は、脳に血液と酸素を供給する首の主要な血管ですが、頸動脈がプラークで詰まると頸動脈狭窄症が起こります。頸動脈の細胞組成を単一細胞レベルで明らかにすることは、頸動脈アテローム性動脈硬化症の治療に不可欠です。しかし、頸動脈からの単一細胞懸濁液を調製するためのすぐに使用できるプロトコルはありません。細胞へのダメージを抑えながら、単一細胞レベルで正常な頸動脈を解離させるのに適したプロトコルを得るために、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合することにより、2段階の消化法を設計しました。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の二重蛍光計数を使用して細胞の生存率と濃度を検出したところ、単一細胞懸濁液は、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、単一細胞シーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。単一細胞のデータ処理後、各頸動脈細胞で細胞あたり中央値~2500の転写産物が検出されました。特に、血管平滑筋細胞(VSMC)、線維芽細胞、内皮細胞(EC)、マクロファージおよび樹状細胞(Mφ/DC)など、正常な頸動脈のさまざまな細胞タイプが同時に検出可能でした。このプロトコルは適切な修正の他のティッシュからの血管の単一細胞懸濁液を準備するのに適用されてもよい。
Introduction
アテローム性動脈硬化症は、高血圧、高脂血症、血行動態などの危険因子に関連する慢性炎症性疾患です1。頸動脈分岐部は血行動態の変化を起こしやすく、頸動脈プラークの形成につながります。頸動脈アテローム性動脈硬化症の臨床症状は、脳卒中や一過性脳虚血などの急性の場合もあれば、再発性一過性脳虚血や血管性認知症などの慢性の場合もある2。機械的には、頸動脈プラークは、病理学的条件下での異なる血管壁細胞と様々な血液細胞との間の相互作用の結果である。したがって、生理学的および病理学的条件下で頸動脈血管の単一細胞アトラスを明らかにすることは、頸動脈プラークの発生を予防および治療するために特に重要です。
シングルセルRNAシーケンシングは、超高分解能で同じ細胞型の生物由来の細胞の不均一性を検出できるため、生物学研究において最も強力な技術の1つです3,4。研究者は、心血管疾患5やがん6など、多くの分野で研究を行うためにシングルセルRNAシーケンシングを使用してきました。しかし、組織を迅速かつ正確に単一細胞に分離することは、依然として主要な課題の1つです。酵素解離は、コラゲナーゼ、パパイン、トリプシン、DNase、ヒアルロニダーゼを主に含む一般的に使用される方法です。具体的には、コラゲナーゼは単一細胞消化の主要な酵素種であり、主に結合組織のコラーゲン成分を加水分解します。乳腺7、糸球体8、虹彩角膜角9、膝関節10、大動脈11、肺12など、異なる種類のコラゲナーゼが異なる組織の解離に適用可能である。異なる組織の特異な生理学的特性により、同じ方法で解離すると、細胞生存率の低下、細胞数の減少、細胞破片の多大化など、単一細胞の獲得に多くの問題が発生する可能性があります。したがって、異なる組織に対する消化法の発明は、高品質の単一細胞懸濁液を調製するために不可欠です。
このプロトコルは野生型マウスの頸動脈の単一セル懸濁液を準備するために二段階のセル消化力方法を開発することを向ける。コラゲナーゼは頸動脈組織のコラーゲンを加水分解し、さらにトリプシンで消化して単細胞懸濁液となるため、頸動脈の特性に応じて、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンを組み合わせ、マウス頸動脈の高品質な単細胞懸濁液を得ました。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の二重蛍光計数を使用して細胞の生存率と濃度を検出したところ、単一細胞懸濁液は、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、単一細胞シーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。シングルセルデータ解析の結果、消化後の正常なマウス頸動脈において、血管平滑筋細胞(VSMC)、線維芽細胞、内皮細胞(EC)、マクロファージおよび樹状細胞(Mφ/DC)の4種類の細胞が同定されました。このプロトコルの利点は、1)頸動脈の複数の細胞タイプを識別でき、2)細胞生存率がよく維持され、3)特別な機器なしで簡単に繰り返すことができます。このプロトコルは、マウス頸動脈の単一細胞マルチオミクスの研究に関心のある研究者に適しています。このプロトコルは、適切な修正を施すことで他の血管を解離させることにも役立つ可能性があります。
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Protocol
以下に説明するすべての動物手順は、東呉大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. 試薬・材料調製
- カルシウムとマグネシウムを含まない1x PBSと2.5 U/mLのヘパリンナトリウム塩を利用して、灌流溶液を調製します。4°Cで保存し、使用するときは氷上で予冷してください。
- 1250 CDU/mL のコラゲナーゼ II と 3000 U/mL の DNase I を HBSS で希釈することにより、125 CDU/mL のコラゲナーゼ II と 60 U/mL の DNase I を含む解離試薬 A を調製します。使用するまで4°Cで保管してください。
- 1 mLの0.25%EDTAフリートリプシン(フェノールレッドなし)を1 mLの1x PBSに希釈して、最終濃度0.12%トリプシンを含む解離試薬Bを調製します。使用するまで4°Cで保管してください。
- 1x PBSで10 mLの1.5% FBSと10 mLの5% FBSを調製します。1.5%FBSを使用して頸動脈をプールし、使用前に氷上に保管してください。5%FBSを使用して消化を中和し、室温(RT)で保存します。
- 1 mL シリンジ、26 G 針付き 20 mL シリンジ、6 ウェル細胞培養プレート、1.5 mL 遠心チューブ、40 μm 滅菌細胞ストレーナー、氷容器などの実験材料を入手してください。
2. 機器の準備
- 実体顕微鏡、解剖ハサミ、マイクロ解剖ハサミ、先端細い鉗子など、すべての手術器具を滅菌します。
- 自動セルカウンターをオンにし、RTに維持します。
- あらかじめ37°Cまで水浴をONにしてください。
- 使用前に微量遠心分離機を4°Cに予冷してください。
3. マウス頸動脈の単離
- 腹腔内注射で1.25%トリブロモエタノール(体重10 gごとに0.24 mL)を使用してマウスを麻酔し、マウスを裏返して3分後に正動反射があるかどうかを確認します。.次に、子宮頸部脱臼によりマウスを安楽死させ、仰向けに寝かせます。マウスの皮膚に75%アルコールをスプレーします。
- 滅菌された解剖ハサミを使用して皮膚を開き、胸腔を露出させます。ダイヤフラムを切り開きます。
- 下顎まで上向きに切断を続け、余分な結合組織と脂肪を慎重に取り除き、頸動脈を露出させます。
- マウスの下大静脈を切開して、閉じた循環から血流を作ります。
- 20 mLの予冷灌流溶液をシリンジで左心室にゆっくりと連続的に注入します。
注:灌流が成功すると、肝臓、脾臓、腎臓などの血液が豊富な臓器が灰白色に変わります。 - 頸動脈周辺の脂肪組織や結合組織を実体顕微鏡下でマイクロ解剖ハサミで剥がします。
注意: この手順は、頸動脈の損傷を防ぐために、ゆっくりと慎重に行う必要があります。 - マウスから頸動脈を単離し、1x PBSで洗浄して血液を再度洗い流し、氷上で1.5%FBSを含む6ウェルプレートに移します。
4. 頸動脈の単一細胞懸濁液への消化
- マイクロ解剖ハサミを使用して頸動脈を縦方向に解剖し、氷上に1.5%FBS1 mLを含む別の6ウェル細胞培養プレートに平らに置きます。
- 内膜を1.5%FBSで注意深く洗い流して、残留血液を取り除きます。
注:フラッシングは、内皮細胞を傷つけないように、穏やかでゆっくりと行う必要があります。 - 1.5%FBSのマイクロダイセクションハサミを使用して、各頸動脈を約2mm2 の組織片に切断します。
- これらの組織片を、1 mLのボアチップが付いた1.5 mLの遠心チューブに移し、400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、組織を底に沈めます。
- 上清を廃棄し、組織を500μLの解離試薬Aに再懸濁します。
- チューブを37°Cのウォーターバスに1時間入れます。10分ごとに1 mLのピペットで静かにピペットします。
- 500 μL の 5% FBS をチューブに加え、1 mL のピペットでよく混ぜます。
- 細胞懸濁液を40 μmの滅菌セルストレーナーでろ過し、新しい1.5 mL遠心チューブに入れ、400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を慎重に除去し、細胞ペレットを200 μLの解離試薬Bに再懸濁します。
- 37°Cのウォーターバスに入れ、さらに5分間消化します。消化中は2分ごとに静かにピペットで移し、完全に解離して単一細胞懸濁液にします。
- 200 μL の 5% FBS を使用して消化反応を終了し、400 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞ペレットを100 μLの1x PBSに氷上に再懸濁します。
5. 細胞懸濁試験とシングルセルRNAシーケンシング
- 10 μLのシングルセル懸濁液に10 μLのAO/PI溶液を加え、20 μLのピペットで穏やかに混合します。
- 混合物20μLをチャンバースライドにピペットで移し、1分間待ちます。
- スライドを自動セルカウンター装置にロードします。
- AO/PI Viability assay を選択し、品質レポートを待ちます。
- シングルセル 3 インチ試薬キットを使用して、シングルセルコントローラー上のエマルジョン中にシングルセルゲルビーズを生成し、メーカーのプロトコルに従ってサーマルサイクラーでバーコード化された cDNA を増幅します。
注:ここでは、Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3を使用しました。 - ペアエンド 150 bp (PE150) 読み取りストラテジーを使用してシーケンサーでシーケンシングを実行します。ソフトウェアアプリケーション(Cell Ranger)を使用して、 mkfastq パイプラインを使用して生のベースコールファイルをfastqファイルに変換します。次に、Cell Ranger のカウント パイプラインを使用して、アライメント、フィルタリング、バーコード カウント、および一意の分子識別子 (UMI) カウント を実行し、特徴バーコード マトリックスを生成します13。
- R パッケージ Seurat14 を使用して、データの次元削減と視覚化を実行します。
- まず、Seurat の Read10X() 関数が Cell Ranger パイプラインの出力を読み取り、カウント行列を使用して Seurat オブジェクトを作成します。次に、<200または>4000の遺伝子の発現、またはミトコンドリア遺伝子比が10%を超える細胞をSeuratの subset() 関数でフィルタリングします。
- NormalizeData() と FindVariableFeatures() を使用してデータを正規化し、それぞれ 2000 個の変動の大きい特徴を識別します。
- スケーリングされたデータに対して主成分分析 (PCA) を実行し、dims = 30、resolution = 0.5 でセルをクラスター化します。最後に、 RunUMAP () 関数を使用して単一セルのデータセットを可視化し、 FindAllMarkers() を使用して各クラスター バイオマーカーを見つけます。
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Representative Results
このプロトコルはマウス頸動脈(図1)の単一セル懸濁液を準備するための2段階のセル消化力方法を記述する。この2段階の細胞消化法は、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンを組み合わせて、マウス頸動脈血管壁を効果的に解離させ、シングルセルシーケンシング用の高品質のシングルセル懸濁液を取得します。解離後、細胞濃度および細胞生存率を自動セルカウンターで計算した。明視野は消化後の頸動脈血管細胞の形態を示し、AOPI二重蛍光染色は同時に細胞生存率を検出しました(図2A、B)。特に、解離試薬Aを単独で使用する場合と比較して、解離試薬Bと組み合わせると、頸動脈組織をより完全に解離させることができます。さらに、9本の動脈の生細胞数と、2段階の細胞消化後のシングルセルシーケンシングの要件を満たした平均細胞径が見つかりました(図2C)。一方、9つの左頸動脈から合計176,000個の単一細胞が収集され、ほとんどの血管血管が解離して生存率の高い単一細胞になりました(図2C)。
アライメント、フィルタリング、バーコードカウント、およびUMIカウントの後、シングルセルシーケンシングの生データをRパッケージSeuratで解析しました。細胞ごとの遺伝子の分布、細胞ごとのUMI、および細胞ごとのミトコンドリアリードをバイオリンプロットに示します(図3A-C)。特筆すべきは、各頸動脈細胞で細胞あたり~2500の転写産物の中央値が検出されたことです。低品質の細胞を除去した後、14,580個の細胞を検出し、下流のシングルセルRNA-seq解析に使用しました。類似したプロファイルを持つ2000の可変遺伝子を用いて、教師なしスーラベースのクラスタリングにより、消化後の正常なマウス頸動脈において、VSMC(74.0%)、線維芽細胞(16.5%)、EC(6.5%)、Mφ/DC(3.0%)を含む4つの主要な細胞型が示されました(図3D-F)。
図1:マウスの頸動脈消化の模式図。 マウス頸動脈を単離して切断した後、500μLの解離試薬Aを添加してマウス頸動脈を解離させた。細胞懸濁液を濾過して遠心分離すると、200 μLの解離試薬Bを添加してさらに解離させ、単一細胞懸濁液を得た。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:マウス頸動脈からの単一細胞懸濁液調製 。 (A)解離試薬Aで1時間消化した後の頸動脈細胞の細胞形態と細胞生存率を明視野とAOPI染色で示します。緑色蛍光で染色された有核細胞は生細胞であり、赤色蛍光で染色された有核細胞は死細胞です。スケールバー = 100 μm。 (B)2段階細胞消化後の頸動脈細胞の細胞形態と細胞生存率を明視野とAOPI染色で示しています。緑色蛍光で染色された有核細胞は生細胞であり、赤色蛍光で染色された有核細胞は死細胞です。スケールバー = 100 μm。 (C)細胞生存率、総細胞数、生細胞数、および平均細胞径を、2段階の細胞消化後に測定した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:scRNA-seqと頸動脈の細胞ランドスケープの標準的な品質管理(QC)指標 。 (A)scRNA-seqデータの細胞あたりの遺伝子の分布(nFeature RNA)、(B)細胞あたりのUMI(nCount_RNA)、(C)細胞あたりのミトコンドリアリード(パーセントmt)を示すバイオリンプロット。(D)頸動脈の同定された4つの細胞タイプを示すUniform Manfold Approximation and Projection(UMAP)プロット。(E)パネルDの各タイプのセルクラスターを定義するマーカーを示すドットプロット。各円のサイズは、各転写産物を発現するグループ内の細胞の割合を示します。青色の点は高発現の遺伝子、灰色の点は発現の低い遺伝子を示します。(F)野生型マウス(WT)のscRNA-seqで検出された4種類の細胞の相対存在量を示す積み上げ棒グラフ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、野生型マウスの頸動脈から高品質の単一細胞懸濁液を調製するための詳細なプロトコルを提供し、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合した2段階の消化法を構築しました。シングルセル懸濁液の品質チェックの結果、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、シングルセルシーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。さらに、頸動脈のVSMC、線維芽細胞、EC、Mφ/DCなど、さまざまな種類の細胞をシングルセルデータ処理で検出することに成功しました。
頸動脈単一細胞懸濁液を調製するための現在の方法はまだ不足しています。Depuydtらは、コラゲナーゼ、DNase、ヒトアルブミン画分V、およびフラボピリドールを37°Cで30分間組み合わせることにより、ヒト頸動脈プラークから単一細胞懸濁液を得た15。蛍光活性化細胞選別後、内皮細胞、平滑筋細胞、肥満細胞、B細胞、骨髄系細胞、T細胞など、14の異なる細胞集団を同定した15。さらに、研究者らは、0.25%トリプシン-EDTAと0.1%コラゲナーゼを用いてラットの総頸動脈を37°Cで消化し、シングルセルRNAシーケンシングに成功した16。VSMC、線維芽細胞、EC、移行細胞、マクロファージを含む5種類の細胞が、正常頸動脈と実験的頸動脈の両方で同定された16。さらに、頸動脈のEC濃縮単一細胞製剤を得るためのプロトコルも確立されています17。管腔酵素消化が完了した後、頸動脈フラッシングにより、scRNAseqおよびscATACseq17に十分なシングルセルペレットが得られます。消化時間を柔軟に制御するために、マウス頸動脈の組織解離と単一細胞懸濁液調製を分離した2段階消化法を開発しました。このプロセスは、125 CDU/mL のコラゲナーゼ II と 60 U/mL の DNase I で 1 時間、続いて EDTA フリーのトリプシンで 5 分間行います。重要なことに、血管の特性に基づいて、他の血管組織の消化のための方法の任意のステップを適切に変更することができます。
説明されている方法にはいくつかの制限があります。まず、この方法が in vitroでの初代細胞培養に使用できるかどうかはわかりません。頸動脈壁は薄く、細胞数も少ないため、 in vitro でどのように培養・増殖させるかが課題です。第二に、他の消化方法とは異なり、このプロトコルでは、消化中に細胞を解離するために穏やかなピペッティングが必要です。また、ウォーターバスを振とうと、良質のシングルセル懸濁液が得られる可能性があります。第三に、本手法は正常な頸動脈に適用できるため、頸動脈プラークの消化に適しているかどうかは検討の余地があります。
結論として、野生型マウスの頸動脈から高品質の単一細胞懸濁液を得るための2段階消化法を設計しました。このプロトコルは、軽微な修正を施した他の血管用の単一細胞懸濁液を調製するために使用でき、心血管研究に非常に役立ちます。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、中国自然科学基金会(82070450 to C.T.および82170466 to L.Z.)およびChina Postdoctoral Science Foundation(7121102223 to F.L.)のフェローシップからの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
- Libby, P., et al.
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).
- Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).
- Stuart, T., et al.
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).
