Summary
Здесь мы опишем двухэтапный протокол клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонных артерий мыши.
Abstract
Сонные артерии являются основными кровеносными сосудами в шее, которые снабжают кровью и кислородом мозг, но стеноз сонной артерии возникает, когда сонные артерии закупориваются бляшками. Выявление клеточного состава сонной артерии на одноклеточном уровне имеет важное значение для лечения атеросклероза сонной артерии. Однако готового к применению протокола приготовления одноклеточных суспензий из сонных артерий не существует. Чтобы получить подходящий протокол диссоциации нормальных сонных артерий на уровне одной клетки с меньшим повреждением клеток, мы разработали двухступенчатый метод расщепления путем интеграции процесса расщепления коллагеназы/ДНКазы и трипсина. Для определения жизнеспособности и концентрации клеток использовали подсчет двойной флуоресценции акридина оранжевого/пропидия (AO/PI), и было обнаружено, что одноклеточная суспензия удовлетворяет требованиям к секвенированию одиночных клеток, с жизнеспособностью клеток более 85% и высокой концентрацией клеток. После обработки данных одной клетки в каждой клетке сонной артерии было обнаружено медиана ~2500 транскриптов на клетку. Примечательно, что различные типы клеток нормальной сонной артерии, включая гладкомышечные клетки сосудов (VSMC), фибробласты, эндотелиальные клетки (EC), макрофаги и дендритные клетки (Mφ/DCs), были обнаружены одновременно. Этот протокол может быть применен для приготовления одноклеточной суспензии кровеносных сосудов из других тканей с соответствующими модификациями.
Introduction
Атеросклероз — это хроническое воспалительное заболевание, связанное с такими факторами риска, как высокое кровяное давление, гиперлипидемия и гемодинамика1. Бифуркации сонных артерий склонны к гемодинамическим изменениям и приводят к образованию сонных бляшек. Клиническая картина атеросклероза сонных артерий может быть острой, такой как инсульт и транзиторная ишемия головного мозга, или хронической, такой как рецидивирующая транзиторная ишемия головного мозга и сосудистая деменция2. Механически бляшка на сонной артерии является результатом взаимодействия между клетками стенки различных сосудов и различными клетками крови при патологических состояниях. Поэтому выявление одноклеточного атласа сонных сосудов в физиологических и патологических условиях особенно важно для профилактики и лечения развития каротидных бляшек.
Секвенирование одноклеточной РНК является одной из самых мощных технологий биологических исследований из-за ее сверхвысокого разрешения и обнаружения клеточной гетерогенности от одного и того же типа клеток организмов 3,4. Исследователи использовали секвенирование одноклеточной РНК для проведения исследований во многих областях, таких как сердечно-сосудистые заболевания5 и рак6. Тем не менее, быстрое и точное разделение тканей на отдельные клетки по-прежнему остается одной из основных задач. Ферментативная диссоциация является широко используемым методом, который преимущественно включает коллагеназу, папаин, трипсин, ДНКазу и гиалуронидазу. В частности, коллагеназы являются основными видами ферментов для пищеварения отдельных клеток, в основном гидролизующих компоненты коллагена в соединительных тканях. Различные типы коллагеназ применимы для диссоциации различных тканей, таких как молочная железа7, клубочек8, иридокорнеальный угол9, коленный сустав10, аорта11 илегкое 12. Из-за уникальных физиологических свойств различных тканей диссоциация с использованием одного и того же метода может вызвать множество проблем при получении одиночных клеток, таких как низкая жизнеспособность клеток, низкое количество клеток и крупный клеточный мусор. Поэтому изобретение методов пищеварения для различных тканей имеет важное значение для получения высококачественных одноклеточных суспензий.
Этот протокол направлен на разработку двухэтапного метода клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонной артерии мышей дикого типа. В соответствии с особенностями сонной артерии мы объединили коллагеназу/ДНКазу с трипсином для получения высококачественной одноклеточной суспензии сонной артерии мыши, поскольку коллагеназа может гидролизовать коллаген сонных тканей, который в дальнейшем переваривался трипсином в одноклеточную суспензию. Для определения жизнеспособности и концентрации клеток использовали подсчет двойной флуоресценции акридина оранжевого/пропидия (AO/PI), и было обнаружено, что одноклеточная суспензия удовлетворяет требованиям к секвенированию одиночных клеток, с жизнеспособностью клеток более 85% и высокой концентрацией клеток. После обработки данных отдельных клеток в нормальных сонных артериях мышей после пищеварения были идентифицированы четыре типа клеток, включая гладкомышечные клетки сосудов (VSMC), фибробласты, эндотелиальные клетки (EC), а также макрофаги и дендритные клетки (Mφ/DCs). Преимущества данного протокола заключаются в том, что: 1) можно идентифицировать несколько типов клеток в сонной артерии, 2) жизнеспособность клеток хорошо сохраняется, и 3) его можно легко повторить без специального оборудования. Этот протокол подходит для исследователей, которые заинтересованы в изучении одноклеточной мультиомики сонных артерий мышей. Этот протокол также может быть полезен при диссоциации других кровеносных сосудов с соответствующими модификациями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Сучжоу.
1. Подготовка реагентов и материалов
- Для приготовления перфузионного раствора используют 1x PBS без кальция и магния и 2,5 ед/мл гепариновой натриевой соли. Хранить при температуре 4 °C, а при использовании охладить на льду.
- Приготовьте диссоциационный реагент А, содержащий 125 КД/мл коллагеназы II и 60 ЕД/мл ДНКазы I, разбавляя 1250 ЕД/мл коллагеназы II и 3000 ЕД/мл ДНКазы I с HBSS. Хранить при температуре 4 °C до использования.
- Приготовьте диссоциационный реагент B, содержащий конечную концентрацию 0,12% трипсина, разбавив 1 мл 0,25% трипсина, не содержащего ЭДТА (без фенолового красного), в 1 мл 1x PBS. Хранить при температуре 4 °C до использования.
- Приготовьте 10 мл 1,5% FBS и 10 мл 5% FBS в 1x PBS. Используйте 1,5% FBS для бассейна сонных артерий и держите на льду перед использованием. Используйте 5% FBS для нейтрализации пищеварения и храните при комнатной температуре (RT).
- Получите экспериментальные материалы, в том числе шприцы объемом 1 мл, шприцы по 20 мл с иглами 26 г, шестилуночные планшеты для клеточных культур, центрифужные пробирки объемом 1,5 мл, стерильные клеточные фильтры объемом 40 мкм и контейнеры для льда.
2. Подготовка оборудования
- Стерилизуйте все хирургическое оборудование, включая стереоскопический микроскоп, ножницы для препарирования, ножницы для микропрепарирования и щипцы с тонким наконечником.
- Включите автоматический счетчик ячеек и поддерживайте его на RT.
- Заранее включите водяную баню до 37 °C.
- Перед использованием охладите микроцентрифугу до 4 °C.
3. Изоляция сонной артерии мыши
- Обезболить мышь 1,25% трибромэтанолом путем внутрибрюшинной инъекции (0,24 мл на каждые 10 г массы тела) и через 3 мин перевернуть мышь, чтобы проверить, есть ли рефлекс выпрямления. Затем усыпьте мышь при вывихе шейки матки и положите ее на спину. Опрыскайте кожу мыши 75% спиртом.
- Используйте стерилизованные ножницы для препарирования, чтобы вскрыть кожу и обнажить грудную полость. Разрежьте диафрагму.
- Продолжайте разрез вверх до нижней челюсти и осторожно удаляйте излишки соединительной ткани и жира, обнажая сонную артерию.
- Перережьте нижнюю полую вену мыши, чтобы кровь вытекла из замкнутого кровообращения.
- Медленно и непрерывно ввести 20 мл предварительно охлажденного раствора перфузии в левый желудочек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если перфузия проходит успешно, богатые кровью органы, такие как печень, селезенка и почки, становятся серо-белыми. - Снимите весь жир и соединительные ткани вокруг сонной артерии микропрепарирующими ножницами под стереоскопическим микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует выполнять медленно и осторожно, чтобы предотвратить повреждение сонной артерии. - Изолируйте сонную артерию от мыши, промойте 1x PBS, чтобы снова промыть кровь, и переложите на шестилуночные планшеты, содержащие 1,5% FBS на льду.
4. Переваривание сонной артерии в одноклеточную суспензию
- Используйте ножницы для микропрепарирования, чтобы рассечь сонную артерию в продольном направлении и положить на другую 6-луночную планшет для культивирования клеток, содержащую 1 мл 1,5% FBS на льду.
- Тщательно промойте интим 1,5% FBS, чтобы удалить остатки крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывание должно быть мягким и медленным, чтобы не повредить эндотелиальные клетки. - Разрежьте каждую сонную артерию примерно на 2мм2 кусочка ткани с помощью микропрепарирующих ножниц в 1,5% FBS.
- Переложите эти кусочки ткани в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл с широкими наконечниками диаметром 1 мл, центрифугу при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C, чтобы ткани опустились на дно.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте ткани в 500 мкл диссоциационного реагента А.
- Поместите пробирку на водяную баню с температурой 37 °C на 1 час. Осторожно пипетку 1 мл каждые 10 минут.
- Добавьте в пробирку 500 мкл 5% FBS и хорошо перемешайте пипеткой объемом 1 мл.
- Отфильтруйте клеточную суспензию через стерильный клеточный фильтр 40 мкм в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл диссоциационного реагента B.
- Поставьте на водяную баню с температурой 37 °C и варите еще 5 минут. Осторожно пипетка каждые 2 минуты во время пищеварения полностью диссоциирует в одноклеточную суспензию.
- Используйте 200 мкл 5% FBS для прекращения реакции разложения и центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл 1x PBS на льду.
5. Исследование клеточной суспензии и секвенирование одноклеточной РНК
- Добавьте 10 мкл раствора АО/ПИ в 10 мкл одноклеточной суспензии и аккуратно перемешайте пипеткой объемом 20 мкл.
- Пипеткой 20 мкл смеси в камеру слайда и подождите 1 мин.
- Загрузите ползунок в автоматический прибор счетчика клеток.
- Выберите анализ жизнеспособности AO/PI и дождитесь отчета о качестве.
- Используйте набор одноклеточных 3ʹ-реагентов для генерации одноклеточных гелевых шариков в эмульсии на одноклеточном контроллере и амплифицируйте кДНК со штрих-кодом в термоамплификаторе в соответствии с протоколом производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались наборы реагентов Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3. - Выполняйте секвенирование на секвенсоре со стратегией считывания парных 150.н. (PE150). Используйте программное приложение (Cell Ranger) для преобразования необработанных файлов базовых вызовов в файлы fastq с помощью конвейера mkfastq . Затем используйте конвейер Count Pipeline в Cell Ranger для выполнения выравнивания, фильтрации, подсчета штрихкодов и подсчета уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) для создания матриц штрихкодов13.
- Уменьшение размерности данных и визуализация с помощью пакета R Seurat14.
- Во-первых, функция Read10X() Seurat считывает выходные данные конвейера Cell Ranger, а затем использует матрицу счетчика для создания объекта Seurat. Затем отфильтруйте клетки с экспрессией генов <200 или >4000 или соотношением митохондриальных генов, которое составляло более 10% по функции подмножества() Сёра.
- Используйте NormalizeData() и FindVariableFeatures() для нормализации данных и определения 2000 сильно изменчивых признаков соответственно.
- Выполните анализ главных компонент (PCA) для масштабированных данных и кластеризуйте ячейки с dims = 30 и разрешением = 0,5. Наконец, используйте функцию RunUMAP () для визуализации наборов данных с одной ячейкой и функцию FindAllMarkers() для поиска каждого биомаркера кластера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает двухэтапный метод клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонных артерий мыши (рис. 1). Этот двухэтапный метод клеточного пищеварения сочетает коллагеназу/ДНКазу с трипсином для эффективной диссоциации сосудистой стенки сонной артерии мыши для получения высококачественных одноклеточных суспензий для секвенирования отдельных клеток. После диссоциации концентрацию клеток и жизнеспособность клеток рассчитывали с помощью автоматического счетчика клеток. Яркое поле показывало морфологию клеток сонных сосудов после расщепления, а двойное флуоресцентное окрашивание AOPI одновременно определяло жизнеспособность клеток (рис. 2А,Б). Примечательно, что по сравнению с использованием только диссоциационного реагента А, ткань сонной артерии может быть более тщательно диссоциирована в сочетании с диссоциационным реагентом В. Кроме того, мы обнаружили жизнеспособное количество клеток в девяти артериях, а средний диаметр клеток удовлетворял требованиям секвенирования отдельных клеток после двухэтапного клеточного расщепления (рис. 2C). Между тем, в общей сложности 176 000 одиночных клеток были собраны из девяти левых сонных артерий, и большинство сосудистых сосудов были диссоциированы на одиночные клетки с высокой жизнеспособностью (рис. 2C).
После выравнивания, фильтрации, подсчета штрихкодов и подсчета UMI необработанные данные секвенирования отдельных клеток были проанализированы с помощью пакета R Seurat. Распределение генов на клетку, UMI на клетку и митохондриальные чтения на клетку показаны на графиках скрипки (рис. 3A-C). Примечательно, что в каждой клетке сонной артерии было обнаружено медиана ~2500 транскриптов на клетку. После удаления низкокачественных клеток было обнаружено 14 580 клеток, которые были использованы для последующего анализа одноклеточной РНК-секвенирования. Используя 2000 вариабельных генов со сходными профилями, неконтролируемая кластеризация на основе Сёра показала четыре основных типа клеток, включая VSMC (74,0%), фибробласты (16,5%), EC (6,5%) и Mφ/DCs (3,0%), в нормальных сонных артериях мышей после пищеварения (рис. 3D-F).
Рисунок 1: Принципиальная схема пищеварения сонной артерии мыши. После того, как сонная артерия мыши была изолирована и перерезана, было добавлено 500 мкл диссоциационного реагента А для диссоциации сонной артерии мыши. Когда клеточную суспензию фильтровали и центрифугировали, добавляли 200 мкл диссоциационного реагента В для дальнейшей диссоциации с получением одноклеточной суспензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Препарат одноклеточной суспензии из сонной артерии мыши. (A) Морфология клеток и жизнеспособность клеток сонной артерии после 1 ч расщепления с диссоциационным реагентом А показаны в ярком поле зрения и окрашивании AOPI. Ядросодержащие клетки, окрашенные зеленой флуоресценцией, являются живыми клетками, в то время как клетки, окрашенные красной флуоресценцией, являются мертвыми клетками. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Морфология клеток и жизнеспособность клеток сонной артерии после двухэтапного клеточного расщепления показаны в ярком поле зрения и окрашивании AOPI. Ядросодержащие клетки, окрашенные зеленой флуоресценцией, являются живыми клетками, в то время как клетки, окрашенные красной флуоресценцией, являются мертвыми клетками. Масштабная линейка = 100 мкм. (C) Жизнеспособность клеток, общее количество клеток, количество жизнеспособных клеток и средний диаметр клеток были измерены после двухступенчатого клеточного разложения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Стандартные показатели контроля качества (КК) для scRNA-seq и клеточного ландшафта сонной артерии . (A) Графики Скрипки, показывающие распределение генов на клетку (nFeature RNA), (B) UMI на клетку (nCount_RNA) и (C) митохондриальные чтения на клетку (% mt) для данных scRNA-seq. (D) График равномерной аппроксимации и проекции многообразия (UMAP), показывающий четыре идентифицированных типа клеток сонной артерии. (E) Точечная диаграмма, показывающая маркеры, определяющие каждый тип кластера клеток на панели D. Размер каждого круга обозначает пропорцию ячеек в группе, выражающую каждый транскрипт. Синие точки указывают на гены с высокой экспрессией, а серые точки указывают на гены с низкой экспрессией. (F) Гистограмма с накоплением, показывающая относительное обилие четырех типов клеток, обнаруженных scRNA-seq мышей дикого типа (WT). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы приводим подробный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из сонной артерии мышей дикого типа, в котором был сконструирован двухстадийный метод пищеварения, интегрирующий процесс пищеварения коллагеназы/ДНКазы и трипсина. После проверки качества одноклеточной суспензии мы обнаружили, что она удовлетворяет требованиям к секвенированию одиночных клеток, с жизнеспособностью клеток более 85% и высокой концентрацией клеток. Кроме того, различные типы клеток в сонной артерии, включая VSMC, фибробласты, EC и Mφ/DCs, были успешно обнаружены после обработки данных одной клетки.
Современные методы приготовления одноклеточных суспензий сонной артерии до сих пор немногочисленны. Depuydt et al. получили одноклеточную суспензию из каротидных бляшек человека, комбинируя коллагеназу, ДНКазу, человеческую альбуминную фракцию V и флавопиридол при 37 °C в течение 30 мин15. После флуоресцентной сортировки клеток они идентифицировали 14 различных клеточных популяций, включая эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки, тучные клетки, В-клетки, миелоидные клетки и Т-клетки15. Кроме того, исследователи переваривали общие сонные артерии крыс, используя 0,25% трипсин-ЭДТА и 0,1% коллагеназы при 37 °C, и успешно проводили секвенирование одноклеточной РНК16. Пять типов клеток, включая VSMC, фибробласты, ECs, переходные клетки и макрофаги, были идентифицированы как в нормальных, так и в экспериментальных сонных артериях16. Кроме того, также установлен протокол получения ЕС-обогащенных одноклеточных препаратов сонной артерии17. После завершения просветного ферментативного расщепления при промывании сонной артерии будет получено достаточное количество одноклеточных гранул для scRNAseq и scATACseq17. Для гибкого контроля времени переваривания мы разработали двухэтапный метод пищеварения сонных артерий мыши, разделяющий стадии диссоциации тканей и приготовления одноклеточной суспензии. Процесс начинается с 125 CDU/мл коллагеназы II и 60 U/мл ДНКазы I в течение 1 ч, после чего следует трипсин, свободный от ЭДТА, в течение 5 мин. Важно отметить, что мы можем соответствующим образом модифицировать любой этап метода переваривания тканей других кровеносных сосудов, основываясь на характеристиках кровеносных сосудов.
У описываемого метода есть некоторые ограничения. Во-первых, мы не знаем, можно ли использовать этот метод для первичной клеточной культуры in vitro. Поскольку стенка сонной артерии тоньше и содержит меньше клеток, культивирование и размножение in vitro является сложной задачей. Во-вторых, в отличие от других методов пищеварения, этот протокол требует осторожного пипетирования для диссоциации клеток во время пищеварения. Водяная баня с встряхиванием также может привести к получению высококачественной одноклеточной суспензии. В-третьих, поскольку наш метод применим к нормальным сонным артериям, еще предстоит изучить, подходит ли он для переваривания сонных бляшек.
В заключение был разработан двухступенчатый метод пищеварения для получения высококачественной одноклеточной суспензии из сонной артерии мышей дикого типа. Этот протокол может быть использован для приготовления одноклеточных суспензий для других сосудов с незначительными изменениями, что делает его очень полезным в сердечно-сосудистых исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Фонда естественных наук Китая (82070450 для К.Т. и 82170466 для Л.З.) и стипендией Китайского фонда постдокторантуры (7121102223 для Ф.Л.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
- Libby, P., et al.
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).
- Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).
- Stuart, T., et al.
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).
