Beredning av en encellssuspension från mössens halspulsådror för encellssekvensering

Summary

Här beskriver vi ett tvåstegs cellmatsmältningsprotokoll för att förbereda en encellssuspension av musens halspulsåder.

Abstract

Halspulsådrorna är stora blodkärl i halsen som förser hjärnan med blod och syre, men karotisstenos uppstår när halspulsådrorna täpps till av plack. Att avslöja den cellulära sammansättningen av halspulsådern på encellsnivå är viktigt för behandling av karotisateroskleros. Det finns dock inget färdigt protokoll för beredning av encellssuspensioner från halspulsådern. För att få ett lämpligt protokoll för dissociation av normala halspulsådror på encellsnivå med mindre skador på cellerna, utformade vi en tvåstegs matsmältningsmetod genom att integrera matsmältningsprocessen av kollagenas/DNas och trypsin. Dubbelfluorescensräkning av akridinorange/propidiumjodid (AO/PI) användes för att detektera cellviabilitet och koncentration, och det visade sig att encellssuspensionen uppfyllde kraven för encellssekvensering, med cellviabilitet över 85 % och en hög cellkoncentration. Efter databehandling med en cell detekterades en median på ~2500 transkript per cell i varje halspulsådercell. Noterbart är att en mängd olika celltyper i den normala halspulsådern, inklusive vaskulära glatta muskelceller (VSMC), fibroblaster, endotelceller (EC) och makrofager och dendritiska celler (Mφ/DC), kunde detekteras samtidigt. Detta protokoll kan användas för att bereda en encellssuspension av blodkärl från andra vävnader med lämpliga modifieringar.

Introduction

Åderförkalkning är en kronisk inflammatorisk sjukdom förknippad med riskfaktorer som högt blodtryck, hyperlipidemi och hemodynamik¹. Halspulsåderns förgreningar är benägna att drabbas av hemodynamiska förändringar och leder till att plack bildas i halspulsådern. Den kliniska presentationen av karotisateroskleros kan vara akut såsom stroke och övergående cerebral ischemi, eller kronisk såsom återkommande övergående cerebral ischemi och vaskulär demens². Mekaniskt är karotisplack resultatet av interaktionen mellan olika kärlväggsceller och olika blodceller under patologiska förhållanden. Därför är det särskilt viktigt att avslöja den encelliga atlasen över karotiskärl under fysiologiska och patologiska förhållanden för att förebygga och behandla utvecklingen av karotisplack.

Encells-RNA-sekvensering är en av de mest kraftfulla teknikerna inom biologisk forskning på grund av dess ultrahöga upplösning och detektion av cellheterogenitet från samma celltyp av organismer ^3,4. Forskare har använt encells-RNA-sekvensering för att bedriva forskning inom många områden, till exempel hjärt-kärlsjukdom⁵ och cancer⁶. Att snabbt och exakt separera vävnader till enskilda celler är dock fortfarande en av de största utmaningarna. Enzymatisk dissociation är en vanligt förekommande metod som främst inkluderar kollagenas, papain, trypsin, DNas och hyaluronidas. Kollagenaser är de viktigaste enzymerna för encellig matsmältning, främst hydrolyserande kollagenkomponenter i bindväv. Olika kollagenastyper är tillämpliga för dissociation av olika vävnader, såsom bröstkörteln⁷, glomerulus⁸, iridohornhinnans vinkel⁹, knäled 10, aorta¹¹ och lunga¹². På grund av de unika fysiologiska egenskaperna hos olika vävnader kan dissociation med samma metod orsaka många problem med att förvärva enstaka celler, såsom låg cellviabilitet, lågt cellantal och stora cellrester. Därför är uppfinningen av matsmältningsmetoder för olika vävnader avgörande för att framställa högkvalitativa encellssuspensioner.

Detta protokoll syftar till att utveckla en tvåstegs cellsmältningsmetod för att förbereda en encellssuspension av halspulsådern hos vildtypsmöss. Enligt egenskaperna hos halspulsådern kombinerade vi kollagenas/DNas med trypsin för att få en högkvalitativ encellssuspension av mössens halspulsåder eftersom kollagenas kan hydrolysera kollagen i halspulsådern, som smältes vidare av trypsin till en encellssuspension. Dubbelfluorescensräkning av akridinorange/propidiumjodid (AO/PI) användes för att detektera cellviabilitet och koncentration, och det visade sig att encellssuspensionen uppfyllde kraven för encellssekvensering, med cellviabilitet över 85 % och en hög cellkoncentration. Efter databehandling med enskilda celler identifierades fyra celltyper, inklusive vaskulära glatta muskelceller (VSMC), fibroblaster, endotelceller (EC) och makrofager och dendritiska celler (Mφ/DC), i normala halspulsådror hos möss efter matsmältning. Fördelarna med detta protokoll är att: 1) flera celltyper i halspulsådern kan identifieras, 2) cellviabiliteten är väl bevarad och 3) den kan enkelt upprepas utan specialutrustning. Detta protokoll är lämpligt för forskare som är intresserade av att studera encelliga multiomiker i mössens halspulsåder. Detta protokoll kan också vara till hjälp vid dissociation av andra blodkärl med lämpliga modifieringar.

Protocol

Alla djurförsök som beskrivs nedan har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Soochow University.

1. Reagenser och materialberedning

1. Använd 1x PBS utan kalcium och magnesium och 2,5 E/ml heparinnatriumsalt för att bereda perfusionslösningen. Förvaras vid 4 °C och förkyls på is vid användning.
2. Bered dissociationsreagens A som innehåller 125 CDU/ml kollagenas II och 60 E/ml DNas I genom att späda 1250 CDU/ml kollagenas II och 3000 E/ml DNas I med HBSS. Förvaras vid 4 °C fram till användning.
3. Bered dissociationsreagens B som innehåller en slutlig koncentration på 0,12 % trypsin genom att späda 1 ml 0,25 % EDTA-fritt trypsin (utan fenolrött) till 1 ml 1x PBS. Förvaras vid 4 °C fram till användning.
4. Förbered 10 ml 1.5 % FBS och 10 ml 5 % FBS i 1x PBS. Använd 1,5 % FBS för att poola halspulsådrorna och håll på is före användning. Använd 5 % FBS för att neutralisera matsmältningen och förvara i rumstemperatur (RT).
5. Skaffa experimentmaterialen, inklusive 1 ml sprutor, 20 ml sprutor med 26-G nålar, sex-brunns cellodlingsplattor, 1,5 ml centrifugrör, 40 μm sterila cellsilar och isbehållare.

2. Förberedelse av utrustning

1. Sterilisera all kirurgisk utrustning, inklusive ett stereoskopiskt mikroskop, dissekeringssax, mikrodissekerande sax och pincett med fin spets.
2. Slå på den automatiska cellräknaren och håll den på RT.
3. Sätt på vattenbadet till 37 °C i förväg.
4. Förkyl mikrocentrifugen till 4 °C före användning.

3. Isolering av mössens halspulsåder

1. Bedöva musen med 1,25 % tribrometanol genom intraperitoneal injektion (0,24 ml för varje 10 g kroppsvikt) och vänd musen för att kontrollera om det finns en rätande reflex efter 3 minuter. Avliva sedan musen genom cervikal luxation och lägg den på rygg. Spraya musens hud med 75 % alkohol.
2. Använd steriliserad dissekeringssax för att öppna upp huden och exponera brösthålan. Skär upp membranet.
3. Fortsätt att skära uppåt till underkäken och ta försiktigt bort överflödig bindväv och fett, exponera halspulsådern.
4. Skär av musens nedre hålven för att få blodet att flöda ut ur den slutna cirkulationen.
5. Injicera 20 ml förkyld perfusionslösning i vänster kammare med en spruta långsamt och kontinuerligt.
   OBS: Om perfusionen lyckas kommer blodrika organ som lever, mjälte och njurar att bli gråvita.
6. Dra av allt fett och bindväv runt halspulsådern med en mikrodissekerande sax under ett stereoskopiskt mikroskop.
   OBS: Detta steg bör göras långsamt och försiktigt för att förhindra skador på halspulsådern.
7. Isolera halspulsådern från musen, tvätta med 1x PBS för att spola blodet igen och överför till plattor med sex brunnar som innehåller 1,5 % FBS på is.

4. Matsmältning av halspulsådern till encellssuspension

1. Använd mikrodissekerande sax för att dissekera halspulsådern i längdriktningen och lägg platt i en annan 6-brunns cellodlingsplatta som innehåller 1 ml 1.5 % FBS på is.
2. Spola intima försiktigt med 1.5 % FBS för att ta bort kvarvarande blod.
   OBS: Spolningen bör vara försiktig och långsam för att undvika att endotelceller skadas.
3. Skär varje halspulsåder i cirka 2 mm² vävnadsbitar med hjälp av mikrodissekerande sax i 1,5 % FBS.
4. Överför dessa vävnadsbitar till ett 1,5 ml centrifugrör med 1 ml breda borrspetsar, centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C för att sänka vävnaderna till botten.
5. Kassera supernatanten och återsuspendera vävnaderna i 500 μl dissociationsreagens A.
6. Placera röret i ett 37 °C vattenbad i 1 timme. Pipettera försiktigt med en 1 ml pipett var 10:e minut.
7. Tillsätt 500 μL 5% FBS i röret och blanda väl med en 1 ml pipett.
8. Filtrera cellsuspensionen genom en 40 μm steril cellsil till ett nytt 1,5 ml centrifugrör och centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
9. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 200 μl dissociationsreagens B.
10. Lägg i ett 37 °C vattenbad och smält i ytterligare 5 minuter. Pipettera försiktigt varannan minut under matsmältningen för att helt dissociera till en encellssuspension.
11. Använd 200 μl 5 % FBS för att avsluta uppslutningsreaktionen och centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
12. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 100 μL 1x PBS på is.

5. Undersökning av cellsuspensioner och encells-RNA-sekvensering

1. Tillsätt 10 μl AO/PI-lösning till 10 μl encellssuspension och blanda försiktigt med en 20 μL pipett.
2. Pipettera 20 μL av blandningen i kammarsliden och vänta i 1 min.
3. Ladda sliden i det automatiserade cellräknarinstrumentet.
4. Välj AO/PI Viability-analysen och vänta sedan på kvalitetsrapporten.
5. Använd ett encells 3ʹ-reagenskit för att generera encelliga gelpärlor i emulsionen på en encellsstyrenhet och amplifiera det streckkodade cDNA:t i en termisk cykler enligt tillverkarens protokoll.
   OBS: Här användes Chromium Single Cell 3ʹReage Kits v3.
6. Utför sekvensering på en sequencer med en parad 150 bp (PE150) lässtrategi. Använd ett program (Cell Ranger) för att konvertera råa basanropsfiler till fastq-filer med hjälp av mkfastq-pipelinen . Använd sedan Count Pipeline of Cell Ranger för att utföra justering, filtrering, streckkodsräkning och UMI-räkning (unique molecular identifier) för att generera funktionsstreckkodsmatriser¹³.
7. Utför minskning och visualisering av datadimensionalitet med R-paketet Seurat¹⁴.
   1. Först läser funktionen Read10X() för Seurat i utdata från Cell Ranger-pipelinen och använder sedan count-matrisen för att skapa ett Seurat objekt. Filtrera sedan bort cellerna med uttryck av <200 eller >4000 gener eller ett mitokondriellt genförhållande som var mer än 10 % av subset() -funktionen av Seurat.
   2. Använd NormalizeData () och FindVariableFeatures() för att normalisera data och identifiera 2000 mycket variabla funktioner.
   3. Utför huvudkomponentanalys (PCA) på skalade data och klustra cellerna med dims = 30 och upplösning = 0,5. Använd slutligen funktionen RunUMAP () för att visualisera datauppsättningarna med en cell och FindAllMarkers() för att hitta varje klusterbiomarkör.

Representative Results

Detta protokoll beskriver en tvåstegs cellnedbrytningsmetod för att bereda en encellssuspension av mössens halspulsådror (figur 1). Denna tvåstegs cellnedbrytningsmetod kombinerar kollagenas/DNas med trypsin för att effektivt dissociera musens karotiskärlvägg för att erhålla högkvalitativa encellssuspensioner för encellssekvensering. Efter dissociation beräknades cellkoncentrationen och cellviabiliteten med hjälp av en automatiserad cellräknare. Det ljusa fältet visade morfologin hos kärlceller i halspulsådern efter matsmältning, och AOPI dubbelfluorescensfärgning detekterade samtidigt cellviabilitet (Figur 2A,B). Jämfört med att enbart använda dissociationsreagens A kan halspulsådervävnad dissocieras mer noggrant i kombination med dissociationsreagens B. Vi fann vidare ett livskraftigt celltal på nio artärer, och den genomsnittliga celldiametern uppfyllde kraven för encellssekvensering efter tvåstegscellnedbrytning (Figur 2C). Samtidigt samlades totalt 176 000 enskilda celler in från nio vänstra halspulsåder, och de flesta kärlkärl dissocierades till enstaka celler med hög viabilitet (Figur 2C).

Efter justering, filtrering, streckkodsräkning och UMI-räkning analyserades rådata för encellssekvensering med R-paketet Seurat. Fördelningen av gener per cell, UMI per cell och mitokondriella avläsningar per cell visas i fioldiagram (Figur 3A-C). Noterbart är att en median på ~2500 transkript per cell detekterades i varje halspulsådercell. Efter att ha avlägsnat cellerna av låg kvalitet detekterades 14 580 celler och användes för nedströms encells-RNA-seq-analys. Med hjälp av 2000 variabla gener med liknande profiler, visade oövervakad Seurat-baserad klustring fyra huvudcelltyper, inklusive VSMC (74,0 %), fibroblaster (16,5 %), EC (6,5 %) och Mφ/DC (3,0 %), i normala halspulsådror hos möss efter matsmältning (Figur 3D-F).

Figur 1: Schematisk bild av matsmältningen av halspulsådern hos möss. Efter att mössens halspulsåder hade isolerats och skurits av tillsattes 500 μL dissociationsreagens A för att dissociera mössens halspulsåder. När cellsuspensionen filtrerades och centrifugerades tillsattes 200 μl dissociationsreagens B för ytterligare dissociation för att erhålla en encellssuspension. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Encellssuspensionsberedning från mössens halspulsåder . (A) Cellmorfologin och cellviabiliteten hos halspulsåderceller efter 1 timmes uppslutning med dissociationsreagens A visas i ljusfältsvyn och AOPI-färgningen. Kärnförsedda celler färgade med grön fluorescens är levande celler, medan de färgade med röd fluorescens är döda celler. Skalstapel = 100 μm. (B) Cellmorfologin och cellviabiliteten hos halspulsåderceller efter tvåstegs cellnedbrytning visas i ljusfältsvyn och AOPI-färgningen. Kärnförsedda celler färgade med grön fluorescens är levande celler, medan de färgade med röd fluorescens är döda celler. Skalstapel = 100 μm. (C) Cellviabilitet, totalt cellantal, antal livsdugliga celler och genomsnittlig celldiameter mättes efter tvåstegs celluppslutning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Standardmått för kvalitetskontroll (QC) för scRNA-seq och celllandskapet i halspulsådern. (A) Violindiagram som visar fördelningen av gener per cell (nFeature RNA), (B) UMI per cell (nCount_RNA) och (C) mitokondriella avläsningar per cell (procent mt) för scRNA-seq-data. (D) Enhetligt grenrörsapproximations- och projektionsdiagram (UMAP) som visar de fyra identifierade celltyperna i halspulsådern. (E) Punktdiagram som visar markörerna som definierar varje typ av cellkluster i panel D. Storleken på varje cirkel anger cellandelen inom gruppen som uttrycker varje transkription. De blå prickarna indikerar starkt uttryckta gener och de grå prickarna indikerar gener med lågt uttryck. (F) Staplat stapeldiagram som visar den relativa förekomsten av de fyra celltyper som påvisats med scRNA-seq hos vildtypsmöss (WT). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för beredning av en högkvalitativ encellssuspension från halspulsådern hos vildtypsmöss, där en tvåstegs matsmältningsmetod som integrerar matsmältningsprocessen av kollagenas/DNas och trypsin konstruerades. Efter kvalitetskontrollen av encellssuspensionen fann vi att den uppfyllde kraven för encellssekvensering, med en livskraft på över 85 % och en hög cellkoncentration. Dessutom upptäcktes en mängd olika celltyper i halspulsådern, inklusive VSMC, fibroblaster, EC och Mφ/DCs, framgångsrikt efter encellsdatabehandling.

Nuvarande metoder för beredning av encelliga karotissuspensioner är fortfarande knapphändiga. Depuydt et al. erhöll en encellssuspension från humana karotisplack genom att kombinera kollagenas, DNas, humanalbuminfraktion V och Flavopiridol vid 37 °C i 30 minuter¹⁵. Efter fluorescensaktiverad cellsortering identifierade de 14 distinkta cellpopulationer, inklusive endotelceller, glatta muskelceller, mastceller, B-celler, myeloida celler och T-celler¹⁵. Dessutom smälte forskare råttornas vanliga halspulsåder med 0,25 % trypsin-EDTA och 0,1 % kollagenas vid 37 °C och utförde framgångsrikt encellig RNA-sekvensering¹⁶. Fem celltyper, inklusive VSMC, fibroblaster, ECs, övergångsceller och makrofager, identifierades i både normala och experimentella halspulsådror¹⁶. Dessutom har ett protokoll för att erhålla EC-berikade encellspreparat av halspulsådern också upprättats¹⁷. Efter avslutad luminal enzymatisk nedbrytning kommer spolning av halspulsådern att erhålla tillräckligt med encelliga pellets för scRNAseq och scATACseq¹⁷. För att på ett flexibelt sätt kontrollera matsmältningstiden utvecklade vi en tvåstegs matsmältningsmetod för mössens halspulsåder, där vi separerade stegen för vävnadsdissociation och encellssuspensionsberedning. Processen börjar med 125 CDU/ml kollagenas II och 60 E/ml DNas I i 1 timme, följt av EDTA-fritt trypsin i 5 minuter. Betecknande nog kan vi på lämpligt sätt modifiera varje steg i metoden för matsmältning av andra blodkärlsvävnader baserat på blodkärlens egenskaper.

Det finns vissa begränsningar med den beskrivna metoden. För det första vet vi inte om denna metod kan användas för primär cellodling in vitro. Eftersom halspulsåderväggen är tunnare och har färre celler är det svårt att odla och expandera in vitro . För det andra, till skillnad från andra matsmältningsmetoder, kräver detta protokoll försiktig pipettering för att dissociera celler under matsmältningen. Ett skakande vattenbad kan också resultera i en encellssuspension av god kvalitet. För det tredje, eftersom vår metod är tillämpbar på normala halspulsåder, återstår det att studera om den är lämplig för matsmältning av karotisplack.

Sammanfattningsvis utformade vi en tvåstegs matsmältningsmetod för att få en högkvalitativ encellssuspension från halspulsådern hos vildtypsmöss. Detta protokoll kan användas för att förbereda encellssuspensioner för andra kärl med mindre modifieringar, vilket gör det till stor hjälp i kardiovaskulär forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% EDTA-free trypsin	Beyotime	C0205	Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.
0.9% NaCl saline solution	Beyotime	ST341	Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL
1 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r009	To perform cardiac perfusion
1.5 mL centrifuge tubes	KIRGEN	KG2211W	To centrifuge the tissue piece and cell suspension
20 mL syringes	SKJYLEAN	sk-r013	To perform cardiac perfusion
40 µm cell strainer	JETBIOFIL	css010040	To filter undigested tissue fragments
AO/PI kit	Hengrui Biological	RE010212	To identify whether the cell is alive or dead
Automated cell counter	Countstar	Mira FL	To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells
Cell Ranger software	10× Genomics	3.0.2	To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3	10× Genomics	1000075	To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885	Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL
Deoxyribonuclease I	Worthington	LS002140	Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL
Fetal bovine serum	HyClone	SH30088.03	Termination of the digestion reaction
Hank's balanced salt solution	Gibco	14175095	Store at the room temperture
Heparin sodium salt	Solarbio Life Science	H8060	Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002560	Applied for spining down the tissues and cell pellets
NovaSeq 6000	Illumina	N/A	Sequencer
Phosphate-buffered saline	Solarbio Life Science	P1000	Used for cardiac perfusion and resuspension of cells
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data
Six-well cell culture plates	NEST	703002	Place the vascular tissue
Water bath	Jinghong	DK-S22	Keep the digestion temperature at 37 °C