Summary
Leptomeningeal lymfatiske endotelceller (LLEC'er), en nyligt identificeret intrakraniel celletype, har dårligt forståede funktioner. Denne undersøgelse præsenterer en reproducerbar protokol til høst af LLEC'er fra mus og etablering af in vitro primære kulturer. Denne protokol er designet til at gøre det muligt for forskere at dykke ned i de cellulære funktioner og potentielle kliniske konsekvenser af LLEC'er.
Abstract
Leptomeningeal lymfatiske endotelceller (LLEC'er) er en nyligt opdaget intrakraniel cellulær population med en unik fordeling, der klart adskiller sig fra perifere lymfeendotelceller. Deres cellulære funktion og kliniske implikationer forbliver stort set ukendte. Tilgængeligheden af LLEC'er er derfor afgørende for at udføre funktionel forskning in vitro. Der findes dog i øjeblikket ingen eksisterende protokol for høst og dyrkning af LLEC'er in vitro.
Denne undersøgelse høstede LLEC'er med succes ved hjælp af en flertrinsprotokol, som omfattede belægning af kolben med fibronectin, dissekering af leptomeninges ved hjælp af et mikroskop, enzymatisk fordøjelse af leptomeninges for at forberede en enkeltcellesuspension, inducering af udvidelsen af LLEC'er med vaskulær endotelvækstfaktor-C (VEGF-C) og udvælgelse af lymfekarhyaluronreceptor-1 (LYVE-1) positive celler gennem magnetisk aktiveret cellesortering (MACS). Denne proces førte i sidste ende til etableringen af en primær kultur. Renheden af LLEC'erne blev bekræftet gennem immunofluorescensfarvning og flowcytometrisk analyse med et renhedsniveau på over 95%. Denne flertrinsprotokol har demonstreret reproducerbarhed og gennemførlighed, hvilket i høj grad vil lette udforskningen af LLEC'ernes cellulære funktion og kliniske implikationer.
Introduction
De nyopdagede leptomeningeale lymfatiske endotelceller (LLEC'er) danner et maskeværk af individuelle celler i leptomeninges, der udviser et tydeligt fordelingsmønster sammenlignet med perifere lymfatiske endotelceller 1,2. De cellulære funktioner og kliniske implikationer forbundet med LLEC'er forbliver stort set ukendt territorium. For at bane vejen for funktionel forskning i LLEC'er er det bydende nødvendigt at etablere en in vitro-model for deres undersøgelse. Derfor har denne undersøgelse udarbejdet en omfattende protokol for LLEC'ers isolation og primære kultur.
Mus er den foretrukne dyremodel på grund af deres egnethed til genetisk manipulation i sygdomsforskning. Tidligere undersøgelser har med succes isoleret lymfatiske endotelceller fra forskellige musevæv, herunder lymfeknuder3, mesenterialvæv4, dermalt væv5, indsamling af lymfeknuder6 og lungevæv7. Disse isolationsprocedurer har primært været afhængige af teknikker som magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) og flowcytometrisortering 8,9,10. Derudover har forskningsindsatsen ført til etablering af rottearachnoide cellelinjer og rottelymfatiske kapillærcellelinjer11,12. På trods af eksistensen af explantagekulturteknikker for leptomeninges13 er der et presserende behov for en standardiseret protokol for isolering og dyrkning af LLEC'er. Derfor har denne undersøgelse med succes høstet og dyrket LLEC'er ved omhyggeligt at adskille leptomeninges under vejledning af et mikroskop og fremme LLECs ekspansion gennem anvendelse af vaskulær endotelvækstfaktor-C (VEGF-C). Den karakteristiske markør for lymfatiske endotelceller er lymfekarhyaluronreceptor-1 (LYVE-1)14. Denne flertrinsprotokol isolerer selektivt LYVE-1-positive LLEC'er ved hjælp af MACS og verificerer derefter deres renhed gennem flowcytometrisk analyse og immunofluorescerende farvning.
De primære trin i denne flertrinsprotokol kan opsummeres som følger: kolbebelægning, dissociation af leptomeninges, enzymatisk fordøjelse af leptomeninges, celleudvidelse, magnetisk celleudvælgelse og efterfølgende dyrkning af LLEC'er. Endelig bekræftes renheden af de isolerede LLEC'er gennem flowcytometrisk analyse og immunofluorescerende farvning. Det overordnede mål med denne undersøgelse er at præsentere en reproducerbar, flertrinsprotokol til isolering af LLEC'er fra museleptomeninges og deres efterfølgende in vitro-kultur . Denne protokol er klar til i høj grad at lette undersøgelser af de cellulære funktioner og kliniske konsekvenser af LLEC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskning modtog godkendelse fra Animal Experiment Ethics Committee of Kunming Medical University (kmmu20220945). Alle forsøg overholdt etablerede retningslinjer for dyrepleje. Leptomeningeale lymfeendotelceller (LLEC'er) blev høstet fra C57Bl/6J-hanmus i alderen 6-8 uger og med en vægt på mellem 20-25 g. Disse mus blev indkøbt fra Kunming Medical University i Kunming, Kina. Hele eksperimentproceduren blev udført under strenge sterile forhold. Alle centrifugeringstrin udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
1. Fremstilling af reagenser og instrumenter
BEMÆRK: Alle trin, der involverer opløsninger, skal udføres i et klasse II biohazard kabinet.
- Forbered vaskebufferen ved at blande fosfatbufret saltvand (PBS) med calcium og magnesium, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (P / S) (se materialetabel). Hold denne buffer kold ved 4 °C. Det er vigtigt at forberede det frisk på brugsdagen og afgasse bufferen.
- Forbered fordøjelsesenzymerne ved at kombinere 10 ml PBS (uden calcium og magnesium) med 2 ml 0,25% trypsin, 1 ml 20 mg / ml papain og 200 μL 1 mg / ml collagenase I (se tabel over materialer).
BEMÆRK: Sørg for brug af delprøver af passende volumener for at forhindre gentagne fryse-optøningscyklusser. Disse delprøver opbevares ved -20 °C. - Forbered dyrkningsmediet ved at bruge det kommercielt tilgængelige endotelcellevækstmediumsæt, som inkluderer VEGF-C (100 ng / ml) og 1% P / S (se materialetabel).
- Forbered stopbufferen ved at supplere Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) med 10% FBS for at stoppe fordøjelsesprocessen.
- Forbered sterile kirurgiske instrumenter: Disse instrumenter skal omfatte saks, pincet med takkede spidser og pincet.
2. Kolbe belægning
- T25-kolben overtrækkes med en 100 μg/ml fibronectinopløsning (se materialetabellen), og den inkuberes natten over ved 37 °C. Før brug fjernes belægningsopløsningen ved hjælp af en pipette.
- Kolben vaskes tre gange med PBS, PBS suges efter, og T25-kolben lufttørres.
3. Leptomeninges dissociation
BEMÆRK: Brug altid forkølede buffere og opløsninger ved 4 °C.
- Bedøv musene med overskydende indånding af 4% isofluran og ofr dem derefter ved hurtig halshugning ved hjælp af en saks, der tidligere er blevet renset med 70% ethanol.
- Skær forsigtigt huden langs midterlinjen, startende fra åbningen bag på kraniet og strækker sig mod frontområdet.
- Fjern kraniet forsigtigt, løft det forsigtigt med saksen for at undgå at beskadige leptomeninges, og sørg for, at hele hjernen, inklusive leptomeninges, opnås.
- Nedsænk hele hjernen i en vaskebuffer og skyl den forsigtigt for at fjerne overfladeblod.
- Overfør hjernen til en steril petriskål uden at hakke, og ekstraher leptomeningerne fra hjernens overflade ved hjælp af finpunktspincet under et mikroskop.
- Skær leptomeningesvævet i fragmenter ved hjælp af steril mikrosaks.
4. Leptomeninges enzymatisk fordøjelse
- Der tilsættes 10 ml enzymblanding (trin 1.2) til fragmenterne og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter. Omrør forsigtigt for at sikre, at fragmenterne løsner sig fra bunden af røret. Derefter tilsættes 10 ml stopbuffer (trin 1.4) for at standse fordøjelsen.
- Supernatanten centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes forsigtigt med en pipette.
- Tilsæt 10 ml kold PBS, og før blandingen gennem en 70 μm si ind i et sterilt 50 ml rør for at filtrere eventuelle klumper fra.
5. Celleudvidelse
- Plade 1 x 10 5 celler pr. cm 2 i en fibronectinbelagt T25-kolbe (trin2) med5 ml dyrkningsmedium.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer. Fjern derefter mediet for at fjerne ikke-bundne celler.
- Oprethold kulturen ved at udskifte 50% af mediet hver anden dag. Gentag denne proces to eller tre gange.
6. Valg af magnetisk celle
BEMÆRK: Arbejd hurtigt, oprethold cellekulde, og brug forkølede løsninger til at forhindre ikke-specifik cellemærkning.
- Forberedelse af instrumenter og reagenser: Fastgør en magnetisk separator til et magnetisk separatorstativ (se materialetabellen). Tilslut en markeringskolonne til den magnetiske separator, og placer en 70 μm cellesi oven på markeringskolonnen. Anbring et 50 ml rør under markeringskolonnen for at opsamle flowet.
- Enzymatisk fordøjelse: Når cellerne når 80% sammenløb, aspireres mediet og skylles cellerne med PBS. Tilsæt 0,25% trypsin for at løsne vedhængende celler og inkubere ved 37 °C i 5 minutter. Stop fordøjelsen ved at tilføje stopbufferen. Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes.
- Antistofinkubation: Resuspender 1 x 107 celler i alt i 100 μL PBS og tilsæt 10 μL LYVE-1-antistof (se materialetabel). Bland grundigt og inkuber i 30 minutter i mørke ved 4 °C.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 minutter og kassér supernatanten. Skyl cellerne ved at indføre 1 ml PBS og centrifugere ved 300 x g i 5 minutter. Supernatanten fjernes helt.
- Mærkning af mikroperler: Resuspender cellerne i 100 μL PBS og tilsæt 20 μL mikroperler (se materialetabel). Bland godt og inkuber i 30 minutter i mørke ved 4 °C.
- Drej cellerne ved 300 x g i 5 minutter og dekanter supernatanten. Derefter renses cellerne med 1 ml PBS gennem centrifugering ved 300 x g i 5 min. Til sidst fjernes supernatanten helt.
- Magnetisk negativ udelukkelse: resuspender cellerne i 4 ml PBS. Før cellerne gennem en 70 μm cellesil for at fjerne klumper. Forbered markeringskolonnen (se materialetabellen) ved at skylle den med 3 ml PBS, og påfør derefter cellesuspensionen i markeringskolonnen.
- Udfør vasketrin med 3 ml PBS, og saml LYVE-1-negative celler i et 50 ml rør placeret under markeringskolonnen, så de kan passere igennem.
- Magnetisk positiv selektion: pipette 6 ml PBS ind i udvælgelseskolonnen. Skyl øjeblikkeligt de magnetisk mærkede celler ud ved at trykke stemplet hårdt ind i udvælgelseskolonnen for at opnå LYVE-1-positive LLEC'er.
BEMÆRK: Vent altid, indtil valgkolonnereservoiret er tomt, før du fortsætter til næste trin.
7. LLECs kultur
- De LYVE-1-positive LLEC'er centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter, og derefter fjernes supernatanten forsigtigt.
- Plade 1 x 10 5 celler pr. cm2 i en fibronectinbelagt T25-kolbe med5 ml dyrkningsmedium.
- Bevar kulturen ved at udskifte 50% af mediet hver anden dag. Når cellerne når 80% sammenløb, løsnes cellerne med 0,25% trypsin og udfører cellepassage. Brug cellerne til efterfølgende eksperimenter efter 2-3 passager.
8. Flow cytometrisk analyse
BEMÆRK: Den flowcytometriske analyse blev udført efter den tidligere beskrevne procedure15.
- Tilsæt 0,25% trypsin for at løsne vedhængende celler og inkubere ved 37 °C i 5 minutter. Tilsæt derefter stopbufferen for at standse fordøjelsen.
- Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter og opsuges supernatanten fuldstændigt. Resuspender 1 x 106 celler i 100 μL PBS.
- Tilsæt 1 μL LYVE-1-antistof. Bland grundigt og inkuber i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Resuspender cellerne i en passende mængde PBS-buffer til analyse ved hjælp af flowcytometri og FlowJo-software (se materialetabel).
9. Immunofluorescerende farvning
BEMÆRK: Den immunfluorescerende farvning blev udført efter proceduren beskrevettidligere 16.
- Vask cellerne med PBS tre gange. Fastgør cellerne med 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér PFA'en og vask cellerne med PBS tre gange.
- Påfør blokbufferen i 1 time ved stuetemperatur. Fjern blokbufferen fra dækslerne.
- Tilsæt LYVE-1-antistoffet i farvningsbufferen til cellerne og inkuber i mørke. Cellerne vaskes tre gange med PBS.
- Tilsæt et passende sekundært antistof (se materialetabel) i farvningsbufferen til cellerne og inkuber i mørke. Cellerne vaskes tre gange med PBS.
- Modbejdse med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Cellerne er nu klar til immunfluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse præsenterer en reproducerbar, flertrinsprotokol til høst af lymfatiske endotelceller (LLEC'er) fra mus og efterfølgende etablering af deres primære kultur in vitro. De vigtigste trin involverer kolbeforberedelse og fibronectinbelægning, dissociation af leptomeninges, opnåelse af en enkeltcellesuspension gennem enzymatisk fordøjelse og inducering af LLEC'er ekspansion med VEGF-C. LYVE-1-positive LLEC'er isoleres derefter selektivt ved hjælp af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS). Endelig udføres immunofluorescensfarvning og flowcytometrisk analyse for at vurdere LLECs renhed, hvor MTT-assayresultater viser robuste LLECs væksthastigheder (supplerende figur 1). De primære trin i denne multiprocedureprotokol er illustreret i rutediagrammet, hvor hele processen tager ca. 2-3 uger (figur 1).
For at høste LLEC'er er det vigtigt at adskille leptomeninges og fremme LLECs ekspansion, samtidig med at cellelevedygtigheden bevares gennem effektive kirurgiske teknikker og opretholdelse af et koldt miljø (figur 2A-E). Efter at have opnået hele hjernen sammen med leptomeninges under sterile forhold, udføres et forsigtigt skyllevasketrin for at fjerne blodrøde blodlegemer (figur 2F). Dernæst ekstraheres leptomeninges omhyggeligt fra hjernens overflade under et mikroskop (figur 2G). Disse leptomeninges består primært af kollagenfibre, så de er fragmenteret for at fremskynde enzymatisk fordøjelse (figur 2H). Derefter udføres enzymatisk fordøjelse af disse fragmenter, og eventuelle resterende klumper filtreres gennem en 70 μm sil for at eliminere større klynger af kollagenfibre (figur 2I). Endelig belægges celler i en fibronectinbelagt T25-kolbe, og VEGF-C tilsættes for at inducere ekspansion (figur 2J). Efter 24 timer fjernes dyrkningsmediet for at eliminere ikke-bundne celler. Disse trin letter høsten af celler fra leptomeninges og fremmer ekspansion, hvilket er afgørende for at opnå tilstrækkelige LYVE-1-positive LLEC'er senere i processen.
Mens VEGF-C inducerer LLEC-ekspansion, kan heterogene cellulære populationer stadig vokse sammen. For at isolere rene LYVE-1-positive LLEC'er anvendes MACS, da LYVE-1 er en anerkendt markør for lymfatiske endotelceller. Renheden af LLEC'er vurderes gennem flowcytometri, hvor resultaterne indikerer, at procentdelen af LYVE-1-positive celler i passage 2 ikke er signifikant forskellig fra passage 3 efter MACS, hvilket viser en renhed større end 95% (figur 3A). For yderligere at validere specificiteten af LYVE-1-positive LLEC'er blev tre yderligere lymfatiske endotelcellemarkører-podoplanin (PDPN), vaskulær endotelvækstfaktorreceptor-3 (VEGFR-3) og Prospero-relateret homeobox1 (PROX1) anvendt til identifikation17,18,19. Immunofluorescensfarvning bekræftede, at LYVE-1 var farvelagt med disse tre markører (figur 3B). Desuden blev identiteten af LLEC'er etableret i hjerneskiver under fysiologiske forhold, hvilket viser co-farvning af LYVE-1 med PROX1, VEGFR-3 og PDPN (supplerende figur 2A). LYVE-1-positive celler udtrykte ikke F4/80 og trombocytafledt vækstfaktor beta (PDGFR-β), hvilket effektivt skelnede LLEC'er fra makrofager og fibroblaster (supplerende figur 2B). Sammenfattende tillader denne protokol høst af meget rene LLEC'er, der er i stand til in vitro-kultur.
Leptomeningeale celler før MACS udviser heterogenitet, forskellig fra kolonierne af lymfatiske endotelceller. Deres morfologi spænder fra enkelte runde kugler til smeltede fiberformer (figur 4A-D). Imidlertid udviser post-MACS, LLEC'er typiske spindel- og brostensformede endotellignende træk (figur 4E-H). Baseret på disse resultater høstes LLEC'er effektivt gennem denne multiprocedureprotokol og opretholdes i en sund væksttilstand.
Figur 1: Skematisk gengivelse af den multiproceduremæssige protokol. Dette rutediagram illustrerer den multiproceduremæssige protokol for høst og kultur af LLEC'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Høst af leptomeningesceller . (A) Fremstilling af sterile kirurgiske instrumenter. (B) Mus blev bedøvet ved inhalation af 4% isofluran og efterfølgende renset med 70% ethanol efter eutanisering. (C) Halshugning af musene og omhyggelig midterlinjesnit af huden, startende fra bagsiden af kraniet mod frontalområdet. (D) Delikat fjernelse af kraniet for at bevare leptomeninges integritet. (E) Udtagning af hele hjernen, der indeholder leptomeninges. (F) Vask af hele hjernen i en bufferopløsning med forsigtig skylning for at fjerne overfladeblod. (G) Dissektion af leptomeninges fra hjernens overflade ved hjælp af finpunktspincet. H) Skæring af leptomeninges i fragmenter med steril mikrosaks efterfulgt af tilsætning af 10 ml enzymblanding og inkubation ved 37 °C i 15 min. (I) Resuspension af pellet i 10 ml PBS og filtrering af klumper gennem en 70 μm si. J) Plettering af celler i en overtrukket T25-kolbe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vurdering af LLEC-renhed efter MACS. (A) Repræsentative histogrammer fra flowcytometrisk analyse, der viser ekspressionen af LYVE-1-positive celler i passager 2 og 3 efter MACS. Procentdelen af LYVE-1-positive celler overstiger 95% efter MACS. Data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter (Mean ± SEM). Fejlbjælker angiver SEM. (B) Repræsentativt immunfluorescensbillede, der viser co-farvning af LYVE-1 med PDPN, VEGFR-3 og PROX1. Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vækstkarakteristika for leptomeningeale celler og LLEC'er. (A) Morfologi af leptomeningeale celler fanget i repræsentative billeder. Skalabjælke = 50 μm. (B-D) Repræsentative billeder, der viser leptomeningealcellernes morfologi på dag 1, dag 2 og dag 3 før MACS. Skalabjælker = 100 μm. (E) Morfologi af LLEC'er optaget i repræsentative billeder. Skalabjælke = 50 μm. (F-H) Repræsentative billeder, der illustrerer LLEC'ernes morfologi på dag 1, dag 2 og dag 3 efter MACS. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Vækstrate for LLEC'er og SVEC4-10. MTT-analyseresultater viser et signifikant fald i væksthastigheden for LLEC'er i passage 1 sammenlignet med SVEC4-10-gruppen. Der var ingen signifikante forskelle mellem passage 2 og passage 3 LLECs grupper sammenlignet med SVEC4-10 gruppen. Data repræsenterer resultater fra seks uafhængige eksperimenter (Mean ± SEM). Fejlbjælker angiver SEM. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Karakterisering og diskrimination af LLEC'er i hjerneskiver. (A) Repræsentativt immunfluorescensbillede, der illustrerer co-farvning af LYVE-1 med PROX1, VEGFR-3 og PDPN i hjerneskiver under fysiologiske forhold. Skalastænger = 2 μm. (B) Repræsentativt immunfluorescensbillede, der viser, at LYVE-1 ikke pletter sammen med F4/80 og PDGFR-β i hjerneskiver under fysiologiske forhold. Skalabjælker = 20 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Vækst af LLEC'er under VEGF-C-stimulering. (A) Repræsentative billeder af LLEC'er under 1 ng/ml VEGF-C-stimulering. (B) Repræsentative billeder af LLEC'er under 100 ng/ml VEGF-C-stimulering. (C) Repræsentative billeder af LLEC'er under 500 ng/ml VEGF-C-stimulering. Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Ekspression af CD31, PDPN og VEGFR-3 efter høst. (A) Repræsentative histogrammer fra flowcytometrisk analyse viser, at CD31-positive celler er mindre end 5%. (B) Repræsentative histogrammer fra flowcytometrisk analyse indikerer, at PDPN-positive celler overstiger 95%. (C) Repræsentative histogrammer fra flowcytometrisk analyse viser, at VEGFR-3-positive celler overstiger 95%. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 5: Morfologi af LLEC'er og sondring fra CD31. (A) Repræsentative billeder af LLECs morfologi afsløret ved hæmatoxylin-eosinfarvning. Skalabjælke = 20 μm. (B) Repræsentative immunfluorescensbilleder illustrerer, at LYVE-1 og PDPN ikke pletter sammen med CD31. Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 6: Spredningshastighed for LLEC'er. Repræsentative resultater fra CCK-8-analysen viser et signifikant fald i spredningshastigheden af LLEC'er i passage 1 og passage 6 sammenlignet med henholdsvis passager 2 og 5. Data repræsenterer resultater fra seks uafhængige eksperimenter (Mean ± SEM). Fejlbjælker angiver SEM. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den eksisterende protokol for høst og dyrkning af LLEC'er in vitro er ikke tidligere rapporteret. Denne undersøgelse introducerer en reproducerbar, multiproceduremæssig protokol til høst og dyrkning af LLEC'er fra museleptomeninges.
Selv om denne multiprocedureprotokol er reproducerbar, er der flere vigtige overvejelser. For eksempel fremmer fibronectinbelagte T25-kolber vedhæftningen af LLEC'er og funktion ved at eliminere ikke-klæbende celler og derved sikre en mere homogen cellulær population. Derudover er varigheden, varigheden og temperaturen under kirurgiske procedurer for dissociering af leptomeninges kritiske faktorer, der påvirker cellelevedygtigheden. Derfor er det afgørende at opretholde en varighed inden for 1 time og holde bufferen tilstrækkelig kold. Et andet kritisk punkt vedrører tilstedeværelsen af røde blodlegemer i leptomeninges, hvorfra frigivelsen af hæmoglobin kan skade LLEC'er. For at afbøde dette er det vigtigt at skylle forsigtigt og vaske for at fjerne røde blodlegemer og forhindre deres cytotoksiske virkninger. Endelig kræver LLEC'er stimulering med VEGF-C20, især ved en koncentration på 100 ng/ml. Under denne stimulering udviser LLEC'er karakteristisk endotellignende morfologi snarere end at danne rør (supplerende figur 3A-C). Derfor anvendte denne undersøgelse et dyrkningsmedium indeholdende 100 ng / ml VEGF-C for at inducere ekspansion og opretholde homogenitet i cellulære populationer.
Den multiprocedureprotokol, der er beskrevet heri, indeholder fejlfindingstrin og nogle begrænsninger. For det første tager denne protokol 2-3 uger at gennemføre, hvilket gør den upraktisk til hyppig gentagelse. For det andet kan kirurgiske og enzymatiske procedurer resultere i tilstedeværelsen af døde celler, der ikke elimineres før plettering, hvilket potentielt påvirker cellekulturen. Denne mulighed vil blive undersøgt i fremtidige protokolimplementeringer. For det tredje, mens renheden af høstede LLEC'er (VEGFR-3 og PDPN-positive celler) overstiger 95%, forbliver nogle heterogene cellepopulationer, herunder CD31-positive celler, som udgør mindre end 5% (supplerende figur 4A-C). Dette er en almindelig udfordring i kulturen af primære celler. Billeder i høj opløsning fra hæmatoxylin-eosinfarvning viser, at LLEC'er viser karakteristiske endotellignende former, men ikke udtrykker CD31 (supplerende figur 5A, B). Endelig indikerer CCK-8-analyseresultaterne et signifikant fald i spredningshastigheden i LLEC'er ved passage 1 og 6 sammenlignet med henholdsvis passage 2 og 5 (supplerende figur 6). Passage 1 kan føre til LLECs skader på grund af antistofbehandling og fysisk stress under sortering, mens passage 6 viser reduceret spredning, da antallet af passager øges. Derfor er efterfølgende celler efter passage 6 uegnede til relevante forsøg. I betragtning af fordelingen af fibroblaster i meninges21 kan ca. 5% af forurenede celler indeholde fibroblaster. For at løse dette kan tilsætning af genetisk og immunmagnetisk cellesortering bruges til at fjerne forurenede fibroblaster22,23. Overvågning af fibroblasters kontamineringshastighed i hver passage af LLEC'er vil bidrage til at eliminere fibroblasters indvirkning på LLEC'ernes vækst24. I betragtning af heterogeniteten mellem mus og mennesker bør høst og dyrkning af primære humane LLEC'er tilstræbes med henblik på potentielle kliniske anvendelser i fremtidig forskning.
Sammenfattende er der i øjeblikket ingen etableret protokol for høst og dyrkning af LLEC'er in vitro. Denne undersøgelse introducerer en reproducerbar, multiproceduremæssig protokol til høst af LLEC'er fra mus leptomeninges og efterfølgende etablering af deres primære kultur in vitro. Dette arbejde vil lette yderligere udforskning af cellulære funktioner og potentielle kliniske anvendelser af LLEC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), Natural Science Foundation of Yunnan Province (202001AS070045, 202301AY070001-011) og Scientific Research Foundation of Yunnan Province Department of Education (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
