Summary
Leptomeningeala lymfatiska endotelceller (LEC), en nyligen identifierad intrakraniell celltyp, har dåligt förstådda funktioner. Denna studie presenterar ett reproducerbart protokoll för skörd av LLEC från möss och etablering av in vitro primära kulturer. Detta protokoll är utformat för att göra det möjligt för forskare att fördjupa sig i de cellulära funktionerna och potentiella kliniska konsekvenserna av LEC.
Abstract
Leptomeningeala lymfatiska endotelceller (LEC) är en nyligen upptäckt intrakraniell cellulär population med en unik fördelning som tydligt skiljer sig från perifera lymfatiska endotelceller. Deras cellulära funktion och kliniska implikationer är fortfarande till stor del okända. Följaktligen är tillgången till ett utbud av LLEC avgörande för att kunna bedriva funktionell forskning in vitro. Det finns dock för närvarande inget befintligt protokoll för skörd och odling av LLEC in vitro.
Denna studie skördade framgångsrikt LLEC med hjälp av ett flerstegsprotokoll, som inkluderade beläggning av kolven med fibronektin, dissekering av leptomeningerna med hjälp av ett mikroskop, enzymatiskt smältande leptomeningerna för att framställa en encellssuspension, inducering av expansion av LLECs med vaskulär endotelial tillväxtfaktor-C (VEGF-C) och selektion av lymfkärlshyaluronreceptor-1 (LYVE-1) positiva celler genom magnetaktiverad cellsortering (MACS). Denna process ledde slutligen till att en primärkultur etablerades. RINC-renheten bekräftades genom immunofluorescensfärgning och flödescytometrisk analys, med en renhetsgrad som översteg 95 %. Detta flerstegsprotokoll har visat reproducerbarhet och genomförbarhet, vilket i hög grad kommer att underlätta utforskningen av den cellulära funktionen och de kliniska konsekvenserna av LEC.
Introduction
De nyupptäckta leptomeningeala lymfatiska endotelcellerna (LEC) bildar ett nätverk av enskilda celler inom leptomeningerna och uppvisar ett distinkt distributionsmönster jämfört med perifera lymfatiska endotelceller 1,2. De cellulära funktionerna och de kliniska implikationerna i samband med LLEC är fortfarande i stort sett outforskade områden. För att bana väg för funktionell forskning om LLEC är det absolut nödvändigt att etablera en in vitro-modell för deras studie. Därför har denna studie utarbetat ett omfattande protokoll för isolering och primär odling av LLECs.
Möss är den föredragna djurmodellen på grund av deras lämplighet för genetisk manipulation inom sjukdomsforskning. Tidigare studier har framgångsrikt isolerat lymfatiska endotelceller från olika musvävnader, inklusive lymfkörtlar3, tarmkäxvävnad4, hudvävnad5, uppsamlingslymfatik6 och lungvävnad7. Dessa isoleringsprocedurer har främst förlitat sig på tekniker som magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) och flödescytometrisortering 8,9,10. Dessutom har forskningsinsatser lett till etablering av araknoidalcellinjer hos råtta och lymfatiska kapillärcellinjer hos råtta11,12. Trots att det finns explantationstekniker för leptomeninges13 finns det ett akut behov av ett standardiserat protokoll för isolering och odling av LLC. Följaktligen har denna studie framgångsrikt skördat och odlat LLECs genom att noggrant dissociera leptomeninges under ledning av ett mikroskop och främja LLECs expansion genom användning av vaskulär endotelial tillväxtfaktor-C (VEGF-C). Den utmärkande markören för lymfatiska endotelceller är lymfkärlets hyaluronreceptor-1 (LYVE-1)14. Detta flerstegsprotokoll isolerar selektivt LYVE-1-positiva LLEC med hjälp av MACS och verifierar därefter deras renhet genom flödescytometrisk analys och immunofluorescensfärgning.
De primära stegen i detta flerstegsprotokoll kan sammanfattas enligt följande: kolvbeläggning, dissociation av leptomeninger, enzymatisk nedbrytning av leptomeninger, cellexpansion, magnetiskt cellval och efterföljande odling av LLC. Slutligen bekräftas renheten hos de isolerade LEC-cellerna genom flödescytometrisk analys och immunofluorescensfärgning. Det övergripande syftet med denna studie är att presentera ett reproducerbart flerstegsprotokoll för isolering av LLEC från musleptomeninger och deras efterföljande in vitro-odling . Detta protokoll är redo att i hög grad underlätta undersökningar av de cellulära funktionerna och de kliniska konsekvenserna av LEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning fick godkännande från Animal Experiment Ethics Committee vid Kunming Medical University (kmmu20220945). Alla försök följde fastställda riktlinjer för djurhållning. Leptomeningeala lymfatiska endotelceller (LEC) skördades från C57Bl/6J-hanmöss i åldern 6-8 veckor och med en vikt på mellan 20-25 g. Dessa möss köptes in från Kunming Medical University i Kunming, Kina. Hela försöksförfarandet utfördes under strikt sterila förhållanden. Alla centrifugeringssteg utförs vid rumstemperatur om inget annat anges.
1. Beredning av reagenser och instrument
OBS: Alla steg som involverar lösningar måste utföras i ett klass II-skåp för biologisk risk.
- Bered tvättbufferten genom att blanda fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med kalcium och magnesium, 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin-streptomycin (P/S) (se materialförteckning). Förvara denna buffert kallt vid 4 °C. Det är viktigt att förbereda den färsk på användningsdagen och avgasa bufferten.
- Förbered matsmältningsenzymerna genom att kombinera 10 ml PBS (utan kalcium och magnesium) med 2 ml 0,25 % trypsin, 1 ml 20 mg/ml papain och 200 μl 1 mg/ml kollagenas I (se materialförteckning).
OBS: Se till att använda alikvoter av lämpliga volymer för att förhindra upprepade frys- och upptiningscykler. Förvara dessa alikvoter vid -20 °C. - Bered odlingsmediet genom att använda det kommersiellt tillgängliga endotelcellstillväxtmediet, som inkluderar VEGF-C (100 ng/ml) och 1 % P/S (se materialtabell).
- Förbered stoppbufferten genom att komplettera Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) med 10 % FBS för att stoppa matsmältningsprocessen.
- Förbered sterila kirurgiska instrument: dessa instrument bör innehålla sax, pincett med tandad spets och pincett.
2. Kolvens överdrag
- Bestryk T25-kolven med en 100 μg/ml fibronektinlösning (se materialtabell) och inkubera över natten vid 37 °C. Före användning, ta bort beläggningslösningen med en pipett.
- Tvätta kolven tre gånger med PBS, aspirera därefter PBS och låt T25-kolven lufttorka.
3. Leptomeninges dissociation
OBS: Använd alltid förkylda buffertar och lösningar vid 4 °C.
- Bedöva mössen med överinhalering av 4 % isofluran och offra dem sedan genom snabb halshuggning med hjälp av sax som tidigare har rengjorts med 70 % etanol.
- Skär försiktigt in huden längs mittlinjen, med början från öppningen på baksidan av skallen och sträcker sig mot frontområdet.
- Ta försiktigt bort skallen och lyft den försiktigt med saxen för att undvika att skada leptomeningerna, se till att hela hjärnan, inklusive leptomeningerna, erhålls.
- Sänk ner hela hjärnan i en tvättbuffert och spola den försiktigt för att ta bort ytligt blod.
- Överför hjärnan till en steril petriskål utan att hacka och extrahera leptomeningerna från hjärnans yta med hjälp av en finspetspincett under ett mikroskop.
- Skär leptomeningesvävnaden i fragment med en steril mikrosax.
4. Leptomeninges enzymatisk nedbrytning
- Tillsätt 10 ml av enzymblandningen (steg 1.2) till fragmenten och inkubera vid 37 °C i 15 minuter. Rör försiktigt om för att säkerställa att fragmenten lossnar från botten av röret. Tillsätt sedan 10 ml stoppbuffert (steg 1.4) för att stoppa matsmältningen.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C och ta försiktigt bort supernatanten med en pipett.
- Tillsätt 10 ml kall PBS och passera blandningen genom en 70 μm sil till ett sterilt 50 ml rör för att filtrera bort eventuella klumpar.
5. Cellexpansion
- Platta 1 x 10 5 celler per cm 2 i en fibronektinbelagd T25-kolv (steg2) med5 ml odlingsmedium.
- Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 % CO2 i 24 timmar. Ta sedan bort mediet för att eliminera icke-anslutna celler.
- Upprätthåll kulturen genom att byta ut 50 % av mediet varannan dag. Upprepa denna process två eller tre gånger.
6. Val av magnetisk cell
OBS: Arbeta snabbt, behåll cellkylan och använd förkylda lösningar för att förhindra icke-specifik cellmärkning.
- Beredning av instrument och reagenser: fäst en magnetisk separator på ett magnetiskt separatorstativ (se materialförteckning). Anslut en selektionskolonn till den magnetiska separatorn och placera en 70 μm cellsil ovanpå selektionskolonnen. Placera ett 50 ml rör under markeringskolonnen för att samla upp flödet.
- Enzymatisk matsmältning: när cellerna når 80 % sammanflöde, aspirera mediet och skölj cellerna med PBS. Tillsätt 0,25 % trypsin för att lossa vidhäftande celler och inkubera vid 37 °C i 5 minuter. Stoppa matsmältningen genom att tillsätta stoppbufferten. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och ta bort supernatanten.
- Antikroppsinkubation: återsuspendera 1 x 107 celler totalt i 100 μl PBS och tillsätt 10 μl LYVE-1-antikropp (se materialförteckning). Blanda ordentligt och inkubera i 30 minuter i mörker vid 4 °C.
- Snurra cellerna i 300 x g i 5 minuter och kassera supernatanten. Skölj cellerna genom att tillsätta 1 ml PBS och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Ta bort supernatanten helt.
- Märkning av mikropärlor: återsuspendera cellerna i 100 μl PBS och tillsätt 20 μL mikropärlor (se materialförteckning). Blanda väl och inkubera i 30 minuter i mörker vid 4 °C.
- Snurra cellerna i 300 x g i 5 minuter och dekantera supernatanten. Rengör sedan cellerna med 1 ml PBS genom centrifugering vid 300 x g i 5 minuter. Slutligen, ta bort supernatanten helt.
- Magnetisk negativ uteslutning: återsuspendera cellerna i 4 ml PBS. För cellerna genom en 70 μm cellsil för att eliminera klumpar. Förbered urvalskolonnen (se materialtabell) genom att skölja den med 3 ml PBS och applicera sedan cellsuspensionen i urvalskolonnen.
- Utför tvättsteg med 3 ml PBS och samla upp LYVE-1-negativa celler i ett 50 ml rör placerat under selektionskolonnen så att de kan passera igenom.
- Magnetiskt positivt urval: pipettera 6 ml PBS i valkolonnen. Spola omedelbart ut de magnetiskt märkta cellerna genom att trycka in kolven ordentligt i urvalskolonnen för att erhålla LYVE-1-positiva LLECs.
OBS: Vänta alltid tills valkolonnbehållaren är tom innan du går vidare till nästa steg.
7. LEC-kulturen
- Centrifugera LYVE-1-positiva LLEC vid 300 x g i 5 minuter och avlägsna sedan försiktigt supernatanten.
- Platta 1 x 10 5 celler per cm2 i en fibronektinbelagd T25-kolv med5 ml odlingsmedium.
- Behåll kulturen genom att byta ut 50 % av mediet varannan dag. När cellerna når 80 % sammanflöde, lossa cellerna med 0,25 % trypsin och utför cellpassage. Använd cellerna för efterföljande experiment efter 2-3 passager.
8. Flödescytometrisk analys
OBS: Den flödescytometriska analysen utfördes enligt den tidigare beskrivna proceduren15.
- Tillsätt 0,25 % trypsin för att lossa vidhäftande celler och inkubera vid 37 °C i 5 minuter. Tillsätt sedan stoppbufferten för att stoppa matsmältningen.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter och aspirera supernatanten helt. Återsuspendera 1 x 106 celler i 100 μl PBS.
- Tillsätt 1 μl LYVE-1-antikropp. Blanda ordentligt och inkubera i 10 minuter i mörker i rumstemperatur.
- Återsuspendera cellerna i en lämplig mängd PBS-buffert för analys med hjälp av flödescytometri och FlowJo-programvara (se materialförteckning).
9. Immunofluorescerande färgning
OBS: Den immunofluorescerande färgningen utfördes enligt den procedur som beskrivits tidigare16.
- Tvätta cellerna med PBS tre gånger. Fixera cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 min vid rumstemperatur. Kassera PFA och tvätta cellerna med PBS tre gånger.
- Applicera blockbufferten i 1 timme i rumstemperatur. Ta bort blockbufferten från täckglasen.
- Tillsätt LYVE-1-antikroppen i färgningsbufferten till cellerna och inkubera i mörkret. Tvätta cellerna tre gånger med PBS.
- Tillsätt en lämplig sekundär antikropp (se materialtabell) i färgningsbufferten till cellerna och inkubera i mörker. Tvätta cellerna tre gånger med PBS.
- Motfärga med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Cellerna är nu redo för immunofluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie presenterar ett reproducerbart flerstegsprotokoll för att skörda lymfatiska endotelceller (LEC) från möss och därefter etablera deras primära kultur in vitro. De viktigaste stegen involverar kolvberedning och fibronektinbeläggning, dissociation av leptomeninger, erhållande av en encellssuspension genom enzymatisk nedbrytning och inducering av LLC-expansion med VEGF-C. LYVE-1-positiva LLEC isoleras sedan selektivt med hjälp av magnetaktiverad cellsortering (MACS). Slutligen utförs immunofluorescensfärgning och flödescytometrisk analys för att bedöma LLC:s renhet, med MTT-analysresultat som visar robusta LLECs tillväxthastigheter (tilläggsfigur 1). De primära stegen i detta multiprocessuella protokoll illustreras i flödesschemat, där hela processen tar cirka 2-3 veckor (figur 1).
För att skörda LLC är det viktigt att dissociera leptomeninger och främja LLECs expansion samtidigt som cellviabiliteten bevaras genom effektiva kirurgiska tekniker och upprätthållande av en kall miljö (Figur 2A-E). Efter att ha erhållit hela hjärnan tillsammans med leptomeningerna under sterila förhållanden, utförs ett försiktigt spolningssteg för att avlägsna blodröda blodkroppar (Figur 2F). Därefter extraheras leptomeninges försiktigt från hjärnans yta under ett mikroskop (Figur 2G). Dessa leptomeninger består huvudsakligen av kollagenfibrer, så de är fragmenterade för att påskynda enzymatisk nedbrytning (Figur 2H). Därefter utförs enzymatisk nedbrytning av dessa fragment och eventuella kvarvarande klumpar filtreras genom en 70 μm sil för att eliminera större kluster av kollagenfibrer (figur 2I). Slutligen pläteras cellerna i en fibronektinbelagd T25-kolv och VEGF-C tillsätts för att inducera expansion (figur 2J). Efter 24 timmar avlägsnas odlingsmediet för att eliminera icke-bundna celler. Dessa steg underlättar skörden av celler från leptomeninger och främjar expansion, vilket är avgörande för att erhålla tillräckligt med LYVE-1-positiva LLEC senare i processen.
Medan VEGF-C inducerar LEC-expansion, kan heterogena cellulära populationer fortfarande växa tillsammans. För att isolera rena LYVE-1-positiva LLC:er används MACS eftersom LYVE-1 är en erkänd markör för lymfatiska endotelceller. Renheten hos LLEC bedöms genom flödescytometri, med resultat som indikerar att andelen LYVE-1-positiva celler i passage 2 inte skiljer sig signifikant från passage 3 efter MACS, vilket visar en renhet större än 95 % (figur 3A). För att ytterligare validera specificiteten hos LYVE-1-positiva LLC:er användes ytterligare tre lymfatiska endotelcellsmarkörer – podoplanin (PDPN), vaskulär endotelial tillväxtfaktorreceptor-3 (VEGFR-3) och Prospero-relaterad homeobox1 (PROX1) för identifiering17,18,19. Immunofluorescensfärgning bekräftade att LYVE-1 samfärgades med dessa tre markörer (Figur 3B). Dessutom fastställdes identiteten hos LLEC i hjärnskivor under fysiologiska förhållanden, vilket visade samfärgning av LYVE-1 med PROX1, VEGFR-3 och PDPN (tilläggsfigur 2A). LYVE-1-positiva celler uttryckte inte F4/80 och Platelet-Derived Growth Factor beta (PDGFR-β), vilket effektivt skiljer LLEC från makrofager och fibroblaster (tilläggsfigur 2B). Sammanfattningsvis möjliggör detta protokoll skörd av mycket rena LLC:er som kan odlas in vitro.
Leptomeningeala celler före MACS uppvisar heterogenitet som skiljer sig från kolonierna av lymfatiska endotelceller. Deras morfologi sträcker sig från enstaka runda sfärer till sammansmälta fiberformer (Figur 4A-D). Efter MACS uppvisar dock LLAC:er typiska spindel- och kullerstensformade endotelliknande egenskaper (Figur 4E-H). Baserat på dessa resultat skördas LLEC effektivt genom detta multiprocedurprotokoll och bibehålls i ett hälsosamt tillväxttillstånd.
Figur 1: Schematisk representation av det multiprocessuella protokollet. Detta flödesschema illustrerar det multiprocessuella protokollet för skörd och odling av LLECs. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Skörd av leptomeningesceller . A) Beredning av sterila kirurgiska instrument. (B) Möss sövdes via inandning av 4 % isofluran och rengjordes därefter med 70 % etanol efter avlivning. C) Halshuggning av mössen och försiktigt snitt i mitten av huden, med början från baksidan av skallen mot frontalområdet. D) Försiktigt avlägsnande av skallen för att bevara leptomeningernas integritet. (E) Hämtning av hela hjärnan som innehåller leptomeninges. F) Tvättning av hela hjärnan i en buffertlösning med försiktig spolning för att avlägsna ytligt blod. (G) Dissektion av leptomeninges från hjärnans yta med hjälp av en finspetspincett. H) Styckning av leptomeninger i fragment med steril mikrosax, följt av tillsats av 10 ml enzymblandning och inkubation vid 37 °C i 15 minuter. (I) Omblandning av pelleten i 10 ml PBS och filtrering av klumparna genom en 70 μm sil. J) Plätering av celler i en belagd T25-kolv. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bedömning av LEC-renhet efter MACS. A) Representativa histogram från flödescytometrisk analys som visar uttrycket av LYVE-1-positiva celler i passagerna 2 och 3 efter MACS. Andelen LYVE-1-positiva celler överstiger 95 % efter MACS. Data är representativa för tre oberoende experiment (medelvärde ± SEM). Felstaplar indikerar SEM. (B) Representativ immunofluorescensbild som visar samfärgning av LYVE-1 med PDPN, VEGFR-3 och PROX1. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Tillväxtkarakteristika hos leptomeningeala celler och LLC. (A) Morfologi hos leptomeningeala celler fångade i representativa bilder. Skalstapel = 50 μm. (B-D) Representativa bilder som visar morfologin hos leptomeningeala celler på dag 1, dag 2 och dag 3 före MACS. Skalstreck = 100 μm. (E) Morfologi hos LLEC fångade i representativa bilder. Skalstapel = 50 μm. (F-H) Representativa bilder som illustrerar LLEC:s morfologi dag 1, dag 2 och dag 3 efter MACS. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfigur 1: Tillväxthastighet för LLEC och SVEC4-10. MTT-analysresultat visar en signifikant minskning av tillväxthastigheten för LLEC i passage 1 jämfört med SVEC4-10-gruppen. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan LEC-grupperna för passage 2 och passage 3 jämfört med SVEC4-10-gruppen. Data representerar resultat från sex oberoende experiment (Mean ± SEM). Felstaplar indikerar SEM. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Karakterisering och diskriminering av LLEC i hjärnskivor. (A) Representativ immunofluorescensbild som illustrerar samfärgning av LYVE-1 med PROX1, VEGFR-3 och PDPN i hjärnskivor under fysiologiska förhållanden. Skalstreck = 2 μm. (B) Representativ immunofluorescensbild som visar att LYVE-1 inte samfärgas med F4/80 och PDGFR-β i hjärnskivor under fysiologiska förhållanden. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Tillväxt av LLEC under VEGF-C-stimulering. (A) Representativa bilder av LLEC under 1 ng/ml VEGF-C-stimulering. (B) Representativa bilder av LLEC under 100 ng/ml VEGF-C-stimulering. (C) Representativa bilder av LLEC under 500 ng/ml VEGF-C-stimulering. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 4: Uttryck av CD31, PDPN och VEGFR-3 efter skörd. (A) Representativa histogram från flödescytometrisk analys visar att CD31-positiva celler är mindre än 5 %. (B) Representativa histogram från flödescytometrisk analys indikerar att PDPN-positiva celler överstiger 95 %. (C) Representativa histogram från flödescytometrisk analys visar att VEGFR-3-positiva celler överstiger 95 %. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 5: Morfologi hos LLEC och distinktion från CD31. (A) Representativa bilder av LLECs morfologi avslöjade genom hematoxylin-eosinfärgning. Skalstreck = 20 μm. (B) Representativa immunofluorescensbilder visar att LYVE-1 och PDPN inte samfärgas med CD31. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 6: Spridningshastighet för LLECs. Representativa resultat från CCK-8-analysen visar en signifikant minskning av proliferationshastigheten för LLEC i passage 1 och passage 6 jämfört med passage 2 respektive 5. Data representerar resultat från sex oberoende experiment (Mean ± SEM). Felstaplar indikerar SEM. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det befintliga protokollet för skörd och odling av LLEC in vitro har inte rapporterats tidigare. Denna studie introducerar ett reproducerbart, multiprocedurellt protokoll för skörd och odling av LLEC från musleptomeninger.
Även om detta protokoll med flera procedurer är reproducerbart finns det flera viktiga överväganden. Till exempel främjar fibronektinbelagda T25-kolvar vidhäftningen av LEC:er och funktion genom att eliminera icke-vidhäftande celler, vilket säkerställer en mer homogen cellulär population. Dessutom är tidslängden och temperaturen under kirurgiska ingrepp för dissocierande leptomeninger kritiska faktorer som påverkar cellviabiliteten. Därför är det viktigt att hålla en varaktighet inom 1 timme och hålla bufferten tillräckligt kall. En annan kritisk punkt gäller förekomsten av röda blodkroppar i leptomeningerna, från vilka frisättningen av hemoglobin kan skada LLECs. För att mildra detta är det viktigt att försiktigt spola och tvätta för att ta bort röda blodkroppar och förhindra deras cytotoxiska effekter. Slutligen kräver LLEC stimulering med VEGF-C20, särskilt vid en koncentration på 100 ng/ml. Under denna stimulering uppvisar LLEC karakteristisk endotelliknande morfologi snarare än att bilda rör (tilläggsfigur 3A-C). Följaktligen använde denna studie ett odlingsmedium som innehöll 100 ng/ml VEGF-C för att inducera expansion och upprätthålla homogenitet i cellulära populationer.
Det multiprocessuella protokollet som beskrivs här kommer med felsökningssteg och vissa begränsningar. För det första tar detta protokoll 2-3 veckor att slutföra, vilket gör det opraktiskt för frekvent upprepning. För det andra kan kirurgiska och enzymatiska ingrepp resultera i närvaro av döda celler som inte elimineras före plätering, vilket kan påverka cellodlingen. Denna möjlighet kommer att undersökas i framtida protokollimplementeringar. För det tredje, medan renheten hos skördade LLEC (VEGFR-3 och PDPN-positiva celler) överstiger 95 %, kvarstår vissa heterogena cellpopulationer, inklusive CD31-positiva celler, som utgör mindre än 5 % (tilläggsfigur 4A-C). Detta är en vanlig utmaning vid odling av primära celler. Högupplösta bilder från hematoxylin-eosinfärgning visar att LLEC uppvisar karakteristiska endotelliknande former men inte uttrycker CD31 (tilläggsfigur 5A,B). Slutligen indikerar CCK-8-analysresultaten en signifikant minskning av proliferationshastigheten i LLEC vid passage 1 och 6 jämfört med passage 2 respektive 5 (tilläggsfigur 6). Passage 1 kan leda till skador på LLECs på grund av antikroppsbehandling och den fysiska stressen under sorteringen, medan passage 6 visar minskad proliferation när antalet passager ökar. Därför är efterföljande celler efter passage 6 olämpliga för relevanta experiment. Med tanke på fördelningen av fibroblaster i hjärnhinnorna21 kan cirka 5 % av de kontaminerade cellerna innehålla fibroblaster. För att ta itu med detta kan tillsats av genetik och immunomagnetisk cellsortering användas för att avlägsna kontaminerade fibroblaster22,23. Övervakning av kontamineringshastigheten av fibroblaster i varje passage av LLEC kommer att bidra till att eliminera fibroblasternas inverkan på LLECs tillväxt24. Med tanke på heterogeniteten mellan möss och människor bör skörd och odling av primära humana LLEC eftersträvas för potentiella kliniska tillämpningar i framtida forskning.
Sammanfattningsvis finns det för närvarande inget etablerat protokoll för skörd och odling av LLEC in vitro. Denna studie introducerar ett reproducerbart, multiprocedurellt protokoll för skörd av LLEC från möss leptomeninges och därefter etablera deras primära kultur in vitro. Detta arbete kommer att underlätta ytterligare utforskning av cellulära funktioner och potentiella kliniska tillämpningar för LEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt att redovisa.
Acknowledgments
Studien stöddes av anslag från National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), Natural Science Foundation of Yunnan Province (202001AS070045, 202301AY070001-011) och Scientific Research Foundation of Yunnan Province Department of Education (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
