Summary
Yakın zamanda tanımlanmış bir intrakraniyal hücre tipi olan leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma, farelerden LLEC'lerin toplanması ve in vitro birincil kültürlerin oluşturulması için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, araştırmacıların LLEC'lerin hücresel fonksiyonlarını ve potansiyel klinik etkilerini araştırmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.
Abstract
Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerinden açıkça farklı bir dağılıma sahip, yakın zamanda keşfedilen bir intrakraniyal hücresel popülasyondur. Hücresel fonksiyonları ve klinik etkileri büyük ölçüde bilinmemektedir. Sonuç olarak, in vitro fonksiyonel araştırma yapmak için bir LLEC arzının mevcudiyeti esastır. Bununla birlikte, şu anda LLEC'lerin in vitro olarak hasat edilmesi ve kültürlenmesi için mevcut bir protokol bulunmamaktadır.
Bu çalışma, şişenin fibronektin ile kaplanmasını, leptomeninglerin mikroskop yardımıyla diseke edilmesini, tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için leptomeninglerin enzimatik olarak sindirilmesini, LLEC'lerin vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) ile genişlemesini indüklemeyi ve manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması (MACS) yoluyla lenfatik damar hyaluronik reseptör-1 (LYVE-1) pozitif hücrelerin seçilmesini içeren çok aşamalı bir protokol kullanarak LLEC'leri başarıyla topladı. Bu süreç nihayetinde birincil bir kültürün kurulmasına yol açtı. LLEC'lerin saflığı, immünofloresan boyama ve akış sitometrik analizi ile doğrulandı ve saflık seviyesi %95'i aştı. Bu çok adımlı protokol, LLEC'lerin hücresel fonksiyonunun ve klinik etkilerinin araştırılmasını büyük ölçüde kolaylaştıracak tekrarlanabilirlik ve fizibilite göstermiştir.
Introduction
Yeni keşfedilen leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerine kıyasla farklı bir dağılım modeli sergileyerek, leptomeningler içindeki tek tek hücrelerin bir ağını oluşturur 1,2. LLEC'lerle ilişkili hücresel fonksiyonlar ve klinik çıkarımlar büyük ölçüde keşfedilmemiş bir alan olarak kalmaktadır. LLEC'ler üzerinde fonksiyonel araştırmaların önünü açmak için, çalışmaları için bir in vitro model oluşturmak zorunludur. Bu nedenle, bu çalışma LLEC'lerin izolasyonu ve birincil kültürü için kapsamlı bir protokol geliştirmiştir.
Fareler, hastalık araştırmalarında genetik manipülasyona uygunlukları nedeniyle tercih edilen hayvan modelidir. Önceki çalışmalar, lenf düğümleri3, mezenterik doku4, dermal doku5, toplayıcı lenfatikler6 ve akciğer dokusu7 dahil olmak üzere çeşitli fare dokularından lenfatik endotel hücrelerini başarıyla izole etmiştir. Bu izolasyon prosedürleri öncelikle manyetik ile aktive edilen hücre sınıflandırması (MACS) ve akış sitometrisi sınıflandırması 8,9,10 gibi tekniklere dayanmaktadır. Ek olarak, araştırma çabaları, sıçan araknoid hücre hatlarının ve sıçan lenfatik kılcal hücre hatlarının kurulmasına yol açmıştır11,12. Leptomeninges13 için eksplant kültür tekniklerinin varlığına rağmen, LLEC'lerin izolasyonu ve kültürü için standart bir protokole acil ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, bu çalışma, bir mikroskop rehberliğinde leptomeningleri titizlikle ayrıştırarak ve vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) kullanarak LLEC'lerin genişlemesini teşvik ederek LLEC'leri başarıyla hasat etmiş ve kültürlemiştir. Lenfatik endotel hücreleri için ayırt edici belirteç lenfatik damar hyaluronik reseptörü-1'dir (LYVE-1)14. Bu çok adımlı protokol, MACS kullanarak LYVE-1 pozitif LLEC'leri seçici olarak izole eder ve ardından akış sitometrik analizi ve immünofloresan boyama yoluyla saflıklarını doğrular.
Bu çok adımlı protokolün birincil adımları şu şekilde özetlenebilir: şişe kaplama, leptomeninglerin ayrışması, leptomeninglerin enzimatik sindirimi, hücre genişlemesi, manyetik hücre seçimi ve müteakip LLEC kültürü. Son olarak, izole edilen LLEC'lerin saflığı, akış sitometrik analizi ve immünofloresan boyama ile doğrulanır. Bu çalışmanın genel amacı, LLEC'lerin fare leptomeninglerinden izolasyonu ve sonraki in vitro kültürleri için tekrarlanabilir, çok adımlı bir protokol sunmaktır. Bu protokol, LLEC'lerin hücresel fonksiyonları ve klinik etkileri ile ilgili araştırmaları büyük ölçüde kolaylaştırmaya hazırdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu'ndan onay almıştır (kmmu20220945). Tüm deneyler belirlenmiş hayvan bakımı kurallarına bağlı kalmıştır. Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), 6-8 haftalık ve 20-25 g ağırlığındaki erkek C57Bl / 6J farelerinden toplandı. Bu fareler, Çin'in Kunming kentindeki Kunming Tıp Üniversitesi'nden temin edildi. Tüm deneysel prosedür sıkı steril koşullar altında gerçekleştirildi. Tüm santrifüj adımları, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
1. Reaktiflerin ve aletlerin hazırlanması
NOT: Çözümleri içeren tüm adımlar, sınıf II biyolojik tehlike kabini içinde gerçekleştirilmelidir.
- Fosfat tamponlu salini (PBS) kalsiyum ve magnezyum, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin (P/S) ile karıştırarak yıkama tamponunu hazırlayın (bkz. Bu tamponu 4 °C'de soğuk tutun. Kullanım gününde taze olarak hazırlanması ve tamponun gazının alınması esastır.
- 10 mL PBS'yi (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 2 mL% 0.25 tripsin, 1 mL 20 mg / mL papain ve 200 μL 1 mg / mL kollajenaz I ile birleştirerek sindirim enzimlerini hazırlayın (bkz.
NOT: Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için uygun hacimlerde alikotların kullanıldığından emin olun. Bu alikotları -20 °C'de saklayın. - VEGF-C (100 ng/mL) ve %1 P/S içeren, ticari olarak temin edilebilen endotel hücre büyüme ortamı kitini kullanarak kültür ortamını hazırlayın (bkz.
- Sindirim sürecini durdurmak için Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerini (DMEM) %10 FBS ile destekleyerek durdurma tamponunu hazırlayın.
- Steril cerrahi aletler hazırlayın: Bu aletler makas, tırtıklı uçlu cımbız ve ince uçlu cımbız içermelidir.
2. Şişe kaplaması
- T25 şişesini 100 μg/mL fibronektin çözeltisi ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kullanmadan önce, bir pipet kullanarak kaplama solüsyonunu çıkarın.
- Şişeyi PBS ile üç kez yıkayın, ardından PBS'yi aspire edin ve T25 şişesinin kurumasını bekleyin.
3. Leptomeninges ayrışması
NOT: Daima 4 °C'de önceden soğutulmuş tamponlar ve çözeltiler kullanın.
- Fareleri% 4 izofluran soluyarak uyuşturun ve daha sonra% 70 etanol ile temizlenmiş makas kullanarak hızlı dekapitasyon ile kurban edin.
- Kafatasının arkasındaki açıklıktan başlayarak ve ön bölgeye doğru uzanan cildi orta hat boyunca dikkatlice kesin.
- Kafatasını nazikçe çıkarın, leptomeninglere zarar vermemek için makasla hafifçe kaldırın ve leptomeningler de dahil olmak üzere tüm beynin elde edilmesini sağlayın.
- Tüm beyni bir yıkama tamponuna batırın ve yüzeydeki kanı çıkarmak için hafifçe yıkayın.
- Beyni doğramadan steril bir Petri kabına aktarın ve mikroskop altında ince uçlu cımbız kullanarak leptomeningleri beyin yüzeyinden çıkarın.
- Leptomeninges dokusunu steril mikro makas kullanarak parçalara ayırın.
4. Leptomeninges enzimatik sindirim
- Parçalara 10 mL enzim karışımı (adım 1.2) ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Parçaların tüpün altından ayrıldığından emin olmak için hafifçe çalkalayın. Daha sonra, sindirimi durdurmak için 10 mL durdurma tamponu (adım 1.4) ekleyin.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- 10 mL soğuk PBS ekleyin ve herhangi bir topaklanmayı filtrelemek için karışımı 70 μm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik steril bir tüpe geçirin.
5. Hücre genişlemesi
- Plaka 1 x 10 cmbaşına 5 hücre2 5 mL kültür ortamı ile fibronektin kaplı bir T25 şişesine (adım 2).
- Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat inkübe edin. Daha sonra, bağlı olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için ortamı çıkarın.
- Her iki günde bir ortamın %50'sini değiştirerek kültürü sürdürün. Bu işlemi iki veya üç kez tekrarlayın.
6. Manyetik hücre seçimi
NOT: Hızlı çalışın, hücre soğukluğunu koruyun ve spesifik olmayan hücre etiketlemesini önlemek için önceden soğutulmuş solüsyonlar kullanın.
- Aletlerin ve reaktiflerin hazırlanması: manyetik bir ayırıcı standına manyetik bir ayırıcı takın (bkz. Malzeme Tablosu). Manyetik ayırıcıya bir seçim sütunu bağlayın ve seçim sütununun üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Akışı toplamak için seçim sütununun altına 50 mL'lik bir tüp yerleştirin.
- Enzimatik sindirim: Hücreler %80 birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile durulayın. Yapışan hücreleri ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Durdurma tamponunu ekleyerek sindirimi durdurun. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- Antikor inkübasyonu: 100 μL PBS'de 1 x10 7 toplam hücreyi yeniden süspanse edin ve 10 μL LYVE-1 antikoru ekleyin (bkz. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı atın. 1 mL PBS ekleyerek ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyerek hücreleri durulayın. Süpernatanı tamamen çıkarın.
- Mikro boncuk etiketleme: hücreleri 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve 20 μL Mikro boncuk ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). İyice karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı boşaltın. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla 1 mL PBS ile temizleyin. Son olarak, süpernatanı tamamen çıkarın.
- Manyetik negatif dışlama: hücreleri 4 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Kümeleri ortadan kaldırmak için hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Seçim sütununu (Malzeme Tablosuna bakın) 3 mL PBS ile durulayarak hazırlayın, ardından hücre süspansiyonunu seçim sütununa uygulayın.
- 3 mL PBS ile yıkama adımlarını gerçekleştirin ve LYVE-1-negatif hücreleri, geçmelerine izin vermek için seçim sütununun altına yerleştirilmiş 50 mL'lik bir tüpe toplayın.
- Manyetik pozitif seçim: Seçim sütununa 6 mL PBS pipetleyin. LYVE-1 pozitif LLEC'ler elde etmek için pistonu seçim sütununa sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri anında temizleyin.
NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce her zaman seçim sütunu haznesinin boşalmasını bekleyin.
7. LLEC kültürü
- LYVE-1-pozitif LLEC'leri 300 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- Plaka 1 x 10cm başına 5 hücre2 5 mL kültür ortamı ile fibronektin kaplı bir T25 şişesine.
- Ortamın %50'sini her gün değiştirerek kültürü koruyun. Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında,% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırın ve hücre geçişini gerçekleştirin. Hücreleri 2-3 geçişten sonra sonraki deneyler için kullanın.
8. Akış sitometrik analizi
NOT: Flow sitometrik analizi, daha önce açıklanan prosedür15 izlenerek gerçekleştirilmiştir.
- Yapışan hücreleri ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Ardından, sindirimi durdurmak için durdurma tamponunu ekleyin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. 100 μL PBS'de 1 x10 6 hücreyi yeniden süspanse edin.
- 1 μL LYVE-1 antikoru ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
- Akış sitometrisi ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz için hücreleri uygun miktarda PBS tamponunda yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu).
9. İmmünofloresan boyama
NOT: İmmünofloresan boyama, daha önce açıklanan prosedür izlenerek gerçekleştirilmiştir16.
- Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. PFA'yı atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
- Blok tamponunu oda sıcaklığında 1 saat uygulayın. Blok tamponunu lamellerden çıkarın.
- Boyama tamponundaki LYVE-1 antikorunu hücrelere ekleyin ve karanlıkta inkübe edin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
- Boyama tamponuna uygun bir ikincil antikor ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) hücrelere ve karanlıkta inkübe edin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
- 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile karşı boyama. Hücreler artık immünofloresan mikroskobu için hazırdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma, farelerden lenfatik endotel hücrelerinin (LLEC'ler) toplanması ve daha sonra birincil kültürlerinin in vitro olarak oluşturulması için tekrarlanabilir, çok aşamalı bir protokol sunmaktadır. Anahtar adımlar, şişe hazırlama ve fibronektin kaplama, leptomeninglerin ayrışması, enzimatik sindirim yoluyla tek hücreli bir süspansiyon elde edilmesi ve VEGF-C ile LLEC'lerin genişlemesinin indüklenmesini içerir. LYVE-1 pozitif LLEC'ler daha sonra manyetik olarak aktive edilen hücre sınıflandırması (MACS) kullanılarak seçici olarak izole edilir. Son olarak, LLEC'lerin saflığını değerlendirmek için immünofloresan boyama ve akış sitometrik analizi yapılır ve MTT tahlil sonuçları sağlam LLEC büyüme oranlarını gösterir (Ek Şekil 1). Bu çok prosedürlü protokolün birincil adımları, tüm süreç yaklaşık 2-3 hafta sürecek şekilde akış şemasında gösterilmektedir (Şekil 1).
LLEC'leri hasat etmek için, etkili cerrahi tekniklerle hücre canlılığını korurken ve soğuk bir ortamı korurken leptomeningleri ayırmak ve LLEC'lerin genişlemesini teşvik etmek esastır (Şekil 2A-E). Steril koşullar altında leptomeninglerle birlikte tüm beyin elde edildikten sonra, kan kırmızısı hücreleri uzaklaştırmak için hafif bir yıkama adımı gerçekleştirilir (Şekil 2F). Daha sonra, leptomeningler beyin yüzeyinden mikroskop altında dikkatlice çıkarılır (Şekil 2G). Bu leptomeningler esas olarak kollajen liflerinden oluşur, bu nedenle enzimatik sindirimi hızlandırmak için parçalanırlar (Şekil 2H). Daha sonra, bu parçaların enzimatik sindirimi gerçekleştirilir ve kalan kümeler, daha büyük kollajen lif kümelerini ortadan kaldırmak için 70 μm'lik bir süzgeçten süzülür (Şekil 2I). Son olarak, hücreler fibronektin kaplı bir T25 şişesine kaplanır ve genişlemeyi indüklemek için VEGF-C eklenir (Şekil 2J). 24 saat sonra, bağlanmamış hücreleri ortadan kaldırmak için kültür ortamı çıkarılır. Bu adımlar, hücrelerin leptomeninglerden toplanmasını kolaylaştırır ve sürecin ilerleyen aşamalarında yeterli LYVE-1-pozitif LLEC'ler elde etmek için kritik olan genişlemeyi teşvik eder.
VEGF-C, LLEC genişlemesini indüklerken, heterojen hücresel popülasyonlar hala birlikte büyüyebilir. Saf LYVE-1-pozitif LLEC'leri izole etmek için, LYVE-1 lenfatik endotel hücreleri için tanınmış bir belirteç olduğu için MACS kullanılır. LLEC'lerin saflığı, akış sitometrisi ile değerlendirilir ve sonuçlar, pasaj 2'deki LYVE-1-pozitif hücrelerin yüzdesinin, MACS'den sonraki pasaj 3'ten önemli ölçüde farklı olmadığını ve %95'ten daha büyük bir saflık gösterdiğini gösterir (Şekil 3A). LYVE-1-pozitif LLEC'lerin özgüllüğünü daha fazla doğrulamak için, üç ek lenfatik endotel hücre belirteci-podoplanin (PDPN), vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü-3 (VEGFR-3) ve Prospero ile ilişkili homeobox1 (PROX1) 17,18,19 tanımlaması için kullanıldı. İmmünofloresan boyama, LYVE-1'in bu üç belirteç ile birlikte boyandığını doğruladı (Şekil 3B). Ayrıca, LYVE-1'in PROX1, VEGFR-3 ve PDPN ile birlikte boyandığını gösteren fizyolojik koşullar altında beyin dilimlerinde LLEC'lerin kimliği belirlendi (Ek Şekil 2A). LYVE-1 pozitif hücreler, LLEC'leri makrofajlardan ve fibroblastlardan etkili bir şekilde ayıran F4/80 ve Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü beta'yı (PDGFR-β) eksprese etmedi (Ek Şekil 2B). Özetle, bu protokol, in vitro kültür yapabilen yüksek saflıkta LLEC'lerin toplanmasına izin verir.
MACS'den önceki leptomeningeal hücreler, lenfatik endotel hücrelerinin kolonilerinden farklı olarak heterojenlik sergiler. Morfolojileri, tek yuvarlak kürelerden kaynaşmış lif şekillerine kadar değişir (Şekil 4A-D). Bununla birlikte, MACS sonrası, LLEC'ler tipik iğ ve parke taşı şeklinde endotel benzeri özellikler sergiler (Şekil 4E-H). Bu sonuçlara dayanarak, LLEC'ler bu çok prosedürlü protokol aracılığıyla etkin bir şekilde hasat edilir ve sağlıklı bir büyüme durumunda tutulur.
Şekil 1: Çoklu prosedür protokolünün şematik gösterimi. Bu akış şeması, LLEC'lerin hasadı ve kültürü için çok prosedürlü protokolü göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Leptomeninges hücrelerinin toplanması . (A) Steril cerrahi aletlerin hazırlanması. (B) Fareler% 4 izofluran solunarak uyuşturuldu ve daha sonra ötenaziden sonra% 70 etanol ile temizlendi. (C) Farelerin başının kesilmesi ve kafatasının arkasından başlayarak ön bölgeye doğru derinin dikkatli bir şekilde orta hat kesilmesi. (D) Leptomeninglerin bütünlüğünü korumak için kafatasının hassas bir şekilde çıkarılması. (E) Leptomeningleri içeren tüm beynin alınması. (F) Yüzeydeki kanı çıkarmak için tüm beynin bir tampon solüsyonda hafifçe yıkanması. (G) İnce uçlu cımbız kullanılarak beyin yüzeyinden leptomeninglerin diseksiyonu. (H) Leptomeninglerin steril mikro makasla parçalara ayrılması, ardından 10 mL enzim karışımının eklenmesi ve 37 °C'de 15 dakika inkübasyon. (I) Peletin 10 mL PBS'de yeniden süspansiyonu ve kümelerin 70 μm'lik bir süzgeçten süzülmesi. (J) Hücrelerin kaplanmış bir T25 şişesine kaplanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MACS sonrası LLEC saflığının değerlendirilmesi. (A) MACS'yi takip eden pasaj 2 ve 3'te LYVE-1-pozitif hücrelerin ekspresyonunu gösteren akış sitometrik analizinden elde edilen temsili histogramlar. LYVE-1 pozitif hücrelerin yüzdesi MACS'den sonra% 95'i aşıyor. Veriler üç bağımsız deneyi temsil eder (Ortalama ± SEM). Hata çubukları SEM'i gösterir. (B) LYVE-1'in PDPN, VEGFR-3 ve PROX1 ile birlikte boyanmasını gösteren temsili immünofloresan görüntüsü. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Leptomeningeal hücrelerin ve LLEC'lerin büyüme özellikleri. (A) Temsili görüntülerde yakalanan leptomeningeal hücrelerin morfolojisi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B-D) MACS'den önceki 1. gün, 2. gün ve 3. günde leptomeningeal hücrelerin morfolojisini gösteren temsili görüntüler. Ölçek çubukları = 100 μm. (E) Temsili görüntülerde yakalanan LLEC'lerin morfolojisi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (F-H) MACS'yi takip eden 1. gün, 2. gün ve 3. günde LLEC'lerin morfolojisini gösteren temsili görüntüler. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: LLEC'lerin ve SVEC4-10'un büyüme hızı. MTT tahlil sonuçları, SVEC4-10 grubuna kıyasla pasaj 1'deki LLEC'lerin büyüme hızında önemli bir düşüş olduğunu göstermektedir. Pasaj 2 ve pasaj 3 LLEC grupları arasında SVEC4-10 grubuna göre anlamlı bir fark yoktu. Veriler, altı bağımsız deneyden elde edilen sonuçları temsil eder (Ortalama ± SEM). Hata çubukları SEM'i gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Beyin dilimlerinde LLEC'lerin karakterizasyonu ve ayrımı. (A) Fizyolojik koşullar altında beyin dilimlerinde LYVE-1'in PROX1, VEGFR-3 ve PDPN ile birlikte boyanmasını gösteren temsili immünofloresan görüntüsü. Ölçek çubukları = 2 μm. (B) LYVE-1'in fizyolojik koşullar altında beyin dilimlerinde F4/80 ve PDGFR-β ile birlikte boyanmadığını gösteren temsili immünofloresan görüntü. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: VEGF-C stimülasyonu altında LLEC'lerin büyümesi. (A) 1 ng/mL VEGF-C stimülasyonu altındaki LLEC'lerin temsili görüntüleri. (B) 100 ng/mL VEGF-C stimülasyonu altındaki LLEC'lerin temsili görüntüleri. (C) 500 ng/mL VEGF-C stimülasyonu altındaki LLEC'lerin temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4: Hasattan sonra CD31, PDPN ve VEGFR-3'ün ekspresyonu. (A) Akış sitometrik analizinden elde edilen temsili histogramlar, CD31 pozitif hücrelerin% 5'ten az olduğunu göstermektedir. (B) Akış sitometrik analizinden elde edilen temsili histogramlar, PDPN pozitif hücrelerin% 95'i aştığını göstermektedir. (C) Akış sitometrik analizinden elde edilen temsili histogramlar, VEGFR-3 pozitif hücrelerin% 95'i aştığını göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 5: LLEC'lerin morfolojisi ve CD31'den farkı. (A) Hematoksilen-eozin boyama ile ortaya çıkan LLEC morfolojisinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Temsili immünofloresan görüntüleri, LYVE-1 ve PDPN'nin CD31 ile birlikte boyanmadığını göstermektedir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 6: LLEC'lerin çoğalma hızı. CCK-8 tahlilinden elde edilen temsili sonuçlar, sırasıyla pasaj 2 ve 5'e kıyasla pasaj 1 ve pasaj 6'daki LLEC'lerin proliferasyon hızında önemli bir azalma olduğunu göstermektedir. Veriler, altı bağımsız deneyden elde edilen sonuçları temsil eder (Ortalama ± SEM). Hata çubukları SEM'i gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LLEC'lerin in vitro olarak toplanması ve kültürlenmesi için mevcut protokol daha önce rapor edilmemiştir. Bu çalışma, fare leptomeninglerinden LLEC'lerin toplanması ve kültürlenmesi için tekrarlanabilir, çok prosedürlü bir protokol sunmaktadır.
Bu çok prosedürlü protokol tekrarlanabilir olsa da, birkaç önemli husus vardır. Örneğin, fibronektin kaplı T25 şişeleri, LLEC'lerin yapışmasını teşvik eder ve yapışmayan hücreleri ortadan kaldırarak işlev görür, böylece daha homojen bir hücresel popülasyon sağlar. Ek olarak, leptomeningleri ayrıştırmak için cerrahi prosedürler sırasındaki süre ve sıcaklık, hücre canlılığını etkileyen kritik faktörlerdir. Bu nedenle, 1 saat içinde bir süreyi korumak ve tamponu yeterince soğuk tutmak çok önemlidir. Diğer bir kritik nokta, hemoglobin salınımının LLEC'lere zarar verebileceği leptomeninglerde kırmızı kan hücrelerinin varlığı ile ilgilidir. Bunu hafifletmek için, kırmızı kan hücrelerini çıkarmak ve sitotoksik etkilerini önlemek için nazikçe yıkamak ve yıkamak önemlidir. Son olarak, LLEC'ler, özellikle100 ng/mL'lik bir konsantrasyonda VEGF-C 20 ile stimülasyon gerektirir. Bu stimülasyon altında, LLEC'ler tüpler oluşturmak yerine karakteristik endotel benzeri morfoloji sergiler (Ek Şekil 3A-C). Sonuç olarak, bu çalışma, hücresel popülasyonlarda genişlemeyi indüklemek ve homojenliği korumak için 100 ng / mL VEGF-C içeren bir kültür ortamı kullanmıştır.
Burada açıklanan çoklu prosedür protokolü, sorun giderme adımları ve bazı sınırlamalarla birlikte gelir. İlk olarak, bu protokolün tamamlanması 2-3 hafta sürer ve bu da sık sık tekrarlanmasını pratik hale getirir. İkinci olarak, cerrahi ve enzimatik prosedürler, kaplamadan önce elimine edilmeyen ve potansiyel olarak hücre kültürünü etkileyen ölü hücrelerin varlığına neden olabilir. Bu olasılık gelecekteki protokol uygulamalarında araştırılacaktır. Üçüncüsü, hasat edilen LLEC'lerin (VEGFR-3 ve PDPN pozitif hücreler) saflığı %95'i aşarken, %5'ten daha azını oluşturan CD31 pozitif hücreler de dahil olmak üzere bazı heterojen hücre popülasyonları devam eder (Ek Şekil 4A-C). Bu, birincil hücrelerin kültüründe yaygın bir zorluktur. Hematoksilen-eozin boyamadan elde edilen yüksek çözünürlüklü görüntüler, LLEC'lerin karakteristik endotel benzeri şekiller gösterdiğini ancak CD31'i eksprese etmediğini göstermektedir (Ek Şekil 5A, B). Son olarak, CCK-8 test sonuçları, sırasıyla pasaj 2 ve 5'e kıyasla pasaj 1 ve 6'da LLEC'lerde proliferasyon hızında önemli bir azalma olduğunu göstermektedir (Ek Şekil 6). Pasaj 1, antikor tedavisi ve sıralama sırasındaki fiziksel stres nedeniyle LLEC'lerin hasar görmesine neden olabilirken, pasaj 6, pasaj sayısı arttıkça proliferasyonun azaldığını gösterir. Bu nedenle, 6. pasajdan sonraki hücreler ilgili deneyler için uygun değildir. Meninkslerdeki fibroblastların dağılımı göz önüne alındığında21, kontamine hücrelerin yaklaşık% 5'i fibroblast içerebilir. Bunu ele almak için, kontamine fibroblastları uzaklaştırmak için genetin ve immünomanyetik hücre sınıflandırmasının eklenmesikullanılabilir 22,23. LLEC'lerin her geçişinde fibroblastların kontaminasyon oranının izlenmesi, fibroblastların LLEC'lerin büyümesi üzerindeki etkisinin ortadan kaldırılmasına yardımcı olacaktır24. Fareler ve insanlar arasındaki heterojenlik göz önüne alındığında, gelecekteki araştırmalarda potansiyel klinik uygulamalar için birincil insan LLEC'lerinin toplanması ve kültürlenmesi takip edilmelidir.
Özetle, şu anda LLEC'lerin in vitro olarak hasat edilmesi ve kültürlenmesi için yerleşik bir protokol bulunmamaktadır. Bu çalışma, fare leptomeninglerinden LLEC'lerin toplanması ve daha sonra birincil kültürlerinin in vitro olarak oluşturulması için tekrarlanabilir, çok prosedürlü bir protokol sunmaktadır. Bu çalışma, LLEC'ler için hücresel fonksiyonların ve potansiyel klinik uygulamaların daha fazla araştırılmasını kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81960226, 81760223), Yunnan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (202001AS070045, 202301AY070001-011) ve Yunnan Eyaleti Eğitim Bakanlığı Bilimsel Araştırma Vakfı (2023Y0784) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
