Summary
Leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC's), een recent geïdentificeerd intracraniaal celtype, hebben slecht begrepen functies. Deze studie presenteert een reproduceerbaar protocol voor het oogsten van LLC's van muizen en het opzetten van in vitro primaire culturen. Dit protocol is ontworpen om onderzoekers in staat te stellen zich te verdiepen in de cellulaire functies en mogelijke klinische implicaties van LLC's.
Abstract
Leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC's) zijn een recent ontdekte intracraniële cellulaire populatie met een unieke verdeling die duidelijk verschilt van perifere lymfatische endotheelcellen. Hun cellulaire functie en klinische implicaties blijven grotendeels onbekend. Bijgevolg is de beschikbaarheid van een aanbod van LLC's van essentieel belang voor het uitvoeren van functioneel onderzoek in vitro. Er bestaat momenteel echter geen protocol voor het oogsten en kweken van LLC's in vitro.
Deze studie oogstte met succes LLC's met behulp van een meerstappenprotocol, waaronder het coaten van de kolf met fibronectine, het ontleden van de leptomeninges met behulp van een microscoop, het enzymatisch verteren van de leptomeninges om een eencellige suspensie te bereiden, het induceren van de expansie van LLC's met vasculaire endotheliale groeifactor-C (VEGF-C) en het selecteren van hyaluronreceptor-1 (LYVE-1) positieve cellen van lymfevaten door middel van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). Dit proces leidde uiteindelijk tot de oprichting van een primaire cultuur. De zuiverheid van de LLC's werd bevestigd door middel van immunofluorescentiekleuring en flowcytometrische analyse, met een zuiverheidsgraad van meer dan 95%. Dit meerstappenprotocol heeft reproduceerbaarheid en haalbaarheid aangetoond, wat de verkenning van de cellulaire functie en klinische implicaties van LLC's aanzienlijk zal vergemakkelijken.
Introduction
De nieuw ontdekte leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC's) vormen een netwerk van individuele cellen in de leptomeninges en vertonen een duidelijk distributiepatroon in vergelijking met perifere lymfatische endotheelcellen 1,2. De cellulaire functies en klinische implicaties die verband houden met LLC's blijven grotendeels onbekend terrein. Om de weg vrij te maken voor functioneel onderzoek naar LLC's, is het absoluut noodzakelijk om een in vitro model voor hun studie op te stellen. Daarom heeft deze studie een uitgebreid protocol opgesteld voor de isolatie en primaire cultuur van LLC's.
Muizen hebben de voorkeur vanwege hun geschiktheid voor genetische manipulatie in ziekteonderzoek. Eerdere studies hebben met succes lymfatische endotheelcellen geïsoleerd uit verschillende muizenweefsels, waaronder lymfeklieren3, mesenteriaal weefsel4, huidweefsel5, verzamelende lymfevaten6 en longweefsel7. Deze isolatieprocedures zijn voornamelijk gebaseerd op technieken zoals magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) en flowcytometriesortering 8,9,10. Bovendien hebben onderzoeksinspanningen geleid tot de oprichting van arachnoïdale cellijnen van ratten en lymfatische capillaire cellijnen van ratten11,12. Ondanks het bestaan van explantatiekweektechnieken voor leptomeninges13 bestaat er dringend behoefte aan een gestandaardiseerd protocol voor de isolatie en kweek van LLC's. Bijgevolg heeft deze studie met succes LLC's geoogst en gekweekt door leptomeningen nauwgezet te dissociëren onder begeleiding van een microscoop en de uitbreiding van LLC's te bevorderen door het gebruik van vasculaire endotheliale groeifactor-C (VEGF-C). De onderscheidende marker voor lymfatische endotheelcellen is hyaluronreceptor-1 (LYVE-1)14 van het lymfevat. Dit meerstapsprotocol isoleert selectief LYVE-1-positieve LLC's met behulp van MACS en verifieert vervolgens hun zuiverheid door middel van flowcytometrische analyse en immunofluorescerende kleuring.
De primaire stappen van dit meerstappenprotocol kunnen als volgt worden samengevat: kolfcoating, dissociatie van leptomeningen, enzymatische vertering van leptomeningen, celexpansie, magnetische celselectie en daaropvolgende kweek van LLC's. Ten slotte wordt de zuiverheid van de geïsoleerde LLC's bevestigd door middel van flowcytometrische analyse en immunofluorescerende kleuring. Het overkoepelende doel van deze studie is het presenteren van een reproduceerbaar, meerstapsprotocol voor de isolatie van LLC's uit leptomeninges van muizen en hun daaropvolgende in vitro kweek. Dit protocol is klaar om het onderzoek naar de cellulaire functies en klinische implicaties van LLC's aanzienlijk te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek kreeg goedkeuring van de Animal Experiment Ethics Committee van de Kunming Medical University (kmmu20220945). Alle experimenten voldeden aan de vastgestelde richtlijnen voor dierverzorging. Leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC's) werden geoogst van mannelijke C57Bl/6J-muizen van 6-8 weken oud en met een gewicht tussen 20-25 g. Deze muizen werden verkregen van de Kunming Medical University in Kunming, China. De hele experimentele procedure werd uitgevoerd onder strikt steriele omstandigheden. Alle centrifugatiestappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.
1. Bereiding van reagentia en instrumenten
NOTITIE: Alle stappen met betrekking tot oplossingen moeten worden uitgevoerd in een klasse II biohazard-kast.
- Bereid de wasbuffer voor door fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te mengen met calcium en magnesium, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (P/S) (zie materiaaltabel). Houd deze buffer koud bij 4 °C. Het is essentieel om het op de dag van gebruik vers te bereiden en de buffer te ontgassen.
- Bereid de spijsverteringsenzymen voor door 10 ml PBS (zonder calcium en magnesium) te combineren met 2 ml 0,25% trypsine, 1 ml 20 mg/ml papaïne en 200 μl 1 mg/ml collagenase I (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Zorg voor het gebruik van aliquots van geschikte volumes om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen. Bewaar deze aliquots bij -20 °C. - Bereid het kweekmedium voor met behulp van de in de handel verkrijgbare endotheelcelgroeimediumkit, die VEGF-C (100 ng/ml) en 1% P/S bevat (zie materiaaltabel).
- Bereid de stopbuffer voor door Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aan te vullen met 10% FBS om het verteringsproces te stoppen.
- Bereid steriele chirurgische instrumenten voor: deze instrumenten moeten een schaar, een pincet met een gekartelde punt en een pincet met fijne punt bevatten.
2. Deklaag van de kolf
- Bestrijk de T25-kolf met een fibronectineoplossing van 100 μg/ml (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende een nacht bij 37 °C. Verwijder voor gebruik de coatingoplossing met behulp van een pipet.
- Spoel de kolf driemaal met PBS, zuig vervolgens de PBS op en laat de T25-kolf aan de lucht drogen.
3. Leptomeninges dissociatie
OPMERKING: Gebruik altijd voorgekoelde buffers en oplossingen bij 4 °C.
- Verdoof de muizen met overmatige inademing van 4% isofluraan en offer ze vervolgens op door snelle onthoofding met een schaar die eerder is schoongemaakt met 70% ethanol.
- Snijd de huid voorzichtig in langs de middellijn, beginnend bij de opening aan de achterkant van de schedel en zich uitstrekkend naar het frontale gebied.
- Verwijder voorzichtig de schedel en til deze voorzichtig op met de schaar om beschadiging van de leptomeninges te voorkomen, zodat de hele hersenen, inclusief de leptomeninges, worden verkregen.
- Dompel de hele hersenen onder in een wasbuffer en spoel deze voorzichtig door om het oppervlaktebloed te verwijderen.
- Breng de hersenen over in een steriele petrischaal zonder te hakken en haal de leptomeningen uit het hersenoppervlak met behulp van een pincet met een fijne punt onder een microscoop.
- Knip het leptomeningesweefsel in fragmenten met behulp van een steriele microschaar.
4. Leptomeninges enzymatische spijsvertering
- Voeg 10 ml van het enzymmengsel (stap 1.2) toe aan de fragmenten en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. Wrijf voorzichtig om ervoor te zorgen dat de fragmenten loskomen van de bodem van de buis. Voeg daarna 10 ml stopbuffer toe (stap 1.4) om de spijsvertering te stoppen.
- Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatans voorzichtig met behulp van een pipet.
- Voeg 10 ml koude PBS toe en giet het mengsel door een zeef van 70 μm in een steriele buis van 50 ml om eventuele klontjes eruit te filteren.
5. Celuitbreiding
- Plaat 1 x 10 5 cellen percm2 in een met fibronectine beklede T25-kolf (stap 2) met5 ml kweekmedium.
- Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur. Verwijder daarna het medium om niet-gehechte cellen te verwijderen.
- Houd de cultuur in stand door elke twee dagen 50% van het medium te vervangen. Herhaal dit proces twee of drie keer.
6. Selectie van magnetische cellen
NOTITIE: Werk snel, behoud de celkou en gebruik voorgekoelde oplossingen om niet-specifieke celetikettering te voorkomen.
- Voorbereiding van instrumenten en reagentia: bevestig een magneetscheider aan een magneetscheiderstandaard (zie Materiaaltabel). Sluit een selectiekolom aan op de magneetscheider en plaats een celzeef van 70 μm bovenop de selectiekolom. Plaats een buis van 50 ml onder de selectiekolom om de stroom op te vangen.
- Enzymatische vertering: zodra de cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt, zuigt u het medium op en spoelt u de cellen met PBS. Voeg 0,25% trypsine toe om de aanhangende cellen los te maken en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Stop de vertering door de stopbuffer toe te voegen. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g en verwijder het supernatant.
- Incubatie van antilichamen: resuspendeer 1 x 107 cellen in totaal in 100 μL PBS en voeg 10 μL LYVE-1-antilichaam toe (zie Materiaaltabel). Meng grondig en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C.
- Draai de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg. Spoel de cellen door 1 ml PBS toe te voegen en gedurende 5 minuten te centrifugeren op 300 x g . Verwijder het supernatant volledig.
- Etikettering van microbeads: resuspendeer de cellen in 100 μL PBS en voeg 20 μL Microbeads toe (zie Tabel met materialen). Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C.
- Draai de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g en decanteer de supernatant. Reinig vervolgens de cellen met 1 ml PBS door middel van centrifugeren op 300 x g gedurende 5 minuten. Verwijder ten slotte de supernatant volledig.
- Magnetische negatieve uitsluiting: resuspendeer de cellen in 4 ml PBS. Haal de cellen door een celzeef van 70 μm om klonten te verwijderen. Bereid de selectiekolom voor (zie Materiaaltabel) door deze te spoelen met 3 ml PBS en breng vervolgens de celsuspensie aan in de selectiekolom.
- Voer wasstappen uit met 3 ml PBS en verzamel LYVE-1-negatieve cellen in een buis van 50 ml die onder de selectiekolom is geplaatst om ze door te laten.
- Magnetische positieve selectie: pipetteer 6 ml PBS in de selectiekolom. Spoel de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk uit door de plunjer stevig in de selectiekolom te duwen om LYVE-1-positieve LLC's te verkrijgen.
NOTITIE: Wacht altijd tot het reservoir van de selectiekolom leeg is voordat u doorgaat naar de volgende stap.
7. LLC-cultuur
- Centrifugeer de LYVE-1-positieve LLC's bij 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.
- Schep 1 x 10 5 cellen percm2 in een met fibronectine beklede T25-kolf met5 ml kweekmedium.
- Onderhoud de cultuur door om de dag 50% van het medium te vervangen. Wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken, maakt u de cellen los met 0,25% trypsine en voert u de celpassage uit. Gebruik de cellen voor volgende experimenten na 2-3 passages.
8. Flowcytometrische analyse
OPMERKING: De flowcytometrische analyse werd uitgevoerd volgens de eerder beschreven procedure15.
- Voeg 0,25% trypsine toe om de aanhangende cellen los te maken en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens de stopbuffer toe om de spijsvertering te stoppen.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g en zuig het supernatant volledig op. Resuspendeer 1 x 106 cellen in 100 μL PBS.
- Voeg 1 μL LYVE-1-antilichaam toe. Meng grondig en incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de cellen in een geschikte hoeveelheid PBS-buffer voor analyse met behulp van flowcytometrie en FlowJo-software (zie Materiaaltabel).
9. Immunofluorescerende kleuring
OPMERKING: De immunofluorescerende kleuring werd uitgevoerd volgens de eerder beschreven procedure16.
- Was de cellen drie keer met PBS. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de PFA weg en was de cellen drie keer met PBS.
- Breng de blokbuffer gedurende 1 uur aan bij kamertemperatuur. Verwijder de blokbuffer van de dekglaasjes.
- Voeg het LYVE-1-antilichaam in de kleuringsbuffer toe aan de cellen en incubeer in het donker. Was de cellen drie keer met PBS.
- Voeg een geschikt secundair antilichaam (zie Materiaaltabel) in de kleuringsbuffer toe aan de cellen en incubeer in het donker. Was de cellen drie keer met PBS.
- Bestrijdt de vlek met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). De cellen zijn nu klaar voor immunofluorescentiemicroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze studie presenteert een reproduceerbaar, meerstapsprotocol voor het oogsten van lymfatische endotheelcellen (LLC's) van muizen en vervolgens het vaststellen van hun primaire kweek in vitro. De belangrijkste stappen zijn de voorbereiding van de kolf en fibronectinecoating, dissociatie van leptomeningen, het verkrijgen van een eencellige suspensie door enzymatische vertering en het induceren van LLC-expansie met VEGF-C. LYVE-1-positieve LLC's worden vervolgens selectief geïsoleerd met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). Ten slotte worden immunofluorescentiekleuring en flowcytometrische analyse uitgevoerd om de zuiverheid van LLC's te beoordelen, waarbij de resultaten van de MTT-test robuuste LLC-groeisnelheden aantonen (aanvullende figuur 1). De primaire stappen van dit multiprocedurele protocol worden geïllustreerd in het stroomschema, waarbij het hele proces ongeveer 2-3 weken in beslag neemt (Figuur 1).
Om LLC's te oogsten, is het essentieel om leptomeninges te dissociëren en de uitbreiding van LLC's te bevorderen, terwijl de levensvatbaarheid van de cellen behouden blijft door middel van efficiënte chirurgische technieken en het handhaven van een koude omgeving (Figuur 2A-E). Na het verkrijgen van de hele hersenen samen met de leptomeningen onder steriele omstandigheden, wordt een zachte spoelstap uitgevoerd om bloedrode bloedcellen te verwijderen (Figuur 2F). Vervolgens worden leptomeningen voorzichtig onder een microscoop uit het hersenoppervlak gehaald (Figuur 2G). Deze leptomeningen bestaan voornamelijk uit collageenvezels, dus ze zijn gefragmenteerd om de enzymatische vertering te versnellen (Figuur 2H). Vervolgens wordt enzymatische vertering van deze fragmenten uitgevoerd en worden eventuele resterende klonten gefilterd door een zeef van 70 μm om grotere clusters collageenvezels te verwijderen (Figuur 2I). Ten slotte worden de cellen geplateerd in een met fibronectine gecoate T25-kolf en wordt VEGF-C toegevoegd om expansie te induceren (Figuur 2J). Na 24 uur wordt het kweekmedium verwijderd om niet-gehechte cellen te verwijderen. Deze stappen vergemakkelijken het oogsten van cellen uit leptomeningen en bevorderen expansie, wat van cruciaal belang is voor het verkrijgen van voldoende LYVE-1-positieve LLC's later in het proces.
Hoewel VEGF-C LLC-expansie induceert, kunnen heterogene cellulaire populaties nog steeds samen groeien. Om pure LYVE-1-positieve LLC's te isoleren, wordt MACS gebruikt omdat LYVE-1 een erkende marker is voor lymfatische endotheelcellen. De zuiverheid van LLC's wordt beoordeeld door middel van flowcytometrie, waarbij de resultaten aangeven dat het percentage LYVE-1-positieve cellen in passage 2 niet significant verschilt van passage 3 na MACS, wat een zuiverheid van meer dan 95% aantoont (Figuur 3A). Om de specificiteit van LYVE-1-positieve LLC's verder te valideren, werden drie extra lymfatische endotheelcelmarkers - podoplanine (PDPN), vasculaire endotheliale groeifactorreceptor-3 (VEGFR-3) en Prospero-gerelateerde homeobox1 (PROX1) gebruikt voor identificatie17,18,19. Immunofluorescentiekleuring bevestigde dat LYVE-1 samen met deze drie markers kleurde (Figuur 3B). Bovendien werd de identiteit van LLC's vastgesteld in hersenplakjes onder fysiologische omstandigheden, waarbij co-kleuring van LYVE-1 met PROX1, VEGFR-3 en PDPN werd aangetoond (aanvullende figuur 2A). LYVE-1-positieve cellen brachten F4/80 en Platelet-Derived Growth Factor beta (PDGFR-β niet tot expressie, waardoor LLC's effectief werden onderscheiden van macrofagen en fibroblasten (aanvullende figuur 2B). Samengevat maakt dit protocol het mogelijk om zeer zuivere LLC's te oogsten die in staat zijn tot in-vitrokweek.
Leptomeningeale cellen vóór MACS vertonen heterogeniteit, die verschilt van de kolonies van lymfatische endotheelcellen. Hun morfologie varieert van enkele ronde bollen tot gesmolten vezelvormen (Figuur 4A-D). Na MACS vertonen LLC's echter typische spil- en geplaveide endotheelachtige kenmerken (Figuur 4E-H). Op basis van deze resultaten worden LLC's effectief geoogst via dit multiprocedurele protocol en in een gezonde groeitoestand gehouden.
Figuur 1: Schematische weergave van het multiprocedurele protocol. Dit stroomschema illustreert het multiprocedurele protocol voor het oogsten en kweken van LLC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Oogsten van leptomeningescellen . (A) Bereiding van steriele chirurgische instrumenten. (B) Muizen werden verdoofd via inhalatie van 4% isofluraan en vervolgens gereinigd met 70% ethanol na euthanasie. (C) Onthoofding van de muizen en zorgvuldige incisie in de middellijn van de huid, beginnend vanaf de achterkant van de schedel naar het frontale gebied. (D) Delicate verwijdering van de schedel om de integriteit van de leptomeninges te behouden. (E) Ophalen van de gehele hersenen die de leptomeningen bevatten. (F) Wassen van de hele hersenen in een bufferoplossing met zachte spoeling om oppervlaktebloed te verwijderen. (G) Dissectie van leptomeningen van het hersenoppervlak met behulp van een pincet met fijne punt. H) Snijden van leptomeningen in fragmenten met een steriele microschaar, gevolgd door toevoeging van 10 ml enzymmengsel en incubatie bij 37 °C gedurende 15 minuten. (I) Resuspensie van de pellet in 10 ml PBS en filtratie van klonten door een zeef van 70 μm. (J) Plateren van cellen in een beklede T25-kolf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beoordeling van de LLC-zuiverheid na MACS. (A) Representatieve histogrammen van flowcytometrische analyse die de expressie van LYVE-1-positieve cellen in passages 2 en 3 na MACS aantonen. Het percentage LYVE-1-positieve cellen overschrijdt 95% na MACS. De gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten (Mean ± SEM). Foutbalken geven SEM aan. (B) Representatief immunofluorescentiebeeld dat co-kleuring van LYVE-1 met PDPN, VEGFR-3 en PROX1 laat zien. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Groeikarakteristieken van leptomeningeale cellen en LLC's. (A) Morfologie van leptomeningeale cellen vastgelegd in representatieve beelden. Schaalbalk = 50 μm. (B-D) Representatieve afbeeldingen die de morfologie van leptomeningeale cellen weergeven op dag 1, dag 2 en dag 3 voorafgaand aan MACS. Schaalbalken = 100 μm. (E) Morfologie van LLC's vastgelegd in representatieve beelden. Schaalbalk = 50 μm. (F-H) Representatieve afbeeldingen die de morfologie van LLC's illustreren op dag 1, dag 2 en dag 3 na MACS. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Groeipercentage van LLC's en SVEC4-10. De resultaten van de MTT-test tonen een significante afname van de groeisnelheid van LLC's in passage 1 in vergelijking met de SVEC4-10-groep. Er waren geen significante verschillen tussen de LLC-groepen van passage 2 en passage 3 in vergelijking met de SVEC4-10-groep. De gegevens vertegenwoordigen de resultaten van zes onafhankelijke experimenten (Mean ± SEM). Foutbalken geven SEM aan. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Karakterisering en discriminatie van LLC's in hersenplakjes. (A) Representatief immunofluorescentiebeeld dat co-kleuring van LYVE-1 met PROX1, VEGFR-3 en PDPN in hersenplakjes onder fysiologische omstandigheden illustreert. Schaalbalken = 2 μm. (B) Representatief immunofluorescentiebeeld dat aantoont dat LYVE-1 onder fysiologische omstandigheden niet samen kleurt met F4/80 en PDGFR-β in hersenplakjes. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Groei van LLC's onder VEGF-C-stimulatie. (A) Representatieve beelden van LLC's onder 1 ng/ml VEGF-C-stimulatie. (B) Representatieve beelden van LLC's onder 100 ng/ml VEGF-C-stimulatie. (C) Representatieve beelden van LLC's onder 500 ng/ml VEGF-C-stimulatie. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Expressie van CD31, PDPN en VEGFR-3 na de oogst. (A) Representatieve histogrammen van flowcytometrische analyse tonen aan dat CD31-positieve cellen minder dan 5% zijn. (B) Representatieve histogrammen van flowcytometrische analyse geven aan dat PDPN-positieve cellen meer dan 95% bedragen. (C) Representatieve histogrammen van flowcytometrische analyse tonen aan dat VEGFR-3-positieve cellen meer dan 95% bedragen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 5: Morfologie van LLC's en onderscheid met CD31. (A) Representatieve beelden van de morfologie van LLC's onthuld door hematoxyline-eosinekleuring. Schaalbalk = 20 μm. (B) Representatieve immunofluorescentiebeelden illustreren dat LYVE-1 en PDPN niet samen met CD31 kleuren. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 6: Proliferatiepercentage van LLC's. Representatieve resultaten van de CCK-8-test tonen een significante afname van de proliferatiesnelheid van LLC's in passage 1 en passage 6 in vergelijking met respectievelijk passages 2 en 5. De gegevens vertegenwoordigen de resultaten van zes onafhankelijke experimenten (Mean ± SEM). Foutbalken geven SEM aan. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bestaande protocol voor het oogsten en kweken van LLC's in vitro is niet eerder gerapporteerd. Deze studie introduceert een reproduceerbaar, multiprocedureel protocol voor het oogsten en kweken van LLC's uit leptomeninges van muizen.
Hoewel dit multiprocedurele protocol reproduceerbaar is, zijn er verschillende belangrijke overwegingen. Met fibronectine gecoate T25-kolven bevorderen bijvoorbeeld de hechting van LLC's en functioneren door niet-hechtende cellen te elimineren, waardoor een meer homogene celpopulatie wordt gegarandeerd. Bovendien zijn de tijdsduur en temperatuur tijdens chirurgische ingrepen voor het dissociëren van leptomeninges kritische factoren die de levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden. Daarom is het van cruciaal belang om een tijdsduur binnen 1 uur aan te houden en de buffer voldoende koud te houden. Een ander kritiek punt heeft betrekking op de aanwezigheid van rode bloedcellen in de leptomeninges, van waaruit het vrijkomen van hemoglobine schadelijk kan zijn voor LLC's. Om dit te verminderen, is het essentieel om voorzichtig te spoelen en te wassen om rode bloedcellen te verwijderen, waardoor hun cytotoxische effecten worden voorkomen. Ten slotte moeten LLC's worden gestimuleerd met VEGF-C20, met name bij een concentratie van 100 ng/ml. Onder deze stimulatie vertonen LLC's een karakteristieke endotheelachtige morfologie in plaats van buizen te vormen (aanvullende figuur 3A-C). Daarom werd in deze studie gebruik gemaakt van een kweekmedium dat 100 ng/ml VEGF-C bevatte om expansie te induceren en homogeniteit in cellulaire populaties te behouden.
Het multiprocedurele protocol dat hierin wordt beschreven, wordt geleverd met stappen voor probleemoplossing en enkele beperkingen. Ten eerste duurt het 2-3 weken om dit protocol te voltooien, waardoor het onpraktisch is voor frequente herhaling. Ten tweede kunnen chirurgische en enzymatische procedures leiden tot de aanwezigheid van dode cellen die niet worden geëlimineerd voordat ze worden geplateerd, wat mogelijk de celkweek beïnvloedt. Deze mogelijkheid zal worden onderzocht bij toekomstige protocolimplementaties. Ten derde, hoewel de zuiverheid van geoogste LLC's (VEGFR-3- en PDPN-positieve cellen) meer dan 95% bedraagt, blijven sommige heterogene celpopulaties bestaan, waaronder CD31-positieve cellen, die minder dan 5% uitmaken (aanvullende figuur 4A-C). Dit is een veel voorkomende uitdaging bij het kweken van primaire cellen. Beelden met een hoge resolutie van hematoxyline-eosinekleuring tonen aan dat LLC's karakteristieke endotheelachtige vormen vertonen, maar geen CD31 tot expressie brengen (aanvullende figuur 5A,B). Ten slotte wijzen de resultaten van de CCK-8-test op een significante afname van de proliferatiesnelheid in LLC's bij passage 1 en 6 in vergelijking met respectievelijk passage 2 en 5 (aanvullende figuur 6). Passage 1 kan leiden tot schade aan LLC's als gevolg van antilichaambehandeling en de fysieke belasting tijdens het sorteren, terwijl passage 6 een verminderde proliferatie vertoont naarmate het aantal passages toeneemt. Daarom zijn volgende cellen na passage 6 ongeschikt voor relevante experimenten. Gezien de verdeling van fibroblasten in de hersenvliezen21, kan ongeveer 5% van de besmette cellen fibroblasten bevatten. Om dit aan te pakken, kan de toevoeging van geneticine en immunomagnetische celsortering worden gebruikt om besmette fibroblasten te verwijderen22,23. Het monitoren van de besmettingsgraad van fibroblasten in elke passage van LLC's zal helpen de impact van fibroblasten op de groei van LLC's te elimineren24. Gezien de heterogeniteit tussen muizen en mensen, moet worden gestreefd naar het oogsten en kweken van primaire menselijke LLC's voor mogelijke klinische toepassingen in toekomstig onderzoek.
Samenvattend kan worden gesteld dat er momenteel geen protocol bestaat voor het oogsten en kweken van LLC's in vitro. Deze studie introduceert een reproduceerbaar, multiprocedureel protocol voor het oogsten van LLC's uit leptomeninges van muizen en vervolgens het vaststellen van hun primaire cultuur in vitro. Dit werk zal verdere verkenning van cellulaire functies en mogelijke klinische toepassingen voor LLC's vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben om bekend te maken.
Acknowledgments
De studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), de Natural Science Foundation van de provincie Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) en de Scientific Research Foundation van het ministerie van Onderwijs van de provincie Yunnan (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
