Summary
Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs), un type de cellules intracrâniennes récemment identifiées, ont des fonctions mal comprises. Cette étude présente un protocole reproductible pour la récolte de LLEC à partir de souris et l’établissement de cultures primaires in vitro . Ce protocole est conçu pour permettre aux chercheurs de se plonger dans les fonctions cellulaires et les implications cliniques potentielles des LLECs.
Abstract
Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) sont une population cellulaire intracrânienne récemment découverte avec une distribution unique clairement distincte des cellules endothéliales lymphatiques périphériques. Leur fonction cellulaire et leurs implications cliniques restent largement inconnues. Par conséquent, la disponibilité d’un approvisionnement en LLEC est essentielle pour mener une recherche fonctionnelle in vitro. Cependant, il n’existe actuellement aucun protocole pour la récolte et la culture des LLEC in vitro.
Cette étude a permis de récolter avec succès les LLEC à l’aide d’un protocole en plusieurs étapes, qui comprenait l’enrobage de la fiole de fibronectine, la dissection des leptoméninges à l’aide d’un microscope, la digestion enzymatique des leptoméninges pour préparer une suspension unicellulaire, l’induction de l’expansion des LLEC avec le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-C (VEGF-C) et la sélection des cellules positives du récepteur hyaluronique des vaisseaux lymphatiques-1 (LYVE-1) par tri cellulaire activé magnétiquement (MACS). Ce processus a finalement conduit à l’établissement d’une culture primaire. La pureté des LLEC a été confirmée par coloration par immunofluorescence et analyse par cytométrie en flux, avec un niveau de pureté supérieur à 95 %. Ce protocole en plusieurs étapes a démontré sa reproductibilité et sa faisabilité, ce qui facilitera grandement l’exploration de la fonction cellulaire et des implications cliniques des LLECs.
Introduction
Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) nouvellement découvertes forment un maillage de cellules individuelles à l’intérieur des leptoméninges, présentant un modèle de distribution distinct par rapport aux cellules endothéliales lymphatiques périphériques 1,2. Les fonctions cellulaires et les implications cliniques associées aux LLEC restent en grande partie un territoire inexploré. Afin d’ouvrir la voie à la recherche fonctionnelle sur les LLECs, il est impératif d’établir un modèle in vitro pour leur étude. Par conséquent, cette étude a mis au point un protocole complet pour l’isolement et la culture primaire des LLECs.
Les souris sont le modèle animal préféré en raison de leur aptitude à la manipulation génétique dans la recherche sur les maladies. Des études antérieures ont réussi à isoler des cellules endothéliales lymphatiques de divers tissus de souris, notamment les ganglions lymphatiques3, le tissu mésentérique4, le tissu dermique5, les lymphatiques collecteurs6 et le tissu pulmonaire7. Ces procédures d’isolement se sont principalement appuyées sur des techniques telles que le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) et le tri par cytométrie en flux 8,9,10. De plus, les efforts de recherche ont conduit à l’établissement de lignées cellulaires arachnoïdiennes de rat et de lignées cellulaires capillaires lymphatiques de rat11,12. Malgré l’existence de techniques de culture d’explants pour les leptoméninges13, il existe un besoin urgent d’un protocole normalisé pour l’isolement et la culture des LLECs. Par conséquent, cette étude a permis de récolter et de cultiver avec succès des LLEC en dissociant méticuleusement les leptoméninges sous la direction d’un microscope et en favorisant l’expansion des LLEC grâce à l’utilisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-C (VEGF-C). Le marqueur distinctif des cellules endothéliales lymphatiques est le récepteur hyaluronique du vaisseau lymphatique-1 (LYVE-1)14. Ce protocole en plusieurs étapes isole sélectivement les LLEC LYVE-1-positives à l’aide de MACS et vérifie ensuite leur pureté par analyse cytométrique en flux et coloration immunofluorescente.
Les principales étapes de ce protocole en plusieurs étapes peuvent être résumées comme suit : enrobage du flacon, dissociation des leptoméninges, digestion enzymatique des leptoméninges, expansion cellulaire, sélection magnétique des cellules et culture ultérieure des LLECs. Enfin, la pureté des LLEC isolées est confirmée par analyse cytométrique en flux et coloration immunofluorescente. L’objectif principal de cette étude est de présenter un protocole reproductible en plusieurs étapes pour l’isolement des LLEC à partir de leptoméninges de souris et leur culture in vitro ultérieure. Ce protocole est sur le point de faciliter grandement les recherches sur les fonctions cellulaires et les implications cliniques des LLECs.
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Protocol
Cette recherche a reçu l’approbation du Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de médecine de Kunming (kmmu20220945). Toutes les expériences ont respecté les lignes directrices établies en matière de soins aux animaux. Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) ont été prélevées sur des souris mâles C57Bl/6J âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 20 et 25 g. Ces souris ont été achetées à l’Université de médecine de Kunming, en Chine. L’ensemble de la procédure expérimentale s’est déroulé dans des conditions stériles strictes. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.
1. Préparation des réactifs et des instruments
REMARQUE : Toutes les étapes impliquant des solutions doivent être effectuées à l’intérieur d’une armoire à risques biologiques de classe II.
- Préparez le tampon de lavage en mélangeant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec du calcium et du magnésium, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) (voir le tableau des matériaux). Conservez ce tampon au froid à 4 °C. Il est indispensable de le préparer frais le jour de l’utilisation et de dégazer le tampon.
- Préparez les enzymes digestives en combinant 10 mL de PBS (sans calcium ni magnésium) avec 2 mL de trypsine à 0,25 %, 1 mL de papaïne à 20 mg/mL et 200 μL de collagénase I à 1 mg/mL (voir le tableau des matériaux).
NOTA : S’assurer d’utiliser des aliquotes de volumes appropriés pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Conserver ces aliquotes à -20 °C. - Préparez le milieu de culture à l’aide de la trousse de milieu de croissance de cellules endothéliales disponible dans le commerce, qui comprend le VEGF-C (100 ng/mL) et 1 % de P/S (voir le tableau des matériaux).
- Préparez le tampon d’arrêt en complétant le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de FBS pour arrêter le processus de digestion.
- Préparez des instruments chirurgicaux stériles : ces instruments doivent inclure des ciseaux, une pince à épiler à pointe dentelée et une pince à épiler à pointe fine.
2. Revêtement de flacon
- Enduire le flacon T25 d’une solution de fibronectine à 100 μg/mL (voir tableau des matériaux) et incuber toute la nuit à 37 °C. Avant utilisation, retirez la solution de revêtement à l’aide d’une pipette.
- Lavez le flacon trois fois avec du PBS, aspirez ensuite le PBS et laissez le flacon T25 sécher à l’air libre.
3. Dissociation des leptoméninges
REMARQUE : Utilisez toujours des tampons et des solutions pré-refroidis à 4 °C.
- Anesthésiez les souris avec une inhalation excessive de 4% d’isoflurane, puis sacrifiez-les par décapitation rapide à l’aide de ciseaux préalablement nettoyés avec de l’éthanol à 70%.
- Incisez soigneusement la peau le long de la ligne médiane, en commençant par l’ouverture à l’arrière du crâne et en s’étendant vers la zone frontale.
- Retirez délicatement le crâne, en le soulevant doucement avec les ciseaux pour éviter d’endommager les leptoméninges, en veillant à ce que tout le cerveau, y compris les leptoméninges, soit obtenu.
- Plongez tout le cerveau dans un tampon de lavage et rincez-le doucement pour éliminer le sang de surface.
- Transférez le cerveau dans une boîte de Pétri stérile sans le hacher et extrayez les leptoméninges de la surface du cerveau à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine sous un microscope.
- Coupez le tissu leptoméninges en fragments à l’aide de micro-ciseaux stériles.
4. Digestion enzymatique des leptoméninges
- Ajouter 10 mL du mélange enzymatique (étape 1.2) aux fragments et incuber à 37 °C pendant 15 min. Agitez doucement pour vous assurer que les fragments se détachent du fond du tube. Ensuite, ajoutez 10 mL de tampon d’arrêt (étape 1.4) pour arrêter la digestion.
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 10 mL de PBS froid et passer le mélange à travers une passoire de 70 μm dans un tube stérile de 50 mL pour filtrer les grumeaux.
5. Expansion cellulaire
- Plaquer 1 x 10 5 cellules par cm 2 dans un flacon T25 enrobé de fibronectine (étape2) avec5 mL de milieu de culture.
- Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h. Ensuite, retirez le milieu pour éliminer les cellules non attachées.
- Maintenir la culture en remplaçant 50 % du milieu tous les deux jours. Répétez ce processus deux ou trois fois.
6. Sélection des cellules magnétiques
REMARQUE : Travaillez rapidement, maintenez la froideur des cellules et utilisez des solutions pré-refroidies pour éviter le marquage non spécifique des cellules.
- Préparation des instruments et des réactifs : fixer un séparateur magnétique sur un support de séparateur magnétique (voir tableau des matériaux). Connectez une colonne de sélection au séparateur magnétique et positionnez une crépine de cellules de 70 μm au sommet de la colonne de sélection. Placez un tube de 50 ml sous la colonne de sélection pour recueillir le débit.
- Digestion enzymatique : une fois que les cellules ont atteint 80 % de confluence, aspirez le milieu et rincez les cellules avec du PBS. Ajouter 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules adhérentes et incuber à 37 °C pendant 5 min. Arrêtez la digestion en ajoutant le tampon d’arrêt. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant.
- Incubation des anticorps : remettre en suspension 1 x 107 cellules au total dans 100 μL de PBS et ajouter 10 μL d’anticorps LYVE-1 (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber pendant 30 min à l’obscurité à 4 °C.
- Essorer les cellules à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Rincez les cellules en introduisant 1 mL de PBS et en centrifugeant à 300 x g pendant 5 min. Retirez complètement le surnageant.
- Marquage des microbilles : remettre les cellules en suspension dans 100 μL de PBS et ajouter 20 μL de microbilles (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber pendant 30 min à l’obscurité à 4 °C.
- Essorer les cellules à 300 x g pendant 5 min et décanter le surnageant. Ensuite, nettoyez les cellules avec 1 mL de PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min. Enfin, retirez complètement le surnageant.
- Exclusion magnétique négative : remettre les cellules en suspension dans 4 mL de PBS. Passez les cellules à travers une crépine de 70 μm pour éliminer les grumeaux. Préparez la colonne de sélection (voir Tableau des matériaux) en la rinçant avec 3 mL de PBS, puis appliquez la suspension cellulaire dans la colonne de sélection.
- Effectuez les étapes de lavage avec 3 mL de PBS et collectez les cellules LYVE-1-négatives dans un tube de 50 mL positionné sous la colonne de sélection pour les laisser passer.
- Sélection magnétique positive : pipeter 6 mL de PBS dans la colonne de sélection. Rincez instantanément les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne de sélection pour obtenir des LLEC LYVE-1-positifs.
REMARQUE : Attendez toujours que le réservoir de la colonne de sélection soit vide avant de passer à l’étape suivante.
7. La culture des LLEC
- Centrifuger les LLEC LYVE-1-positives à 300 x g pendant 5 min, puis retirer délicatement le surnageant.
- Plaquer 1 x 10 5 cellules par cm2 dans un flacon T25 enrobé de fibronectine avec5 mL de milieu de culture.
- Entretenez la culture en remplaçant 50 % du support tous les deux jours. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, détachez les cellules avec 0,25 % de trypsine et effectuez le passage cellulaire. Utilisez les cellules pour les expériences suivantes après 2-3 passages.
8. Analyse par cytométrie en flux
REMARQUE : L’analyse par cytométrie en flux a été effectuée selon la procédure décrite précédemment15.
- Ajouter 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules adhérentes et incuber à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, ajoutez le tampon d’arrêt pour arrêter la digestion.
- Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min et aspirer complètement le surnageant. Remettre en suspension 1 x 106 cellules dans 100 μL de PBS.
- Ajouter 1 μL d’anticorps LYVE-1. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à l’obscurité à température ambiante.
- Remettre les cellules en suspension dans une quantité appropriée de tampon PBS pour analyse à l’aide de la cytométrie en flux et du logiciel FlowJo (voir le tableau des matériaux).
9. Coloration immunofluorescente
REMARQUE : La coloration par immunofluorescence a été effectuée selon la procédure décrite précédemment16.
- Lavez les cellules avec du PBS trois fois. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min à température ambiante. Jetez le PFA et lavez les cellules avec du PBS trois fois.
- Appliquer le tampon de bloc pendant 1 h à température ambiante. Retirez le tampon de bloc des lamelles.
- Ajouter l’anticorps LYVE-1 dans le tampon de coloration aux cellules et incuber dans l’obscurité. Lavez les cellules trois fois avec du PBS.
- Ajouter un anticorps secondaire approprié (voir le tableau des matériaux) dans le tampon de coloration aux cellules et incuber dans l’obscurité. Lavez les cellules trois fois avec du PBS.
- Contre-coloration avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Les cellules sont maintenant prêtes pour la microscopie d’immunofluorescence.
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Representative Results
Cette étude présente un protocole reproductible en plusieurs étapes pour le prélèvement de cellules endothéliales lymphatiques (LLECs) chez la souris et l’établissement ultérieur de leur culture primaire in vitro. Les étapes clés comprennent la préparation du flacon et l’enrobage de la fibronectine, la dissociation des leptoméninges, l’obtention d’une suspension unicellulaire par digestion enzymatique et l’induction de l’expansion des LLEC avec le VEGF-C. Les LLEC LYVE-1-positives sont ensuite isolées sélectivement à l’aide du tri cellulaire activé par magnétisme (MACS). Enfin, la coloration par immunofluorescence et l’analyse par cytométrie en flux sont effectuées pour évaluer la pureté des LLECs, les résultats des tests MTT démontrant des taux de croissance robustes des LLEC (Figure supplémentaire 1). Les principales étapes de ce protocole multiprocédural sont illustrées dans l’organigramme, l’ensemble du processus prenant environ 2 à 3 semaines (figure 1).
Pour récolter les LLECs, il est essentiel de dissocier les leptoméninges et de favoriser l’expansion des LLEC tout en préservant la viabilité cellulaire grâce à des techniques chirurgicales efficaces et au maintien d’un environnement froid (Figure 2A-E). Après avoir obtenu le cerveau entier avec les leptoméninges dans des conditions stériles, une étape de lavage doux est effectuée pour éliminer les globules rouges sanguins (Figure 2F). Ensuite, les leptoméninges sont soigneusement extraites de la surface du cerveau au microscope (Figure 2G). Ces leptoméninges sont principalement constituées de fibres de collagène, elles sont donc fragmentées pour accélérer la digestion enzymatique (Figure 2H). Par la suite, une digestion enzymatique de ces fragments est effectuée et les amas restants sont filtrés à travers une passoire de 70 μm pour éliminer les plus gros amas de fibres de collagène (Figure 2I). Enfin, les cellules sont plaquées dans une fiole T25 enrobée de fibronectine, et le VEGF-C est ajouté pour induire l’expansion (Figure 2J). Après 24 h, le milieu de culture est retiré pour éliminer les cellules non attachées. Ces étapes facilitent le prélèvement des cellules à partir des leptoméninges et favorisent l’expansion, ce qui est essentiel pour obtenir suffisamment de LLEC LYVE-1-positives plus tard dans le processus.
Bien que le VEGF-C induise l’expansion du LLEC, des populations cellulaires hétérogènes peuvent toujours se développer ensemble. Pour isoler les LLEC pures LYVE-1-positives, MACS est utilisé car LYVE-1 est un marqueur reconnu pour les cellules endothéliales lymphatiques. La pureté des LLEC est évaluée par cytométrie en flux, et les résultats indiquent que le pourcentage de cellules LYVE-1 positives dans le passage 2 n’est pas significativement différent de celui du passage 3 après MACS, démontrant une pureté supérieure à 95 % (Figure 3A). Pour valider davantage la spécificité des LLEC LYVE-1-positifs, trois marqueurs de cellules endothéliales lymphatiques supplémentaires - la podoplanine (PDPN), le récepteur 3 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR-3) et l’homéobox1 liée à Prospero (PROX1) ont été utilisés pour l’identification17,18,19. La coloration par immunofluorescence a confirmé que LYVE-1 co-coloré avec ces trois marqueurs (Figure 3B). De plus, l’identité des LLEC a été établie dans des coupes de cerveau dans des conditions physiologiques, montrant une co-coloration de LYVE-1 avec PROX1, VEGFR-3 et PDPN (Figure 2A supplémentaire). Les cellules LYVE-1 positives n’exprimaient pas F4/80 et le facteur de croissance dérivé des plaquettes bêta (PDGFR-β), ce qui distingue efficacement les LLEC des macrophages et des fibroblastes (Figure 2B supplémentaire). En résumé, ce protocole permet la récolte de LLEC d’une grande pureté et capables d’être cultivées in vitro.
Les cellules leptoméningées avant MACS présentent une hétérogénéité, différente des colonies de cellules endothéliales lymphatiques. Leur morphologie varie de sphères rondes simples à des formes de fibres fusionnées (Figure 4A-D). Cependant, les LLEC post-MACS présentent des caractéristiques endothéliales typiques en forme de fuseau et de pavé (Figure 4E-H). Sur la base de ces résultats, les LLEC sont efficacement récoltés grâce à ce protocole multi-procédural et maintenus dans un état de croissance sain.
Figure 1 : Représentation schématique du protocole multi-procédures. Cet organigramme illustre le protocole multiprocédural pour la récolte et la culture des LLECs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Prélèvement des cellules de leptoméninges. (A) Préparation d’instruments chirurgicaux stériles. (B) Les souris ont été anesthésiées par inhalation d’isoflurane à 4 %, puis nettoyées avec de l’éthanol à 70 % après l’euthanasie. (C) Décapitation des souris et incision minutieuse de la ligne médiane de la peau, en partant de l’arrière du crâne vers la zone frontale. (D) Ablation délicate du crâne pour préserver l’intégrité des leptoméninges. (E) Récupération de l’ensemble du cerveau contenant les leptoméninges. (F) Lavage de l’ensemble du cerveau dans une solution tampon avec rinçage doux pour éliminer le sang de surface. (G) Dissection des leptoméninges de la surface du cerveau à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine. (H) Découpe des leptoméninges en fragments à l’aide de micro-ciseaux stériles, suivie de l’ajout de 10 mL de mélange enzymatique et de l’incubation à 37 °C pendant 15 min. (I) Mise en suspension de la pastille dans 10 mL de PBS et filtration des amas à travers une passoire de 70 μm. (J) Placage des cellules dans une fiole T25 revêtue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation de la pureté du LLEC après MACS. (A) Histogrammes représentatifs de l’analyse cytométrique en flux démontrant l’expression des cellules LYVE-1-positives dans les passages 2 et 3 suivant le MACS. Le pourcentage de cellules LYVE-1 positives dépasse 95 % après MACS. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes (moyenne ± MEB). Les barres d’erreur indiquent le MEB. (B) Image d’immunofluorescence représentative montrant la co-coloration de LYVE-1 avec PDPN, VEGFR-3 et PROX1. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractéristiques de croissance des cellules leptoméningées et des LLECs. (A) Morphologie des cellules leptoméningées capturées dans des images représentatives. Barre d’échelle = 50 μm. (B-D) Images représentatives illustrant la morphologie des cellules leptoméningées aux jours 1, 2 et 3 avant le MACS. Barres d’échelle = 100 μm. (E) Morphologie des LLEC capturées dans des images représentatives. Barre d’échelle = 50 μm. (F-H) Images représentatives illustrant la morphologie des LLEC aux jours 1, 2 et 3 suivant le MACS. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Taux de croissance des CLLA et du SVEC4-10. Les résultats de l’analyse MTT montrent une diminution significative du taux de croissance des LLEC dans le passage 1 par rapport au groupe SVEC4-10. Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes de LLEC de passage 2 et de passage 3 par rapport au groupe SVEC4-10. Les données représentent les résultats de six expériences indépendantes (moyenne ± MEB). Les barres d’erreur indiquent le SEM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Caractérisation et discrimination des LLEC dans des tranches de cerveau. (A) Image d’immunofluorescence représentative illustrant la co-coloration de LYVE-1 avec PROX1, VEGFR-3 et PDPN dans des coupes de cerveau dans des conditions physiologiques. Barres d’échelle = 2 μm. (B) Image d’immunofluorescence représentative démontrant que LYVE-1 ne co-colore pas avec F4/80 et PDGFR-β dans des coupes de cerveau dans des conditions physiologiques. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Croissance des LLEC sous stimulation par le VEGF-C. (A) Images représentatives des LLEC sous stimulation VEGF-C à 1 ng/mL. (B) Images représentatives des LLEC sous stimulation VEGF-C à 100 ng/mL. (C) Images représentatives des LLEC sous stimulation VEGF-C à 500 ng/mL. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure 4 supplémentaire : Expression de CD31, de PDPN et de VEGFR-3 après le récolte. (A) Les histogrammes représentatifs de l’analyse par cytométrie en flux montrent que les cellules CD31 positives sont inférieures à 5 %. (B) Les histogrammes représentatifs de l’analyse cytométrique en flux indiquent que les cellules PDPN positives dépassent 95 %. (C) Les histogrammes représentatifs de l’analyse par cytométrie en flux montrent que les cellules VEGFR-3 positives dépassent 95 %. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 5 : Morphologie des LLEC et distinction avec le CD31. (A) Images représentatives de la morphologie des LLEC révélées par la coloration à l’hématoxyline-éosine. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Des images d’immunofluorescence représentatives montrent que LYVE-1 et PDPN ne co-colorent pas avec CD31. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 6 : Taux de prolifération des pays à faible revenu. Les résultats représentatifs de l’analyse CCK-8 montrent une diminution significative du taux de prolifération des LLEC dans les passages 1 et 6 par rapport aux passages 2 et 5, respectivement. Les données représentent les résultats de six expériences indépendantes (moyenne ± MEB). Les barres d’erreur indiquent le SEM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le protocole actuel pour la récolte et la culture in vitro des LLEC n’a pas encore été rapporté. Cette étude présente un protocole multiprocédural reproductible pour la récolte et la culture des LLEC à partir de leptoméninges de souris.
Bien que ce protocole multiprocédural soit reproductible, il y a plusieurs considérations clés. Par exemple, les flacons T25 enrobés de fibronectine favorisent l’adhésion des LLEC et leur fonction en éliminant les cellules non adhérentes, assurant ainsi une population cellulaire plus homogène. De plus, la durée et la température pendant les interventions chirurgicales de dissociation des leptoméninges sont des facteurs critiques affectant la viabilité cellulaire. Par conséquent, il est crucial de maintenir une durée inférieure à 1 h et de garder le tampon suffisamment froid. Un autre point critique concerne la présence de globules rouges dans les leptoméninges, à partir desquels la libération d’hémoglobine peut nuire aux LLECs. Pour atténuer cela, il est essentiel de rincer et de laver doucement pour éliminer les globules rouges, évitant ainsi leurs effets cytotoxiques. Enfin, les LLEC nécessitent une stimulation avec le VEGF-C20, en particulier à une concentration de 100 ng/mL. Sous l’effet de cette stimulation, les LLEC présentent une morphologie caractéristique de type endothélial plutôt que de former des tubes (figure supplémentaire 3A-C). Par conséquent, cette étude a utilisé un milieu de culture contenant 100 ng/mL de VEGF-C pour induire l’expansion et maintenir l’homogénéité dans les populations cellulaires.
Le protocole multi-procédures décrit ici comporte des étapes de dépannage et certaines limitations. Tout d’abord, ce protocole prend 2 à 3 semaines, ce qui le rend peu pratique pour une répétition fréquente. Deuxièmement, les procédures chirurgicales et enzymatiques peuvent entraîner la présence de cellules mortes qui ne sont pas éliminées avant le placage, ce qui peut affecter la culture cellulaire. Cette possibilité sera explorée dans les futures implémentations de protocoles. Troisièmement, alors que la pureté des LLEC récoltés (cellules VEGFR-3 et PDPN-positives) dépasse 95 %, certaines populations cellulaires hétérogènes persistent, y compris les cellules CD31-positives, qui constituent moins de 5 % (figure supplémentaire 4A-C). Il s’agit d’un défi courant dans la culture de cellules primaires. Des images à haute résolution obtenues à partir de la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine montrent que les LLEC présentent des formes endothéliales caractéristiques, mais n’expriment pas CD31 (Figure supplémentaire 5A,B). Enfin, les résultats de l’analyse CCK-8 indiquent une diminution significative du taux de prolifération dans les LLEC aux passages 1 et 6 par rapport aux passages 2 et 5, respectivement (figure supplémentaire 6). Le passage 1 peut entraîner des dommages aux LLEC en raison du traitement par anticorps et du stress physique pendant le tri, tandis que le passage 6 montre une prolifération réduite à mesure que le nombre de passages augmente. Par conséquent, les cellules suivantes après le passage 6 ne conviennent pas aux expériences pertinentes. Compte tenu de la répartition des fibroblastes dans les méninges21, environ 5 % des cellules contaminées peuvent contenir des fibroblastes. Pour remédier à ce problème, l’ajout de génétique et le tri cellulaire immunomagnétique peuvent être utilisés pour éliminer les fibroblastes contaminés22,23. La surveillance du taux de contamination des fibroblastes à chaque passage des LLEC permettra d’éliminer l’impact des fibroblastes sur la croissance des LLEC24. Compte tenu de l’hétérogénéité entre les souris et les humains, la récolte et la culture des LLEC humains primaires devraient être poursuivies pour des applications cliniques potentielles dans les recherches futures.
En résumé, il n’existe actuellement aucun protocole établi pour la récolte et la culture des LLEC in vitro. Cette étude présente un protocole reproductible et multi-procédural pour la récolte de LLEC à partir de leptoméninges de souris et l’établissement ultérieur de leur culture primaire in vitro. Ces travaux faciliteront l’exploration des fonctions cellulaires et des applications cliniques potentielles pour les LLECs.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
L’étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81960226, 81760223), de la Fondation des sciences naturelles de la province du Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) et de la Fondation de recherche scientifique du Département de l’éducation de la province du Yunnan (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
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