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Neuroscience

लेप्टोमेनिंगियल लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं की फसल और प्राथमिक संस्कृति

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65872
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3, 1, 1, 1
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, 2Department of Clinical Laboratory, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, 3Clinical Medical Research Center, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

Summary

लेप्टोमेनिंगियल लसीका एंडोथेलियल कोशिकाएं (एलएलईसी), हाल ही में पहचाने गए इंट्राक्रैनील सेल प्रकार, खराब समझ वाले कार्यों को समझते हैं। यह अध्ययन चूहों से एलएलईसी की कटाई और इन विट्रो प्राथमिक संस्कृतियों में स्थापित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को सेलुलर कार्यों और एलएलईसी के संभावित नैदानिक प्रभावों में तल्लीन करने में सक्षम बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

Abstract

लेप्टोमेनिंगियल लसीका एंडोथेलियल कोशिकाएं (एलएलईसी) हाल ही में खोजी गई इंट्राक्रैनील सेलुलर आबादी हैं जिनका एक अनूठा वितरण परिधीय लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं से स्पष्ट रूप से अलग है। उनके सेलुलर फ़ंक्शन और नैदानिक निहितार्थ काफी हद तक अज्ञात रहते हैं। नतीजतन, इन विट्रो में कार्यात्मक अनुसंधान करने के लिए एलएलईसी की आपूर्ति की उपलब्धता आवश्यक है। हालांकि, इन विट्रो में एलएलईसी की कटाई और संवर्धन के लिए वर्तमान में कोई मौजूदा प्रोटोकॉल नहीं है।

इस अध्ययन ने सफलतापूर्वक एक बहु-चरण प्रोटोकॉल का उपयोग करके एलएलईसी काटा, जिसमें फाइब्रोनेक्टिन के साथ फ्लास्क को कोटिंग करना, माइक्रोस्कोप की सहायता से लेप्टोमेनिंग को विच्छेदित करना, एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए लेप्टोमेनिंग को एंजाइमेटिक रूप से पचाना, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर-सी (वीईजीएफ-सी) के साथ एलएलईसी के विस्तार को प्रेरित करना, और चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) के माध्यम से लसीका पोत हाइलूरोनिक रिसेप्टर -1 (एलवाईवीई -1) सकारात्मक कोशिकाओं का चयन करना। इस प्रक्रिया ने अंततः एक प्राथमिक संस्कृति की स्थापना की। एलएलईसी की शुद्धता की पुष्टि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के माध्यम से की गई थी, जिसमें शुद्धता का स्तर 95% से अधिक था। इस बहु-चरण प्रोटोकॉल ने प्रजनन क्षमता और व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है, जो सेलुलर फ़ंक्शन और एलएलईसी के नैदानिक निहितार्थों की खोज को बहुत सुविधाजनक बनाएगा।

Introduction

नव खोजा लेप्टोमेनिंगियल लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं (एलएलईसी) लेप्टोमेनिंग के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं का एक जाल बनाते हैं, परिधीय लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं 1,2की तुलना में एक अलग वितरण पैटर्न प्रदर्शित करते हैं। एलएलईसी से जुड़े सेलुलर कार्य और नैदानिक निहितार्थ काफी हद तक अज्ञात क्षेत्र बने हुए हैं। एलएलईसी पर कार्यात्मक अनुसंधान का मार्ग प्रशस्त करने के लिए, उनके अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल स्थापित करना अनिवार्य है। इसलिए, इस अध्ययन ने एलएलईसी के अलगाव और प्राथमिक संस्कृति के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल तैयार किया है।

रोग अनुसंधान में आनुवंशिक हेरफेर के लिए उनकी उपयुक्तता के कारण चूहे पसंदीदा पशु मॉडल हैं। पिछले अध्ययनों ने लिम्फ नोड्स3, मेसेंटेरिक ऊतक4, त्वचीय ऊतक5, लिम्फेटिक्स6 और फेफड़े के ऊतक7 एकत्र करने सहित विभिन्न माउस ऊतकों से लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं को सफलतापूर्वक अलग किया है। इन अलगाव प्रक्रियाओं ने मुख्य रूप से चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) और प्रवाह साइटोमेट्री सॉर्टिंग 8,9,10 जैसी तकनीकों पर भरोसा किया है। इसके अतिरिक्त, अनुसंधान के प्रयासों चूहा arachnoid सेल लाइनों और चूहा लसीका केशिका सेल लाइनों11,12 की स्थापना के लिए नेतृत्व किया है. लेप्टोमेनिंग13 के लिए एक्सप्लांट कल्चर तकनीकों के अस्तित्व के बावजूद, एलएलईसी के अलगाव और संस्कृति के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल की तत्काल आवश्यकता मौजूद है। नतीजतन, इस अध्ययन ने माइक्रोस्कोप के मार्गदर्शन में लेप्टोमेनिंग को सावधानीपूर्वक अलग करके और संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर-सी (वीईजीएफ-सी) के उपयोग के माध्यम से एलएलईसी विस्तार को बढ़ावा देकर एलएलईसी को सफलतापूर्वक काटा और सुसंस्कृत किया है। लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए विशिष्ट मार्कर लसीका पोत हयालूरोनिक रिसेप्टर -1 (एलवाईवीई -1)14है। यह बहु-चरण प्रोटोकॉल एमएसीएस का उपयोग करके चुनिंदा रूप से एलवाईवी-1-पॉजिटिव एलएलईसी को अलग करता है और बाद में प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के माध्यम से उनकी शुद्धता की पुष्टि करता है।

इस बहु-चरण प्रोटोकॉल के प्राथमिक चरणों को निम्नानुसार संक्षेप में प्रस्तुत किया जा सकता है: फ्लास्क कोटिंग, लेप्टोमेनिंग का पृथक्करण, लेप्टोमेनिंग का एंजाइमेटिक पाचन, सेल विस्तार, चुंबकीय सेल चयन, और एलएलईसी की बाद की संस्कृति। अंत में, पृथक एलएलईसी की शुद्धता की पुष्टि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के माध्यम से की जाती है। इस अध्ययन के व्यापक उद्देश्य माउस leptomeninges और इन विट्रो संस्कृति में उनके बाद LLECs के अलगाव के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, बहु कदम प्रोटोकॉल पेश करने के लिए है. यह प्रोटोकॉल सेलुलर कार्यों और एलएलईसी के नैदानिक निहितार्थों में जांच को सुविधाजनक बनाने के लिए तैयार है।

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Protocol

इस शोध को कुनमिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी (kmmu20220945) की पशु प्रयोग आचार समिति से अनुमोदन प्राप्त हुआ। सभी प्रयोगों ने स्थापित पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन किया। लेप्टोमेनिंगियल लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं (एलएलईसी) को 6-8 सप्ताह की आयु के पुरुष C57Bl/6J चूहों से काटा गया था और इसका वजन 20-25 ग्राम के बीच था। इन चूहों को चीन के कुनमिंग में कुनमिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी से खरीदा गया था। पूरी प्रयोगात्मक प्रक्रिया सख्त बाँझ परिस्थितियों में आयोजित की गई थी। सभी सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों को कमरे के तापमान पर किया जाता है जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो।

1. अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी

नोट: समाधान से जुड़े सभी चरणों को एक कक्षा II बायोहाज़र्ड कैबिनेट के भीतर आयोजित किया जाना चाहिए।

  1. कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ मिश्रण करके धोने बफर तैयार करें। इस बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखें। उपयोग के दिन इसे ताजा तैयार करना और बफर को अलग करना आवश्यक है।
  2. 0.25% ट्रिप्सिन के 2 एमएल, 20 मिलीग्राम/एमएल पपैन के 1 एमएल, और 1 मिलीग्राम/एमएल कोलेजनेज I के 200 माइक्रोन के साथ पीबीएस (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) के 10 एमएल के संयोजन से पाचन एंजाइम तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्रों को रोकने के लिए उपयुक्त मात्रा के विभाज्य का उपयोग सुनिश्चित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर इन aliquots दुकान.
  3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम किट का उपयोग करके कल्चर माध्यम तैयार करें, जिसमें वीईजीएफ-सी (100 एनजी/एमएल) और 1% पी/एस ( सामग्री की तालिकादेखें) शामिल हैं।
  4. पाचन प्रक्रिया को रोकने के लिए 10% FBS के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) के पूरक द्वारा रोक बफर तैयार करें.
  5. बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों तैयार: इन उपकरणों कैंची, दाँतेदार टिप चिमटी, और ठीक बिंदु चिमटी शामिल होना चाहिए.

2. फ्लास्क कोटिंग

  1. एक 100 μg/mL fibronectin समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ T25 फ्लास्क कोट और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं. उपयोग करने से पहले, एक विंदुक का उपयोग करके कोटिंग समाधान को हटा दें।
  2. पीबीएस के साथ तीन बार फ्लास्क धो लें, बाद में पीबीएस महाप्राण, और टी 25 फ्लास्क हवा सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं.

3. लेप्टोमेनिंग पृथक्करण

नोट: हमेशा 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा बफ़र्स और समाधान का उपयोग करें।

  1. 4% isoflurane के अतिरिक्त साँस लेना के साथ चूहों Anesthetize और फिर पहले 70% इथेनॉल के साथ साफ किया गया है कि कैंची का उपयोग कर तेजी से सिर काटना द्वारा उन्हें बलिदान.
  2. ध्यान से midline के साथ त्वचा को चीरा, खोपड़ी के पीछे खोलने से शुरू और ललाट क्षेत्र की ओर विस्तार.
  3. नाजुक रूप से खोपड़ी को हटा दें, लेप्टोमेनिंग को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए कैंची के साथ धीरे से उठाएं, यह सुनिश्चित करें कि लेप्टोमेनिंग सहित पूरे मस्तिष्क को प्राप्त किया जाता है।
  4. एक धोने बफर में पूरे मस्तिष्क जलमग्न और धीरे सतह रक्त को हटाने के लिए यह फ्लश.
  5. काटने के बिना एक बाँझ पेट्री डिश में मस्तिष्क स्थानांतरण, और एक खुर्दबीन के तहत ठीक बिंदु चिमटी का उपयोग कर मस्तिष्क की सतह से leptomeninges निकालने.
  6. बाँझ सूक्ष्म कैंची का उपयोग कर टुकड़े टुकड़े में leptomeninges ऊतक कटौती.

4. लेप्टोमेनिंग्स एंजाइमेटिक पाचन

  1. एंजाइम मिश्रण (चरण 1.2) के 10 एमएल को टुकड़ों में जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। धीरे टुकड़े ट्यूब के नीचे से अलग सुनिश्चित करने के लिए आंदोलन. बाद में, पाचन को रोकने के लिए बफर (चरण 1.4) को रोकने के 10 एमएल जोड़ें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और ध्यान से एक विंदुक का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  3. ठंड पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें, और किसी भी गुच्छों को फ़िल्टर करने के लिए एक बाँझ 50 एमएल ट्यूब में 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से मिश्रण पास करें।

5. सेल विस्तार

  1. प्लेट 1 x 10 5 कोशिकाओं प्रति सेमी 2 एक फाइब्रोनेक्टिन-लेपित टी 25 फ्लास्क (चरण2) में संस्कृति माध्यम के5 एमएल के साथ।
  2. 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। बाद में, गैर संलग्न कोशिकाओं को खत्म करने के लिए माध्यम को हटा दें.
  3. हर दो दिनों में 50% माध्यम की जगह लेकर संस्कृति को बनाए रखें। इस प्रक्रिया को दो या तीन बार दोहराएं।

6. चुंबकीय सेल चयन

नोट: तेजी से काम करें, सेल शीतलता बनाए रखें, और गैर-विशिष्ट सेल लेबलिंग को रोकने के लिए पूर्व-ठंडा समाधान का उपयोग करें।

  1. उपकरणों और अभिकर्मकों की तैयारी: एक चुंबकीय विभाजक को एक चुंबकीय विभाजक स्टैंड से संलग्न करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। चुंबकीय विभाजक के लिए एक चयन स्तंभ कनेक्ट करें, और चयन स्तंभ के ऊपर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी स्थिति. प्रवाह को इकट्ठा करने के लिए चयन कॉलम के नीचे एक 50 एमएल ट्यूब रखें।
  2. एंजाइमी पाचन: एक बार कोशिकाओं को 80% संगम तक पहुँचने के बाद, माध्यम महाप्राण और पीबीएस के साथ कोशिकाओं कुल्ला. पक्षपाती कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन जोड़ें और 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। स्टॉपिंग बफर जोड़कर पाचन को रोकें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  3. एंटीबॉडी इनक्यूबेशन: पीबीएस के 100 माइक्रोन में 1 x 107 कुल कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और एलवाईवीई -1 एंटीबॉडी के 10 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। अच्छी तरह से मिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    1. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. पीबीएस के 1 एमएल शुरू करने और 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को कुल्ला। सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटा दें।
  4. माइक्रोबीड्स लेबलिंग: पीबीएस के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और माइक्रोबीड्स के 20 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। अच्छी तरह से मिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    1. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को स्पिन करें और सतह पर तैरनेवाला छानना। इसके बाद, 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को साफ करें। अंत में, सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटा दें।
  5. चुंबकीय नकारात्मक बहिष्करण: पीबीएस के 4 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। गुच्छों को खत्म करने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं को पास करें। चयन कॉलम तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें) इसे पीबीएस के 3 एमएल के साथ rinsing करके, फिर चयन कॉलम में सेल निलंबन लागू करें।
    1. पीबीएस के 3 एमएल के साथ धोने के कदम प्रदर्शन और उन्हें के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देने के लिए चयन स्तंभ के नीचे तैनात एक 50 एमएल ट्यूब में LYVE-1 नकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा.
  6. चुंबकीय सकारात्मक चयन: चयन कॉलम में पीबीएस के पिपेट 6 एमएल। तुरंत मजबूती से LYVE-1 सकारात्मक LLECs प्राप्त करने के लिए चयन स्तंभ में सवार धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल कोशिकाओं बाहर फ्लश.
    नोट: अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले चयन कॉलम जलाशय खाली होने तक हमेशा प्रतीक्षा करें।

7. एलएलईसी संस्कृति

  1. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर LYVE-1 पॉजिटिव LLECs अपकेंद्रित्र, और फिर ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  2. प्लेट 1 x 10 5 कोशिकाओं प्रति सेमी2 संस्कृति माध्यम के5 एमएल के साथ एक फाइब्रोनेक्टिन-लेपित टी 25 फ्लास्क में।
  3. हर दूसरे दिन 50% माध्यम को बदलकर संस्कृति को बनाए रखें। जब कोशिकाएं 80% संगम तक पहुंचती हैं, तो कोशिकाओं को 0.25% ट्रिप्सिन से अलग करें और सेल मार्ग करें। 2-3 मार्ग के बाद बाद के प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें.

8. फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

नोट: फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण पहले वर्णित प्रक्रिया15 के बाद आयोजित किया गया था।

  1. पक्षपाती कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन जोड़ें और 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, पाचन को रोकने के लिए स्टॉपिंग बफर डालें।
  2. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से महाप्राण करें। पीबीएस के 100 माइक्रोन में 1 x 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  3. LYVE-1 एंटीबॉडी का 1 माइक्रोन जोड़ें। अच्छी तरह से मिक्स और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. प्रवाह साइटोमेट्री और फ्लोजो सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण के लिए पीबीएस बफर की उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।

9. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना

नोट: इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला पहले वर्णित प्रक्रिया के बाद आयोजित किया गया था16.

  1. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें. पीएफए त्यागें और तीन बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक बफर लागू करें। coverslips से ब्लॉक बफर निकालें.
  3. कोशिकाओं को धुंधला बफर में LYVE-1 एंटीबॉडी जोड़ें और अंधेरे में सेते हैं. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  4. कोशिकाओं को धुंधला बफर में एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें और अंधेरे में सेते हैं। कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  5. 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के साथ काउंटरस्टेन। कोशिकाएं अब इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार हैं।

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Representative Results

यह अध्ययन चूहों से लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं (एलएलईसी) की कटाई के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, बहु-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और बाद में इन विट्रो में अपनी प्राथमिक संस्कृति स्थापित करता है। प्रमुख चरणों में फ्लास्क की तैयारी और फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग, लेप्टोमेनिंग का पृथक्करण, एंजाइमैटिक पाचन के माध्यम से एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करना और वीईजीएफ-सी के साथ एलएलईसी विस्तार को प्रेरित करना शामिल है। LYVE-1-सकारात्मक LLECs को चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (MACS) का उपयोग करके चुनिंदा रूप से अलग किया जाता है। अंत में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण एलएलईसी शुद्धता का आकलन करने के लिए किया जाता है, एमटीटी परख परिणामों के साथ मजबूत एलएलईसी विकास दर (अनुपूरक चित्रा 1) का प्रदर्शन करता है। इस बहु-प्रक्रियात्मक प्रोटोकॉल के प्राथमिक चरणों को फ़्लोचार्ट में चित्रित किया गया है, जिसमें पूरी प्रक्रिया में लगभग 2-3 सप्ताह लगते हैं (चित्र 1)।

एलएलईसी की कटाई के लिए, कुशल सर्जिकल तकनीकों के माध्यम से सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करते हुए और ठंडे वातावरण को बनाए रखते हुए लेप्टोमेनिंग को अलग करना और एलएलईसी विस्तार को बढ़ावा देना आवश्यक है(चित्र 2ए-ई)। बाँझ परिस्थितियों में लेप्टोमेनिंग के साथ पूरे मस्तिष्क को प्राप्त करने के बाद, रक्त-लाल कोशिकाओं(चित्रा 2एफ)को हटाने के लिए एक कोमल फ्लश वॉशिंग स्टेप किया जाता है। अगला, लेप्टोमेनिंग को माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 जी) के तहत मस्तिष्क की सतह से सावधानीपूर्वक निकाला जाता है। इन लेप्टोमेनिंग में मुख्य रूप से कोलेजन फाइबर होते हैं, इसलिए वे एंजाइमी पाचन(चित्रा 2एच)में तेजी लाने के लिए खंडित होते हैं। इसके बाद, इन टुकड़ों के एंजाइमेटिक पाचन किया जाता है, और कोलेजन फाइबर(चित्रा 2I)के बड़े समूहों को खत्म करने के लिए किसी भी शेष गुच्छे को 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है। अंत में, कोशिकाओं को फाइब्रोनेक्टिन-लेपित टी 25 फ्लास्क में चढ़ाया जाता है, और वीईजीएफ-सी को विस्तार(चित्रा 2जे)को प्रेरित करने के लिए जोड़ा जाता है। 24 घंटे के बाद, संस्कृति माध्यम गैर संलग्न कोशिकाओं को खत्म करने के लिए हटा दिया जाता है. ये कदम लेप्टोमेनिंग से कोशिकाओं की कटाई की सुविधा प्रदान करते हैं और विस्तार को बढ़ावा देते हैं, जो बाद में प्रक्रिया में पर्याप्त एलवाईवीई -1-पॉजिटिव एलएलईसी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।

जबकि वीईजीएफ-सी एलएलईसी विस्तार को प्रेरित करता है, विषम सेलुलर आबादी अभी भी एक साथ बढ़ सकती है। शुद्ध LYVE-1-पॉजिटिव LLECs को अलग करने के लिए, MACS को LYVE-1 के रूप में नियोजित किया जाता है जो लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए एक मान्यता प्राप्त मार्कर है। एलएलईसी की शुद्धता का मूल्यांकन प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से किया जाता है, जिसके परिणाम दर्शाते हैं कि मार्ग 2 में एलवाईवीई-1-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत एमएसीएस के बाद मार्ग 3 से काफी अलग नहीं है, जो 95% (चित्रा 3ए) से अधिक शुद्धता का प्रदर्शन करता है। LYVE-1-पॉजिटिव LLECs की विशिष्टता को और मान्य करने के लिए, तीन अतिरिक्त लसीका एंडोथेलियल सेल मार्कर-पोडोप्लानिन (PDPN), संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर -3 (VEGFR-3), और प्रोस्पेरो से संबंधित होमोबॉक्स 1 (PROX1) का उपयोग17,18,19 की पहचान के लिए किया गया था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना पुष्टि की है कि LYVE-1 इन तीन मार्करों(चित्रा 3B)के साथ सह दाग है. इसके अलावा, एलएलईसी की पहचान शारीरिक परिस्थितियों में मस्तिष्क स्लाइस में स्थापित की गई थी, जो प्रोक्स 1, वीईजीएफआर -3 और पीडीएन (पूरक चित्रा 2ए) के साथ एलवाईवीई -1 के सह-धुंधला दिखा रही थी। LYVE-1-पॉजिटिव कोशिकाओं ने F4/80 और प्लेटलेट-व्युत्पन्न ग्रोथ फैक्टर बीटा (PDGFR-β) को व्यक्त नहीं किया, प्रभावी रूप से मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट्स(पूरक चित्रा 2B) से LLECs को अलग किया। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध LLECs इन विट्रो संस्कृति में सक्षम की कटाई की अनुमति देता है.

एमएसीएस से पहले लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाएं विषमता प्रदर्शित करती हैं, जो लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं की कालोनियों से भिन्न होती हैं। उनकी आकृति विज्ञान एकल गोल क्षेत्रों से लेकर फ्यूज्ड फाइबर आकृतियों (चित्रा 4 ए-डी) तक होती है। हालांकि, पोस्ट-एमएसीएस, एलएलईसी ठेठ धुरी और कोबलस्टोन के आकार के एंडोथेलियल जैसी विशेषताओं (चित्रा 4ई-एच) का प्रदर्शन करते हैं। इन परिणामों के आधार पर, एलएलईसी को इस बहु-प्रक्रियात्मक प्रोटोकॉल के माध्यम से प्रभावी ढंग से काटा जाता है और स्वस्थ विकास की स्थिति में बनाए रखा जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: बहु-प्रक्रियात्मक प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह फ़्लोचार्ट एलएलईसी की कटाई और संस्कृति के लिए बहु-प्रक्रियात्मक प्रोटोकॉल दिखाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: लेप्टोमेनिंग कोशिकाओं की कटाई। (ए) बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों की तैयारी. (बी) चूहों को 4% आइसोफ्लुरेन के साँस लेना के माध्यम से संवेदनाहारी किया गया था और बाद में इच्छामृत्यु के बाद 70% इथेनॉल के साथ साफ किया गया था। (सी) ललाट क्षेत्र की ओर खोपड़ी के पीछे से शुरू चूहों और त्वचा की सावधान midline चीरा, के सिर काटना. (डी) लेप्टोमेनिंग की अखंडता को बनाए रखने के लिए खोपड़ी को नाजुक हटाना। (ई) लेप्टोमेनिंग युक्त पूरे मस्तिष्क की पुनर्प्राप्ति। (एफ) सतह के रक्त को हटाने के लिए कोमल फ्लशिंग के साथ एक बफर समाधान में पूरे मस्तिष्क की धुलाई। (जी) ठीक बिंदु चिमटी का उपयोग मस्तिष्क की सतह से leptomeninges के विच्छेदन. (एच) बाँझ सूक्ष्म कैंची के साथ टुकड़ों में लेप्टोमेनिंग की कटिंग, एंजाइम मिश्रण के 10 एमएल के अलावा और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद। (I) पीबीएस के 10 एमएल में गोली का पुन: निलंबन और 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से गुच्छों का निस्पंदन। (J) एक लेपित T25 फ्लास्क में कोशिकाओं की चढ़ाना. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एमएसीएस के बाद एलएलईसी शुद्धता का आकलन। (ए) प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से प्रतिनिधि हिस्टोग्राम एमएसीएस के बाद मार्ग 2 और 3 में एलवाईवी-1-पॉजिटिव कोशिकाओं की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करते हैं। LYVE-1-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत MACS के बाद 95% से अधिक हो जाता है। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों (मतलब ± एसईएम) के प्रतिनिधि हैं. त्रुटि पट्टियाँ SEM इंगित करती हैं। (बी) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि PDPN, VEGFR-3 और PROX1 के साथ LYVE-1 के सह-धुंधला दिखा रही है। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं और एलएलईसी की वृद्धि विशेषताएं। (ए) प्रतिनिधि छवियों में कब्जा कर लिया लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (बी-डी) प्रतिनिधि छवियों दिन 1, दिन 2, और दिन 3 MACS से पहले पर लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं की आकृति विज्ञान चित्रण. स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ई) प्रतिनिधि छवियों में कैद एलएलईसी की आकृति विज्ञान। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (एफ-एच) प्रतिनिधि छवियों दिन 1, दिन 2, और MACS के बाद दिन 3 पर LLECs की आकृति विज्ञान चित्रण. स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: एलएलईसी और एसवीईसी4-10 की वृद्धि दर। एमटीटी परख के परिणाम एसवीईसी 4-10 समूह की तुलना में मार्ग 1 में एलएलईसी की वृद्धि दर में उल्लेखनीय कमी दिखाते हैं। SVEC4-10 समूह की तुलना में मार्ग 2 और मार्ग 3 LLECs समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे। डेटा छह स्वतंत्र प्रयोगों (मतलब ± एसईएम) से परिणाम का प्रतिनिधित्व करते हैं. त्रुटि पट्टियाँ SEM इंगित करती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: मस्तिष्क स्लाइस में एलएलईसी की विशेषता और भेदभाव। (ए) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि शारीरिक परिस्थितियों में मस्तिष्क स्लाइस में PROX1, VEGFR-3 और PDPN के साथ LYVE-1 के सह-धुंधला को दर्शाती है। स्केल बार = 2 माइक्रोन। (बी) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि दर्शाती है कि एलवाईवीई -1 शारीरिक परिस्थितियों में मस्तिष्क स्लाइस में एफ 4/80 और पीडीजीएफआर -β के साथ सह-दाग नहीं करता है। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 3: वीईजीएफ-सी उत्तेजना के तहत एलएलईसी का विकास। (ए) 1 एनजी/एमएल वीईजीएफ-सी उत्तेजना के तहत एलएलईसी की प्रतिनिधि छवियां। (बी) 100 एनजी/एमएल वीईजीएफ-सी उत्तेजना के तहत एलएलईसी की प्रतिनिधि छवियां। (सी)500 एनजी/एमएल वीईजीएफ-सी उत्तेजना के तहत एलएलईसी की प्रतिनिधि छवियां। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 4: कटाई के बाद सीडी 31, पीडीपीएन और वीईजीएफआर -3 की अभिव्यक्ति। (ए) प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से प्रतिनिधि हिस्टोग्राम बताते हैं कि सीडी 31-पॉजिटिव कोशिकाएं 5% से कम हैं। (बी) प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से प्रतिनिधि हिस्टोग्राम से संकेत मिलता है कि पीडीपीएन पॉजिटिव कोशिकाएं 95% से अधिक हैं। (सी) प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से प्रतिनिधि हिस्टोग्राम से पता चलता है कि वीईजीएफआर -3-पॉजिटिव कोशिकाएं 95% से अधिक हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 5: एलएलईसी की आकृति विज्ञान और सीडी 31 से भेद। (ए) हेमेटोक्सिलिन-ईोसिन धुंधला द्वारा प्रकट एलएलईसी आकृति विज्ञान की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 20 माइक्रोन। (बी) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां बताती हैं कि एलवाईवीई -1 और पीडीपीएन सीडी 31 के साथ सह-दाग नहीं करते हैं। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 6: एलएलईसी की प्रसार दर। CCK-8 परख से प्रतिनिधि परिणाम क्रमशः मार्ग 1 और मार्ग 6 की तुलना में LLECs की प्रसार दर में उल्लेखनीय कमी दिखाते हैं, क्रमशः 2 और 5। डेटा छह स्वतंत्र प्रयोगों (मतलब ± एसईएम) से परिणाम का प्रतिनिधित्व करते हैं. त्रुटि पट्टियाँ SEM इंगित करती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इन विट्रो में एलएलईसी की कटाई और संवर्धन के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल पहले रिपोर्ट नहीं किया गया है। यह अध्ययन माउस लेप्टोमेनिंग से एलएलईसी की कटाई और संवर्धन के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, बहु-प्रक्रियात्मक प्रोटोकॉल का परिचय देता है।

जबकि यह बहु-प्रक्रियात्मक प्रोटोकॉल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, कई महत्वपूर्ण विचार हैं। उदाहरण के लिए, फाइब्रोनेक्टिन-लेपित टी 25 बोतल एलएलईसी के आसंजन को बढ़ावा देते हैं और गैर-पक्षपाती कोशिकाओं को समाप्त करके कार्य करते हैं, जिससे अधिक समरूप सेलुलर आबादी सुनिश्चित होती है। इसके अतिरिक्त, लेप्टोमेनिंग को अलग करने के लिए सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान समय अवधि और तापमान सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारक हैं। इसलिए, 1 घंटे के भीतर एक समय अवधि बनाए रखना और बफर को पर्याप्त रूप से ठंडा रखना महत्वपूर्ण है। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु लेप्टोमेनिंग में लाल रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति से संबंधित है, जिससे हीमोग्लोबिन की रिहाई एलएलईसी को नुकसान पहुंचा सकती है। इसे कम करने के लिए, लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए धीरे से फ्लश और धोना आवश्यक है, जिससे उनके साइटोटोक्सिक प्रभाव को रोका जा सके। अंत में, एलएलईसी को वीईजीएफ-सी20 के साथ उत्तेजना की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से 100 एनजी / एमएल की एकाग्रता पर। इस उत्तेजना के तहत, एलएलईसी ट्यूब बनाने के बजाय विशेषता एंडोथेलियल जैसी आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं (पूरक चित्रा 3 ए-सी)। नतीजतन, इस अध्ययन विस्तार को प्रेरित करने और सेलुलर आबादी में एकरूपता बनाए रखने के लिए 100 एनजी / एमएल वीईजीएफ-सी युक्त एक संस्कृति माध्यम को नियोजित किया।

यहां वर्णित बहु-प्रक्रियात्मक प्रोटोकॉल समस्या निवारण चरणों और कुछ सीमाओं के साथ आता है। सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल को पूरा होने में 2-3 सप्ताह लगते हैं, जिससे यह लगातार पुनरावृत्ति के लिए अव्यावहारिक हो जाता है। दूसरे, सर्जिकल और एंजाइमेटिक प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप मृत कोशिकाओं की उपस्थिति हो सकती है जो चढ़ाना से पहले समाप्त नहीं होती हैं, संभावित रूप से सेल संस्कृति को प्रभावित करती हैं। भविष्य के प्रोटोकॉल कार्यान्वयन में इस संभावना का पता लगाया जाएगा। तीसरा, जबकि काटे गए एलएलईसी (वीईजीएफआर -3 और पीडीपीएन-पॉजिटिव कोशिकाओं) की शुद्धता 95% से अधिक है, कुछ विषम सेल आबादी सीडी 31-पॉजिटिव कोशिकाओं सहित बनी रहती है, जो 5% से कम (पूरक चित्रा 4 ए-सी) का गठन करती है। यह प्राथमिक कोशिकाओं की संस्कृति में एक आम चुनौती है. हेमटोक्सिलिन-ईोसिन धुंधला से उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां दर्शाती हैं कि एलएलईसी विशेषता एंडोथेलियल जैसी आकृतियों को प्रदर्शित करते हैं लेकिन सीडी 31 (पूरक चित्रा 5 ए, बी) को व्यक्त नहीं करते हैं। अंत में, CCK-8 परख परिणाम क्रमशः मार्ग 2 और 5 की तुलना में मार्ग 1 और 6 पर LLECs में प्रसार दर में उल्लेखनीय कमी का संकेत देते हैं (अनुपूरक चित्रा 6)। पैसेज 1 से एंटीबॉडी उपचार और छँटाई के दौरान शारीरिक तनाव के कारण एलएलईसी को नुकसान हो सकता है, जबकि मार्ग 6 में कम प्रसार दिखाई देता है क्योंकि मार्ग की संख्या बढ़ जाती है। इसलिए, पारित होने के बाद की कोशिकाएं 6 प्रासंगिक प्रयोगों के लिए अनुपयुक्त हैं। मेनिन्जेस21 में फाइब्रोब्लास्ट के वितरण को देखते हुए, लगभग 5% दूषित कोशिकाओं में फाइब्रोब्लास्ट हो सकते हैं। इसे संबोधित करने के लिए, जेनेटिसिन और इम्यूनोमैग्नेटिक सेल सॉर्टिंग के अलावा दूषित फाइब्रोब्लास्ट22,23 को हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एलएलईसी के प्रत्येक मार्ग में फाइब्रोब्लास्ट की संदूषण दर की निगरानी करने से एलएलईसी के विकासपर फाइब्रोब्लास्ट के प्रभाव को खत्म करने में मदद मिलेगी। चूहों और मनुष्यों के बीच विषमता को ध्यान में रखते हुए, भविष्य के अनुसंधान में संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए प्राथमिक मानव एलएलईसी की कटाई और संवर्धन का पीछा किया जाना चाहिए।

संक्षेप में, वर्तमान में इन विट्रो में एलएलईसी की कटाई और संवर्धन के लिए कोई स्थापित प्रोटोकॉल नहीं है। यह अध्ययन चूहों लेप्टोमेनिंग से एलएलईसी की कटाई के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, बहु-प्रक्रियात्मक प्रोटोकॉल का परिचय देता है और बाद में इन विट्रो में अपनी प्राथमिक संस्कृति स्थापित करता है। यह काम एलएलईसी के लिए सेलुलर कार्यों और संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों की आगे की खोज की सुविधा प्रदान करेगा।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81960226, 81760223), युन्नान प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (202001AS070045, 202301AY070001-011), और युन्नान प्रांत शिक्षा विभाग के वैज्ञानिक अनुसंधान फाउंडेशन (2023Y0784) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Block buffer Beyotime P0102 Store aliquots at –4 °C
Collagenase I Solarbio C8140 Store aliquots at –20 °C
DAPI Beyotime P0131 Store aliquots at –20 °C
DMEM Solarbio 11995 Store aliquots at –4 °C
D-PBS Solarbio D1041 Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza C-3202 Store aliquots at –4 °C
FBS Solarbio S9010 Store aliquots at –20 °C
Fibronectin Solarbio F8180  Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software BD Biosciences V10.8.1
LYVE-1 antibody eBioscience 12-0443-82 Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator Miltenyi 130-042-302 Sterile before use
Magnetic separator stand Miltenyi 130-042-303 Sterile before use
Microbeads Miltenyi 130-048-801 Store aliquots at –4 °C
P/S Solarbio P1400 Store aliquots at –20 °C
Papain Solarbio G8430-25g Store aliquots at –20 °C
PBS Solarbio D1040 Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody Santa sc-53533 Store aliquots at –4 °C
PFA Solarbio P1110 Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody Santa sc-81983 Store aliquots at –4 °C
Selection column  Miltenyi 130-042-401 Sterile before use
Trypsin Gibco 25200072 Store aliquots at –20 °C
VEGF-C  Abcam ab51947 Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody Santa sc-514825 Store aliquots at –4 °C

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References

  1. Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
  2. Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
  3. Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
  4. Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
  5. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  6. Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
  7. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  8. Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
  9. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  10. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
  11. Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
  12. Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
  13. Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
  14. Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
  15. Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
  16. Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
  17. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
  18. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
  19. Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
  20. Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
  21. DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
  22. Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
  23. Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
  24. Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).

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Deng, H. J., Wu, K., Yu, H. F., Zhang, Y. J., Li, Y. C., Li, C., Wang, F. Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (199), e65872, doi:10.3791/65872 (2023).

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