Summary
Leptomeningeale lymfatiske endotelceller (LLECs), en nylig identifisert intrakraniell celletype, har dårlig forstått funksjoner. Denne studien presenterer en reproduserbar protokoll for høsting av LLEC fra mus og etablering av in vitro primærkulturer. Denne protokollen er utformet for å gjøre det mulig for forskere å dykke inn i cellulære funksjoner og potensielle kliniske implikasjoner av LLECs.
Abstract
Leptomeningeale lymfatiske endotelceller (LLECs) er en nylig oppdaget intrakraniell cellulær populasjon med en unik fordeling klart forskjellig fra perifere lymfatiske endotelceller. Deres cellulære funksjon og kliniske implikasjoner forblir stort sett ukjente. Derfor er tilgjengeligheten av en tilførsel av LLEC avgjørende for å utføre funksjonell forskning in vitro. Imidlertid er det for tiden ingen eksisterende protokoll for høsting og dyrking av LLEC in vitro.
Denne studien høstet vellykket LLEC ved hjelp av en flertrinnsprotokoll, som inkluderte å belegge kolben med fibronektin, dissekere leptomeningene ved hjelp av et mikroskop, enzymatisk fordøye leptomeningene for å forberede en enkeltcellesuspensjon, indusere utvidelsen av LLEC med vaskulær endotelial vekstfaktor-C (VEGF-C), og velge lymfekarhyaluronreseptor-1 (LYVE-1) positive celler gjennom magnetisk aktivert cellesortering (MACS). Denne prosessen førte til slutt til etableringen av en primærkultur. Renheten til LLEC ble bekreftet gjennom immunfluorescensfarging og flowcytometrisk analyse, med et renhetsnivå på over 95 %. Denne flertrinnsprotokollen har vist reproduserbarhet og gjennomførbarhet, noe som i stor grad vil lette utforskningen av den cellulære funksjonen og kliniske implikasjoner av LLECs.
Introduction
De nylig oppdagede leptomeningeale lymfatiske endotelceller (LLEC) danner et maskeverk av individuelle celler i leptomeningene, og viser et distinkt distribusjonsmønster sammenlignet med perifere lymfatiske endotelceller 1,2. De cellulære funksjonene og kliniske implikasjonene forbundet med LLEC forblir stort sett ukjent territorium. For å bane vei for funksjonell forskning på LLEC, er det viktig å etablere en in vitro-modell for studien. Derfor har denne studien utarbeidet en omfattende protokoll for isolasjon og primærkultur av LLECs.
Mus er den foretrukne dyremodellen på grunn av deres egnethet for genetisk manipulasjon i sykdomsforskning. Tidligere studier har vellykket isolert lymfatiske endotelceller fra forskjellige musevev, inkludert lymfeknuter3, mesenterisk vev4, dermal vev5, samle lymfe6 og lungevev7. Disse isolasjonsprosedyrene har primært basert seg på teknikker som magnetisk-aktivert cellesortering (MACS) og flowcytometrisortering 8,9,10. I tillegg har forskningsinnsatsen ført til etablering av rotte araknoidale cellelinjer og rotte lymfatiske kapillære cellelinjer11,12. Til tross for eksistensen av eksplantkulturteknikker for leptomeninger13, eksisterer det et presserende behov for en standardisert protokoll for isolasjon og kultur av LLEC. Følgelig har denne studien vellykket høstet og dyrket LLEC ved omhyggelig dissosiering av leptomeninger under veiledning av et mikroskop og fremme LLECs ekspansjon ved bruk av vaskulær endotelial vekstfaktor-C (VEGF-C). Den karakteristiske markøren for lymfatiske endotelceller er lymfekarhyaluronreseptor-1 (LYVE-1)14. Denne flertrinnsprotokollen isolerer selektivt LYVE-1-positive LLEC-er ved bruk av MACS og verifiserer deretter deres renhet gjennom flowcytometrisk analyse og immunfluorescerende farging.
De primære trinnene i denne flertrinnsprotokollen kan oppsummeres som følger: kolbebelegg, dissosiasjon av leptomeninger, enzymatisk fordøyelse av leptomeninger, celleutvidelse, magnetisk cellevalg og påfølgende kultur av LLEC. Til slutt bekreftes renheten til de isolerte LLECene gjennom flowcytometrisk analyse og immunfluorescerende farging. Det overordnede målet med denne studien er å presentere en reproduserbar, flertrinnsprotokoll for isolering av LLEC fra museleptomeninger og deres påfølgende in vitro-kultur . Denne protokollen er klar til å legge til rette for undersøkelser av cellulære funksjoner og kliniske implikasjoner av LLECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskningen fikk godkjenning fra Animal Experiment Ethics Committee of Kunming Medical University (kmmu20220945). Alle eksperimenter fulgte etablerte retningslinjer for dyrepleie. Leptomeningeale lymfatiske endotelceller (LLEC) ble høstet fra mannlige C57Bl/6J-mus i alderen 6-8 uker og veide mellom 20-25 g. Disse musene ble anskaffet fra Kunming Medical University i Kunming, Kina. Hele eksperimentelle prosedyren ble utført under strenge sterile forhold. Alle sentrifugeringstrinnene utføres ved romtemperatur med mindre annet er spesifisert.
1. Fremstilling av reagenser og instrumenter
MERK: Alle trinn som involverer løsninger må utføres innenfor et biohazard-skap i klasse II.
- Forbered vaskebufferen ved å blande fosfatbufret saltvann (PBS) med kalsium og magnesium, 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (P / S) (se materialtabell). Hold denne bufferen kald ved 4 °C. Det er viktig å tilberede det friskt på bruksdagen og degas bufferen.
- Forbered fordøyelsesenzymer ved å kombinere 10 ml PBS (uten kalsium og magnesium) med 2 ml 0,25% trypsin, 1 ml 20 mg / ml papain og 200 μL 1 mg / ml kollagenase I (se materialtabell).
MERK: Sørg for bruk av alikoter med passende volum for å forhindre gjentatte fryse-tine-sykluser. Oppbevar disse alikotene ved -20 °C. - Forbered kulturmediet ved å bruke det kommersielt tilgjengelige endotelcellevekstmediesettet, som inkluderer VEGF-C (100 ng / ml) og 1% P / S (se materialtabell).
- Forbered stoppbufferen ved å supplere Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) med 10% FBS for å stoppe fordøyelsesprosessen.
- Forbered sterile kirurgiske instrumenter: Disse instrumentene bør inneholde saks, serrated-tip pinsett og finpunktpinsett.
2. Kolbe belegg
- Beleg T25-kolben med en fibronektinoppløsning på 100 μg/ml (se materialfortegnelse) og rug over natten ved 37 °C. Før bruk, fjern beleggløsningen med en pipette.
- Vask kolben tre ganger med PBS, aspirer deretter PBS, og la T25-kolben lufttørke.
3. Leptomeninges dissosiasjon
MERK: Bruk alltid forkjølte buffere og oppløsninger ved 4 °C.
- Bedøv musene med overflødig innånding av 4% isofluran og ofre dem deretter ved rask halshugging ved hjelp av saks som tidligere har blitt rengjort med 70% etanol.
- Forsiktig snitt huden langs midtlinjen, starter fra åpningen på baksiden av skallen og strekker seg mot frontalområdet.
- Fjern skallen forsiktig, løft den forsiktig med saksen for å unngå å skade leptomeningene, slik at hele hjernen, inkludert leptomeningene, oppnås.
- Senk hele hjernen i en vaskebuffer og skyll den forsiktig for å fjerne overflateblod.
- Overfør hjernen til en steril petriskål uten å hakke, og trekk ut leptomeningene fra hjernens overflate ved hjelp av finpunktpinsett under et mikroskop.
- Klipp leptomeningevevet i fragmenter ved hjelp av steril mikrosaks.
4. Leptomeninger enzymatisk fordøyelse
- Tilsett 10 ml av enzymblandingen (trinn 1,2) til fragmentene og inkuber ved 37 °C i 15 minutter. Rist forsiktig for å sikre at fragmentene løsner fra bunnen av røret. Etterpå tilsettes 10 ml stoppbuffer (trinn 1.4) for å stoppe fordøyelsen.
- Sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C og fjern forsiktig supernatanten med en pipette.
- Tilsett 10 ml kald PBS, og før blandingen gjennom en 70 μm sil inn i et sterilt 50 ml rør for å filtrere ut eventuelle klumper.
5. Cell utvidelse
- Plate 1 x 10 5 celler per cm 2 i en fibronektinbelagt T25-kolbe (trinn2) med5 ml kulturmedium.
- Inkuber cellene ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer. Etterpå fjerner du mediet for å eliminere ikke-festede celler.
- Opprettholde kulturen ved å erstatte 50% av mediet annenhver dag. Gjenta denne prosessen to eller tre ganger.
6. Magnetisk cellevalg
MERK: Arbeid raskt, oppretthold cellekulde og bruk forhåndskjølte løsninger for å forhindre ikke-spesifikk cellemerking.
- Klargjøring av instrumenter og reagenser: Fest en magnetisk separator til et magnetisk separatorstativ (se materialtabell). Koble en markeringskolonne til den magnetiske separatoren, og plasser en 70 μm cellesil på toppen av utvalgskolonnen. Plasser et 50 ml rør under valgkolonnen for å samle opp strømmen.
- Enzymatisk fordøyelse: Når cellene når 80% sammenløp, aspirer mediet og skyll cellene med PBS. Tilsett 0,25 % trypsin for å løsne adherente celler og inkubere ved 37 °C i 5 minutter. Stopp fordøyelsen ved å legge til stoppbufferen. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten.
- Antistoffinkubasjon: resuspendere 1 x 107 totale celler i 100 μL PBS og tilsett 10 μL LYVE-1 antistoff (se materialtabell). Bland godt og rug i 30 minutter i mørket ved 4 °C.
- Spinn cellene ved 300 x g i 5 minutter og kast supernatanten. Skyll cellene ved å introdusere 1 ml PBS og sentrifugere ved 300 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten helt.
- Merking av mikroperler: resuspender cellene i 100 μL PBS og tilsett 20 μL mikroperler (se materialfortegnelse). Bland godt og rug i 30 minutter i mørket ved 4 °C.
- Spinn cellene ved 300 x g i 5 minutter og dekanter supernatanten. Deretter renser du cellene med 1 ml PBS gjennom sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter. Til slutt, fjern supernatanten helt.
- Magnetisk negativ ekskludering: resuspender cellene i 4 ml PBS. Pass cellene gjennom en 70 μm cellesil for å eliminere klumper. Forbered utvalgskolonnen (se Materialfortegnelse) ved å skylle den med 3 ml PBS, og påfør deretter cellesuspensjonen i utvalgskolonnen.
- Utfør vasketrinn med 3 ml PBS og samle LYVE-1-negative celler i et 50 ml rør plassert under markeringskolonnen for å la dem passere gjennom.
- Magnetisk positivt utvalg: pipett 6 ml PBS inn i valgkolonnen. Skyll umiddelbart ut de magnetisk merkede cellene ved å skyve stempelet bestemt inn i markeringskolonnen for å oppnå LYVE-1-positive LLECs.
MERK: Vent alltid til magasinet for utvalgskolonnen er tomt før du går videre til neste trinn.
7. LLECs kultur
- Sentrifuger LYVE-1-positive LLEC ved 300 x g i 5 minutter, og fjern deretter supernatanten forsiktig.
- Plate 1 x 10 5 celler per cm2 i en fibronektinbelagt T25-kolbe med5 ml kulturmedium.
- Oppretthold kulturen ved å erstatte 50% av mediet annenhver dag. Når cellene når 80% sammenløp, løsner cellene med 0,25% trypsin og utfører cellepassasje. Bruk cellene til påfølgende eksperimenter etter 2-3 passasjer.
8. Flowcytometrisk analyse
MERK: Den flowcytometriske analysen ble utført etter den tidligere beskrevne prosedyren15.
- Tilsett 0,25 % trypsin for å løsne adherente celler og inkubere ved 37 °C i 5 minutter. Deretter legger du til stoppbufferen for å stoppe fordøyelsen.
- Sentrifuge cellene ved 300 x g i 5 minutter og aspirer supernatanten fullstendig. Resuspender 1 x 106 celler i 100 μL PBS.
- Tilsett 1 μL LYVE-1 antistoff. Bland godt og rug i 10 minutter i mørket ved romtemperatur.
- Resuspendere cellene i en passende mengde PBS-buffer for analyse ved hjelp av flowcytometri og FlowJo-programvare (se materialfortegnelse).
9. Immunfluorescerende farging
MERK: Den immunfluorescerende fargingen ble utført etter prosedyren beskrevet tidligere16.
- Vask cellene med PBS tre ganger. Fest cellene med 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter ved romtemperatur. Kast PFA og vask cellene med PBS tre ganger.
- Påfør blokkbufferen i 1 time ved romtemperatur. Fjern blokkbufferen fra dekslene.
- Tilsett LYVE-1-antistoffet i fargebufferen til cellene og inkuber i mørket. Vask cellene tre ganger med PBS.
- Legg til et passende sekundært antistoff (se materialfortegnelse) i fargebufferen til cellene og inkuber i mørket. Vask cellene tre ganger med PBS.
- Motflekk med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Cellene er nå klare for immunfluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien presenterer en reproduserbar, flertrinnsprotokoll for høsting av lymfatiske endotelceller (LLEC) fra mus og deretter etablering av deres primære kultur in vitro. De viktigste trinnene involverer kolbepreparasjon og fibronektinbelegg, dissosiasjon av leptomeninger, oppnåelse av en enkeltcellesuspensjon gjennom enzymatisk fordøyelse og indusering av LLECs ekspansjon med VEGF-C. LYVE-1-positive LLEC isoleres deretter selektivt ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MACS). Til slutt utføres immunfluorescensfarging og flowcytometrisk analyse for å vurdere LLECs renhet, med MTT-analyseresultater som viser robuste LLECs vekstrater (tilleggsfigur 1). De primære trinnene i denne multi-prosedyreprotokollen er illustrert i flytskjemaet, med hele prosessen som tar omtrent 2-3 uker (figur 1).
For å høste LLEC er det viktig å dissosiere leptomeninger og fremme LLECs ekspansjon samtidig som cellens levedyktighet opprettholdes gjennom effektive kirurgiske teknikker og opprettholdelse av et kaldt miljø (figur 2A-E). Etter å ha oppnådd hele hjernen sammen med leptomeningene under sterile forhold, utføres et forsiktig spylevasketrinn for å fjerne blodrøde blodlegemer (figur 2F). Deretter ekstraheres leptomeninger forsiktig fra hjernens overflate under et mikroskop (figur 2G). Disse leptomeningene består hovedsakelig av kollagenfibre, så de er fragmentert for å fremskynde enzymatisk fordøyelse (figur 2H). Deretter utføres enzymatisk fordøyelse av disse fragmentene, og eventuelle gjenværende klumper filtreres gjennom en 70 μm sil for å eliminere større klynger av kollagenfibre (figur 2I). Til slutt blir celler belagt i en fibronektinbelagt T25-kolbe, og VEGF-C tilsettes for å indusere ekspansjon (figur 2J). Etter 24 timer fjernes kulturmediet for å eliminere ikke-festede celler. Disse trinnene letter høstingen av celler fra leptomeninger og fremmer ekspansjon, noe som er kritisk for å oppnå tilstrekkelig LYVE-1-positive LLEC senere i prosessen.
Mens VEGF-C induserer LLEC-ekspansjon, kan heterogene cellulære populasjoner fortsatt vokse sammen. For å isolere rene LYVE-1-positive LLECs, brukes MACS da LYVE-1 er en anerkjent markør for lymfatiske endotelceller. Renheten til LLEC vurderes gjennom flowcytometri, med resultater som indikerer at prosentandelen av LYVE-1-positive celler i passasje 2 ikke er signifikant forskjellig fra passasje 3 etter MACS, noe som viser en renhet større enn 95 % (figur 3A). For ytterligere å validere spesifisiteten til LYVE-1-positive LLECs, ble ytterligere tre lymfatiske endotelcellemarkører-podoplanin (PDPN), vaskulær endotelial vekstfaktorreseptor-3 (VEGFR-3) og Prospero-relatert homeobox1 (PROX1) brukt for identifisering17,18,19. Immunfluorescensfarging bekreftet at LYVE-1 farget sammen med disse tre markørene (figur 3B). Videre ble identiteten til LLEC etablert i hjerneskiver under fysiologiske forhold, som viser samtidig farging av LYVE-1 med PROX1, VEGFR-3 og PDPN (tilleggsfigur 2A). LYVE-1-positive celler uttrykte ikke F4/80 og blodplatederivert vekstfaktor beta (PDGFR-β), og skilte effektivt LLEC fra makrofager og fibroblaster (tilleggsfigur 2B). Oppsummert tillater denne protokollen høsting av svært rene LLEC som er i stand til in vitro-kultur.
Leptomeningeale celler før MACS utviser heterogenitet, forskjellig fra koloniene av lymfatiske endotelceller. Morfologien deres varierer fra enkle runde kuler til smeltede fiberformer (figur 4A-D). Etter MAC har imidlertid LLEC typiske spindel- og brosteinsformede endotellignende egenskaper (figur 4E-H). Basert på disse resultatene høstes LLEC effektivt gjennom denne multi-prosedyreprotokollen og opprettholdes i en sunn veksttilstand.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av den multiprosessuelle protokollen. Dette flytskjemaet illustrerer den multi-prosessuelle protokollen for høsting og kultur av LLECs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Høsting av leptomeningeceller. (A) Fremstilling av sterile kirurgiske instrumenter. (B) Mus ble bedøvet via inhalasjon av 4% isofluran og deretter rengjort med 70% etanol etter avlivning. (C) Halshugging av musene og forsiktig midtlinjesnitt av huden, fra baksiden av skallen mot frontalområdet. (D) Delikat fjerning av hodeskallen for å bevare integriteten til leptomeningene. (E) Henting av hele hjernen som inneholder leptomeningene. (F) Vasking av hele hjernen i en bufferløsning med forsiktig spyling for å fjerne overflateblod. (G) Disseksjon av leptomeninger fra hjernens overflate ved hjelp av finpunktpinsett. (H) Skjæring av leptomeninger i fragmenter med steril mikrosaks, etterfulgt av tilsetning av 10 ml enzymblanding og inkubasjon ved 37 °C i 15 minutter. (I) Suspensjon av pelleten i 10 ml PBS og filtrering av klumper gjennom en 70 μm sil. (J) Plettering av celler i en belagt T25-kolbe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vurdering av LLEC-renhet etter MACS. (A) Representative histogrammer fra flowcytometrisk analyse som demonstrerer ekspresjonen av LYVE-1-positive celler i passasjer 2 og 3 etter MACS. Prosentandelen LYVE-1-positive celler overstiger 95% etter MACS. Data er representative for tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnittlig ± SEM). Feilfelt indikerer SEM. (B) Representativt immunfluorescensbilde som viser samtidig farging av LYVE-1 med PDPN, VEGFR-3 og PROX1. Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vekstkarakteristika for leptomeningeale celler og LLECs. (A) Morfologi av leptomeningeale celler fanget i representative bilder. Skala bar = 50 μm. (B-D) Representative bilder som viser morfologien til leptomeningeale celler på dag 1, dag 2 og dag 3 før MACS. Skalastenger = 100 μm. (E) Morfologi av LLEC fanget i representative bilder. Skala bar = 50 μm. (F-H) Representative bilder som illustrerer morfologien til LLEC på dag 1, dag 2 og dag 3 etter MACS. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Vekstrate for LLEC og SVEC4-10. MTT-analyseresultater viser en signifikant reduksjon i vekstraten for LLEC i passasje 1 sammenlignet med SVEC4-10-gruppen. Det var ingen signifikante forskjeller mellom passasje 2 og passasje 3 LLEC grupper sammenlignet med SVEC4-10 gruppen. Data representerer resultater fra seks uavhengige eksperimenter (gjennomsnittlig ± SEM). Feilfelt angir SEM. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Karakterisering og diskriminering av LLEC i hjerneskiver. (A) Representativt immunfluorescensbilde som illustrerer samtidig farging av LYVE-1 med PROX1, VEGFR-3 og PDPN i hjerneskiver under fysiologiske forhold. Skalastenger = 2 μm. (B) Representativt immunfluorescensbilde som viser at LYVE-1 ikke samfarger med F4/80 og PDGFR-β i hjerneskiver under fysiologiske forhold. Skalastenger = 20 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Vekst av LLEC under VEGF-C-stimulering. (A) Representative bilder av LLEC under 1 ng / ml VEGF-C stimulering. (B) Representative bilder av LLEC under 100 ng/ml VEGF-C-stimulering. (C) Representative bilder av LLEC under 500 ng / ml VEGF-C stimulering. Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 4: Ekspresjon av CD31, PDPN og VEGFR-3 etter høsting. (A) Representative histogrammer fra flowcytometrisk analyse viser at CD31-positive celler er mindre enn 5%. (B) Representative histogrammer fra flowcytometrisk analyse indikerer at PDPN-positive celler overstiger 95%. (C) Representative histogrammer fra flowcytometrisk analyse viser at VEGFR-3-positive celler overstiger 95%. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 5: Morfologi av LLEC og skille fra CD31. (A) Representative bilder av LLECs morfologi avslørt ved hematoksylin-eosinfarging. Skala bar = 20 μm. (B) Representative immunfluorescensbilder illustrerer at LYVE-1 og PDPN ikke samfarger med CD31. Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 6: Spredningsrate for LLEC. Representative resultater fra CCK-8-analysen viser en signifikant reduksjon i spredningsraten for LLEC i passasje 1 og passasje 6 sammenlignet med henholdsvis passasje 2 og 5. Data representerer resultater fra seks uavhengige eksperimenter (gjennomsnittlig ± SEM). Feilfelt angir SEM. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den eksisterende protokollen for høsting og dyrking av LLEC in vitro er ikke tidligere rapportert. Denne studien introduserer en reproduserbar, multi-prosedyreprotokoll for høsting og dyrking av LLEC fra museleptomeninger.
Selv om denne protokollen med flere prosedyrer er reproduserbar, er det flere viktige hensyn. For eksempel fremmer fibronektinbelagte T25-kolber adhesjonen av LLEC og funksjon ved å eliminere ikke-adherente celler, og sikrer dermed en mer homogen cellulær populasjon. I tillegg er tidsvarighet og temperatur under kirurgiske prosedyrer for dissosiering av leptomeninger kritiske faktorer som påvirker cellens levedyktighet. Derfor er det avgjørende å opprettholde en varighet innen 1 time og holde bufferen tilstrekkelig kald. Et annet kritisk punkt gjelder tilstedeværelsen av røde blodlegemer i leptomeningene, hvorfra frigjøring av hemoglobin kan skade LLEC. For å redusere dette er det viktig å skylle forsiktig og vaske for å fjerne røde blodlegemer, og forhindre deres cytotoksiske effekter. Til slutt krever LLEC stimulering med VEGF-C20, spesielt ved en konsentrasjon på 100 ng / ml. Under denne stimuleringen viser LLEC karakteristisk endotellignende morfologi i stedet for å danne rør (tilleggsfigur 3A-C). Følgelig benyttet denne studien et kulturmedium som inneholdt 100 ng / ml VEGF-C for å indusere ekspansjon og opprettholde homogenitet i cellulære populasjoner.
Multiprosedyreprotokollen som er beskrevet her, kommer med feilsøkingstrinn og noen begrensninger. For det første tar denne protokollen 2-3 uker å fullføre, noe som gjør den upraktisk for hyppig repetisjon. For det andre kan kirurgiske og enzymatiske prosedyrer resultere i tilstedeværelse av døde celler som ikke elimineres før plating, noe som potensielt påvirker cellekulturen. Denne muligheten vil bli utforsket i fremtidige protokollimplementeringer. For det tredje, mens renheten til høstede LLEC (VEGFR-3 og PDPN-positive celler) overstiger 95%, vedvarer noen heterogene cellepopulasjoner, inkludert CD31-positive celler, som utgjør mindre enn 5% (tilleggsfigur 4A-C). Dette er en vanlig utfordring i kulturen av primære celler. Høyoppløselige bilder fra hematoksylin-eosinfarging viser at LLEC viser karakteristiske endotellignende former, men uttrykker ikke CD31 (tilleggsfigur 5A,B). Til slutt indikerer CCK-8-analyseresultater en signifikant reduksjon i spredningsraten i LLEC ved passasje 1 og 6 sammenlignet med henholdsvis passasje 2 og 5 (tilleggsfigur 6). Passasje 1 kan føre til LLECs skade på grunn av antistoffbehandling og den fysiske belastningen under sortering, mens passasje 6 viser redusert spredning etter hvert som antall passeringer øker. Derfor er etterfølgende celler etter passasje 6 uegnet for relevante eksperimenter. Gitt fordelingen av fibroblaster i meningene21, kan ca. 5% av forurensede celler inneholde fibroblaster. For å løse dette kan tilsetning av genetikk og immunomagnetisk cellesortering brukes til å fjerne forurensede fibroblaster22,23. Overvåking av forurensningshastigheten til fibroblaster i hver passasje av LLEC vil bidra til å eliminere virkningen av fibroblaster på LLECs vekst24. Tatt i betraktning heterogeniteten mellom mus og mennesker, bør høsting og dyrking av primære humane LLEC forfølges for potensielle kliniske anvendelser i fremtidig forskning.
Oppsummert er det for tiden ingen etablert protokoll for høsting og dyrking av LLEC in vitro. Denne studien introduserer en reproduserbar, multi-prosedyreprotokoll for høsting av LLEC fra mus leptomeninger og deretter etablering av deres primære kultur in vitro. Dette arbeidet vil legge til rette for videre utforskning av cellulære funksjoner og potensielle kliniske anvendelser for LLEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), Natural Science Foundation of Yunnan-provinsen (202001AS070045, 202301AY070001-011), og Scientific Research Foundation of Yunnan Province Department of Education (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
