Summary
Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs), ein kürzlich identifizierter intrakranieller Zelltyp, haben nur unzureichend verstandene Funktionen. In dieser Studie wird ein reproduzierbares Protokoll für die Entnahme von LLECs aus Mäusen und die Etablierung von In-vitro-Primärkulturen vorgestellt. Dieses Protokoll soll es Forschern ermöglichen, sich mit den zellulären Funktionen und möglichen klinischen Auswirkungen von LLECs zu befassen.
Abstract
Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) sind eine kürzlich entdeckte intrakranielle Zellpopulation mit einer einzigartigen Verteilung, die sich deutlich von peripheren lymphatischen Endothelzellen unterscheidet. Ihre zelluläre Funktion und ihre klinischen Implikationen sind noch weitgehend unbekannt. Folglich ist die Verfügbarkeit eines Angebots an LLECs für die Durchführung funktioneller Forschung in vitro unerlässlich. Derzeit gibt es jedoch kein bestehendes Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro.
In dieser Studie wurden LLECs erfolgreich mit einem mehrstufigen Protokoll geerntet, das die Beschichtung des Kolbens mit Fibronektin, die Präparation der Leptomeninge mit Hilfe eines Mikroskops, die enzymatische Verdauung der Leptomeninge zur Herstellung einer Einzelzellsuspension, die Induktion der Expansion von LLECs mit dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-C (VEGF-C) und die Selektion von lymphatischen Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)-positiven Zellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) umfasste. Dieser Prozess führte schließlich zur Etablierung einer Primärkultur. Die Reinheit der LLECs wurde durch Immunfluoreszenzfärbung und durchflusszytometrische Analyse mit einem Reinheitsgrad von über 95 % bestätigt. Dieses mehrstufige Protokoll hat die Reproduzierbarkeit und Durchführbarkeit unter Beweis gestellt, was die Erforschung der zellulären Funktion und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern wird.
Introduction
Die neu entdeckten leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen (LLECs) bilden ein Geflecht aus einzelnen Zellen innerhalb der Leptomeninge und weisen im Vergleich zu peripheren lymphatischen Endothelzellen ein deutliches Verteilungsmuster auf 1,2. Die zellulären Funktionen und klinischen Implikationen, die mit LLECs verbunden sind, sind nach wie vor weitgehend unbekanntes Terrain. Um den Weg für die funktionelle Forschung an LLECs zu ebnen, ist es zwingend erforderlich, ein In-vitro-Modell für ihre Untersuchung zu etablieren. Daher wurde in dieser Studie ein umfassendes Protokoll für die Isolierung und Primärkultur von LLECs entwickelt.
Mäuse sind aufgrund ihrer Eignung für die genetische Manipulation in der Krankheitsforschung das bevorzugte Tiermodell. Frühere Studien haben erfolgreich lymphatische Endothelzellen aus verschiedenen Mausgeweben isoliert, darunter Lymphknoten3, Mesenterialgewebe4, Hautgewebe5, sammelnde Lymphgefäße6 und Lungengewebe7. Diese Isolierungsverfahren beruhen in erster Linie auf Techniken wie der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MACS) und der Durchflusszytometrie 8,9,10. Darüber hinaus haben die Forschungsbemühungen zur Etablierung von Arachnoidalzelllinien der Ratte und lymphatischen Kapillarzelllinien der Ratte geführt11,12. Trotz der Existenz von Explantatkulturtechniken für Leptomeninge13 besteht ein dringender Bedarf an einem standardisierten Protokoll für die Isolierung und Kultur von LLECs. Folglich wurden in dieser Studie erfolgreich LLECs geerntet und kultiviert, indem Leptomeninge unter Anleitung eines Mikroskops akribisch dissoziiert und die LLEC-Expansion durch den Einsatz des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors-C (VEGF-C) gefördert wurden. Der charakteristische Marker für lymphatische Endothelzellen ist der lymphatische Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)14. Dieses mehrstufige Protokoll isoliert selektiv LYVE-1-positive LLECs mittels MACS und verifiziert anschließend ihre Reinheit durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung.
Die Hauptschritte dieses mehrstufigen Protokolls können wie folgt zusammengefasst werden: Kolbenbeschichtung, Dissoziation von Leptomeningen, enzymatischer Verdau von Leptomeningen, Zellexpansion, magnetische Zellselektion und anschließende Kultur von LLECs. Abschließend wird die Reinheit der isolierten LLECs durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, ein reproduzierbares, mehrstufiges Protokoll für die Isolierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus und deren anschließende in vitro Kultur vorzustellen. Dieses Protokoll wird die Untersuchung der zellulären Funktionen und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern.
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Protocol
Diese Forschung wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (kmmu20220945). Alle Versuche hielten sich an die etablierten Richtlinien für die Tierpflege. Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) wurden von männlichen C57Bl/6J-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht zwischen 20-25 g gewonnen. Diese Mäuse wurden von der Medizinischen Universität Kunming in Kunming, China, beschafft. Der gesamte Versuchsablauf wurde unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt. Alle Zentrifugationsschritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.
1. Vorbereitung von Reagenzien und Instrumenten
HINWEIS: Alle Schritte, bei denen Lösungen zum Einsatz kommen, müssen in einem Biogefahrenschrank der Klasse II durchgeführt werden.
- Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Kalzium und Magnesium, 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) mischen (siehe Materialtabelle). Halten Sie diesen Puffer kalt bei 4 °C. Es ist wichtig, ihn am Tag der Verwendung frisch zuzubereiten und den Puffer zu entgasen.
- Bereiten Sie die Verdauungsenzyme vor, indem Sie 10 ml PBS (ohne Kalzium und Magnesium) mit 2 ml 0,25%igem Trypsin, 1 ml 20 mg/ml Papain und 200 μl 1 mg/ml Kollagenase I kombinieren (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Aliquots geeigneter Volumina verwenden, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Lagern Sie diese Aliquoten bei -20 °C. - Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie das handelsübliche Endothelzell-Wachstumsmedium-Kit verwenden, das VEGF-C (100 ng/ml) und 1 % P/S enthält (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie den Stopppuffer vor, indem Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10% FBS ergänzen, um den Verdauungsprozess zu stoppen.
- Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente vor: Zu diesen Instrumenten sollten eine Schere, eine Pinzette mit gezackter Spitze und eine Pinzette mit feiner Spitze gehören.
2. Kolbenbeschichtung
- Der T25-Kolben wird mit einer 100 μg/ml Fibronektinlösung bestrichen (siehe Materialtabelle) und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Entfernen Sie die Beschichtungslösung vor Gebrauch mit einer Pipette.
- Waschen Sie den Kolben dreimal mit PBS, saugen Sie anschließend den PBS an und lassen Sie den T25-Kolben an der Luft trocknen.
3. Dissoziation von Leptomeningen
HINWEIS: Verwenden Sie immer vorgekühlte Puffer und Lösungen bei 4 °C.
- Betäuben Sie die Mäuse mit einer übermäßigen Inhalation von 4 % Isofluran und opfern Sie sie dann durch schnelle Enthauptung mit einer Schere, die zuvor mit 70 % Ethanol gereinigt wurde.
- Schneiden Sie die Haut vorsichtig entlang der Mittellinie ein, beginnend mit der Öffnung an der Rückseite des Schädels und in Richtung des vorderen Bereichs.
- Entfernen Sie den Schädel vorsichtig und heben Sie ihn vorsichtig mit der Schere an, um eine Beschädigung der Leptomeninge zu vermeiden und sicherzustellen, dass das gesamte Gehirn, einschließlich der Leptomeninge, erhalten wird.
- Tauchen Sie das gesamte Gehirn in einen Waschpuffer und spülen Sie ihn vorsichtig aus, um oberflächliches Blut zu entfernen.
- Übertragen Sie das Gehirn in eine sterile Petrischale, ohne es zu zerkleinern, und extrahieren Sie die Leptomeninge mit einer feinen Pinzette unter einem Mikroskop von der Gehirnoberfläche.
- Schneiden Sie das Leptomening-Gewebe mit einer sterilen Mikroschere in Fragmente.
4. Enzymatische Verdauung von Leptomeningen
- Zu den Fragmenten werden 10 ml der Enzymmischung (Schritt 1.2) gegeben und bei 37 °C 15 min inkubiert. Rühren Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich die Fragmente vom Boden des Röhrchens lösen. Geben Sie anschließend 10 ml Stopppuffer hinzu (Schritt 1.4), um die Verdauung zu stoppen.
- Bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen.
- Fügen Sie 10 ml kaltes PBS hinzu und leiten Sie die Mischung durch ein 70-μm-Sieb in ein steriles 50-ml-Röhrchen, um Klumpen herauszufiltern.
5. Zellausdehnung
- 1 x 10 5 Zellen procm2 in einen mit Fibronektin beschichteten T25-Kolben (Schritt 2) mit5 ml Nährmedium geben.
- Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 %CO2 für 24 h inkubiert. Entfernen Sie anschließend das Medium, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
- Pflegen Sie die Kultur, indem Sie alle zwei Tage 50 % des Mediums austauschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- bis dreimal.
6. Auswahl der Magnetzellen
HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, halten Sie die Zellkälte aufrecht und verwenden Sie vorgekühlte Lösungen, um eine unspezifische Zellmarkierung zu verhindern.
- Vorbereitung von Instrumenten und Reagenzien: Befestigen Sie einen Magnetabscheider an einem Magnetabscheiderständer (siehe Materialtabelle). Schließen Sie eine Auswahlsäule an den Magnetabscheider an und positionieren Sie ein 70-μm-Zellsieb auf der Auswahlsäule. Platzieren Sie ein 50-ml-Röhrchen unter der Auswahlsäule, um den Durchfluss aufzufangen.
- Enzymatische Verdauung: Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, saugen Sie das Medium ab und spülen Sie die Zellen mit PBS. Fügen Sie 0,25 % Trypsin hinzu, um adhärente Zellen abzulösen, und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie den Stopppuffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.
- Antikörper-Inkubation: Resuspendierung von 1 x10 7 Gesamtzellen in 100 μl PBS und Zugabe von 10 μl LYVE-1-Antikörper (siehe Materialtabelle). Gut mischen und 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
- Drehen Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 300 x g und verwerfen Sie den Überstand. Spülen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS einführen und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vollständig.
- Markierung von Mikrokügelchen: Resuspendierung der Zellen in 100 μl PBS und Zugabe von 20 μl Mikrokügelchen (siehe Materialtabelle). Gut mischen und 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
- Schleudern Sie die Zellen 5 min lang bei 300 x g und dekantieren Sie den Überstand. Anschließend werden die Zellen mit 1 ml PBS durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min gereinigt. Zum Schluss entfernen Sie den Überstand vollständig.
- Magnetischer negativer Ausschluss: Resuspendierung der Zellen in 4 ml PBS. Führen Sie die Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb, um Klumpen zu entfernen. Bereiten Sie die Auswahlsäule (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie sie mit 3 ml PBS spülen und dann die Zellsuspension in die Auswahlsäule auftragen.
- Waschschritte mit 3 ml PBS durchführen und LYVE-1-negative Zellen in einem 50-ml-Röhrchen sammeln, das unterhalb der Auswahlsäule positioniert ist, damit sie passieren können.
- Magnetische positive Auswahl: Pipettieren Sie 6 ml PBS in die Auswahlspalte. Spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Auswahlsäule drücken, um LYVE-1-positive LLECs zu erhalten.
HINWEIS: Warten Sie immer, bis das Auswahlspaltenreservoir leer ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
7. LLEC-Kultur
- Zentrifugieren Sie die LYVE-1-positiven LLECs bei 300 x g für 5 Minuten und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.
- 1 x 10 5 Zellen procm2 in einen mit Fibronektin beschichteten T25-Kolben mit5 ml Nährmedium geben.
- Pflegen Sie die Kultur, indem Sie jeden zweiten Tag 50 % des Mediums austauschen. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, trennen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin und führen Sie die Zellpassage durch. Verwenden Sie die Zellen nach 2-3 Durchgängen für nachfolgende Experimente.
8. Durchflusszytometrische Analyse
HINWEIS: Die durchflusszytometrische Analyse wurde nach dem zuvor beschriebenen Verfahren15 durchgeführt.
- Fügen Sie 0,25 % Trypsin hinzu, um adhärente Zellen abzulösen, und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten. Fügen Sie dann den Stopppuffer hinzu, um die Verdauung zu stoppen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min und saugen Sie den Überstand vollständig ab. Resuspendieren Sie 1 x 106 Zellen in 100 μl PBS.
- Fügen Sie 1 μl LYVE-1-Antikörper hinzu. Gründlich mischen und 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einer geeigneten Menge PBS-Puffer für die Analyse mit Durchflusszytometrie und FlowJo-Software (siehe Materialtabelle).
9. Immunfluoreszenz-Färbung
HINWEIS: Die Immunfluoreszenzfärbung wurde nach dem zuvor beschriebenen Verfahrendurchgeführt 16.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das PFA und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
- Wenden Sie den Blockpuffer 1 h bei Raumtemperatur an. Entfernen Sie den Blockpuffer aus den Deckgläsern.
- Geben Sie den LYVE-1-Antikörper im Färbepuffer zu den Zellen und inkubieren Sie im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
- Geben Sie einen geeigneten Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) in den Färbepuffer zu den Zellen und inkubieren Sie im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
- Gegenfärbung mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Die Zellen sind nun bereit für die Immunfluoreszenzmikroskopie.
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Representative Results
In dieser Studie wird ein reproduzierbares, mehrstufiges Protokoll für die Entnahme von lymphatischen Endothelzellen (LLECs) aus Mäusen und die anschließende Etablierung ihrer Primärkultur in vitro vorgestellt. Zu den wichtigsten Schritten gehören die Kolbenvorbereitung und die Fibronektin-Beschichtung, die Dissoziation von Leptomeningen, die Gewinnung einer Einzelzellsuspension durch enzymatischen Aufschluss und die Induktion der LLEC-Expansion mit VEGF-C. LYVE-1-positive LLECs werden dann selektiv mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) isoliert. Abschließend werden Immunfluoreszenzfärbungen und durchflusszytometrische Analysen durchgeführt, um die Reinheit der LLECs zu beurteilen, wobei die MTT-Assay-Ergebnisse robuste Wachstumsraten der LLECs zeigen (ergänzende Abbildung 1). Die wichtigsten Schritte dieses multiprozeduralen Protokolls sind im Flussdiagramm dargestellt, wobei der gesamte Prozess etwa 2-3 Wochen dauert (Abbildung 1).
Um LLECs zu gewinnen, ist es wichtig, Leptomeninge zu dissoziieren und die Expansion von LLECs zu fördern, während die Zelllebensfähigkeit durch effiziente chirurgische Techniken und die Aufrechterhaltung einer kalten Umgebung erhalten bleibt (Abbildung 2A-E). Nach der Entnahme des gesamten Gehirns zusammen mit den Leptomeningen unter sterilen Bedingungen wird ein sanfter Waschschritt durchgeführt, um die roten Blutkörperchen zu entfernen (Abbildung 2F). Anschließend werden Leptomeninge vorsichtig unter dem Mikroskop aus der Gehirnoberfläche extrahiert (Abbildung 2G). Diese Leptomeninge bestehen hauptsächlich aus Kollagenfasern und werden daher fragmentiert, um die enzymatische Verdauung zu beschleunigen (Abbildung 2H). Anschließend wird ein enzymatischer Verdau dieser Fragmente durchgeführt, und alle verbleibenden Klumpen werden durch ein 70-μm-Sieb filtriert, um größere Cluster von Kollagenfasern zu eliminieren (Abbildung 2I). Schließlich werden die Zellen in einem mit Fibronektin beschichteten T25-Kolben plattiert, und VEGF-C wird hinzugefügt, um die Expansion zu induzieren (Abbildung 2J). Nach 24 h wird das Nährmedium entfernt, um nicht anhaftende Zellen zu eliminieren. Diese Schritte erleichtern die Gewinnung von Zellen aus Leptomeningen und fördern die Expansion, was entscheidend ist, um später im Prozess genügend LYVE-1-positive LLECs zu erhalten.
Während VEGF-C die LLEC-Expansion induziert, können heterogene zelluläre Populationen immer noch zusammenwachsen. Zur Isolierung reiner LYVE-1-positiver LLECs wird MACS eingesetzt, da LYVE-1 ein anerkannter Marker für lymphatische Endothelzellen ist. Die Reinheit von LLECs wird durch Durchflusszytometrie bewertet, wobei die Ergebnisse darauf hindeuten, dass sich der Prozentsatz der LYVE-1-positiven Zellen in Passage 2 nicht signifikant von Passage 3 nach MACS unterscheidet und eine Reinheit von mehr als 95 % aufweist (Abbildung 3A). Um die Spezifität von LYVE-1-positiven LLECs weiter zu validieren, wurden drei zusätzliche lymphatische Endothelzellmarker – Podoplanin (PDPN), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor-3 (VEGFR-3) und Prospero-verwandte Homöobox1 (PROX1) – zur Identifizierung verwendet17,18,19. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte, dass LYVE-1 mit diesen drei Markern kofärbte (Abbildung 3B). Darüber hinaus wurde die Identität von LLECs in Gehirnschnitten unter physiologischen Bedingungen festgestellt, was eine Ko-Färbung von LYVE-1 mit PROX1, VEGFR-3 und PDPN zeigt (Ergänzende Abbildung 2A). LYVE-1-positive Zellen exprimierten weder F4/80 noch Platelet-Derived Growth Factor beta (PDGFR-β), wodurch LLECs effektiv von Makrophagen und Fibroblasten unterschieden wurden (ergänzende Abbildung 2B). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Gewinnung von hochreinen LLECs ermöglicht, die in vitro kultiviert werden können.
Leptomeningeale Zellen vor dem MACS weisen eine Heterogenität auf, die sich von den Kolonien lymphatischer Endothelzellen unterscheidet. Ihre Morphologie reicht von einzelnen runden Kugeln bis hin zu verschmolzenen Faserformen (Abbildung 4A-D). Nach MACS weisen LLECs jedoch typische spindel- und kopfsteinpflasterförmige endothelartige Merkmale auf (Abbildung 4E-H). Basierend auf diesen Ergebnissen werden LLECs durch dieses multiprozedurale Protokoll effektiv geerntet und in einem gesunden Wachstumszustand gehalten.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Multi-Prozedur-Protokolls. Dieses Flussdiagramm veranschaulicht das multiprozedurale Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gewinnung von Leptomening-Zellen . (A) Herstellung steriler chirurgischer Instrumente. (B) Mäuse wurden durch Inhalation von 4% Isofluran betäubt und anschließend nach der Euthanasie mit 70% Ethanol gereinigt. (C) Enthauptung der Mäuse und vorsichtiger Mittellinienschnitt der Haut, beginnend von der Rückseite des Schädels in Richtung des vorderen Bereichs. (D) Behutsame Entfernung des Schädels, um die Unversehrtheit der Leptomeninge zu erhalten. (E) Entnahme des gesamten Gehirns, das die Leptomeninge enthält. (F) Waschen des gesamten Gehirns in einer Pufferlösung mit sanfter Spülung, um oberflächliches Blut zu entfernen. (G) Dissektion von Leptomeningen von der Gehirnoberfläche mit einer Feinspitzpinzette. (H) Schneiden von Leptomeningen in Fragmente mit einer sterilen Mikroschere, gefolgt von der Zugabe von 10 ml Enzymmischung und Inkubation bei 37 °C für 15 Minuten. (I) Resuspension des Pellets in 10 ml PBS und Filtration der Klumpen durch ein 70-μm-Sieb. (J) Beschichtung der Zellen in einen beschichteten T25-Kolben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bewertung der LLEC-Reinheit nach MACS. (A) Repräsentative Histogramme aus durchflusszytometrischen Analysen, die die Expression von LYVE-1-positiven Zellen in den Passagen 2 und 3 nach MACS zeigen. Der Anteil der LYVE-1-positiven Zellen liegt nach MACS bei über 95%. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente (Mean ± SEM). (B) Repräsentatives Immunfluoreszenzbild, das die Co-Färbung von LYVE-1 mit PDPN, VEGFR-3 und PROX1 zeigt. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Wachstumscharakteristika von Leptomeningealzellen und LLECs. (A) Morphologie von Leptomeningealzellen in repräsentativen Bildern. Maßstabsbalken = 50 μm. (B-D) Repräsentative Bilder, die die Morphologie von Leptomeningealzellen an Tag 1, Tag 2 und Tag 3 vor MACS darstellen. Maßstabsbalken = 100 μm. (E) Morphologie von LLECs, aufgenommen in repräsentativen Bildern. Maßstabsbalken = 50 μm. (F-H) Repräsentative Bilder, die die Morphologie von LLECs an Tag 1, Tag 2 und Tag 3 nach MACS veranschaulichen. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Wachstumsrate von LLECs und SVEC4-10. Die Ergebnisse des MTT-Assays zeigen eine signifikante Abnahme der Wachstumsrate der LLECs in Passage 1 im Vergleich zur SVEC4-10-Gruppe. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den LLEC-Gruppen der Passage 2 und der Passage 3 im Vergleich zur SVEC4-10-Gruppe. Die Daten stellen die Ergebnisse von sechs unabhängigen Experimenten dar (Mittelwert ± SEM). Fehlerbalken zeigen SEM an. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Charakterisierung und Unterscheidung von LLECs in Hirnschnitten. (A) Repräsentatives Immunfluoreszenzbild, das die Co-Färbung von LYVE-1 mit PROX1, VEGFR-3 und PDPN in Gehirnschnitten unter physiologischen Bedingungen zeigt. Maßstabsbalken = 2 μm. (B) Repräsentatives Immunfluoreszenzbild, das zeigt, dass LYVE-1 unter physiologischen Bedingungen nicht mit F4/80 und PDGFR-β in Gehirnschnitten kofärbt. Maßstäbe = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Wachstum von LLECs unter VEGF-C-Stimulation. (A) Repräsentative Bilder von LLECs unter 1 ng/ml VEGF-C-Stimulation. (B) Repräsentative Bilder von LLECs unter 100 ng/ml VEGF-C-Stimulation. (C) Repräsentative Bilder von LLECs unter 500 ng/ml VEGF-C-Stimulation. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Expression von CD31, PDPN und VEGFR-3 nach der Ernte. (A) Repräsentative Histogramme aus durchflusszytometrischen Analysen zeigen, dass CD31-positive Zellen weniger als 5% ausmachen. (B) Repräsentative Histogramme aus durchflusszytometrischen Analysen zeigen, dass PDPN-positive Zellen über 95 % liegen. (C) Repräsentative Histogramme aus durchflusszytometrischen Analysen zeigen, dass VEGFR-3-positive Zellen über 95 % liegen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 5: Morphologie der LLECs und Abgrenzung zu CD31. (A) Repräsentative Bilder der LLEC-Morphologie, die durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung enthüllt wurden. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder zeigen, dass LYVE-1 und PDPN nicht mit CD31 kofärben. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 6: Proliferationsrate von LLECs. Repräsentative Ergebnisse des CCK-8-Assays zeigen eine signifikante Abnahme der Proliferationsrate von LLECs in Passage 1 und Passage 6 im Vergleich zu Passage 2 bzw. 5. Die Daten stellen die Ergebnisse von sechs unabhängigen Experimenten dar (Mittelwert ± SEM). Fehlerbalken zeigen SEM an. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Über das bestehende Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro wurde bisher nicht berichtet. In dieser Studie wird ein reproduzierbares, multiprozedurales Protokoll für die Gewinnung und Kultivierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus vorgestellt.
Obwohl dieses multiprozedurale Protokoll reproduzierbar ist, gibt es mehrere wichtige Überlegungen. Zum Beispiel fördern Fibronektin-beschichtete T25-Kolben die Adhäsion von LLECs und ihre Funktion, indem sie nicht adhärente Zellen eliminieren und so eine homogenere Zellpopulation gewährleisten. Darüber hinaus sind die Zeitdauer und die Temperatur während chirurgischer Eingriffe zur Dissoziation von Leptomeningen entscheidende Faktoren, die die Zelllebensfähigkeit beeinflussen. Daher ist es wichtig, eine Zeitdauer innerhalb von 1 h einzuhalten und den Puffer ausreichend kalt zu halten. Ein weiterer kritischer Punkt betrifft das Vorhandensein von roten Blutkörperchen in den Leptomeningen, von denen die Freisetzung von Hämoglobin LLECs schädigen kann. Um dies zu mildern, ist es wichtig, sanft zu spülen und zu waschen, um rote Blutkörperchen zu entfernen und ihre zytotoxische Wirkung zu verhindern. Schließlich erfordern LLECs eine Stimulation mit VEGF-C20, insbesondere bei einer Konzentration von 100 ng/ml. Unter dieser Stimulation weisen LLECs eine charakteristische endotheliale Morphologie auf, anstatt Röhrchen zu bilden (Ergänzende Abbildung 3A-C). Folglich wurde in dieser Studie ein Nährmedium mit 100 ng/ml VEGF-C verwendet, um die Expansion zu induzieren und die Homogenität in zellulären Populationen aufrechtzuerhalten.
Das hier beschriebene Protokoll mit mehreren Verfahren enthält Schritte zur Fehlerbehebung und einige Einschränkungen. Erstens dauert dieses Protokoll 2-3 Wochen, was es für häufige Wiederholungen unpraktisch macht. Zweitens können chirurgische und enzymatische Eingriffe dazu führen, dass tote Zellen vorhanden sind, die vor der Beschichtung nicht eliminiert werden, was die Zellkultur beeinträchtigen kann. Diese Möglichkeit wird in zukünftigen Protokollimplementierungen untersucht. Drittens: Während die Reinheit der geernteten LLECs (VEGFR-3- und PDPN-positive Zellen) 95 % übersteigt, bleiben einige heterogene Zellpopulationen bestehen, einschließlich CD31-positiver Zellen, die weniger als 5 % ausmachen (Ergänzende Abbildung 4A-C). Dies ist eine häufige Herausforderung bei der Kultivierung von Primärzellen. Hochauflösende Bilder aus der Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigen, dass LLECs charakteristische endotheliale Formen aufweisen, aber CD31 nicht exprimieren (Ergänzende Abbildung 5A,B). Schließlich deuten die CCK-8-Assay-Ergebnisse auf eine signifikante Abnahme der Proliferationsrate bei LLECs in Passage 1 und 6 im Vergleich zu Passage 2 bzw. 5 hin (Ergänzende Abbildung 6). Passage 1 kann aufgrund der Antikörperbehandlung und der körperlichen Belastung während der Sortierung zu einer Schädigung der LLECs führen, während Passage 6 mit zunehmender Anzahl der Passagen eine reduzierte Proliferation aufweist. Daher sind nachfolgende Zellen nach Passage 6 für entsprechende Experimente ungeeignet. Aufgrund der Verteilung der Fibroblasten in den Hirnhäuten21 können etwa 5 % der kontaminierten Zellen Fibroblasten enthalten. Um dies zu beheben, kann die Zugabe von Genetikin und immunmagnetischer Zellsortierung verwendet werden, um kontaminierte Fibroblasten zu entfernen22,23. Die Überwachung der Kontaminationsrate von Fibroblasten in jeder Passage von LLECs wird dazu beitragen, den Einfluss von Fibroblasten auf das Wachstum von LLECs zu eliminieren24. In Anbetracht der Heterogenität zwischen Mäusen und Menschen sollte die Ernte und Kultivierung von primären humanen LLECs für mögliche klinische Anwendungen in der zukünftigen Forschung verfolgt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es derzeit kein etabliertes Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro gibt. In dieser Studie wird ein reproduzierbares, multiprozedurales Protokoll für die Gewinnung von LLECs aus Leptomeninges von Mäusen und die anschließende Etablierung ihrer Primärkultur in vitro vorgestellt. Diese Arbeit wird die weitere Erforschung zellulärer Funktionen und potenzieller klinischer Anwendungen für LLECs erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt offenlegen müssen.
Acknowledgments
Die Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), der Natural Science Foundation of Yunnan Province (202001AS070045, 202301AY070001-011) und der Scientific Research Foundation des Bildungsministeriums der Provinz Yunnan (2023Y0784) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
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