Summary
תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs), סוג תא תוך גולגולתי שזוהה לאחרונה, הם בעלי תפקידים לא מובנים. מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לקצירת LLECs מעכברים וביסוס תרביות ראשוניות במבחנה . פרוטוקול זה נועד לאפשר לחוקרים להתעמק בתפקודים התאיים ובהשלכות הקליניות האפשריות של LLECs.
Abstract
תאי אנדותל לימפטיים לפטומנינגיאליים (LLECs) הם אוכלוסיית תאים תוך-גולגולתיים שהתגלתה לאחרונה עם תפוצה ייחודית הנבדלת בבירור מתאי אנדותל לימפטיים היקפיים. תפקודם התאי והשלכותיהם הקליניות עדיין אינם ידועים במידה רבה. כתוצאה מכך, הזמינות של אספקת LLECs חיונית לביצוע מחקר פונקציונלי במבחנה. עם זאת, אין כיום פרוטוקול קיים לקציר וגידול LLECs במבחנה.
מחקר זה אסף בהצלחה LLECs באמצעות פרוטוקול רב-שלבי, שכלל ציפוי הבקבוק בפיברונקטין (FIBRONECTIN), ניתוח הלפטומנינגים בעזרת מיקרוסקופ, עיכול אנזימטי של הלפטומנינגים כדי להכין תרחיף חד-תאי, גרימת התרחבות של LLECs עם גורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C), ובחירת תאים חיוביים קולטן היאלורוני של כלי הלימפה -1 (LYVE-1) באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS). תהליך זה הוביל בסופו של דבר לכינונה של תרבות ראשונית. טוהר ה- LLECs אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח ציטומטרי זרימה, עם רמת טוהר העולה על 95%. פרוטוקול רב-שלבי זה הוכיח יכולת שחזור והיתכנות, אשר יקלו מאוד על חקר התפקוד התאי וההשלכות הקליניות של LLECs.
Introduction
תאי אנדותל לימפה לפטומנינגיאליים שהתגלו לאחרונה (LLECs) יוצרים רשת של תאים בודדים בתוך הלפטומנינגים, ומציגים דפוס התפלגות מובהק בהשוואה לתאי אנדותל לימפטיים היקפיים 1,2. התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות הקשורות ל-LLECs נותרו במידה רבה טריטוריה לא ממופת. על מנת לסלול את הדרך למחקר פונקציונלי על LLECs, הכרחי להקים מודל in vitro עבור המחקר שלהם. לכן, מחקר זה פיתח פרוטוקול מקיף לבידוד ותרבות ראשונית של LLECs.
עכברים הם המודל המועדף על בעלי חיים בשל התאמתם למניפולציה גנטית בחקר מחלות. מחקרים קודמים בודדו בהצלחה תאי אנדותל לימפטיים מרקמות עכבר שונות, כולל בלוטות לימפה3, רקמה מזנטרית4, רקמת עור5, איסוף לימפה6 ורקמת ריאה7. הליכי בידוד אלה הסתמכו בעיקר על טכניקות כגון מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) ומיון ציטומטריית זרימה 8,9,10. בנוסף, מאמצי המחקר הובילו להקמת קווי תאים ארכנואידים של חולדות וקווי תאי נימים לימפטיים של חולדות11,12. למרות קיומן של טכניקות תרבית צמחים עבור לפטומנינגה13, קיים צורך דחוף בפרוטוקול סטנדרטי לבידוד ותרבית של LLECs. כתוצאה מכך, מחקר זה הצליח לקצור ולתרבת LLECs על ידי ניתוק קפדני של לפטומנינגים בהנחיית מיקרוסקופ וקידום הרחבת LLECs באמצעות שימוש בגורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C). הסמן הייחודי לתאי אנדותל לימפטיים הוא קולטן היאלורוני של כלי הלימפה-1 (LYVE-1)14. פרוטוקול רב-שלבי זה מבודד באופן סלקטיבי LLECs חיוביים ל-LYVE-1 באמצעות MACS ולאחר מכן מוודא את טוהרם באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית.
ניתן לסכם את השלבים העיקריים של פרוטוקול רב-שלבי זה באופן הבא: ציפוי בקבוקים, דיסוציאציה של לפטומנינגים, עיכול אנזימטי של לפטומנינגים, התפשטות תאים, בחירת תאים מגנטיים ותרבית עוקבת של LLECs. לבסוף, טוהר ה- LLECs המבודדים מאושר באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית. מטרת העל של מחקר זה היא להציג פרוטוקול רב-שלבי הניתן לשחזור לבידוד LLECs מלפטומינינגים של עכברים ומתרבית המבחנה שבאה בעקבותיהם. פרוטוקול זה צפוי להקל מאוד על חקירת התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות של LLECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה קיבל אישור מוועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית של קונמינג (kmmu20220945). כל הניסויים עמדו בהנחיות שנקבעו לטיפול בבעלי חיים. תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs) נלקחו מעכברים זכרים C57Bl/6J בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל בין 20-25 גרם. עכברים אלה נרכשו מהאוניברסיטה הרפואית של קונמינג בקונמינג, סין. ההליך הניסיוני כולו נערך בתנאים סטריליים קפדניים. כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
1. הכנת ריאגנטים ומכשירים
הערה: כל השלבים הכוללים פתרונות חייבים להתבצע בתוך ארון סיכונים ביולוגיים סוג II.
- הכינו את מאגר הכביסה על ידי ערבוב מלח חוצץ פוספט (PBS) עם סידן ומגנזיום, 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (ראו טבלת חומרים). שמור על חיץ זה קר ב 4 °C. חשוב להכין אותו טרי ביום השימוש ולנטרל את החיץ.
- הכינו את אנזימי העיכול על ידי שילוב של 10 מ"ל PBS (ללא סידן ומגנזיום) עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין, 1 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל פפאין, ו-200 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז I (ראו טבלת חומרים).
הערה: הקפד להשתמש ב- aliquots של אמצעי אחסון מתאימים כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. אחסן aliquots אלה ב -20 °C. - הכינו את מדיום התרבית על ידי שימוש בערכת מדיום גידול תאי אנדותל הזמינה מסחרית, הכוללת VEGF-C (100 ננוגרם/מ"ל) ו-1% P/S (ראו טבלת חומרים).
- הכינו את מאגר העצירה על ידי השלמת מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) עם 10% FBS כדי לעצור את תהליך העיכול.
- הכינו כלי ניתוח סטריליים: מכשירים אלה צריכים לכלול מספריים, פינצטה משוננת ופינצטה עדינה.
2. ציפוי בקבוקון
- מצפים את בקבוק T25 בתמיסת פיברונקטין 100 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת חומרים) ודגרים למשך הלילה ב-37°C. לפני השימוש יש להסיר את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה.
- שטפו את הבקבוק שלוש פעמים עם PBS, לאחר מכן שאפו את PBS, ואפשרו לבקבוק T25 להתייבש באוויר.
3. דיסוציאציה Leptomeninges
הערה: השתמש תמיד במאגרים ותמיסות מקוררים מראש בטמפרטורה של 4°C.
- מרדימים את העכברים בשאיפה עודפת של 4% איזופלורן ולאחר מכן מקריבים אותם על ידי עריפת ראש מהירה באמצעות מספריים שנוקו בעבר עם 70% אתנול.
- יש לחתוך בזהירות את העור לאורך קו האמצע, החל מהפתח בחלק האחורי של הגולגולת ועד לאזור הקדמי.
- הסר בעדינות את הגולגולת, הרים אותה בעדינות עם המספריים כדי למנוע נזק leptomeninges, להבטיח את המוח כולו, כולל leptomeninges, מתקבל.
- השקיעו את כל המוח במאגר כביסה ושטפו אותו בעדינות כדי להסיר דם משטח.
- מעבירים את המוח לצלחת פטרי סטרילית ללא קיצוץ, ומחלצים את הלפטומנינגים מפני השטח של המוח באמצעות פינצטה עדינה תחת מיקרוסקופ.
- חותכים את רקמת הלפטומנינגס לשברים באמצעות מיקרו-מספריים סטריליים.
4. Leptomeninges עיכול אנזימטי
- מוסיפים 10 מ"ל של תערובת האנזימים (שלב 1.2) למקטעים ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות. יש להתסיס בעדינות כדי להבטיח שהשברים יתנתקו מתחתית הצינור. לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של חיץ עצירה (שלב 1.4) כדי לעצור את העיכול.
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה.
- מוסיפים 10 מ"ל PBS קר, ומעבירים את התערובת דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי של 50 מ"ל כדי לסנן את כל הגושים.
5. הרחבת תאים
- צלחת 1 x 10 5 תאים לס"מ 2 לתוך בקבוק T25 מצופה פיברונקטין (שלב2) עם5 מ"ל של מדיום תרבית.
- לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות. לאחר מכן, הסר את המדיום כדי לחסל תאים שאינם מחוברים.
- לשמור על התרבות על ידי החלפת 50% של המדיום כל יומיים. חזור על תהליך זה פעמיים או שלוש.
6. בחירת תאים מגנטיים
הערה: עבוד במהירות, שמור על קור התאים והשתמש בתמיסות מקוררות מראש כדי למנוע תיוג תאים לא ספציפי.
- הכנת מכשירים וריאגנטים: מחברים מפריד מגנטי למעמד מפריד מגנטי (ראה טבלת חומרים). חבר עמודת בחירה למפריד המגנטי ומקם מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר על גבי עמודת הבחירה. מקם צינור של 50 מ"ל מתחת לעמודת הבחירה כדי לאסוף את הזרימה.
- עיכול אנזימטי: ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%, שואפים את התווך ושוטפים את התאים עם PBS. הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק תאים דבקים ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. עצור את העיכול על ידי הוספת מאגר העצירה. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.
- דגירה של נוגדנים: להשהות מחדש 1 x 107 תאים סה"כ ב 100 μL של PBS ולהוסיף 10 μL של נוגדן LYVE-1 (ראה טבלה של חומרים). מערבבים היטב ודגרים במשך 30 דקות בחושך ב-18 מעלות.
- סובבו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. שטוף את התאים על ידי החדרת 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר לחלוטין את הסופרנטנט.
- תיוג מיקרו-כדוריות: יש להשהות מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBS ולהוסיף 20 מיקרו-כדוריות (ראו טבלת חומרים). מערבבים היטב ודגרים במשך 30 דקות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס.
- סובבו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ו decant את supernatant. לאחר מכן, לנקות את התאים עם 1 מ"ל של PBS באמצעות צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. לבסוף, להסיר לחלוטין את supernatant.
- הרחקה שלילית מגנטית: להשעות מחדש את התאים ב 4 מ"ל של PBS. העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לסלק גושים. הכינו את עמודת הבחירה (ראו טבלת חומרים) על-ידי שטיפתה ב-3 מ"ל PBS, ולאחר מכן החילו את תרחיף התא בעמודת הבחירה.
- בצעו שלבי שטיפה עם 3 מ"ל PBS ואספו תאים שליליים מסוג LYVE-1 לתוך צינור של 50 מ"ל הממוקם מתחת לעמודת הבחירה כדי לאפשר להם לעבור.
- בחירה חיובית מגנטית: פיפטה 6 מ"ל של PBS לתוך עמודת הבחירה. שטוף באופן מיידי את התאים המסומנים מגנטית על-ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך עמודת הבחירה כדי לקבל LLECs חיוביים ל-LYVE-1.
הערה: המתן תמיד עד שמאגר עמודת הבחירה יתרוקן לפני שתמשיך לשלב הבא.
7. תרבות LLECs
- צנטריפוגו את ה-LLECs החיוביים ל-LYVE-1 ב-300 x גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הסופר-נטנט.
- צלחת 1 x 10 5 תאים לס"מ2 לתוך בקבוק T25 מצופה פיברונקטין עם5 מ"ל של מדיום תרבית.
- לשמור על התרבות על ידי החלפת 50% של המדיום כל יומיים. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, מנתקים את התאים עם 0.25% טריפסין ומבצעים מעבר תאים. נצלו את התאים לניסויים הבאים לאחר 2-3 מעברים.
8. ניתוח ציטומטרי זרימה
הערה: הניתוח הציטומטרי של Flow נערך בעקבות הליך15 שתואר קודם לכן.
- הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק תאים דבקים ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף את מאגר העצירה כדי לעצור את העיכול.
- צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות לחלוטין לשאוף את supernatant. השהה מחדש 1 x 106 תאים ב 100 μL של PBS.
- הוסף 1 μL של נוגדן LYVE-1. מערבבים היטב ודגרים במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
- השהה מחדש את התאים בכמות מתאימה של מאגר PBS לצורך ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה ותוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים).
9. צביעה אימונופלואורסצנטית
הערה: הצביעה האימונופלואורסצנטית בוצעה בעקבות ההליך שתואר קודם לכן16.
- לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את ה-PFA ושטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים.
- החל את מאגר הבלוקים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הסר את מאגר הבלוקים מהכיסויים.
- מוסיפים את נוגדן LYVE-1 במאגר הצביעה לתאים ודגרים בחושך. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.
- מוסיפים נוגדן משני מתאים (ראו טבלת חומרים) בחיץ הצביעה לתאים ודגרים בחושך. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.
- כתם נגדי עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). התאים מוכנים כעת למיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מחקר זה מציג פרוטוקול רב-שלבי הניתן לשחזור לקצירת תאי אנדותל לימפטיים (LLECs) מעכברים ולאחר מכן לביסוס התרבית הראשונית שלהם במבחנה. שלבי המפתח כוללים הכנת בקבוקים וציפוי פיברונקטין (fibronectin), דיסוציאציה של לפטומנינגים, השגת תרחיף חד-תאי באמצעות עיכול אנזימטי, וגרימת הרחבת LLECs עם VEGF-C. לאחר מכן, LLECs חיוביים מסוג LYVE-1 מבודדים באופן סלקטיבי באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית (MACS). לבסוף, צביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח ציטומטרי של זרימה מבוצעים כדי להעריך את טוהר LLECs, כאשר תוצאות בדיקת MTT מדגימות שיעורי צמיחה חזקים של LLECs (איור משלים 1). השלבים העיקריים של פרוטוקול רב-פרוצדורלי זה מתוארים בתרשים הזרימה, כאשר התהליך כולו אורך כ-2-3 שבועות (איור 1).
כדי לקצור LLECs, חיוני לנתק לפטומנינים ולקדם התרחבות LLECs תוך שמירה על כדאיות התא באמצעות טכניקות כירורגיות יעילות ושמירה על סביבה קרה (איור 2A-E). לאחר קבלת המוח כולו יחד עם הלפטומנינגים בתנאים סטריליים, מתבצע שלב שטיפה עדין כדי להסיר תאים אדומים בדם (איור 2F). לאחר מכן, לפטומינינגים מופקים בזהירות מפני השטח של המוח תחת מיקרוסקופ (איור 2G). הלפטומינינגים האלה מורכבים בעיקר מסיבי קולגן, כך שהם מפוצלים כדי לזרז עיכול אנזימטי (איור 2H). לאחר מכן, מתבצע עיכול אנזימטי של המקטעים האלה, וכל הגושים שנותרו מסוננים דרך מסננת של 70 מיקרומטר כדי לסלק אשכולות גדולים יותר של סיבי קולגן (איור 2I). לבסוף, תאים מצופים בצלוחית T25 מצופה פיברונקטין ומוסיפים VEGF-C כדי לגרום להתרחבות (איור 2J). לאחר 24 שעות, מדיום התרבית מוסר כדי לחסל תאים שאינם מחוברים. צעדים אלה מקלים על קצירת תאים מלפטומינינגים ומקדמים התרחבות, שהיא קריטית להשגת LLECs חיוביים מספיקים ל-LYVE-1 בהמשך התהליך.
בעוד VEGF-C גורם להתרחבות LELEC, אוכלוסיות תאים הטרוגניות עדיין יכולות לגדול יחד. כדי לבודד LLECs חיוביים טהורים של LYVE-1, MACS משמש מכיוון ש- LYVE-1 הוא סמן מוכר עבור תאי אנדותל לימפה. טוהר ה-LLECs מוערך באמצעות ציטומטריית זרימה, כאשר התוצאות מצביעות על כך שאחוז התאים החיוביים ל-LYVE-1 במעבר 2 אינו שונה באופן משמעותי ממעבר 3 לאחר MACS, מה שמדגים טוהר גדול מ-95% (איור 3A). כדי לאמת עוד יותר את הספציפיות של LLECs חיוביים ל-LYVE-1, שלושה סמנים נוספים של תאי אנדותל לימפה-פודופלנין (PDPN), קולטן גורם גדילה אנדותל כלי דם-3 (VEGFR-3) והומיאובוקס הקשור לפרוספרו1 (PROX1) שימשו לזיהוי17,18,19. צביעה אימונופלואורסצנטית אישרה כי LYVE-1 מוכתם יחד עם שלושת הסמנים האלה (איור 3B). יתר על כן, הזהות של LLECs נקבעה בפרוסות מוח בתנאים פיזיולוגיים, והראתה צביעה משותפת של LYVE-1 עם PROX1, VEGFR-3 ו-PDPN (איור משלים 2A). תאים חיוביים ל-LYVE-1 לא ביטאו F4/80 ובטא של גורם גדילה הנגזר מטסיות דם (PDGFR-β), מה שהבדיל ביעילות בין LLECs לבין מקרופאגים ופיברובלסטים (איור משלים 2B). לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר קציר של LLECs טהורים ביותר המסוגלים לתרבית חוץ גופית.
תאים Leptomeningeal לפני MACS להציג הטרוגניות, שונה מן המושבות של תאי אנדותל הלימפה. המורפולוגיה שלהם נעה בין כדורים עגולים בודדים לצורות סיבים מאוחים (איור 4A-D). אולם לאחר MACS, LLECs מציגים ציר טיפוסי ומאפיינים דמויי אנדותל בצורת אבן מרוצפת (איור 4E-H). בהתבסס על תוצאות אלה, LLECs נקצרים ביעילות באמצעות פרוטוקול רב-פרוצדורלי זה ונשמרים במצב צמיחה בריא.
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול הרב-פרוצדורלי. תרשים זרימה זה ממחיש את הפרוטוקול הרב-פרוצדורלי לקציר ולתרבות של LLECs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קצירת תאי לפטומנינגס . (A) הכנת כלי ניתוח סטריליים. (B) עכברים הורדמו באמצעות שאיפה של 4% איזופלורן ולאחר מכן נוקו עם 70% אתנול לאחר המתת חסד. (C) עריפת ראש של העכברים וחתך זהיר בקו האמצע של העור, החל מהחלק האחורי של הגולגולת לכיוון האזור הקדמי. (D) הסרה עדינה של הגולגולת כדי לשמור על שלמות הלפטומנינגים. (E) שליפה של כל המוח המכיל את הלפטומנינגים. (F) שטיפת המוח כולו בתמיסת חיץ עם שטיפה עדינה לסילוק דם פני השטח. (G) דיסקציה של לפטומינינגים מפני השטח של המוח באמצעות פינצטה עדינה. (H) חיתוך של לפטומנינים לשברים עם מיקרו-מספריים סטריליים, ואחריו תוספת של 10 מ"ל תערובת אנזימים ודגירת 37°C למשך 15 דקות. (I) השעיה של הגלולה ב-10 מ"ל PBS וסינון גושים דרך מסננת של 70 מיקרומטר. (J) ציפוי התאים לצלוחית T25 מצופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכת טוהר LLEC לאחר MACS. (A) היסטוגרמות מייצגות מאנליזה ציטומטרית של זרימה המדגימות את הביטוי של תאים חיוביים LYVE-1 במעברים 2 ו-3 לאחר MACS. אחוז התאים החיוביים ל-LYVE-1 עולה על 95% לאחר MACS. הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים (Mean ± SEM). קווי שגיאה מציינים SEM. (B) תמונה אימונופלואורסצנטית מייצגת המציגה צביעה משותפת של LYVE-1 עם PDPN, VEGFR-3 ו-PROX1. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מאפייני גדילה של תאים לפטומנינגיאליים ותאי LLEC. (A) מורפולוגיה של תאים לפטומנינגיאליים שנלכדו בתמונות מייצגות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B-D) תמונות מייצגות המתארות את המורפולוגיה של תאי לפטומנינגה ביום 1, יום 2 ויום 3 לפני MACS. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) מורפולוגיה של LLECs שנלכדו בתמונות מייצגות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (F-H) תמונות מייצגות הממחישות את המורפולוגיה של LLECs ביום 1, יום 2 ויום 3 לאחר MACS. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים משלים 1: קצב הצמיחה של LLECs ו-SVEC4-10. תוצאות בדיקת MTT מראות ירידה משמעותית בקצב הצמיחה של LLECs במעבר 1 בהשוואה לקבוצת SVEC4-10. לא היו הבדלים משמעותיים בין קבוצות LLECs מעבר 2 ומעבר 3 בהשוואה לקבוצת SVEC4-10. הנתונים מייצגים תוצאות של שישה ניסויים עצמאיים (Mean ± SEM). קווי שגיאה מציינים SEM. לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 2: אפיון והבחנה של LLECs בפרוסות מוח. (A) תמונה אימונופלואורסצנטית מייצגת המדגימה צביעה משותפת של LYVE-1 עם PROX1, VEGFR-3 ו-PDPN בפרוסות מוח בתנאים פיזיולוגיים. פסי קנה מידה = 2 מיקרומטר. (B) תמונה אימונופלואורסצנטית מייצגת המדגימה כי LYVE-1 אינו מוכתם יחד עם F4/80 ו-PDGFR-β בפרוסות מוח בתנאים פיזיולוגיים. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
תרשים משלים 3: צמיחה של LLECs תחת גירוי VEGF-C. (A) תמונות מייצגות של LLECs תחת גירוי VEGF-C של 1 ננוגרם/מ"ל. (B) תמונות מייצגות של LLECs מתחת לגירוי VEGF-C של 100 ננוגרם/מ"ל. (C) תמונות מייצגות של LLECs מתחת לגירוי VEGF-C של 500 ננוגרם/מ"ל. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
איור משלים 4: ביטוי של CD31, PDPN ו-VEGFR-3 לאחר הקציר. (A) היסטוגרמות מייצגות מניתוח ציטומטרי זרימה מראות כי תאים חיוביים ל- CD31 הם פחות מ -5%. (B) היסטוגרמות מייצגות מניתוח ציטומטרי של זרימה מצביעות על כך שתאים חיוביים ל-PDPN עולים על 95%. (C) היסטוגרמות מייצגות מאנליזה ציטומטרית של זרימה מראות כי תאים חיוביים ל-VEGFR-3 עולים על 95%. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 5: מורפולוגיה של LLECs והבחנה מ-CD31. (A) תמונות מייצגות של מורפולוגיית LLECs המתגלות על ידי צביעת המטוקסילין-אאוסין. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) תמונות אימונופלואורסנטיות מייצגות ממחישות כי LYVE-1 ו- PDPN אינם מכתימים יחד עם CD31. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
תרשים משלים 6: שיעור ההתרבות של LLECs. תוצאות מייצגות מבדיקת CCK-8 מראות ירידה משמעותית בשיעור ההתפשטות של LLECs בקטע 1 ובקטע 6 בהשוואה לקטעים 2 ו-5, בהתאמה. הנתונים מייצגים תוצאות של שישה ניסויים עצמאיים (Mean ± SEM). קווי שגיאה מציינים SEM. לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הקיים לקציר וגידול LLECs במבחנה לא דווח בעבר. מחקר זה מציג פרוטוקול רב-פרוצדורלי הניתן לשחזור לקציר וגידול LLECs מלפטומינינגים של עכברים.
בעוד פרוטוקול רב-פרוצדורלי זה ניתן לשחזור, ישנם מספר שיקולים מרכזיים. לדוגמה, צלוחיות T25 מצופות פיברונקטין מקדמות הידבקות של LLECs ומתפקדות על ידי חיסול תאים שאינם דבקים, ובכך מבטיחות אוכלוסיית תאים הומוגנית יותר. בנוסף, משך הזמן והטמפרטורה במהלך הליכים כירורגיים לניתוק לפטומינינגים הם גורמים קריטיים המשפיעים על כדאיות התא. לכן, חשוב לשמור על משך זמן של שעה אחת ולשמור על החיץ קר מספיק. נקודה קריטית נוספת נוגעת לנוכחות תאי דם אדומים בלפטומנינגים, מהם שחרור המוגלובין עלול לפגוע ב- LLECs. כדי להקל על כך, חיוני לשטוף בעדינות ולשטוף כדי להסיר תאי דם אדומים, מניעת ההשפעות ציטוטוקסיות שלהם. לבסוף, LLECs דורשים גירוי עם VEGF-C20, במיוחד בריכוז של 100 ננוגרם/מ"ל. תחת הגירוי הזה, LLECs מציגים מורפולוגיה אופיינית דמוית אנדותל ולא יוצרים צינורות (איור משלים 3A-C). כתוצאה מכך, מחקר זה השתמש במדיום תרבית המכיל 100 ננוגרם/מ"ל VEGF-C כדי לגרום להתרחבות ולשמור על הומוגניות באוכלוסיות תאים.
הפרוטוקול הרב-פרוצדורלי המתואר כאן מגיע עם שלבים לפתרון בעיות וכמה מגבלות. ראשית, פרוטוקול זה לוקח 2-3 שבועות כדי להשלים, מה שהופך אותו לא מעשי עבור חזרות תכופות. שנית, הליכים כירורגיים ואנזימטיים עלולים לגרום לנוכחות של תאים מתים שאינם מסולקים לפני הציפוי, מה שעלול להשפיע על תרבית התא. אפשרות זו תיבחן ביישומי פרוטוקול עתידיים. שלישית, בעוד שהטוהר של LLECs שנקטפו (תאים חיוביים ל-VEGFR-3 ו-PDPN) עולה על 95%, חלק מאוכלוסיות התאים ההטרוגניות ממשיכות להתקיים, כולל תאים חיוביים ל-CD31, המהווים פחות מ-5% (איור משלים 4A-C). זהו אתגר נפוץ בתרבית של תאים ראשוניים. תמונות ברזולוציה גבוהה מצביעת המטוקסילין-אאוסין מראות כי LLECs מציגים צורות אופייניות דמויות אנדותל, אך אינם מבטאים CD31 (איור משלים 5A,B). לבסוף, תוצאות בדיקת CCK-8 מצביעות על ירידה משמעותית בשיעור ההתפשטות ב-LLECs במעבר 1 ו-6 בהשוואה למעבר 2 ו-5, בהתאמה (איור משלים 6). מעבר 1 עלול להוביל לנזק ל-LLECs עקב טיפול בנוגדנים והלחץ הפיזי במהלך המיון, ואילו קטע 6 מראה התפשטות מופחתת ככל שמספר המעברים גדל. לכן, התאים הבאים לאחר מעבר 6 אינם מתאימים לניסויים רלוונטיים. בהתחשב בפיזור הפיברובלסטים בקרומי המוח21, כ-5% מהתאים המזוהמים עשויים להכיל פיברובלסטים. כדי לטפל בכך, ניתן להשתמש בתוספת של גנטיקה ומיון תאים אימונומגנטי כדי להסיר פיברובלסטים מזוהמים22,23. ניטור קצב הזיהום של פיברובלסטים בכל מעבר של LLECs יסייע לחסל את ההשפעה של פיברובלסטים על צמיחת LLECs24. בהתחשב בהטרוגניות בין עכברים לבני אדם, יש לחפש את הקציר והטיפוח של LLECs אנושיים ראשוניים ליישומים קליניים פוטנציאליים במחקר עתידי.
לסיכום, אין כיום פרוטוקול מסודר לקציר וגידול LLECs במבחנה. מחקר זה מציג פרוטוקול רב-פרוצדורלי הניתן לשחזור לקצירת LLECs מלפטומנינים של עכברים ולאחר מכן לביסוס התרבית העיקרית שלהם במבחנה. עבודה זו תאפשר חקירה נוספת של תפקודים תאיים ויישומים קליניים פוטנציאליים עבור LLECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81960226, 81760223), הקרן למדעי הטבע של מחוז יונאן (202001AS070045, 202301AY070001-011), וקרן המחקר המדעי של מחלקת החינוך של מחוז יונאן (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
